Guia de Microbiologia Practicas 2014 PDF

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA Y CIENCIAS
DE LA SALUD
ESCUELA PROFESIONAL DE ESTOMATOLOGIA

GUIA DE PRCTICAS
DE
MICROBIOLOGIA Y PARASITOLOGIA
GENERAL Y ESTOMATOLOGICA

DOCENTES:
BLGO. CHAVEZ SALAS, IVONNE
BLGO. RONDON CHAMBI, ROMINA
BLGO. VASQUEZ BEZADA, GEORGE

AREQUIPA PERU
2014
Facultad de Medicina Humana y Ciencias de la Salud
Escuela Profesional de Estomatologa
Ctedra de Microbiologa y Parasitologa General y Estomatolgica
Msc. Blgos: Chvez Salas, Ivonne, Rondn Chambi, Romina y Vasquez Bezada, George

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MANUAL DE PRACTICAS
CONCEPTOS Y APLICACIONES
NOMBRES : __________________________________________________
MATERIA : MICROBIOLOGIA Y PARASITOLOGIA GENERAL
Y ESTOMATOLOGICA
AO : II SEMESTRE: III
ESCUELA : PROFESIONAL Y ACADEMICA DE ESTOMATOLOGIA
FACULTAD : MEDICINA HUMANA Y CIENCIAS DE LA SALUD
UNIVERSIDAD : ALAS PERUANAS FILIAL AREQUIPA
DIRECCION : ___________________________________________________
TELEFONO : ___________________________________________________
E-MAIL : ___________________________________________________

FECHAS DE EXAMENES:

TEORIA PRACTICAS
_____________________ ______________________________
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INDICE
Prctica 1. NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA _______________4
Practica 2. MATERIALES Y EQUIPOS BASICOS EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA ____________9
MICROSCOPIA
Practica 3. ESTERILIZACION Y DESINFECCION DEL MATERIAL DE LABORATORIO _________________15
Practica 4. TOMA Y TRANSPORTE DE MUESTRAS MICROBIOLOGICAS _________________________24
Prctica 5. MEDIOS DE CULTIVO MICROBIOLOGICO (clasificacin, preparacin y usos) ____________33
Prctica 6. SIEMBRA, AISLAMIENTO Y RECUENTO DE BACTERIAS _____________________________36
Prctica 7. ANTIBIOGRAMA ___________________________________________________________48
Prctica 8. REACCIONES SEROLOGICAS __________________________________________________55
Prctica 9. IDENTIFICACION DE BACTERIAS GRAMPOSITIVAS ________________________________58
Prctica 10. IDENTIFICACION DE BACTERIAS GRAMNEGATIVAS _______________________________60
Prctica 11. METABOLISMO BACTERIANO ________________________________________________62
Prctica 12. IDENTIFICACION DE MICOBACTERIAS __________________________________________69
Practica 13 METODOS DE DIAGNOSTICO EN MICOLOGIA____________________________________72
Practica 14 DIAGNOSTICO PARASITOLOGICO______________________________________________76


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PRACTICA 1
NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL
LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA
Una de las responsabilidades ms importantes que tiene el personal del rea de salud es el de controlar y
prevenir las infecciones hospitalarias, ya sea en los pacientes internados o a s mismos.
Es necesario actuar con conciencia en la manipulacin de materiales y equipos que se utilizan en los
distintos procedimientos ya que pueden ser potenciales portadores de agentes infecciosos y adems tomar
todas las precauciones de barrera en el tratamiento de los pacientes y el manejo de los materiales con ellos
utilizados, como as tambin el material orgnico que provenga de los pacientes (sangre, orina, etc.).
Esto es importante tambin en la etapa corno estudiantes de enfermera, donde estarn en contacto con
agentes patgenos, por lo tanto deben conocer a la perfeccin las Normas de Bioseguridad en un hospital y
en el laboratorio.
BIOSEGURIDAD
El objetivo general de Bioseguridad es minimizar el riesgo potencial de accidentes laborales en el manejo de
los residuos patognicos. El conjunto de medidas, normas y procedimientos destinados a minimizar y/o
controlar dicho riesgo biolgico es la Bioseguridad, quedando claro que el riesgo cero NO EXISTE.
Debe entenderse como una doctrina de comportamiento encaminada a lograr actitudes y conductas que
disminuyan el riesgo del trabajador de la salud de adquirir infecciones en el medio laboral. Compromete
tambin a todas aquellas otras personas que se encuentran en el ambiente asistencial, ambiente ste que
debe estar diseado en el marco de una estrategia de disminucin de riesgos.
Los principios de BIOSEGURIDAD se pueden resumir en:
A. UNIVERSALIDAD: Las medidas deben involucrar a todos los pacientes de todos los servicios,
independientemente de conocer o no su serologa. Todo el personal debe seguir las precauciones
estndares rutinariamente para prevenir la exposicin de la piel y de las membranas mucosas, en todas
las situaciones que puedan dar origen a accidentes, estando o no previsto el contacto con sangre o
cualquier otro fluido corporal del paciente. Estas precauciones, deben ser aplicadas para TODAS las
personas, independientemente de presentar o no patologas.
B. USO DE BARRERAS: Comprende el concepto de evitar la exposicin directa a sangre y otros fluidos
orgnicos potencialmente contaminantes, mediante la utilizacin de materiales adecuados que se
interpongan al contacto de los mismos. La utilizacin de barreras (ej. guantes) no evitan los accidentes de
exposicin a estos fluidos, pero disminuyen las consecuencias de dicho accidente.
C. MEDIOS DE ELIMINACIN DE MATERIAL CONTAMINADO: Comprende el conjunto de dispositivos y
procedimientos adecuados a travs de los cuales los materiales utilizados en la atencin de pacientes,
son depositados y eliminados sin riesgo.
LIQUIDOS POTENCIALMENTE INFECTANTES:
1. Sangre.
2. Semen.
3. Secrecin vaginal.
4. Leche materna.
5. Lquido cefalorraqudeo.
6. Lquido sinovial.
7. Lquido pleural.
8. Lquido amnitico.
9. Lquido peritoneal.
10. Lquido pericrdico.
11. Cualquier otro liquido contaminado con sangre.
PRECAUCIONES ESTANDAR INCLUYEN:
1. Barreras de proteccin: Lavado de manos, Guantes, Barbijo, Lentes y Mandil.
2. Desinfeccin y esterilizacin.
3. Manejo y eliminacin de desechos.
4. Ventilacin e iluminacin adecuada.
5. Limpieza y desinfeccin de ambientes.
6. Clasificacin y distribucin de pacientes hospitalizados.

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7. Prevencin de accidentes ocupacionales
OBJETIVOS:
1. Conocer y aplicar las normas de Bioseguridad de un laboratorio de Microbiologa y Parasitologa.
2. Conocer y aplicar las normas de Bioseguridad como estudiantes de enfermera en un Centro Asistencial.
3. Reconocer los materiales de un laboratorio de Microbiologa y Parasitologa, as como el manejo y uso de
los mismos.
NORMAS GENERALES DE BIOSEGURIDAD.
Mantener el lugar de trabajo en ptimas condiciones de higiene y aseo.
Debern ser utilizadas las cocinetas designadas por el hospital para la preparacin y el consumo de
alimentos, no es permitido la preparacin y consumo de alimentos en las reas asistenciales y
administrativas.
No guardar alimentos en las neveras ni en los equipos de refrigeracin de sustancias contaminantes o
qumicos.
Las condiciones de temperatura, iluminacin y ventilacin de los sitios de trabajo deben ser confortables.
Maneje todo paciente como potencialmente infectado. Las normas universales deben aplicarse con todos
los pacientes independientemente del diagnstico, por lo que se hace innecesario la clasificacin
especfica de sangre y otros lquidos corporales como "infectada o no infectada".
Lvese cuidadosamente las manos antes y despus de cada procedimiento e igualmente si se tiene
contacto con material patgeno.
Utilice en forma sistemtica guantes plsticos o de ltex en procedimientos que conlleven manipulacin
de elementos biolgicos y cuando maneje instrumental o equipo contaminado en la atencin de
pacientes. Hacer lavado previo antes de quitrselos y al terminar el procedimiento.
Utilice un par de guantes nuevos por paciente.
Abstngase de tocar con las manos enguantadas alguna parte de su cuerpo
y de manipular objetos diferentes a los requeridos durante el procedimiento.
Emplee mascarilla y protectores oculares durante procedimientos que puedan generar salpicaduras o
gotitas aerosoles de sangre u otros lquidos corporales.
Use delantal plstico en aquellos procedimientos en que se esperen salpicaduras, aerosoles o derrames
importantes de sangre u otros lquidos orgnicos.
Evite deambular con los elementos de proteccin personal fuera de su rea de trabajo.
Mantenga sus elementos de proteccin personal en ptimas condiciones de aseo, en un lugar seguro y
de fcil acceso.
Utilice equipos de reanimacin mecnica, para evitar el procedimiento boca-boca.
Evite la atencin directa de pacientes si usted presenta lesiones exudativas o dermatitis serosas, hasta
tanto stas hayan desaparecido.
Si presenta alguna herida, por pequea que sea, cbrala con esparadrapo o coritas.
Mantenga actualizado su esquema de vacunacin contra Hepatitis B.
Las mujeres embarazadas que trabajan en ambientes hospitalarios expuestas a factor de Riesgo
Biolgico de transmisin parenteral debern ser muy estrictas en el cumplimiento de las precauciones
universales y, cuando el caso lo amerite, se deben reubicar en reas de menor riesgo.
Aplique en todo procedimiento asistencial las normas de asepsia necesarias. Utilice las tcnicas correctas
en la realizacin de todo procedimiento.
Maneje con estricta precaucin los elementos cortopunzantes y deschelos en lugares destinados para
estos en cada servicio. Los basureros debern estar firmemente sujetos de tal manera que pueda
desechar las agujas halando la jeringa para que caigan entre el recipiente, sin necesidad de utilizar para
nada la otra mano.

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Cuando no sea posible la recomendacin anterior, evite desenfundar manualmente la aguja de la jeringa.
Deseche completamente la jeringa.
No cambie elementos cortopunzantes de un recipiente a ota-V.
Abstngase de doblar o partir manualmente la hoja de bistur, cuchillas, agujas o cualquier otro material
cortopunzante.
Evite reutilizar el material contaminado como agujas, jeringas y hojas de bistur.
Todo equipo que requiera reparacin tcnica debe ser llevado a mantenimiento, previa desinfeccin y
limpieza por parte del personal encargado del mismo.
El personal del rea de mantenimiento debe cumplir las normas universales de prevencin y control del
factor de riesgo Biolgico.
Realice desinfeccin y limpieza a las superficies, elementos, equipos de trabajo, al final de cada
procedimiento y al finalizar la jornada de acuerdo a el proceso descrito en el manual de limpieza y
desinfeccin.
En caso de derrame o contaminacin accidental de sangre u otros lquidos corporales sobre superficies
de trabajo. Cubra con papel u otro material absorbente, luego vierta hipoclorito de sodio a 5000 partes por
milln sobre el mismo y sobre la superficie circundante, dejando actuar durante 30 minutos; despus
limpie nuevamente la superficie con desinfectante a la misma concentracin y realice limpieza con agua y
jabn. El personal encargado de realizar dicho procedimiento debe utilizar guantes, mascarilla y bata.
En caso de ruptura del material de vidrio contaminado con sangre u otro liquido corporal los vidrios se
deben recoger con escoba y recogedor-, nunca con las manos
Los recipientes para transporte de muestras debe ser de material irrompible y cierre hermtico. Debe
tener preferiblemente el tapn de rosca
Manipule, transporte y enve las muestras disponindolas en recipientes seguros, con tapa y
debidamente rotuladas, empleando gradillas limpias para su transporte. Las gradillas a su vez se
transportarn en recipientes hermticos de plstico o acrlicos que detengan fugas o derrames
accidentales. Adems deben ser fcilmente lavables.
En caso de contaminacin externa accidental del recipiente, ste debe lavarse con hipoclorito de sodio a
1000 partes por milln y secarse.
En las reas de alto riesgo biolgico el lavamos debe permitir accionamiento con el pi, la rodilla o el
codo.
Restrinja el ingreso a las reas de alto riesgo biolgico al personal no autorizado, al que no utilice los
elementos de proteccin personal necesarios y a los nios.
La ropa contaminada con sangre, lquidos corporales u otro material orgnico debe ser enviado a la
lavandera en bolsa plstica roja.
Disponga el material patgeno en las bolsas de color rojo, rotulndolas con el smbolo de riesgo biolgico
En caso de accidente de trabajo con material cortopunzante haga el autoreporte inmediato del presunto
accidente de trabajo.
Los trabajadores sometidos a tratamiento con inmunosupresores no deben trabajar en reas de alto
riesgo biolgico.
REGLAS GENERALES DE CONDUCTA EN EL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGA Y PARASITOLOGA:
1. El uso del mandil blanco es obligatorio para la asistencia a las sesiones prcticas, el cual debe ser largo y
estar abotonado.
2. No se permite el ingreso al laboratorio de alumnas (os) con sandalias o falda.
3. Para los alumnos(as) con cabello largo debe ser recogido antes de colocarse el gorro.
4. No se permite comer ni beber en el laboratorio.
5. Evite Llevarse objetos a la boca (lapiceros, dedos, cuadernos, etc.) durante su permanencia en el
laboratorio.

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6. Lvese las manos las manos con agua y jabn al trmino de cada sesin de prctica.
7. Si por accidente se derrama un cultivo de microorganismos, ocurre algn accidente inesperado, hgalo
saber inmediatamente al profesor.
8. No ponga sobre la mesa de trabajo: tiles, prendas, etc., colquelos en un lugar designado para ello.
9. Al concluir la prctica DEJE SIEMPRE EL MICROSCOPIO CON LOS OBJETIVOS LIMPIOS DE ACEITE
DE INMERSIN Y CON EL OBJETIVO DE MENOR AUMENTO.
10. Tanto el ambiente como la mesa al finalizar el trabajo debe dejarlo limpio y los asientos deben estar
encima de la mesa.

ACTIVIDADES.
1. Traer para todas las sesiones de prcticas:
INDIVIDUAL: MESON:
Mandil. 1 Encendedor. 3 agujas descartables.
Gorro. 1 Frasco de jabn lquido. 3 lancetas.
Guantes. 1 Alcohol 95 (1 litro). 1 plumn de tinta indeleble.
Barbijo, tapaboca. 1 Alcohol de 70 (1 litro). 3 jeringas de 5 ml.
Mechero. 1 Bolsa de algodn de 100 grs. 1 rollo cinta maskin tape.
Toalla individual (campo). 1 metro de gasa. 1 pinza de acero inoxidable
Gua de prcticas. 1 Tijera. 1 rollo de pabilo.
Zapatos cerrados de cuero. 30 hisopos largos. Lpiz de cera o marcad or.

SALON: CADA 2 PERSONAS:
1 botella de leja. 1 pliego de papel kraff
2 o 3 pulverizadores. 1 rollo de papel toalla.
1 caja de portaobjetos.
1 caja de cubreobjetos.
1 paquete de bolsas rojas.
2. Observe y manipule cuidadosamente materiales de laboratorio que-estn sobre la mesa de trabajo.
Pipetas graduadas (1 ml, 5ml, 10ml.).
Pipetas Pasteur.
Placas Petri.
Tubos de ensayo.
Asas de microbiologa.
Mechero de alcohol.
Matraz.
Probeta.
Estufa u horno.
Autoclave u olla a presin.
Termmetro ambiental.
Gradillas.
Pinzas.
Porta lminas.
Lminas portaobjetos - Lminas
cubreobjetos.
Aceite de inmersin.
Microscopio ptico.
Campo.
Lpiz de cera.
Batera de coloracin de Gram.
3. Traer para la siguiente sesin de prctica lo indicado por los profesores.


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CUESTIONARIO.
1. Que comprende la bioseguridad?
2. Cules son los principios de la bioseguridad?
3. A que se llama accidente de exposicin a sangre o fluidos corporales?
4. Que tipos de fluidos humanos conoce que puedan transmitir contagio?
5. Cules son las precauciones estndares o universales en bioseguridad?
6. En qu momento se recomienda el lavado de manos para prevenir contaminaciones cruzadas?
7. Que artculos conoce para proteccin contra contaminacin?
8. Que precauciones se deben tomar durante los procedimientos invasivos?
9. Como se procede con la ropa contaminada?
10. Cules son las recomendaciones prcticas para desarrollar tareas vinculadas a la atencin del paciente
con referencia a bioseguridad?
11. Como se descontaminan los utensilios de uso con el paciente ?(pinzas, espejos, hisopos, etc)
12. Como se descartan y donde, los materiales de curacin usados ?(Gasas y corto punzantes )


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PRACTICA 2
MATERIALES Y EQUIPOS BASICOS EN
EL LABORATORIO DE MICROBILOGIA
I MATERIAL DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA.
En un laboratorio de Microbiologa y Parasitologa se utilizan una serie de materiales:
A. Materiales qumicos, colorantes tales como los de la coloracin de Gram, cristal violeta y Safranina.
Indicadores como el rojo fenol; reactivas y soluciones como lugol, alcohol, fenol y acido actico
adems de medios de cultivo como el caldo peptonado.
B. Materiales de vidrio, como tubos de ensayo, placas petri, probetas, matraz, pipetas, mechero y laminas
portaobjetos y cubreobjetos.
C. Materiales varios, como escobillas, papel indicador de Ph, gradillas, lpiz de cera y papel filtro.
D. Equipos como estufas, autoclave, termmetro, centrifuga, microscopio ptico y de fluorescencia.
Los materiales bsicos son:
Tubo de ensayo: Ah se observan las reacciones de las sustancias que se depositan en l. Los hay de
diferentes medidas y tambin sirven para preparar cultivos de bacterias y hongos.
Caja de Petri: En ella se cultivan microorganismos, como hongos o bacterias; tambin puede usarse
para seleccionar muestras de animales.
Embudo: Es til para separar sustancias por medio de filtracin y para evitar su desperdicio o
derramamiento al ser cambiadas de un recipiente a otro.
Portaobjetos: Son laminillas de cristal planas pero tambin pueden ser cncavas, en ellas se
depositan sustancias para su observacin.
Cubreobjetos: Cubren y protegen las preparaciones u objetos que se observarn al microscopio e
impiden que se desprendan o muevan al ser observados.
Lupas: Son lentes convexos para la observacin detallada de objetos pequeos; como partes de
plantas, insectos, etctera.
Lmpara de alcohol: Se emplea como fuente de calor cuando se requiere calentamiento lento. Al
usarla debe cuidarse que la mecha est limpia y recortada para que el calor que proporcione sea
adecuado
Vidrio de reloj: Sobre l se depositan sustancias en pequea cantidad. Son tiles para cubrir vasos de
precipitados y para colocar en agua cortes transversales muy delgados, los cuales, sern
seleccionados con una aguja de diseccin para ser observados al microscopio.
Mechero de gas: Se emplea para el calentamiento rpido de sustancias.
Microscopio: Hace visibles al ojo humano objetos diminutos. Es de suma importancia en un
laboratorio. Con l se han hecho avances notables en medicina, qumica, biologa, etctera.
Mortero: Sirve para moler, triturar slidos o mezclar dos o ms sustancias slidas.
Estuche de diseccin: Contiene bistur, agujas de diseccin, pinzas, tijeras, etctera.
Beaker: Se usan para preparar, disolver o calentar directamente sobre rejillas o planchas de
calentamiento
Matraz Erlenmeyer: Se utiliza para montar sistemas generadores de gases
Matraz Aforado: Sirve para preparar volmenes exactos de concentraciones
Bureta: Son tubos de vidrios calibrados que suelen terminar en una llave y sirven para medir
volmenes de lquidos con mayor precisin y exactitud.

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Termmetro: Con l se mide la temperatura a diversas sustancias reaccionantes (reactivos).
Balanza: Con ella se conoce el peso de objetos
Bao Mara: Es un dispositivo que permite calentar sustancias en forma indirecta, es decir, sustancias
que no pueden ser expuestos a fuego directo.
Vasos de precipitados: Permite calentar sustancias y obtener precipitados de ellas.
Matraz de fondo plano: Se utiliza para calentar lquido.
Matraz de fondo redondo: Se utiliza para poner volmenes exactos de soluciones
Agitador: Se usa para agitar mezclas reactivas y como accesorio en el trasvase de lquidos
Cpsula de porcelana: Sirve para calentar y evaporar lquidos, fundir cristalizar slidos
Crisol: Sirve para calcinar sustancias, fundir slidos.
Mortero: Sirve para triturar, pulverizar y mezclar slidos.
Esptula: Sirve para trasegar slidos y tomar nuestras de slidos.
Soporte universal: Pieza bsica en el montaje de los sistemas y aparatos como pinzas y anillos de
metal
Rejilla de Metal con Centro de Asbesto: Sirve para calentar indirectamente ya que la llama del
mechero se concentra en el anillo.
Trpode: Soporte de vaso de precipitado, matraces, etc
Pinza para soporte universal: Sirve para sujetar instrumentos en el montaje de sistemas
Gradilla: Se utiliza para colocar los tubos de ensayo.

II MICROSCOPIA.
Es una de las herramientas ms utilizadas en la microbiologa y es la que permiti el desarrollo de esta
ciencia. La habilidad en el manejo del microscopio es muy importante en la identificacin de los
microorganismos. Los pasos bsicos en el manejo del microscopio son la iluminacin, el enfoque y la
observacin de las preparaciones. El microscopio posee dos clases de objetivos, el objetivo seco
interpone el aire entre la lente frontal y la superficie de la muestra (laminilla). Estos objetos pueden ser de

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2, 5, 10 y 40 aumentos; el objetivo hmedo o de inmersin usa un liquido transparente (aceite de
inmersin) y permite aprovechar la mayor cantidad de luz (100 a 120 aumentos). El tamao final de la
imagen se puede calcular multiplicando el valor del lente objetivo por el del ocular usado y se expresa en
dimetros o aumentos.
OBJETIVOS:
1. Reconocer los materiales de un laboratorio de Microbiologa y Parasitologa, as como el manejo y uso de
los mismos.
2. Lograr destreza en el manejo del microscopio ptico.
MATERIALES:
Pipetas graduadas (1 ml, 5ml, 10ml.)
Pipetas Pasteur
Placas Petri.
Tubos de ensayo.
Asas de microbiologa.
Mechero de alcohol.
Matraz.
Probeta.
Estufa u horno.
Termmetro ambiental.
Gradillas.
Pinzas.
Porta lminas.
Lminas portaobjetos - Lminas cubreobjetos.
Aceite de inmersin.
Microscopio ptico.
Campo.
Lpiz de cera.
Batera de coloracin de Gram.
PROCEDIMIENTO:
A. Observe y manipule cuidadosamente materiales de laboratorio que estn sobre la mesa de trabajo.
B. Reconocer y rotular en la figura las partes del microscopio.
C. Observe una muestra de agua estancada y de mucosa oral siguiendo correctamente las siguientes
instrucciones de manejo del microscopio:
1. Colocar el objetivo de menor aumento en posicin de empleo y bajar la platina completamente. Si el
microscopio se recogi correctamente en el uso anterior, ya debera estar en esas condiciones.
2. Colocar la preparacin sobre la platina sujetndola con las pinzas metlicas.
3. Comenzar la observacin con el objetivo de 4x (ya est en posicin) o colocar el de 10 aumentos (10x)
si la preparacin es de bacterias.
4. Para realizar el enfoque:
a. Acercar al mximo la lente del objetivo a la preparacin, empleando el tornillo micromtrico. Esto
debe hacerse mirando directamente y no a travs del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el
objetivo en la preparacin pudindose daar alguno de ellos o ambos.
b. Mirando, ahora s, a travs de los oculares, ir separando lentamente el objetivo, de la preparacin
con el micromtrico y, cuando se observe algo ntido la muestra, girar el micromtrico hasta obtener
un enfoque fino.
5. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debera estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover
un poco el micromtrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdi por completo la
imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operacin desde el paso 3. El
objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparacin y por ello es fcil que ocurran dos tipos
de percances: incrustarlo en la preparacin si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo
con aceite de inmersin si se observa una preparacin que ya se enfoc con el objetivo de inmersin.
6. Empleo del objetivo de inmersin:
a. Bajar totalmente la platina y subir totalmente el condensador para ver claramente el crculo de luz
que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habr que echar el aceite.
b. Girar el revlver hacia el objetivo de inmersin dejndolo a medio camino entre ste y el de X40.
c. Colocar una gota mnima de aceite de inmersin sobre el crculo de luz.
d. Terminar de girar suavemente el revlver hasta la posicin del objetivo de inmersin.

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e. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de
aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente.
f. Enfocar cuidadosamente con el micromtrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersin y
la preparacin es mnima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy
grande.
g. Una vez se haya puesto aceite de inmersin sobre la preparacin, ya no se puede volver a usar el
objetivo 40x sobre esa zona, pues se manchara de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo,
hay croe bajar la platina y repetir la operacin desde el paso 3.
h. Una vez finalizada la observacin de la preparacin se baja la platina y se coloca el objetivo de
menor aumento girando el revlver. En este momento ya se puede retirar la preparacin de la
platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersin en posicin de observacin.
i. Limpiar el objetivo de inmersin con cuidado empleando un papel especial para ptica. Comprobar
tambin que el objetivo 40x est perfectamente limpio.
ACTIVIDADES:
1. Esquematice los materiales de laboratorio observados e indique cual es su funcin.
2. Identifique y esquematice las muestras observadas en el microscopio, rotulando correctamente el
esquema.


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MUESTRA:.
COLORACION:.
AUMENTO:
OBSERVACION:..

MUESTRA:.
COLORACION:.
AUMENTO:
OBSERVACION:..

MUESTRA:.
COLORACION:.
AUMENTO:
OBSERVACION:..

MUESTRA:.
COLORACION:.
AUMENTO:
OBSERVACION:..


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CUESTIONARIO.
1. Caractersticas del material de vidrio utilizado en el laboratorio de microbiologa
2. Qu recipientes son indicados para someterlos al calor y cules no?
3. Cules son las caractersticas y parmetros de una buena cmara de siembra?
4. Que es una micropipeta, cuando y como se usa?
5. Mencione los materiales necesarios para pesar 5 g de una medio de cultivo en polvo. Mencione 2
precauciones a tomar en cuenta.


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PRACTICA 3
ESTERILIZACION Y DESINFECCION
DEL MATERIAL DE LABORATORIO
INTRODUCCION:
No se puede hablar de esterilizacin sin considerar el concepto de microorganismo. Un microorganismo es
un agente microscpico vivo e imperceptible a los sentidos que generalmente est agrupado en colonias,
aunque bien puede estar como una unidad formadora de colonias (U.F.C.), la que se desarrolla en un medio
apropiado para formar colonias perceptibles. Los microorganismos pueden ser patgenos (productores de
ciertas enfermedades) o banales (los habitualmente hallados en los alimentos, el aire, el polvillo ambiental),
que no perjudican al hombre.
El hecho de que existan distintos tipos de grmenes en el medio ambiente, crea grandes dificultades en los
estudios bacteriolgicos, cuando es necesario obtener las especies microbianas en estado de pureza, ya
que tanto el instrumental como los medios de cultivo son invadidos con suma facilidad por los microbios del
medio ambiente.
Con el fin de subsanar estos inconvenientes se practica la esterilizacin, procedimiento que consiste en
destruir todos los grmenes vivos que existan sobre los objetos o sustancias que se desean libre de ellos
(aspticos).
Los Microorganismos pueden clasificarse en criorresistentes, que son los resistentes al fro y
termorresistentes o resistentes a las altas temperaturas, aunque la clasificacin ms comn es por la
temperatura a la que se reproducen. As se los puede clasificar en Crifilos (-5 a 14 C); Mesfilos (25 a 47
C) y Termfilos (50 hasta 113 C). Por ejemplo, muchos hongos se destruyen con la temperatura, pero sus
esporas an son viables y cuando encuentran un medio apropiado, rico en nutrientes y humedad, se
reproducen. Por tal motivo la tecnologa para su destruccin debe considerar stas variables.
ESTERILIZACIN: Esta operacin comprende todos los procedimientos fsicos, mecnicos y
qumicos, que se emplean para destruir, inactivar o retener grmenes en general y patgenos en particular.
A travs de esta, los materiales de laboratorio para determinados diagnsticos y los elementos quirrgicos y
la piel del enfermo alcanzan un estado de desinfeccin que evita la contaminacin operatoria.
DESINFECCION: No se destruyen todos los microorganismos, dependiendo del desinfectante, pueden
sobrevivir algunas formas resistentes y permanecer relativamente viables. No obstante, los trminos
esterilizacin y desinfeccin se utilizan indistintamente.
CLASES DE ESTERILIZACION:
A. MTODOS FSICOS:
1. Calor: La utilizacin de este mtodo y su eficacia depende de dos factores: el tiempo de exposicin y
la temperatura.
Todos los microorganismos son susceptibles, en distinto grado, a la accin del calor. El calor provoca
desnaturalizacin de protenas, fusin y desorganizacin de las membranas y/o procesos oxidantes
irreversibles en los microorganismos.
a. Ebullicin: Durante mucho tiempo se "hirvieron" los utensilios y materiales quirrgicos o jeringas
hipodrmicas para esterilizarlas. El agua a 100 C no garantiza una adecuada esterilizacin, no
obstante posee la propiedad de desprender las colonias o los microorganismos y destruir aquellos
que son susceptibles a sta temperatura.
Un claro ejemplo de ello fue el sistema utilizado hasta hace pocos aos para esterilizar jeringas de
vidrio y agujas hipodrmicas de nquel con embocadura de bronce en el mejor de los casos,
platino, hirvindolos en agua.
b. Calor Seco: El calor seco produce desecacin de la clula, esto es txico por niveles elevados de
electrolitos y fusin de membranas, residuos que quedan adheridos al objeto estril. Estos efectos
se deben a la transferencia de calor desde los materiales a los microorganismos que estn en
contacto con stos.

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An as se sigue utilizando el calor seco en todos los laboratorios para la esterilizacin de placas de
petri y pipeteros (recipientes metlicos para alojar pipetas para la siembra de sustancias lquidas).
La accin destructiva del calor sobre protenas y lpidos componentes o nutrientes de los
microorganismos, requiere mayor temperatura cuando el material est seco o la actividad de agua
del medio es baja.
Fuego Directo: Este procedimiento consiste en exponer a la llama de un mechero de Bunsen o
con alcohol con el objeto que se desea esterilizar. Cuando ste es de metal se deja permanecer
en el rea de reduccin de la llama hasta que se ponga al rojo (asas de cultivo; algunas agujas,
etc). Si es de vidrio se deja un tiempo prudencial, procurando que la llama llegue a todos lados.
Antes de utilizar el objeto esterilizado es necesario dejarlo enfriar en un sitio asptico. Este
procedimiento tiene limitaciones debido a que deteriora los objetos y si son de gran volumen, la
esterilizacin nunca es perfecta.
Estufas: Para esterilizar por intermedio del aire caliente es necesario colocar los objetos en
aparatos especiales llamados ESTUFAS. Y llevar el aire interior a una temperatura entre 150 y
190 C. Uno de los primeros aparatos utilizados para este fin fu el horno de Pasteur, que luego
se sustituy por estufas de aire caliente. Estas constan de una doble cmara, el aire caliente
generado por una resistencia elctrica circula por la cavidad principal y por el espacio entre
ambas cmaras, a temperaturas variables, siendo la ms aconsejadas 170 C para el
instrumental metlico y a 140 C para el contenido de los tambores. Se mantiene una temperatura
estable mediante termostatos de metal denominados de par bimetlico, consistente en dos
metales de distinto coeficiente de dilatacin. Cuando uno se dilata, el otro no lo hace y se arquea.
Uno de los extremos de ste dispositivo se halla en contacto con un interruptor que corta la
alimentacin de la resistencia calefactora.
Ventajas del calor seco:
No es corrosivo para metales e instrumentos.
Permite la esterilizacin de sustancias en polvo y no acuosas, y de sustancias viscosas no
voltiles.
Desventajas:
Requiere mayor tiempo de esterilizacin, respecto al calor hmedo, debido a la baja penetracin
del calor.
c. Calor Hmedo: Se realiza la esterilizacin por el vapor de agua a presin en autoclave. El modelo
ms usado es el de Chamberland.
Esteriliza a 120 a una atmsfera de presin (estas condiciones pueden variar) y se deja el material
durante 20 a 30 minutos.
El equipo consta de una caldera de cobre, sostenida por una camisa externa metlica, que en la
parte inferior recibe calor por combustin de gas o por una resistencia elctrica.
La caldera se cierra en la parte superior por una tapa de bronce sujetada por bulones, mariposas o
charnelas. Esta tapa posee tres orificios, uno para el manmetro, otro para el escape de vapor en
forma de robinete (tambin llamado espita) y el tercero, para una vlvula de seguridad que funciona
por contrapeso o a resorte.
Funcionamiento y mtodo para esterilizar adecuadamente en Autoclave: Se coloca agua en la
caldera, procurando que su nivel no alcance a los objetos que se disponen sobre una rejilla o
canasta de metal.
Se cierra asegurando la tapa, ajustando los bulones y se da calor, dejando abierta la vlvula de
escape hasta que todo el aire se desaloje y comience la salida de vapor en forma de chorro
continuo y abundante.
Se cierra la espita de vapor y se espera hasta que llegue a la temperatura adecuada. A partir de all
se cuenta el tiempo de esterilizacin, luego del cual se debe esperar al descenso de la temperatura
para abrir la espita de purga y la tapa del autoclave nuevamente.
Atmsferas Grados Centgrados
0 100

- 17 -
1/2 112
1 120
1 1/2 128
2 135

Este proceso de esterilizacin es el que mejor resultados d en microbiologa. El vapor de agua a
fuerte presin acta a mayores temperaturas:
Tiempos de esterilizacin en autoclave: Del tiempo, temperatura y presin usadas en la
esterilizacin depende el xito alcanzado. Generalmente los datos presin y temperatura son fijados,
y el nico factor que se vara es el tiempo. Los materiales necesitan diferentes tiempos de
esterilizacin dependiendo de su textura, porosidad, y otras caractersticas propias de cada material.
Algunos materiales como el hule, necesitan poco tiempo, mientras otros como el metal quirrgico
necesitan ms. Los siguientes datos han sido tomados para una temperatura de esterilizacin de
250F (121C) a 15-20 PSI.
Guantes de Caucho (Hule). 15 minutos.
Sondas (base tejida). 15 minutos.
Sondas (ltex). 15 minutos.
Frascos de Vidrio, Cristalera en General. 20 minutos.
Agua en frascos. 20 minutos.
Jeringas de Vidrio. 20 minutos.
Bandeja. 30 minutos.
Equipo de transfusin. 30 minutos.
Paquetes de maternidad. 30 minutos.
Ropa. 30 minutos.
Torundas. 30 minutos.
Paquete quirrgico. 45 minutos.
Instrumental de acero inoxidable. 45 minutos.
Cuando se esteriliza se deben hacer paquetes bien cerrados y bien ordenados, para que haya
buena penetracin de vapor en el material.
No incluir dentro del mismo paquete material con diferentes tiempos de esterilizacin. Ej.: lencera y
vidrio.
El mtodo utilizado para envolver los paquetes deber garantizar el mantenimiento de las
condiciones de esterilidad de los materiales durante su almacenamiento.
Como Cargar el Autoclave:
Se deben acomodar los bultos o paquetes de tal forma que haya una libre circulacin de vapor
entre ellos (no tratar de llenar el autoclave hasta sobrecargarlo).
Colocar de lado las botellas, frascos y cualquier clase de recipiente no poroso de material seco.
Esto permite un pronto desplazamiento del aire y un rpido contacto del vapor con las superficies
de las vasijas y su contenido. Tambin facilita el secado.
Esterilizar los lquidos separndolos de otros materiales.
Cuando se esterilizan lquidos, debe hacerse con los recipientes destapados.
La cristalera deber esterilizarse colocando los recipientes boca abajo u horizontales (nunca con
la boca hacia arriba).
Ventajas del calor hmedo:
Rpido calentamiento y penetracin
Destruccin de bacterias y esporas en corto tiempo
No deja residuos txicos
Hay un bajo deterioro del material expuesto
Econmico

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Desventajas:
No permite esterilizar soluciones que formen emulsiones con el agua
Es corrosivo sobre ciertos instrumentos metlicos.

d. Tyndalizacin: Mtodo de esterilizacin en el que el calor se utiliza intermitentemente, dejando un
tiempo entre dos calentamientos para permitir el desarrollo de las esporas que son destruidas ms
fcilmente en el siguiente calentamiento.
Esterilizacin por accin discontinua del vapor de agua, se basa en el principio de Tyndall. Las
bacterias que resisten una sesin de calefaccin, hecha en determinadas condiciones, pueden ser
destruidas cuando la misma operacin se repite con intervalos separados y en varias sesiones.
Se efecta por medio del autoclave de Chamberland, dejando abierta la vlvula de escape, o sea
funcionando a la presin normal. Puede tambin realizarse a temperaturas ms bajas, 56 u 80
para evitar la descomposicin de las sustancias a esterilizar, por las temperaturas elevadas.
2. Filtracin: Este procedimiento es aplicable a la esterilizacin de lquidos y gases, especialmente los
primeros. Cuando el lquido a filtrar no puede resistir, sin descomponerse, la accin del calor, se aplica
la tcnica de filtracin, la que puede efectuarse mediante presin o aspiracin.
Se basa en el pasaje de lquidos a travs de sustancias porosas que detienen a los microbios. Los
antiguos filtros se fabricaban en forma de bujas que son cilindros huecos abiertos por una extremidad
y cerrados por otra, de paredes de espesor variable.
En la actualidad se usan membranas filtrantes con poros de un tamao determinado. El tamao del
poro depender del uso al que se va a someter la muestra. Los filtros que se utilizan no retienen virus
ni micoplasmas, estos ltimos estn en el lmite de separacin segn el dimetro de poro que se
utilice. La filtracin se utiliza para emulsiones oleosas o soluciones termolbiles. Su usa para esterilizar

- 19 -
aceites, algunos tipos de pomadas, soluciones oftlmicas, soluciones intravenosas, drogas
diagnsticas, radiofrmacos, medios para cultivos celulares, y soluciones de antibiticos y vitaminas.
B. MTODOS QUMICOS: Estos mtodos provocan la perdida de viabilidad de los microorganismos.
En comparacin con los procedimientos fsicos, estos mtodos tienen una importancia secundaria. Los
antispticos son considerados venenos protoplasmticos que, al actuar sobre los grmenes, los
destruyen. Algunos de ellos ejercen su accin nociva sobre todas las clulas, por lo cual se les considera
venenos generales, por el contrario otros actan sobre algunas especies bacterianas, mostrndose como
venenos especficos. Este mtodo es ptimo para la antisepsia de las manos del operador, de locales, de
mesas de trabajo, de jaulas de animales, y para destruir grmenes que puedan caer en lugares de
trabajo.
Agentes qumicos: La Iodopovidona (pervinox), el Cloruro de Benzalconio (sal de amonio cuaternario o
Cloruro de Zefirano) son ejemplos de antispticos tiles para desinfectar manos y superficies. Cuando la
superficie es resistente, el mejor agente biocida es el Hipoclorito de Sodio (agua lavandina).
Estufas de esterilizacin por xido de etileno: Destruye todos los organismos y microorganismos
conocidos, incluso esporas y virus. Esteriliza sin deterioro artculos de goma, plstico, metal, madera,
lana, piel, papel, productos farmacuticos.
El xido de etileno era bactericida, esporicida, con gran poder de penetracin, efectivo a bajas
temperaturas y penetra sustancias porosas; para evitar su poder explosivo y su alto potencial inflamable
se mezcl con CO
2
en una proporcin de 7,15 veces el volumen de xido de etileno.
El tiempo de esterilizacin que requiere el material depende de mltiples variables, el vaco que se
produce, la humedad, la concentracin del gas expresado en gs./l y la temperatura, es decir que
reduciendo la temperatura aumenta el tiempo de exposicin requerido.
El gas se adquiere en botellas metlicas o cartuchos que se vaporizan, cambian de lquido a gas a 10 C.
Todos los artculos debern airearse por 6 hs. despus de una esterilizacin.
El xido de etileno es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrgenos lbiles como los
que tienen grupos carboxilos, amino, sulfhidrilos, hidroxilos, etc.
Es utilizado en la esterilizacin gaseosa, generalmente en la industria farmacutica. Destruye todos los
microorganismos incluso virus. Sirve para esterilizar material termosensibles como el descartable (goma,
plstico, papel, etc.), equipos electrnicos, bombas cardiorrespiratorias, metal, etc. Es muy peligroso por
ser altamente inflamable y explosivo, y adems cancergeno.
Con aldehdos: Son agentes alquilantes que actan sobre las protenas, provocando una modificacin
irreversible en enzimas e inhiben la actividad enzimtica. Estos compuestos destruyen las esporas.
Glutaraldehdo: Consiste en preparar una solucin alcalina al 2% y sumergir el material a esterilizar de
20 a 30 minutos, y luego un enjuague de 10 minutos.
Este mtodo tiene la ventaja de ser rpido y ser el nico esterilizante efectivo fro. Puede esterilizar
plstico, goma, vidrio, metal, etc.
Antispticos
Alcoholes
Iodo
Agentes catinicos, aninicos y anfteros
rgano Mercuriales
Colorantes
Desinfectantes y/o Esterilizantes
Cloro y Compuestos clorados
Aldehdos
xido de Etileno
Compuestos Fenlicos
cidos y lcalis

Formaldehido: Se utilizan las pastillas de paraformaldehdo, las cuales pueden disponerse en el fondo
de una caja envueltas en gasa o algodn, que despus pueden ser expuesta al calor para un rpida
esterilizacin (accin del gas formaldehdo). Tambin pueden ser usadas en Estufas de Formol, llamadas
tambin de formalina, que son cajas de doble fondo, en cuya base se colocan las pastillas y se calienta
hasta los 60 C y pueden esterilizar materiales de ltex, goma, plsticos, etc.

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Las pastillas de formalina a temperatura ambiente esterilizan en 36 hs.
OBJETIVOS DE LA PRCTICA:
1. Preparar el material de laboratorio antes de ser esterilizados o desinfectado.
2. Adquirir experiencia en aplicar mtodos de esterilizacin y desinfeccin utilizando distintos agentes.
MATERIALES:
Material de laboratorio: pipetas, placas petri,
tubos de ensayo, frascos u otros materiales de
vidrio.
Asas microbiolgicas.
Estufa u horno.
Mechero de Bunsen o alcohol.
Alcohol etlico, alcohol yodado, isodine, fenol,
hipocloritos, cido paraactico.
Medios de cultivo slidos y lquidos.
Agua destilada.
Papel filtro.
Papel kraff.
Gasa.
Algodn.
Pabilo.
Detergente, cepillo.
Lpiz de cera.
PROCEDIMIENTO:
I PREPARACIN DEL MATERIAL DE VIDRIO.
Para conservar la asepsia se debe preparar previamente el material antes de ser esterilizado:
Lavar y cepillar con detergente todo el material y darle el primer enjuague con agua de cao.
Posteriormente enjuagarlo con agua destilada y secarlo externamente con papel toalla.
A. ELABORACIN DE TAPONES DE ALGODN.
Los tapones son utilizados en los diferentes tamaos de tubos y matraces.
1. Tapn para matraz de 500 ml.:
Recortar una tira de algodn de (15 20 cm. de largo, 3 cm. de ancho y un grosor de 0.5 cm.)
aproximadamente.
Envolver este algodn con una gasa de 10 x 10 cm. presionando con los dedos para que
quede duro y amarrar con pabilo fuertemente.
Luego probar en la boca del matraz de tal manera que quede el tamao exacto y no caiga
hacia dentro del matraz.


- 21 -
2. Tapn para tubo de ensayo:
Se corta una tira de algodn, de largo adecuado al tamao de la boca del tubo.
Con una pinza de diseccin se prensa uno de los extremos.
Se enrolla el algodn en la pinza, de una manera que quede firme el enrollado.
Por otro lado, se corta el cuadro de gasa adecuado al tamao requerido y se amarra con pabilo
fuerte, luego probar que no caiga hacia dentro del tubo.
B. PREPARACIN PARA LA ELABORACIN DE LOS GORROS:
Para tener una base para el clculo del gorro tenemos que cortar un cuadrado de 30 X 30 cm
aproximadamente de papel Kraff, se obtiene un gorro adecuado para tapar un matraz de 500 ml.
Pasos:
Se dobla el papel por la mitad el cuadrado y se obtendr un rectngulo vuelva a doblar y ser un
cuadrado con 4 puntas. Luego se doblan las puntas de encima de ambas caras (superior e inferior) y
las puntas restantes (medio) se doblan dentro de la cavidad que qued al doblar las primeras
puntas. Finalmente se abre el gorro, se coloca encima de la boca del matraz, cubriendo el tapn y
se asegura con pabilo por encima.
C. PREPARACIN Y ENVOLTURAS DE PIPETAS:
Se lavan perfectamente con agua y detergente. Se enjuaga con la pizeta de agua destilada.
Se coloca un pequeo tapn de gasa o
algodn en la boquilla de la pipeta
dejando un trozo libre para que el
taponcito no se quede perdido dentro
de la pipeta, Este tapn tiene una
doble funcin, una es para evitar que
en un descuido de succin forzada,
por. obstruccin de la pipeta, ingiera el
alumno el producto succionado al
destaparse bruscamente, y1a segunda
razn es para evitar que por la boquilla
de succin entren microorganismos
que alteren el trabajo realizado.
Se corta una tira de papel crack de
aproximadamente 5 cm de ancho y 30
cm de largo.
Se dobla el extremo inferior
aproximadamente 2 cm. Se coloca la
pipeta con la punta a la mitad del
doblez anterior y con un ngulo de
aproximadamente 25 - 30 grados de
inclinacin con respecto a la posicin
del papel crack. Se le hace un segundo
doblez, tapando la punta de la pipeta
con la porcin de papel que sobresale
a la punta de la pipeta. Se le hace un
tercer doblez a la punta de la pipeta
que queda en el ngulo de inclinacin.
Se d vuelta a la pipeta procurando
que el papel vaya envolvindola en
forma de espiral. Verificar que el
enrollado no quede flojo, en caso de
estarlo, reafirmar el papel con respecto
a la forma de la pipeta. En la parte
superior, doblar hacia abajo el papel sobresaliente.
Cubrir con cinta adhesiva dicho doblez.

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Rotular indicando el volumen de la pipeta.
D. PROCEDIMIENTO PARA LA ENVOLTURA DE PLACAS PETRI:
Al utilizar placas Petri en los cultivos microbianos, tienen que ser esterilizadas para poder vaciar
dichos medios de cultivo que servirn de nutriente a los microorganismos tratados. Estas placas se
pueden esterilizar por calor hmedo o calor seco, siendo ms recomendable el calor seco, por ser
ms confiable su efectividad.
Es necesario envolver placas Petri antes de esterilizarlas para evitar que al trmino de la
esterilizacin estn expuestas al medio ambiente y se contaminen, de nuevo.

Para esterilizarlas se puede utilizar un recipiente cilndrico de metal o envolvindolas en papel
Kraff.
La manera de envolver las placas se describe a continuacin: Se corta un cuadrado de papel
Kraff de aproximadamente 20 X 20 cm, se coloca una de las tapas en el centro y se lleva las
puntas hacia el centro, presionando para reducir el volumen del papel.
E. A LOS FRASCOS TAMBIN COLOCAR TAPONES DE CORCHO O CON GASA Y SE CUBRE
CON PAPEL.
F. OTROS MATERIALES DE VIDRIO SE TAPONAN CON ALGODN O PAPEL ALUMINIO Y SE
CUBREN CON PAPEL KRAFF.
G. EL INSTRUMENTAL TAMBIN SE ENVUELVE CON PAPEL ALUMINIO O PAPEL KRAFF.
II ESTERILIZACIN FSICA.
A. POR CALOR SECO:
1. Esterilizar a la llama directa de un mechero. Es en forma breve y temporal. Se esteriliza asas
microbiolgicas u otro material que contenga directamente material biolgico.
2. Esterilizar por aire caliente, utilizando una estufa u horno de esterilizacin, se realiza a una
temperatura de 165 - 170 C durante media hora. Se esteriliza material de vidrio, porcelana,
instrumental.
B. POR CALOR HMEDO:
1. Autoclavar a 121 'C durante 15 minutos y a presin superior a la atmosfrica (15 libras de presin).
Se pueden esterilizar material de vidrio, medios de cultivo, material biolgico.
2. Esterilizar el instrumental utilizando un recipiente con agua en ebullicin.
C. POR FILTRACIN: Se realiza para medios lquidos, los microorganismos y micelas orgnicas son
retenidas en el papel filtro o gasa.
D. POR CENTRIFUGACIN: Se puede emplear previo a la filtracin, separa los grmenes del lquido en
que se encuentran suspendidos.
III ESTERILIZACIN QUMICA.
1. Pasar un algodn o gasa empapado de alcohol, alcohol yodado. fenol o isodine sobre toda la superficie
del instrumental.
2. Alternativamente, remojar por 20 minutos el material biolgico o instrumental en hipoclorito de sodio al
5%, luego enjuagar en agua destilada por tres veces.

- 23 -
ACTIVIDADES:
1. Explique el fundamento de cada uno de los tipos de esterilizacin.
2. Describa el efecto sobre los microorganismos de cada uno de los tipos de esterilizacin.
CUESTIONARIO:
1. Qu mtodo de esterilizacin utilizara para desinfectar su instrumental si se encuentra en alejado de la
ciudad?.
2. Cul es la diferencia entre los mtodos de ebullicin y autoclavado?.
3. Qu sustancia qumica es ms eficiente para la desinfeccin de tejidos vivos?.
4. Qu es un desinfectante, cul es su mecanismo, y cul es su importancia en el laboratorio de
microbiologa?
5. Cules son los diferentes efectos que se producen sobre los microorganismos sometidos a procesos de
esterilizacin?
6. En qu lugares se aplica la esterilizacin con luz ultravioleta? Qu cuidados debe tenerse en cuenta con
el empleo de la luz ultravioleta?
7. Qu tipo de materiales se deben esterilizar con filtros?
8. Cul es la diferencia entre esterilizacin, desinfeccin y asepsia?
9. Cules son los efectos nocivos que provocan los desinfectantes sobre los microorganismos?
10. Cules son las condiciones ptimas de esterilizacin por calor hmedo?, se pueden modificar estos
parmetros, sin afectar la eficacia de la esterilizacin. Explica cmo.

- 24 -
PRACTICA 4
TOMA Y TRANSPORTE DE MUESTRAS
MICROBIOLOGICAS
INTRODUCCION.
Las funciones ms importantes del laboratorio de Microbiologa Clnica Medica son examinar y cultivar
muestras en busca de microorganismos, identificar con certeza especies involucradas en aislamientos
importantes y llevar a cabo las pruebas de susceptibilidad a antibiticos en caso de ser indicadas.
CICLO DIAGNOSTICO. En el siguiente cuadro se muestra el ciclo de diagnostico microbiolgico.
Paciente consulta al medico con
signos/sintomas de enfermedad
infecciosa
El medico examina al paciente y
formula un diagnostico clnico
presuntivo
El medico interpreta el informe e
instaura la terapia apropiada
La muestra apropiada es tomada
para cultivo. Todos los recipientes
son rotulado correctamente
Se prepara el informe final y se
envia al medico tratante
Al recibir la muestra en el
laboratorio, se transcriben los
datos a un libro de registro o
computadora
Se examina los subcultivos y
resultados de los sistemas de
identificacion
La muestra es examinada
directamente. Pueden prepararse
o no montajes para microscopio,
extendidos y tinciones
Luego de la incubacin, los
cultivos son examinados. Se
preparan sistemas de
identificacin definitiva
Las muestras son procesadas.
Los medios de cultivo son
seleccionados, inoculados e
incubados

I TOMA DE MUESTRA:
La toma apropiada de una muestra para cultivo es posiblemente el paso ms importante en la
confirmacin final de que un microorganismo es responsable de un proceso de enfermedad infecciosa.
Una muestra mal tomada no solo puede resultar en la recoleccin fallida de microorganismos
importantes, sino tambin conducir a una terapia equivocada y aun daina si el tratamiento es dirigido
hacia un comensal o contaminante.
Se debe tomar en cuenta las siguientes consideraciones para la toma de muestras:

- 25 -
1. La muestra debe ser de material del sitio real de infeccin, y tiene que ser tomada con el mnimo de
contaminacin de los tejidos, rganos o secreciones adyacentes.
2. Debe establecerse los momentos ptimos para la toma de muestras, a fin de contar con las mejores
oportunidades de recuperacin de microorganismos causantes de enfermedad. El conocimiento de la
historia natural de la enfermedad y de la fisiopatologa del proceso de enfermedad infecciosa es
importante para la determinacin del momento ptimo de recoleccin de la muestra.
3. Debe obtenerse una cantidad de muestra suficiente para llevar a cabo las tcnicas de cultivo
solicitadas.
4. Debe utilizarse una serie adecuada de dispositivos de recuperacin, envases para muestras y medios
de cultivo. Para la toma de la mayora de muestras deberan usarse recipientes de cultivo. Tambin es
importante que el recipiente facilite la toma, particularmente si el paciente debe obtener su propia
muestra. Ejemplo botellas de boca ancha para muestras de esputo y orina. Los recipientes deben tener
tapas hermticas para evitar derrames o contaminaciones durante el transporte.
5. Siempre que sea posible obtener los cultivos antes de la administracin de antibiticos.
6. El recipiente de cultivo debe estar adecuadamente rotulado.

1. TOMA DE MUESTRAS DE FARINGE: La faringitis aguda es la infeccin ms comn del tracto
respiratorio superior. Entre las causas ms comunes deben considerarse los estreptococos, los virus y la
difteria. Para obtener la muestra de hisopado de garganta debe enfocarse en la cavidad oral una luz
brillante por encima del hombro del que toma la muestra de modo que el hisopo pueda guiarse a la
faringe posterior y el rea amigdalina. Se indica al paciente que incline la cabeza hacia atrs y que
respire profundamente. La lengua se baja con una esptula (bajalengua) para lengua para visualizar la
fosa amigdalina y la faringe posterior. El hisopo se extiende entre los pilares tonsilares y debajo de la
vula. Se debe tener cuidado para no tocar las paredes laterales de la cavidad bucal o de la lengua y as
minimizar contaminaciones con bacterias comensales. Un largo "ah" producido por el paciente sirve para
elevar la vula y evitar nuseas. El rea amigdalina y faringe posterior deben ser frotadas con firmeza
con el hisopo. As mismo, es preciso un muestreo de cualquier exudado purulento.
2. MUESTRAS NASOFARNGEAS: Se obtienen por observacin directa usando iluminacin por encima del
hombro. Con el pulgar de la mano, se eleva delicadamente la punta de la nariz. Se humedece la punta de
un hisopo nasofarngeo con agua o solucin salina estril y se lo inserta con suavidad en uno de los
orificios nasales. El hisopo se gua hacia atrs y hacia arriba a lo largo del septo hasta encontrar
resistencia, que indica que se ha llegado a la faringe posterior. El hisopo se retira con delicadeza.

INFECCIONES DEL TRACTO RESPIRATORIO INFERIOR.
MUESTRAS DE ESPUTO: Inmediatamente antes de obtener la muestra de esputo el paciente debe lavar
sus dientes y garganta con agua, para reducir el nmero de bacterias contaminantes de la orofarnge o
bucofarnge. Deben obtenerse las muestras de esputo temprano por la maana, porque ellas contienen el
conjunto de las secreciones de la noche. Pueden utilizarse frascos de boca ancha con tapas hermticas a
rosca. Se le indicar al paciente que presione el reborde del recipiente debajo del labio inferior para tomar la
muestra de tos expectorada.

- 26 -

II TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS:
El objetivo primario en el transporte de muestras de diagnstico, es mantener la muestra tan prxima a su
estado original como sea posible, con deterioro mnimo y minimizando el riesgo que afrontan quienes
transportan la muestra, mediante el uso de recipientes hermticamente cerrados.
La mayor parte de muestras liquidas deben ser transportadas al laboratorio hasta un mximo de 2 horas.
El medio de transporte Carey-Blair es uno de los ms usados, este medio es esencialmente una solucin
de tampones con carbohidratos, peptonas y otros nutrientes, con exclusin de factores de crecimiento, y
han sido planeados para preservar la viabilidad de las bacterias durante el transporte sin permitir la
multiplicacin.
TECNICAS DE COLORACIN.
TINCIONES: Generalmente se requieren tinciones biolgicas para visualizar bacterias en forma
adecuada y poner en evidencia las estructuras externas e internas. Segn Erhlich los colorantes pueden
ser:
1. cidos: Que tienen la parte acida coloreada y la bsica incolora, tienen afinidad por los elementos
protoplasmticos (bsicos) de la clula. Ejemplo: eosina, fluorescencia, fucsina acida, etc.
2. Bsicos: Tienen la parte bsica coloreada y la parte acida incolora, son muy usados en bacteriologa
pues los microorganismos estn constituidos en gran parte por compuestos cidos de sustancia
nuclear. Ejemplo: violeta de genciana, safranina, fucsina bsica, azul de metileno, verde de malaquita,
etc.
MTODOS DE COLORACIN:
1. SIMPLES: Emplean un solo colorante y se aplican en una sola operacin. Se usan para apreciar
morfologa.
Coloracin Azul de Metileno o Safranina:
a. Hacer el frotis: Si la muestra el liquida se coloca sobre el portaobjetos y si es slida entonces colocar
primero sobre el porta una gota de agua.
b. Fijar a la llama.
c. Cubrir la preparacin con solucin acuosa al 3% de Azul de Metileno, durante 5 minutos.
d. Lavar con agua y secar a la llama.
e. Observar con objetivo de inmersin.
2. COMPUESTOS: Intervienen 2 o ms colorantes y se efecta en varios tiempos.
a. Coloracin de Gram: Descubierta por Hans Christian Gram, se usa para el examen microscpico
directo de muestras y subcultivos. El procedimiento es el siguiente:
Hacer un delgado extendido del material para estudio, y permitir que seque al aire (si la muestra

- 27 -
el liquida se coloca sobre el portaobjetos y si es slida entonces colocar primero sobre el porta
una gota de agua).
Fijar el material al portaobjeto, pasndolo 3 o 4 veces a travs de la llama de un mechero de
Bunsen, de modo que el material no se lave durante la tincin.
Colocar el extendido en una bandeja o rejilla para teido, y cubrir la superficie con solucin de
cristal violeta o violeta de genciana.
Luego de un minuto lavar con agua destilada.
Cubrir con lugol durante 2 minutos. Lavar nuevamente con agua.
Cubrir con alcohol cetona al 95% por 10 segundos o hasta que no se arrastre ms violeta.
Lavar y cubrir son safranina en solucin acuosa al 0.75% durante un minuto. Lavar.
Dejar secar al aire libre y observar al microscopio con objetivo de inmersin.
b. Coloracin Alcohol-cido: Las micobacterias estn cubiertas por material grueso, seroso, que
resiste la tincin; no obstante una vez que se tien las paredes celulares bacterianas resisten la
decoloracin por solventes orgnicos fuertes, como el alcohol-cido. Consecuentemente dichas
bacterias son conocidas como resistentes al cido, un fenmeno descubierto por Ziehl y Neelsen en
1881.
Para que la carbolfucsina penetre en el material ceroso de los bacilos resistentes al cido se utiliza
calor. El procedimiento es el siguiente:
Hacer frotis y fijar al calor.
Cubrirlo con fucsina fenicada de Ziehl, y calentar suavemente hasta emisin de vapores blancos,
repetir la operacin dos o tres veces ms, mantener as durante 5 minutos. Restituir el colorante
evaporado y evitar que se seque sobre la preparacin.
Lavar con agua corriente.
Decolorar con alcohol de 95 ms 3% de cido clorhdrico (alcohol-cido) hasta que la
preparacin quede incolora. Lavar.
Teir con Azul de Metileno 30 segundos. Lavar.
Secar. Examinar con inmersin.
PROCEDIMIENTO:
Tomar la muestra del paciente, segn las indicaciones del cuadro de abajo. Prepare su mesa de trabajo
con todos los instrumentos y materiales que necesita. Recuerde mantener las medidas de bioseguridad e
higiene.
MUESTRA
INSTRUMENTO DE
MUESTREO
ENJUAGUE AGUA FROTIS FIJACION
Mucosa Farngea Hisopo No Si Si Si
Mucosa oral Hisopo Si Si Si Si
Dorso de la lengua Baja lenguas Si Si Si Si
Superficie dental Hisopo Si Si Si Si
Superficie interdental Punta de papel Si Si Si Si
Surco gingival Punta de papel Si Si Si Si
Saliva Asa microbiolgica No No Si Si
Agua estancada Asa microbiolgica No No Si Si


- 28 -

Coloracin GRAM


- 29 -
ACTIVIDADES: Siga los procedimientos de coloracin simple y gram, segn se le indique, con cada
una de las muestras tomadas.

Dibuje la mucosa farngea

Muestra :..
Coloracin :..
Aumento :
Observacin :

Dibuje la mucosa oral

Muestra :
Coloracin :
Aumento :
Observacin :


- 30 -
Dibuje el dorso de la lengua

Muestra :
Coloracin :
Aumento :
Observacin :

Dibuje la superficie dental.

Muestra :
Coloracin :
Aumento :
Observacin :


- 31 -
Dibuje el surco interdental

Muestra :
Coloracin :
Aumento :
Observacin :

Dibuje el de surco gingival

Muestra :
Coloracin :
Aumento :
Observacin :


- 32 -

Muestra : Muestra :
Coloracin : Coloracin :
Aumento : Aumento :
Observacin : Observacin :

CUESTIONARIO:
1. Refirase a las diferentes causas que pueden afectar la representatividad de una muestra.
2. Qu implicaciones puede tener la demora en la realizacin de la siembra?
3. Explique los diferentes mtodos empleados para la conservacin de las muestras.
4. Qu importancia tiene para usted, la cantidad de muestra a tomar?
5. En qu momento se debe tomar la muestra?
6. Qu indicaciones le dara al paciente para recolectar una muestra de esputo con calidad?
7. Mencione dos ventajas y dos desventajas de las coloraciones compuestas.
8. Explique el fundamento de la coloracin de Gram. Haga un dibujo del paso a paso.


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PRACTICA 5
MEDIOS DE CULTIVO
INTRODUCCION.
Gran parte de la microbiologa depende de la capacidad de cultivar y mantener microorganismos en un
laboratorio, y esto solo es posible si se dispone de los medios de cultivo adecuados.
Adems, los medios especiales son imprescindibles para aislar e identificar los microorganismos, evaluar la
sensibilidad a los antibiticos, analizar el agua y los alimentos, en la microbiologa industrial y en muchas
otras actividades.
MEDIO DE CULTIVO: Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y
otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. La
diversidad metablica de los microorganismos es enorme; por ello la variedad de medios de cultivo es
grande, no existiendo un medio de cultivo universal adecuado para todos ellos.
Un medio de cultivo debe contener en forma asimilable: nitrgeno y protenas (peptonas), lpidos, hidratos
de carbono, distintas sales minerales, factores de crecimiento (ej. vitaminas, sangre, etc), agua, extractos de
carne o levadura agentes solidificantes (agar o gelatina).
CLASIFICACION.
I TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO POR SU CONSISTENCIA: Los medios de cultivo pueden ser:
A. Lquidos.
B. Slidos o semislidos.
Los medios slidos o semislidos pueden contener los mismos ingredientes que los medios lquidos, pero
poseen adems agentes solidificantes que pueden ser agar, gelatina o slica gel.
a. El agar proviene de las algas rojas Gelidium, Gracilaria, Acanthopeltis, Ceratium y Pterocladia y
qumicamente es un polmero de azcares que posee interesantes propiedades que lo hacen ideal
para el cultivo de una gran variedad de microorganismos. Se funde a altas temperaturas (87C) y
solidifica a 40- 45C. Adems no es degradado por la mayora de las bacterias. Se usa a una
concentracin del 1.5-2%.
b. La gelatina tiene el inconveniente de que se lica a temperaturas relativamente bajas y muchos
microorganismos la utilizan como fuente de carbono y nitrgeno. Se utiliza a una concentracin del 5-
10%.
c. La slica gel se emplea para algunos microorganismos que se inhiben en presencia de agar.
II TIPOS DE MEDIO DE CULTIVO POR SU USO:
A. COMUNES: Medios que permiten el crecimiento de un amplio espectro de microorganismos.
a. Medio sinttico: Son los medios que contienen una composicin qumica definida cuali y
cuantitativamente. Se utilizan para el estudio de requerimientos nutricionales y para obtener
resultados reproducibles.
b. Medio mnimo: Son los medios que presentan la mnima cantidad de nutrientes capaz de permitir el
desarrollo de los microorganismos.
c. Medio complejo: Medios que contienen nutrientes de composicin qumica variable o no
establecida. Son mezclas complejas y poco definidas de sustancias. Se forman a partir de extractos
animales, vegetales, etc. Se utilizan cuando se necesita obtener una amplia gama de
microorganismos.
B. MEJORADOS O ESPECIALES: Aquel que permite el crecimiento de un determinado tipo e
microorganismos que nos permite diferenciar ciertas cualidades de los microorganismos.
a. Medio enriquecido: Medio que tiene un gran exceso de nutrientes y se utiliza para
microorganismos que tienen grandes exigencias nutricionales. Ejemplo: Agar chocolate (ACHO),

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Agar sangre (PAS) (permite visualizar la sntesis de hemolisinas), Agar cerebro-corazn (BHI),
etc.
b. Medio selectivo: Medio que slo permite el crecimiento de un grupo o tipo de microorganismos e
inhibe el de otros. Permite seleccionar y aislar microorganismos a partir de poblaciones mixtas.
Ejemplo SS (shigella y salmonella), Agar Mac Conkey, Agar Chapman (permite el crecimiento de
ciertos Staphilococcus).
c. Medio diferencial: Medio que permite revelar caractersticas fisiolgicas de los microorganismos.
Levine o EMB (permite visualizar la fermentacin de lactosa por viraje de un indicador cido-
base).
d. Medio selectivo-diferencial: Permite conocer las caractersticas culturales y fisiolgicas de un
determinado microorganismo como EMB (agar eosina azul de metileno).
III PROCESAMIENTO DE LOS CULTIVOS:
Una vez que una muestra para cultivo ha sido recibida, deben tomarse las siguientes decisiones claves
para recuperar e identificar los microorganismos que puedan estar presentes:
1. Seleccionar el medio de cultivo primario adecuado para el tipo de muestra en particular.
2. Determinar la temperatura y la atmsfera de incubacin, para recuperar todos los microorganismos
potencialmente significativos.
3. Determinar cul de los aislamientos recuperados en el medio primario requiere una caracterizacin
posterior.
4. Determinar si se requieren pruebas de susceptibilidad antimicrobianos, una vez que se ha identificado
al organismo.
La decisin de hasta dnde hay que procesar los cultivos de muestras individuales debe estar basada en
un profundo conocimiento de las relaciones husped-parsito que se aplique a cada caso.
SELECCIN DE MEDIOS PARA EL CULTIVO PRIMARIO:
La inoculacin en caldos de cultivo debera estar limitada slo a aqullas muestras, como las de lquidos
corporales, las biopsias puntuales o las aspiraciones profundas de tejido, en que hasta la recuperacin de
unos pocos microorganismos en baja concentracin, o para los cuales es razonable la posibilidad de
recuperar un anaerobio, puede ser significativa.
Los medios pueden ser selectivos o no selectivos. Los no selectivos no presentan inhibidores, y
sustentan el crecimiento de la mayora de los microorganismos. El agar sangre es el medio no selectivo
ms comnmente usado, permite observar hemlisis y brindar una pista para la identificacin presuntiva.
El agar MacConkey es el medio de cultivo selectivo ms comnmente utilizado para inhibir el crecimiento
de organismos Grampositivos.
El caldo de enriquecimiento es utilizado para recuperar microorganismos patgenos de muestras tales
como materia fecal, donde hay elevada concentracin de microorganismos comensales. Por ejemplo E.
coli y otros comensales "entricos" son mantenidos en una prolongada fase de retardo del crecimiento
por los inhibidores del caldo de enriquecimiento, permitiendo que las relativamente pocas clulas
bacterianas de especies de Salmonella y Shigella, entren en una fase logartmica de crecimiento no
inhibida.
OBJETIVOS:
1. Reconocer los requerimientos nutricionales que necesitan los microorganismos para su desarrollo.
2. Prepara un medio de cultivo microbiolgico.
3. Conocer algunos medos de cultivo cuyo uso es frecuente en microbiologa.
MATERIALES:
Medio de cultivo: slidos (agar sangre, MS,
MacConkey, agar cuenta colonias, TSI, LIA,
etc) y lquidos (caldo de selenito, indol,etc)
Placas Petri.
Tubos de Ensayo 10ml con tapones.
Probetas 100, 250ml.
Matraces 100ml, 250ml.
Pipetas de 5 y 10ml.

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Mecheros.
Agar MacConkey Scharlau CEIME (medio
deshidratado).
Agar base Sangre Scharlau CEIME (medio
deshidratado).
Jeringas de 5ml.
Agua destilada.
Balanza y esptula.
Bao Mara.
Cocinilla elctrica.
Termmetro.
Papel crack.
Pabilo.
Lpiz de cera.
Algodn.
Alcohol 70 grados.
Guantes.
Gasas.
Tijera.
Baguetas.
Tiras para medio Ph.
PROCEDIMIENTO:
Preparacin del medio de cultivo deshidratado:
Preparar placas Petri y tubo de cultivo aspticos (lo que el profesor requiera en la prctica).
Pesar el medio de cultivo deshidratado.
Suspender el agar en los ml de agua destilada de acuerdo a lo indicado.
Agitar y calentar hasta ebullicin.
ACTIVIDADES:
A. Reconocer, caracterizar medios slidos y lquidos de uso frecuente, mostrados por el profesor, indicando
que microorganismo crecen en los distintos medios de cultivo.
B. Indicar la frmula de los medios de cultivo.
CUESTIONARIO:
1. Qu medios de cultivo se indican para bacterias anaerobias?
2. Qu medidas de control de calidad se deben de tomar en cuenta para la preparacin de medios de
cultivo?
3. Qu microorganismos especficamente crecen en el medio de agar Mac Conkey?
4. Por qu necesitamos que la hemoglobina se separe del eritrocito en la preparacin del agar chocolate?
5. Indique que medio de cultivo se utiliza para el crecimiento de hongos.
6. Por qu el medio salado manitol cambia a amarillo en presencia de S.aureus?
7. En qu consiste la accin selectiva y diferencial de los medios de cultivo?
8. Haga una lista de 3 medios selectivos y 3 medios diferenciales, explicando para qu grupo o grupos de
microorganismos se emplean.
9. Por qu se omite la glucosa en la formulacin de medios de cultivos de aislamiento primarios como el
Agar EMB o el Agar MacConkey? Qu pasara si no se omitiera este carbohidrato en estos medios?.

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PRACTICA 6
SIEMBRA, RECUENTO Y AISLAMIENTO
DE BACTERIAS
INTRODUCCION.
Para estudiar los diferentes microorganismos, primero se necesita poder cultivarlos en condiciones de
laboratorio para su posterior aislamiento. Generalmente al laboratorio llegan muestras clnicas que
presentan los siguientes inconvenientes:
Las muestras contienen varios tipos de microorganismos, muchos de los cuales son contaminantes.
No existe la suficiente cantidad de microorganismo en la muestra.
Para el cultivo de los microorganismo se realiza la siembra del inculo (cantidad representativa de la
muestras). Que consiste en acondicionar a los microorganismos a un medio de cultivo frtil, de acuerdo a
sus exigencias vitales, para que en condiciones ptimas de temperatura y tiempo de incubacin, puedan
desarrollarse y multiplicarse in Vitro.
Aislamiento: Es la separacin de los microorganismos al estado de pureza a partir de una muestra
problema. Se requiere de un medio slido de gran superficie para que los microorganismos al ser
diseminados sobre el medio generen su progenie (cepa) mediante la formacin de colonias separadas. Si
se aslan especies distintas, cada colonia tendr caractersticas especiales.
Transplante: Es la separacin previa de la cepa a un medio de cultivo adecuado en un tubo, el medio
puede ser liquido o slido. La cepa pura se conserva por subsiguientes transplantes en medios especiales,
para lograr conocer las propiedades culturales y bioqumicas, resultando en la exacta identificacin.
En la primera siembra se obtiene un cultivo mixto primario, del cual se extrae un aislamiento inicial,
seleccionando uno ms colonias para sembrarse en un cultivo secundario para obtener un cultivo puro, y
as realizar la identificacin del microorganismo patgeno.
I SIEMBRA EN PLACA: Siembra por agotamiento:
A. Estra simple: El inoculo se distribuye en un solo plano por todo el medio.

B. Estra Mltiple: Su finalidad es diluir el suficiente inculo en la superficie del medio agariado de
manera que se puedan obtener colonias bacterianas bien aisladas, denominadas unidades formadoras
de colonias (UFC).

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II SIEMBRA EN TUBO: La mayora de medios usados en bacteriologa pertenecen a uno de los
siguientes tipos:
A. Siembra en medio liquido: Los caldos de cultivo en un tubo pueden ser inoculados por el mtodo
siguiente:

B. Siembra por picadura (tubo recto): Se utiliza para la siembra de cultivos semislidos, como por
ejemplo, el medio SIM, que es una prueba que permite la movilidad de las bacterias.

C. Siembra por estra (pico de flauta): Se realiza en medio slido inclinado, es utilizado para conservar
cepa durante largos periodos, as como para la realizacin de ciertas pruebas bioqumicas como la
prueba de la ureasa.
D. Siembra por picadura y estra (pico de flauta): Consiste en unir las dos tcnicas anteriores. Se
realiza cuando el medio es slido e inclinado. Se lleva a cabo en medios tales como el TSA, LIA,
Citrato de Simmons.


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OBJETIVOS:
Adquirir destreza en los diferentes tipos de siembra de microorganismos.
Aprender una tcnica para separar a las bacterias de los dems microorganismos que se encuentran en
una muestra.
Mantener y aislar cepas microbianas de inters clnico.
MATERIALES:
Placas Petri y tubos de ensayo con medios de
cultivo: Agar nutritivo, Agar sangre, Agar
MacConkey, Agar Chocolate.
Probetas 100, 250ml.
Muestras biolgicas: secrecin farngea,
mucosa oral, piel, orina y heces.
Estufa.
Mecheros.
Solucin Salina.
Termmetro.
Lpiz de cera.
Asas microbiolgicas (asas de Kohlle)
Hisopos.
Algodn.
Alcohol 70.
Guantes.
10 tubos de ensayo con la solucin salina
previamente esterilizada.
11 pipetas estriles de 1 ml.
1 bagueta.
6 placas Petri con Agar Cuenta Colonias.
PROCEDIMIENTO:
A. SIEMBRA EN PLACA:
Puede utilizarse asas microbiolgicas o un hisopo para la toma de muestra, si se realizan ms de una
estra, las siguientes se harn con el asa.
Esterilizar previamente el asa a la llama del mechero cada vez que se tome la muestra y se incline una
nueva estra
Evitar romper el medio.
1. Estra simple:
Con el asa de siembra estril se distribuye el inculo por estras en zig-zag, con escasa separacin
de unas a otras (1 a 3mm).

2. Estra Mltiple:
Depositar el inoculo en el extremo superior de la placa extendindose de un lado a otro solo de la
parte superior. Volver a flamear el asa, y sin coger muestras, girar la placa en ngulo de 90, se
repite lo anterior, lo que nos permite arrastrar la muestra desde uno de los bordes donde quedo la
muestra hasta el otro extremo siguiendo la misma direccin, hasta que el ltimo tramo se realizar
hacia el interior de la placa.
Para el recuento semicuantitativo de colonias esparcir la muestra cubriendo toda la superficie del
agar.

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B. SIEMBRA EN TUBOS:
1. Siembra por Picadura: Introducir el asa en e[ medio de cultivo del tubo hasta el fondo de este y en
posicin central.


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2. Siembra por Estra: Se realiza en la parte superficial del medio con movimiento ascendente en zigzag
desde la base hasta la parte superior exterior, sin rasgar el medio.

3. Siembra por Picadura y Estra: Se inocula primero por puncin en profundidad del agar, seguido por
un estriado del pico de flauta desde el fondo hacia la parte superior con un movimiento en S a medida
que se retira el asa.
4. Siembra en medios lquidos: Emulsionar la muestra problema con el asa microbiolgica, y agitar
vigorosamente en inculo en el tubo.
Rotular las placas y tubo sembrados.
Llevar a la estufa a 37C de temperatura durante 24 a 48 horas aproximadamente.

C. AISLAMIENTO DE BACTERIAS:
Lo que se debe hacer para poder aislar las bacterias es; (si es un lquido se agarra 1 ml de la muestra
directamente y si es un slido, se pesa 1 gr y se diluye en agua), con una pipeta estril se toma 1 ml de
la solucin y se vaca en el primer tubo con solucin salina previamente flameada la boca del tubo y en
rea estril, entonces ya se tiene 10ml, luego con otra pipeta a estril se toma 1ml del tubo donde se
agreg la muestra (pura) y se pone en el otro tubo, luego se agarra otra pipeta estril, se destapa el
tubo se flamea la boca del tubo anterior, se agarra 1 ml de la muestra, se tapa, tomas el siguiente tubo
le quitas el tapn y lo flameas. Luego agregara la muestra, este tubo se vuelve a flamear y se vuelve a
tapar de nuevo y as sucesivamente hasta terminar con los 10 tubos.
Una vez que se haya puesto la muestra en los 10 tubos, se seleccionar 3 tubos: el ms diluido, el
menos diluido y uno del medio. Entonces lo que se va hacer es poner las bacterias en las placas Petri
con agar para que crezcan, esto se hace por separado y por duplicado.
Primero se agarra el ms diluido, se toma 0.1 ml de la muestra del tubo y se coloca en la placa Petri, la
varilla de vidrio se remoja en el alcohol y se pasa en la flama, luego se deja que se enfre por 10
segundos y se esparce la muestra por toda la placa, luego se agarra el tubo de en medio y se toma 0.1
ml de la muestras, se coloca en la placa Petri y se realiza el mismo procedimiento con la varilla de
vidrio y despus se esparce por toda la placa. Por ltimo se toma el tubo que tiene ms muestra de los
tres, se agarra 0.1 ml de la muestra y se la pone en la placa Petri, se agarra la varilla de vidrio y se
esparce pro toda la placa.

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Una vez terminado el trabajo, se flamea muy bien la varilla de vidrio, se envuelven las placas con papel
crack y se guarda en la estufa para esperar que crezcan las bacterias.

D. RECUENTO DE UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS:
Para el recuento de las unidades formadoras de colonias (UFC) elegimos la primera placa que se
supone que es la menos diluida, debe haber ms colonias de bacterias que en las otras dos placas.
En los cultivos procedentes de las otras diluciones aparecen muchsimas colonias.
El recuento tenemos que multiplicar por el factor de dilucin, por la cantidad de diluciones. Por
Ejemplo: 30 colonias, 10 diluciones y se estudio el tubo ms diluido 10
10

30 x 10 x 10
10
= esto nos da la cantidad de clulas viables por mililitro de solucin.
ACTIVIDADES:
Complete las tablas para la lectura de medios de cultivo lquido.
CALDO PEPTONADO
CARACTERISTICA TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4 TUBO 5 TUBO 6
Nombre del medio

Fecha

Muestra

Superficie

Turbidez

Sedimento

Color


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CALDO GLICOLATO
CARACTERISTICA TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4 TUBO 5 TUBO 6
Nombre del medio

Fecha

Muestra

Superficie

Turbidez

Sedimento

Color

Complete las tablas para la lectura de las colonias en los medios de cultivo.
CODIGO DE LA PLACA:

Medio de cultivo Hemlisis

Color de la colonia Tamao de la colonia

Luz trasmitida Margen

Superficie Elevacin

Forma Presencia de ncleo

Prueba de la catalasa Viscosidad

BACTERIA O GRUPO BACTERIANO

CODIGO DE LA PLACA:




Superficie Elevacin




CODIGO DE LA PLACA:




Superficie Elevacin





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CODIGO DE LA PLACA:




Superficie Elevacin




CODIGO DE LA PLACA:




Superficie Elevacin




CODIGO DE LA PLACA:




Superficie Elevacin




Esquematizar los procedimientos y los resultados.


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CUESTIONARIO:
1. Qu es una cepa?
2. Cmo es el asa de Digarsky y para qu sirve?
3. Para qu se emplea agar SIM?
4. Cmo se interpreta los resultados de un cultivo?
5. Cmo se interpreta los resultados de un cultivo?
6. Se obtendra el mismo resultado si cuantificramos las bacterias de una muestra por siembra en
superficie y siembra en profundidad?
7. Se toman 2.5 g de tierra y se re suspenden en solucin salina estril hasta un volumen final de 50 ml. A
continuacin, se hacen diluciones decimales y se siembran 0.2 ml de cada una sobre un medio
adecuado. Tras la incubacin, en la placa de la dilucin 10-6 crecen 200 colonias. Calcule el nmero
probable de UFC por gramo de tierra
8. Por qu deben realizarse varios pases de una colonia antes de su identificacin?
9. Por qu los microorganismos presentan diferencias morfolgicas al ser sembradas en diferentes medios
teniendo en cuenta los medios que sembr cada grupo?


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PROTOCOLO DE SIEMBRAS DE CULTIVO
MUESTRA
AGAR
MAC
CONKEY
AGAR
SANGRE
(PAS)
AGAR
MANITOL
SALADO
AGAR
TIOGLICOLATO
AGAR
CHOCOLATE
(ACHO)
CALDO
SELENITO
CALDO
CEREBRO
CORAZON
(BHI)
AGAR
SABORAUND
UROCULTIVO X X
ESPERMOCULTIVO X X X X X
COPROCULTIVO X X
LIQUIDO
CEFALORRAQUIDEO
X X X X X X X
LIQ. PERITONEAL X X X X X
LIQ. ASCITICO X X X X X
LIQ. SINOVIAL X X X X X
LIQ. PLEURAL X X X X X
ABSCESO ABDOMINAL X X X X X
SEC. FARINGEA X X X
SEC. OCULAR X X X X X X
SEC. OTICA X X X X X X
SEC. URETRAL X X X X
SEC. PROSTATICA X X X X
SEC. VAGINAL X X X X X X
SEC. BILIAR X X X X X
SEC. TRACTO
RESPIRATORIO
(ESPUTO, ASPIRADOS
BRONQUIALES)
X X X
SEC. HERIDA X X X X
PUNTA CATETER
VENOSO CENTRAL
X X X X X
PUNTA SONDA
VESICAL
X X X X X

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PRACTICA 7

ACCION DE LOS ANTIBIOTICOS SOBRE
EL CRECIMIENTO BACTERIANO:
ANTIBIOGRAMA
PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA.
Los agentes quimioterpicos han demostrado inhibir y detener el crecimiento de las bacterias, sin embargo
ellas han desarrollado la capacidad de resistencia a esos frmacos. Cuando se selecciona un agente
antimicrobiano para la terapia, se debe tener en cuenta las caractersticas farmacolgicas de varias drogas,
as como ver el efecto antimicrobiano relativo; para lo cual debe proveerse de la informacin de laboratorio,
a travs de pruebas in vitro estandarizadas. Los resultados de las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana
in vitro tienen valor para seleccionar los agentes quimioterpicos activos contra el germen causal. Existen 3
mtodos para este tipo de prueba:
1. Pruebas de difusin , mtodo ms ampliamente usado, da resultados cualitativos
2. Pruebas de dilucin, da informacin adems cuantitativa, pero su interpretacin es mas compleja y no se
puede realizar de muestras directas.
3. Pruebas automatizadas, facilita su ejecucin y lectura, pero es de mayor costo.
PRUEBA DE DIFUSIN: ANTIBIOGRAMA
Utiliza los principios de difusin del agar, en la que los microorganismos son categorizados como
resistentes, intermedios o susceptibles para cada antibitico. Estos agentes antimicrobianos son
comnmente aplicados a las placas de prueba en discos de papel filtro seco. Cuando el disco es aplicado
en la superficie inoculada, estos discos absorben el agua del medio de agar, disolviendo as la droga. Segn
la difusin del antibitico progrese, tambin procede la multiplicacin antimicrobiana. No aparecer
crecimiento en la zona donde la droga ejerza su accin.


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OBJETIVOS:
1. Demostrar "in vitro" la sensibilidad de las bacterias frente a los antibiticos.
2. Interpretar los resultados del antibiograma, ayudndose con una tabla de estndares de las zonas de
dimetro de difusin.
3. Conocer la importancia de las pruebas de susceptibilidad a antibiticos de bacterias infectantes.
MATERIALES:
Placas de cultivo primario en medio agar
McConkey.
Placas de cultivo con medio agar sangre.
Discos de sensibilidad.
Amoxicilina (25 ug).
Ampicilina (25 ug).
Dicloxacilina (10 ug).
Estreptomicina (10 ug).
Gentamicina (10 ug).
Triometropin + Sulfametoxazol (25 ug).
Estufa.
Hisopos.
Pinzas.
Pipetas 1 ml.
Tubos de ensayo pequeos.
Mechero.
Alcohol etlico.
Agua destilada.
Papel toalla.
Jabn, detergente, cepillo secador.
Lpiz de cera.
Tabla de lectura de estndares de
interpretacin de la zona de dimetro para
antibiograma.
PROCEDIMIENTO:
Pruebas de difusin antimicrobiana: antibiograma.
1. Siembra de la muestra:
a. Directa:
Tomar una muestra farngea.
Sembrar en una placa de agar sangre.
Aplicar los discos de sensibilidad en forma equidistante.
Rotular y colocar en la estufa a 37 C por 6 a 24 horas.
b. De un cultivo primario:
Tomar una colonia de una placa de agar McConkey.
Sembrarla en una placa de agar Mueller Hinton.
Aplicar lo discos de sensibilidad en forma equidistante.
Rotular y colocar en la estufa a 37C por 6 a 24 horas.
2. Lectura e interpretacin de resultados:
Medir el dimetro de la zona para cada antibitico.
Interpretar con la ayuda de una tabla estandarizada de la zona de dimetro.
ACTIVIDADES:
1. Esquematizar y rotular la zona para cada antibitico.
2. Colocar los resultados en una tabla.
3. Explicar cada resultado.
CUESTIONARIO:
1. Cul es el espectro de accin de la amoxicilina?
2. Cul es el espectro de accin de la gentamicina?
3. Los antibiticos con lectura intermedia Se deben aplicar en un tratamiento?
4. La dinmica del antimicrobiano frente al germen es la misma in vitro que en nuestros organismos de qu
depende?

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ANTIBIOTICOS Y DIAMETROS CRITICOS PARA ENTEROBACTERIAS
A N T I M I C R O B I A N O
CONTENIDO
DEL DISCO
D I A M E T R O E N mm.
R I S
PENICILINAS
Ampicilina = Amoxicilina 10 g 13 14 16 17
CEFALOSPORINA
Cefalotina 30 g 14 15 17 18
Cefuroxima axetil (oral) 30 g 14 15 22 23
Cefuroxima sodium (parenteral) 30 g 14 15 17 18
Cefoxitina 30 g 14 15 17 18
Cefotaxima 30 g 14 15 22 23
Ceftriaxona 30 g 13 14 20 21
Ceftazidima 30 g 14 15 17 18
Cefixima 5 g 15 16 18 19
Cefpirome 30 g 14 15 17 18
Cefepime 30 g 14 15 17 18
LACTAMICOS / INHIBIDOR DE BETALACTAMASA
Ampicilina / Sulbactam 10 / 10 g 11 12 14 15
Amoxicilina / Acido Clavulanico 20 / 10 g 13 14 17 18
Cefoperazona / sulbactam + 75 / 30 g 15 16 20 21
MONOBACTAMS
Aztreonam 30 g 15 16 21 22
CARBAPENEMS
Imipenem 10 g 13 14 15 16
Meropenem 10 g 13 14 15 15
AMINOGLUCOSIDOS
Gentamicina 10 g 12 13 14 15
Amikacina 30 g 14 15 16 17
QUINOLONAS
Acido nalidixico 30 g 13 14 18 19
Norfloxacina 10 g 12 13 16 17
Ciprofloxacina 5 g 15 16 20 21
Ofloxacina 5 g 12 13 15 16
TETRACICLINA
Tetraciclina 30 g 14 15 18 19
OTROS
Cloramfenicol 30 g 12 13 17 18
Trimetoprim / Sulfametoxasol 1,25/23,75 g 10 11 15 16


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ANTIBIOTICOS Y DIAMETROS CRITICOS PARA Staphylococcus spp.
CONTENIDO
DEL DISCO
R I S
PENICILINAS
Penicilinas 10 U 28 29
S aureus:
Oxacilina 1 ug 10 11 12 13
Cafoxitina 30 ug 21 22
S. cuagulasa negativos
Oxacilina 1 ug 17 18
Cafoxitina 30 ug 24 25
GLICOPEPTIDOS
Vancomicina 30 ug - - 15
Teicoplanina 30 ug 10 11 - 13 14
AMINOGLUCOSIDOS
Gentamicina 10 ug 12 13 14 15
Amikacina 30 ug 14 15 16 17
Kanamicina 10 ug 13 14 - 17 18
Tobramicina 10 ug 12 13 - 14 15
MACROLIDOS
Eritromicina 15 ug 13 14 - 22 23
Azitromicina 15 ug 13 14 17 18
Claritromicina 15 ug 13 14 - 17 18
FLUOROQUINOLONAS
Norfloxacina 10 ug 12 13 - 16 17
Ciprofloxacina 5 ug 15 16 - 20 21
Levofloxacina 5 ug 15 16 - 18 19
Ofloxacina 5 ug 14 15 - 17 18
Moxifloxacina 5 ug 20 21 - 23 24
NITROFURANTOINAS
Nitrofurantoina 300 ug 14 15 - 16 17
LINCOSAMIDAS
Clindamicina 2 ug 14 15 - 20 21
INHIBIDORES DE LA VIA DE LOS FOLATOS
Trimetoprim / sulfametoxasol 1,25/23,75 g 10 11 15 16
FENICOLES
Cloramfenicol 30 ug 12 13 17 18
ANSIMICINAS
Rifampicina 5 ug 16 17 19 20
ESTREPTOGRAMINAS
Quinupristina / dalfopristina 15 ug 15 16 18 19
OXAZOLIDINONAS
Linezolid 30 ug 20 21


- 52 -
ANTIBIOTICOS Y DIAMETROS CRITICOS PARA
Streptococcus pneumoniae.
CONTENIDO
DEL DISCO
R I S
PENICILINAS
Oxacilina 1 ug - - 20
GLICOPEPTIDOS
MACROLIDOS
Eritromicina 15 ug 15 16 20 21
TETRACICLINAS
Tetraciclina 30 ug 18 19 - 22 23
FLUOROQUINOLONAS
Levofloxacina 5 ug 13 14 16 17
Moxifloxacina 5 ug 14 15 17 18
INHIBIDORES DE LA VIA DE LOS FOLATOS
Trimetoprim / sulfametoxasol 1,25/23,75 g 15 16 18 19
LINCOSAMIDAS
FENICOLES
Cloramfenicol 30 ug 20 - 21
ANSIMICINAS
Rifampicina 5 ug 16 17 18 19
OXAZOLIDINONAS
Linezolid 30 ug - 21


- 53 -
Streptococcus spp. - hemolticos.
CONTENIDO
DEL DISCO
R I S
PENICILINAS
Ampicilina 10 ug - - 24
Penicilina 10 U - - 24
CEFALOSPORINAS DE USO PARENTERAL
Cefotaxima 30 ug - - 24
Ceftriaxona 30 ug - - 24
Cefepime 30 ug - - 24
GLICOPEPTIDOS
MACROLIDOS
TETRACICLINAS
FLUOROQUINOLONAS
FENICOLES
Cloramfenicol 30 ug 17 18 - 20 21
LINCOSAMIDAS
OXAZOLIDINONAS
Linezolid 30 ug - 21


- 54 -
Streptococcus spp. GRUPO Viridans.
CONTENIDO
DEL DISCO
R I S
CEFALOSPORINAS DE USO PARENTERAL
Cefotaxima (viridans) 30 ug 25 26 - 27 28
Ceftriaxona 30 ug 24 25 - 26 27
Cefepime 30 ug 21 22 - 23 24
GLICOPEPTIDOS
MACROLIDOS
TETRACICLINAS
FLUOROQUINOLONAS
FENICOLES
Cloramfenicol 30 ug 17 18 - 20 21
LINCOSAMIDAS
OXAZOLIDINONAS
Linezolid 30 ug - - 21


- 55 -
PRACTICA 8
REACCIONES SEROLOGICAS
La serologa estudia la deteccin de anticuerpos (Ac) y antgenos (Ag) especficos en los lquidos
corporales, habitualmente en el suero. Tambin llamadas reacciones inmunolgicas, se basan en las
reacciones de antgeno anticuerpo, las cuales constituyen una base de mucha importancia para el
diagnostico de las enfermedades infecciosas, puesto que ocurren in Vitro como in vivo. La validez de una
reaccin serolgica est condicionada por su sensibilidad y especificidad.
La sensibilidad de una prueba viene determinada por el nmero de muestras que es capaz de detectar
como positivas entre un grupo de muestras que son realmente positivas. Por ejemplo, una prueba con
sensibilidad de 95% es capaz de detectar 95 de cada 100 muestras positivas. Por lo cual existirn 5 falsos
negativos.
La especificidad de una reaccin viene determinada por el nmero de muestras que es capaz de detectar
como negativas entre un grupo de ellas que son realmente negativas. En este caso, una especificidad de
95% proporciona un 5% de falsos positivos.
Las pruebas serolgicas bsicamente pueden tener tres categoras:
1. Pruebas de unin primaria: Las cuales miden directamente la captacin M antgeno por parte del
anticuerpo. Son las de mayor sensibilidad y entre estas estn las pruebas de ELISA y los radio
inmunoensayos.
2. Pruebas de unin secundaria: Son menos sensibles que las primarias, pero son ms fciles de realizar,
miden los resultados de la unin antgeno anticuerpo realizada in Vitro. Estas incluyen las pruebas de
precipitacin de los antgenos solubles, la aglutinacin de los antgenos que se encuentran en forma de
partculas, as como la activacin de la cascada del complemento.
3. Pruebas de unin terciaria o in vivo: Miden el efecto protector de los anticuerpos. Se realiza
generalmente en animales.
REACCIN DE AGLUTINACIN:
Es el fenmeno que ocurre cuando se pone en contacto un Ag, es decir el Ag se halla en la superficie
celular, en contacto con su anticuerpo correspondiente. La reaccin Ag-Ac conlleva a una agregacin de las
partculas o clulas que son visibles microscpicamente. Se pueden detectar antgenos partiendo de
anticuerpos conocidos, se emplea para conocer Ag en bacterias aisladas y para el estudio de grupos
sanguneos. Se pueden detectar anticuerpos en sueros problema (se desconoce si presentan Ac frente a
determinados Ag). Partiendo de los antgenos especficos para ellos.
Grupos sanguneos: la aglutinacin de los
eritrocitos se denomina hemoaglutinacin, En la
superficie de los eritrocitos se encuentran los
antgenos A y B, existen 4 combinaciones de los
antgenos: tipo A, tipo B, tipo AB, tipo O. el suero
tiene anticuerpos contra los Ag ausentes. Las
personas con sangre tipo O tendrn Ac anti - A y
anti - B, los de tipo A tendrn Ac anti B. para el
factor Rh es semejante, si en la superficie del
eritrocito hay antgenos Rh, el tipo sanguneo
ser Rh positivo, y viceversa, Rh negativo.
REACCIN DE PRECIPITACIN:
Se produce cuando entran en contacto antgenos
solubles con sus anticuerpos especficos,
formndose un precipitado visible, dando una
apariencia de grumos. Es una reaccin muy
especfica pero poco a poco sensible, ya que se
necesitan cantidades relativamente elevadas de
anticuerpos para que se detecte.

- 56 -

TITULACIN O CUANTIFICACIN DE ANTICUERPOS:
Luego de realizar pruebas cualitativas que resulten positivas en los tipos de reacciones antes mencionadas,
en muchos casos se necesita evaluar la tasa de anticuerpos presentes en un suero problema. Esta se
realiza en tubos o posillos de placas serolgicas mediante diluciones progresivas de suero y cantidades
constantes de antgeno. Permite detectar el titulo de la reaccin como la mayor dilucin de suero en la que
aparece el fenmeno visible. Esto es posible gracias a que lega un momento en el que en las diluciones del
suero hay poca cantidad de anticuerpos, que ya no estn en proporcin con el antgeno, por lo que no se
observa reaccin.
OBJETIVOS:
1. Demostrar reacciones de aglutinacin determinando grupos sanguneos ABO y factor Rh en gotas de
sangre problema.
2. Demostrar reacciones de precipitacin determinando la reaccin de VDRL o RPR en sueros problema.
3. Detectar el ttulo en sueros positivos de una reaccin RPR.
MATERIALES:
Muestras de sangre problema
Muestras de suero problema
Lminas portaobjetos
Laminas cubreobjetos
Suero Anti A (color azul)
Suero anti B (color amarillo)
Suero anti D o anti Rh (incoloro)
Kit de determinaciones VDRL o RPR
Liguilla de jebe Lancetas o agujas estriles
Mondadientes Alcohol Etlico Lpiz de cera
Algodn
Suero Fisiolgico
Pipetas 1 m.
Tubos de Ensayo.
PROCEDIMIENTO:
1. Reaccin de Aglutinacin: grupos sanguneos ABO y factor Rh.
a. Rotular una lmina portaobjeto.
b. Limpiar el pulpejo de un dedo.
c. Punzar con 1 lanceta o aguja y colocar 3 gotas de sangre en el portaobjetos.
d. Aadir el anti suero Anti A a la primera gota de sangre, empezando por la izquierda., El Anti B a la
segunda gota y por ltimo el Anti D a la tercera gota.

- 57 -
e. Inmediatamente con un mondadientes u otro dispositivos estril mezclar la primera gota de sangre con
el suero, con otros mondadientes mezclar la segunda y tercera gota.
f. Observar cuales aglutinan.
g. Identificar los grupos sanguneos interpretando la aglutinacin o no aglutinacin.
2. Reaccin de Precipitacin: reaccin VDRL o RPR:
a. Tomar una muestra de sangre venosa, aproximadamente 3ml.
b. Centrifugar a 10 000 rpm/min.
c. Tomar una a dos gotas del suero obtenido (suero problema) y colocarlo en un portaobjetos.
d. Colocar una a dos gotas del reactivo de determinacin de RPR sobre las gotas del suero problema y
mezclar.
e. Rotar suavemente durante dos a tres minutos.
f. Observar a la luz, si hay grumos de precipitacin en la base de la mezcla el suero problema ser
positivo. El control negativo no formara grumos y servir de comparacin con los sueros problema.
3. Titulacin:
a. Colocar en tubos diluciones progresivas de suero positivo a la prueba anterior 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32,
1/64 y un control negativo (suero fisiolgico), las diluciones realizadas con suero fisiolgico, por
ejemplo 1/2, colocar en un tubo la mitad de suero positivo y la mitad de suero fisiolgico.
b. Rotular 6 lminas portaobjetos con las diluciones indicadas y colocar una gota de cada dilucin de
suero en cada uno.
c. Colocar cantidades constantes del antgeno sin diluir (frasco de reaccin del Kitt RPR), una gota, en las
lminas portaobjetos con el suero.
d. Mezclar y rotar suavemente por dos a tres minutos
e. Observar los grumos de precipitacin
f. Hasta la mayor o ltima dilucin donde se formen los grumos, este ser el ttulo de la reaccin o la
cantidad de concentracin de anticuerpos en el suero positivo.
ACTIVIDADES:
1. Esquematizar y rotular los procedimientos
2. Explicar cada resultado.
CUESTIONARIO:
1. A qu se refiere la sensibilidad de las pruebas serolgicas?
2. Por qu en los sueros positivos en diluciones altas no se da la reaccin AgAc?
3. Por qu una sangre tipo O no puede donarse a un paciente con sangre tipo A, B o AB?


- 58 -
PRACTICA 9
IDENTIFICACION DE BACTERIAS
GRAMPOSITIVAS
ESTREPTOCOCOS Y ESTAFILOCOCO.
El gnero Streptococcus son cocos Gram positivos, catalasa negativos, que se agrupan en cadenas o
algunas veces en parejas, Son organismos frgiles que slo crecen en medios enriquecidos o especiales
como en agar Sangre, agar azida. Est ampliamente distribuido en el ambiente, tales como alimentos, agua,
polvo, as como en la boca e intestinos del hombre y animales. Hay una variedad de especies saprfitas y
comensales. Entre patgenos de importancia en el hombre se encuentran Streptococcus pyogenes, del
grupo A, que produce hemlisis en el agar sangre; y Streptococcus viridans que produce a hemlisis.
Streptococcus pneumonae, forman diplococos lanceolados que forman cpsula, se desarrolla en el tracto
respiratorio alto en humanos causando neumonas, otitis, sinusitis, etc.
El gnero Staphylococcus son cocos Gram positivos generalmente agrupados en forma de racimos de uva;
adems de su forma que se visualiza en el microscopio, se diferencian de los estreptococos en que son
catalasa positivos, son de fcil crecimiento como por ejemplo en agar sangre, agar triptosa y varios otros
medios de cultivo; producen pigmentaciones que van desde el blanco a amarillo dorado. Se encuentran en
ambientes variados como alimentos, agua, suelo, ropa, y en el hombre en la piel, mucosas bucal y
nasofarngea e intestinos. Staphylococcus aureus es el de mayor importancia por su patogenicidad, en el
hombre causa infecciones purulentas, abscesos, supuraciones e intoxicacin por alimentos contaminados,
produce . hemlisis, pigmentacin amarilllo - dorada, y es coagulasa positiva a diferencia de otras especies
de Staphylococcus, como S. epdermidis y S. saprophyticus. Staphylococcus epidermidis pertenece a
la flora normal de las mucosas y piel, pero puede producir infecciones oportunistas, da hemlisis y
pigmentacin amarillo claro-blanquecina.
OBJETIVOS:
1. Identificar bacterias del gnero Streptococcus y bacterias del gnero Staphylococcus.
2. Observar las caractersticas culturales de las colonias de dichas bacterias.
MATERIALES:
Material biolgico: muestras de secrecin
farngea y de cavidad oral.
Material biolgico: placas con cultivo de
Grampositivos en agar Sangre y agar Triptosa.
Batera de coloracin Gram.
Microscopio ptico.
Pipetas Pasteur.
Hisopos, bajalenguas.
Estufa.
Mecheros.
Lminas portaobjetos y cubreobjetos.
Aceite de inmersin.
Guantes.
Barbijo.
Papel toalla.
Lpiz de cera.
PROCEDIMIENTO:
1. Observacin macroscpica: En placas con agar sangre y agar tripticasa soya observar las
caractersticas culturales de las colonias de especies de Streptococcus y Staphylococcus.
2. Observacin microscpica: Tomar una muestra de secrecin farngea con ayuda de bajalenguas e
hisopo.
Colocar la muestra y hacer un frotis en una lmina portaobjetos, rotular.
Realizar la coloracin de Gram a la muestra.
Observar la morfologa bacteriana en el microscopio con el objetivo de 100X e identificar Streptococcus
y Staphylococcus.

- 59 -
Tomar una muestra de secrecin gingival con un mondadientes, y realizar el mismo procedimiento
anterior.
3. Pruebas bioqumicas:
a. Prueba de la catalasa: Colocar en un portaobjetos una colonia y adicionarle una gota de perxido de
hidrgeno al 3% (10 volmenes). La formacin de burbujas indica que la prueba es positiva, debido a
la formacin de O
2
.
b. Prueba de la coagulasa: Prueba en portaobjetos o coagulasa unida. Colocar una gota de solucin
salina en 2 portaobjetos, rotular uno como C (Control) y el otro como P (plasma), emulsionar una
buena cantidad de bacterias en ambas gotas: agregar una gota de solucin salina a C, y una gota de
plasma a P, mezclar moviendo los portaobjetos por 1 minuto.
Positivo: si P aglutina y C no aglutina.
Negativo: si ambos no aglutinan.
ACTIVIDADES:
1. Anotar, esquematizar y rotular lo observado
2. Identificar a la bacteria en ambas pruebas.
CUESTIONARIO.
1. Qu significa hemolisis?
2. Qu significa hemolisis?
3. Porque se produce aglutinacin en la prueba de la coagulasa?
4. En qu medios de cultivo se desarrolla Staphylococcus aureus.?


- 60 -
PRACTICA 10
IDENTIFICACION DE BACTERIAS
GRAMNEGATIVAS
Las bacterias Gram negativas presentan generalmente una envoltura celular de tres capas: la mas interna
llamada membrana citoplasmtica, luego esta una delgada capa de peptidoglicano formando la pared
celular, seguida a esta se encuentra el espacio periplasmtico, en el cual se encuentran protenas como
enzimas sintetizadores, y la membrana externa, en la cual se proyectan hacia afuera las molculas de
lipopolisacridos, consideradas como endotoxinas debido ni fuerte carcter antignico que proporciona a las
gran negativas desencadenando respuestas en el sistema inmune que pueden llevar al shock e in cluso a la
muerte del hospedero
ENTEROBACTERIAS:
Son bacilos Gram negativos que son parte del a flora normal de nuestro cuerpo o causan enfermedades
gastrointestinales. Todas ellas pueden desarrollarse bien en medio de cultivo con inhibidores de Gram
positivos, como en los agares MacConkey y EMB.
ENTEROBACTERIACEAE TRANSMISION METABOLISMO VIRULENCIA DIAGNOSTICO
Escherichia coli
Fecal oral
Migracin a la
uretra.
Colonizacin de
catteres
Indol +
hemolticos
Lactosa +
Fimbrias: factor
de colonizacin.
Capsula (Ag K).
Flagelos (AG
H).
Sideroforos.
Adhesinas.
Gram.
MacConkey.
Colonias rosado
purpureas.
Crece hasta
45.5C.
Proteus vulgaris

Indol -
Ureasa +
Mviles.
Ph alto por la
ureasa.
Cultivo: bacilos se
movilizan.
Shigella dysenteriae Fecal oral. No produce H
2
S.
Invade
submucosa de
tracto intestinal.
Cultivo heces: no
es parte de la
flora normal.
Salmonella typhi Fecal oral. Produce H
2
S.
Mviles
capsula.
Prueba de Widal.
OBJETIVOS:
1. Reconocer las caractersticas culturales y morfolgicas de las bacterias Gram negativas,
2. Conocer y analizar las caractersticas metablicas de las bacterias Gram negativas
MATERIALES:
Tubos con medios de cultivo diferenciales: TSI,
LIA, Citrato, Caldo peptonado inoculados.
LIA, Citrato, Caldo peptonado no inoculados.
Gradillas.
Placas Petri con cultivo de gran negativas.
Lminas portaobjetos.
Batera de coloracin gran.
Microscopios pticos.
Mecheros.
Suero fisiolgico.
Lpiz de cera.
Alcohol 70.
Guantes.
Tiras para medir Ph.


- 61 -
PROCEDIMIENTO:
1. Caractersticas culturales y morfolgicas de las bacterias Gram negativas.
Observe las caractersticas culturales de las colonias de la placa proporcionada con medio agar
McConkey e identifique las bacterias.
Coloque en un portaobjetos con el asa microbiolgica una gota de suero fisiolgico.
Tome con el asa una colonia de la placa y dilyala en la gota de la lmina haciendo una emulsin.
Extender, fijar y dejar secar.
Colorear con la batera de Gram.
Observar las caractersticas morfolgicas de las bacterias en el microscopio ptico.
2. Anlisis e interpretacin de pruebas bioqumicas:
Observe las caractersticas de los tubos proporcionados con medios diferenciales inoculados, interprete e
identifique las bacterias con la ayuda de las tablas (ver PRCTICA 12 y anexo 1)
a. TSI:
Fermentacin de carbohidratos
Produccin de gas
Produccin de sulfuro de hierro
b. LIA:
K/K
R/A
K/A
A/A
c. Caldo peptonado (prueba indol):
d. Citrato de Simmons:
e. SIM.
ACTIVIDADES:
1. Esquematice y caracterice las colonias bacterianas analizadas.
2. Esquematice los tubos observados con las distintas reacciones y su identificacin.
3. Realice una tabla de Ios caracteres bioqumicos de enterobacterias.
CUESTIONARIO:
1. Qu caractersticas presentan las enterobacterias.
2. Qu pruebas utilizara para diferencias Escherichia coli de Klebsiella sp?


- 62 -
PRACTICA 11
METABOLISMO BACTERIANO
Si bien es cierto que los caracteres culturales y morfolgicos, nos dan indicios de orientacin muy
significativos para llegar a la identificacin de un microorganismo; sin embargo, una serie de especies
bacterianas pueden presentar similitud en sus caracteres culturales y morfolgicos, pero son totalmente
diferentes en sus caracteres bioqumicos (metablicos). Precisamente en esta prctica estudiaremos y
analizaremos el comportamiento bioqumico de los microorganismos; para ello es necesario aadir a los
medios de cultivo que conocemos, sustratos adecuados como: carbohidratos, protenas, aminocidos,
peptonas, etc. , los productos formados y las modificaciones producidas en estos medios se manifiestan por
el cambio de color debido al reactivo indicador que llevan, en otros casos dicho indicador es aadido
despus de la inoculacin como en el caso de la prueba del indol.
Por ejemplo en la accin bioqumica de los microorganismos sobre los aminocidos, algunos poseen
determinadas enzimas que le dan la capacidad de desnaturalizar los aminocidos, dando lugar a la
formacin de otros elementos o compuestos, los cuales se ponen de manifiesto gracias a los indicadores
incorporados al medio, por su viraje o cambio de color original.
Asimismo, segn la accin de los microorganismos sobre los carbohidratos; gran nmero de ellos gracias a
las enzimas que tienen, muy especficas por cierto, fermentan los carbohidratos, con produccin de cidos
orgnicos y gas, otros solamente cidos y hay algunos que no tienen esta capacidad, la presencia de cido,
se evidencia agregando al medio base, el carbohidrato como: glucosa, sacarosa, lactosa, manitol, etc. y un
indicador especfico de pH. La presencia de gas nos indica que la fermentacin del carbohidrato ha sido
completa, con formacin final de CO
2
y agua, y se manifiesta por el resquebrajamiento del medio slido en
el lugar o sitio de inoculacin, como por formacin de una cavidad en el fondo del tubo inclusive, si la
cantidad de gas es bastante el medio es desplazado hacia la parte superior del medio, dejando un gran
espacio en el fondo del tubo.
En fin la accin metablica de los organismos es fascinante e ilimitada debido a que se diferencia en la
capacidad para actuar y desnaturalizar una infinidad de sustancias y de compuestos como: protenas,
carbono, nitrgeno, carbohidratos, nitratos, nitritos, perxido de hidrgeno, cianuro, petrleo, sulfuros, etc.
TSI (Triple azcar hierro).
Este es un medio diferencial de agar con 3 azcares (glucosa, sacarosa y lactosa) y hierro, donde se
observa el metabolismo de los carbohidratos.
1. Composicin: Cuatro protenas derivativas: extracto de carne, extracto de levadura, peptona y proteasa
peptona; carbohidratos (glucosa 1g, lactosa 10g, sacarosa 10g), cloruro de sodio, sulfato ferroso,
tiosulfato de sodio, el indicador es rojo de fenol y agaragar. No poseen inhibidores permitiendo el
crecimiento de casi todas las bacterias (excepto anaerobios obligados).
2. Principio: Para demostrar la fermentacin de los carbohidratos est el indicador rojo de fenol que es
amarillo a un pH de 6,08, ya que el medio sin inocular es bufferado a pH de 7,4, cantidades relativamente
pequeas de produccin de cido resultan en un visible cambio de color. El sulfato ferroso es un detector
de H
2
S, algunos microorganismos reducen el tiosulfato hasta hidrgeno sulfurado y este al contactar con
el sulfato ferroso da lugar a la formacin de sulfuro de hierro. Tambin se observa si hay produccin de
gas debido a la fermentacin completa de glucosa en CO
2
y H
2
O.
LIA (Agar con Lisina y Hierro).
1. Base Bioqumica: La lisina puede ser descarboxilada por microorganismos lisina descarboxilasa
positivos que la transforman en la diamina Cadaverina, la cual alcaliniza todo el medio, intensificando el
medio a color violeta; este proceso se realiza debido a que ellos presentan la enzima lisina
descarboxilasa. La lisina puede ser desaminada por microorganismos lisina desaminasa positivos, es
decir presentan la enzima lisina desaminasa, que por desaminacin oxidativa transforma a la lisina en un
alfa-cetocido, el cual es naranja en presencia de sales frricas y se torna rojo granate por el indicador
prpura de bromocresol en la parte superficial del tubo.
2. Principio: Mide la capacidad de un organismo para descarboxilar (rompiendo el radical carboxilo) o
desaminar (rompiendo el radical amino) la lisina para formar aminasa o cetocidos con la alcalinidad y
acidez respectiva.

- 63 -
CALDO PEPTONADO (Prueba del indol).
1. Base Bioqumica: Es un medio de cultivo diferencial lquido (caldo) que tiene como ingrediente
fundamental el aminocido triptfano incorporado a la peptona, produciendo una serie de sustancias
voltiles como amoniaco, cido pirvico, indol, etc.
2. Principio: Sirve para demostrar la desnaturalizacin del triptfano al aadir un reactivo especfico al
medio (reactivo de Kovac's o de Erlich's). Se forma un complejo de color rojo cuando el indol reacciona
con el grupo para dimetil - aminobenzaldehdo, en un medio cido, produciendo en la superficie del tubo
un anillo de color rojo grosella
CITRATO SIMMONS
1. Base Bioqumica: El citrato de sodio, nica fuente de carbono, es una sal de cido ctrico, un compuesto
simple obtenido en el ciclo de Krebs, algunas bacterias obtienen energa de este compuesto como nica
fuente de carbono. Este medio est libre de protenas y carbohidratos para detectar el uso del citrato por
una bacteria.
2. Principio: El uso del citrato por una bacteria se identifica por la produccin de productos secundarios
alcalinos. El indicador de esto es el azul de bromotimol, que es amarillo a pH menor a 6.0 y azul a ph
mayor de 7,6.
SIM (H2S, Indol, Movilidad)
1. Base Bioqumica: El triptfano es un aminocido constituyente de muchas peptonas, y particularmente
de la triptena, que puede ser oxidado por algunas bacterias para formar indol. En el proceso interviene
un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa. El indol producido se combina con el aldehido del reactivo
de Kovacs o de Erlich, para originar un compuesto de color rojo.
2. Principio: En este medio se estudian 3 procesos adems que el medio puede ser de transporte por ser
semislido, las pruebas son: la produccin de hidrogeno sulfurado (H
2
S), indol y motilidad, pero las dos
primeras pruebas significan que el medio exista por naturaleza los aminocidos cistena y triptfano, la
primera para liberar las molculas de H
2
S y la segunda para dar indol, la motilidad se observa por solo
desarrollo invasivo del medio a temperatura ambiente, pH neutro, sin la presencia de cidos, alcohol ni
acetona por lo que el medio carece de carbohidratos.
Las cepas mviles pueden apreciarse en este medio, por la turbidez que producen alrededor de la
puncin de siembra, mientras que aquellas cepas productoras de sulfhdrico se distinguen por la
formacin de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre que el medio se
mantenga a un pH mayor a 7.2.
OBJETIVOS:
1. Reconocer las caractersticas culturales y morfolgicas de las bacterias Gram negativas.
2. Conocer y analizar las caractersticas metablicas del as bacterias Gram negativas.
3. Adquirir destreza en la identificacin de microorganismos.
MATERIALES:
LIA, SIM, Citrato, caldo peptonado inoculados.
LIA, SIM, Citrato, caldo peptonado no
inoculados.
Gradillas.
Placas Petri con cultivo de Gram negativas.
Asa microbiolgicas.
Lminas portaobjetos.
Microscopios pticos.
Mecheros.
Suero fisiolgico.
Lpiz de cera.
Alcohol 70.
Guantes.
Tiras para medir pH.
PROCEDIMIENTO:
1. Caractersticas culturales y morfolgicas de bacterias Gram Negativas:
Observe las caractersticas culturales de las colonias de la placa proporcionada con medio agar
McConkey e identifique las bacterias.

- 64 -
Coloque en un portaobjetos con el asa microbiolgica una gota de suero fisiolgico.
Tome con el asa una colonia de la placa y dilyala en la gota de la lmina haciendo una emulsin.
Extender, fijar y dejar secar.
Colorear con la batera de Gram.
Observar las caractersticas morfolgicas de las bacterias en el microscopio ptico.
2. Anlisis e Interpretacin de Pruebas Bioqumicas:
Observe las caractersticas de los tubos proporcionados con medios. diferenciales inoculados,
interprete e identifique las bacterias con la ayuda de las tablas (ver Anexo 1):
TSI.- Este medio al inicio es de color rojo ladrillo.
a. Fermentacin de carbohidratos:
K/K: N/N: Una reaccin alcalina en todo el tubo, es decir no hay viraje de color, indica que hay
una falta de produccin de cidos e incapacidad de la bacteria para fermentar los carbohidratos, por
lo tanto el microorganismo no pertenece a la familia Enterobacteriaceae.
K/A: Fermentacin slo de glucosa, el viraje muestra un color rojizo en el bisel y color amarillo en el
fondo (alcalinidad sobre acidez), quiere decir negativo a la lactosa y sacarosa y positivo a la glucosa.
A/A: Los microorganismos son capaces de fermenta los tres azcares, hay un viraje en todo el
medio al color amarillo (acidez sobre acidez), quiere decir positivo a lactosa, sacarosa y glucosa.
b. Produccin de gas:
Positivo: Si hay produccin de gas, por resquebrajamiento del medio en el sitio de la inoculacin o
hay una formacin de burbuja en el fondo del tubo, a veces la produccin de gas es tan abundante
que hay un desplazamiento del medio hacia arriba.
Negativo: No hay produccin de gas.
c. Produccin de sulfuro de hierro:
Positivo: Si hay produccin sulfuro de hierro, se observa una coloracin negruzca, que va desde
una + hasta ++++ si hay mucha cantidad.
Negativo: No hay produccin de H
2
S.
LIA: Este medio antes de ser inoculado es de color lila plido (pH neutro). La prueba positiva significa
desnaturalizacin de la lisina, presentndose los siguientes casos:
a. K/K: Todo el medio virado a violeta, se lee alcalino sobre alcalino (descarboxilacin).
b. R/A: Bisel pardo rojizo, fondo amarillo, se lee rojo sobre cido (desaminacin).
c. K/A: Bisel violeta por efecto de la incubacin, el fondo vira a amarillo por la acidez producida por
fermentar al glucosa, se lee alcalino sobre cido (lisina negativa).
d. A/A: A veces el medio se presenta amarillo en su totalidad, se lee alcalino sin cambio (lisina negativa).
Caldo peptonado (Prueba de Indol):
a. Positivo: Si se produce el anillo rojo grosella en la superficie del medio, indol positivo.
b. Negativo: No hay produccin del anillo, es decir indol negativo.
Citrato de Simmons:
a. Positivo: Citrato positivo si hay un viraje al color azul en todo el medio o en la lnea de inoculacin
b. Negativo: Citrato negativo si el medio permanece de color verde.
SIM.
a. Prueba del indol: Agregar al medio de cultivo 3 a 5 gotas de indol reactivo Kovacs o de Erlich.
b. Produccin de SH
2
:
Positivo: Ennegrecimiento del medio de cultivo a lo largo de la lnea de siembra o en todo el medio.
Negativo: El medio permanece sin cambio de color.

- 65 -
c. Movilidad:
Positivo: Presencia de turbidez o crecimiento ms all de la lnea de siembra.
Negativo: Crecimiento solamente en la lnea de siembra.
ACTIVIDADES:
1. Esquematice y caracterice las colonias bacterianas analizadas.
2. Esquematice los tubos observados con las distintas reacciones y su identificacin.
3. Complete la tabla de cada grupo de los caracteres bioqumicos de enterobacterias.

MESON 1 TSI LIA CITRATO SIM

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CODIGOS

LECTURA EN
PALABRAS

INTERPRETACION

BACTERIAS
PROBABLES

BACTERIA FINAL


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CODIGOS

LECTURA EN
PALABRAS

INTERPRETACION

BACTERIAS
PROBABLES

BACTERIA FINAL


- 66 -

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CODIGOS

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PALABRAS

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BACTERIAS
PROBABLES

BACTERIA FINAL


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BACTERIAS
PROBABLES

BACTERIA FINAL


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BACTERIAS
PROBABLES

BACTERIA FINAL


- 67 -


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INTERPRETACION

BACTERIAS
PROBABLES

BACTERIA FINAL

CUESTIONARIO:
1. Es posible identificar un microorganismo recurriendo slo a sus caracteres bioqumicos?.
2. Qu caractersticas presentan las enterobacterias?.
3. Qu pruebas utilizara para diferenciar Escherichia coli de Klebsiella sp.?.
4. Cmo se produce la formacin de gas en el TSI?
5. En qu otra forma se puede evidenciar la formacin de cido sulfhdrico, aparte del uso de los medios
de TSI y LIA?


- 68 -
REACCIONES DE ENTEROBACTERIACEAE EN AGAR TRIPLE AZUCAR (TSI) Y EN AGAR HIERRO LISINA
(LIA) (Edwards Ewing)
GENERO Y
ESPECIE
T S I L I A CITRATO S I M
Inclinado Profundo Gas H
2
S Inclinado Profundo Gas H
2
S H
2
S Indol Motilidad
ESCHERICHIA A (K) A + (-) - K K o N - o + - - - + +
SHIGELLA K A - - K A - - - - + -
SALMONELLA K A + (-)
+++ (-
)
K K o H - + (-) - + - +
S. TYPHI K A - + (-) K K - + o - - + - +
S. PARATYPHI K A + (-) - K A + o - - - - - +
ARIZONA K (A) A + +++ K K o H - + (-)
CITROBACTER K (A) A + +++ K A - o + +
ADWARSIELA K A + +++ K K - o + +
KLEBSIELLA A A ++ - K o H K o H + o - - + - - -
ENTEROBACTER A A ++ - + - - +
E. CLOACAE A A + - K o H A + o - - + - - +
E. AEROGENES A A + - K K o H + o - -
E. HAPNIAE K A + - K K o H - o + -
SERRATIA K o A A - - K K o H - -
P. VULGARIS A (K) A + +++ R A - - (+) v + + +
P. MIRABILIS K (A) A + +++ R A - - (+)
P. MORGANII K A - (+) - K o R A - -
P. RETTGERI K A - (+) - R A - -
PROVIDENCIA K A + o - - R A - -
A : Acido. K : Alcalino N : Neutro R : Desaminacin oxidativa.
Los smbolos en parntesis indican reacciones adicionales. Una reaccin alcalina o neutra en lo profundo del medio indica descarboxilacin.

- 69 -
PRACTICA 12
IDENTIFICACION DE MICOBACTERIAS
El gnero Mycobacterium son bacilos muy delgados curvos o rectos de metabolismo aerbico, no mviles a
los cuales se les denomina bacilos alcohol cido resistentes (BAAR) ya que presentan alto contenido de
lpidos y cidos grasos, sobretodo cido miclico en su pared celular. Incluye ms de 54 especies
conocidas, en el hombre son especies patgenas tales como Mycobacterium tuberculosis y
Mycobacterium leprae, y especies oportunistas como Mycobacterium avium, Mycobacterium
intracellulare, Mycobacterium fortuitum etc.
Para la identificacin de los BAAR en muestras sospechosas de micobacterias patgenas se utilizan
mtodos de coloracin cido alcohol resistentes como la de Ziehl Neelsen y la de Kinyoun, esta tcnica es
rpida, sencilla y econmica sin embargo es de baja sensibilidad y no es exclusiva de las micobacterias la
bsqueda de estos bacilos y su conteo resulta en un diagnostico presuntivo para la tuberculosis y se le
denomina baciloscopa.
La tuberculosis es una enfermedad causada por el bacilo de Koch (Mycobacterium tuberculosis), se
desarrolla solo en el hombre siendo un patgeno obligado e intracelular facultativo, generalmente se
transmite por inhalacin de aerosoles que contienen la bacteria expulsados por la persona infectada.
Generalmente afecta los pulmones causando tuberculosis pulmonar, pero tambin se presenta la
tuberculosis extrapulmonar, que afecta a otros rganos como intestino, riones, meninges, pleura, etc. Su
diagnstico definitivo se establece a travs del aislamiento en cultivo e identificacin bioqumica de
Mycobacterium tuberculosis obtenidas a partir de muestras biolgicas representativas de la zona afectada,
OBJETIVOS:
1. Conocer La importancia del proceso microbiolgico para el diagnstico clnico de Mycobacterium
tuberculosis
2. Conocer un procedimiento de coloracin cido alcohol resistente (Ziehl- Neelsen) para micobacterias
3. Identificar bacilos de Mycobacterium tuberculosis e interpretar resultados de la baciloscopa.
MATERIALES:
Muestras de esputo.
Lminas con frotis de BAAR s/c coloracin
alcohol cido resistente.
Batera de coloracin de Ziehl Neelsen
Microscopio ptico.
Lamina portaobjetos.
Bajalenguas.
Frascos estriles con tapa de boca ancha.
Mechero.
Portalminas.
Guantes.
Barbijo.
Lpiz de cera.
PROCEDIMIENTO:
1. Toma de muestra:
Colocarse guantes y barbijo, utilizar material estril.
Seleccionar un envase de plstico transparente con tapa rosca y boca ancha.
Etiquetar o rotular el envase con el nombre del paciente, tipo de muestra fecha y hora de recoleccin
de la muestra, as como el nmero de registro del paciente.
Obtener una muestra de esputo, de preferencia a primera hora de la maana, en cantidad suficiente
para que la muestra sea representativa.
No usar fijadores ni preservantes y transportarlas de inmediato para su procesamiento (de lo contrario
conservarla a 4 C).
2. Coloracin de Ziehl Neelsen:
Con la ayuda de un bajalenguas mezclar la muestra y realizar un frotis a lo largo de la lmina

- 70 -
portaobjetos, expandir lo suficiente, fijar con mechero dejar secar y rotular.
Colocar el frotis en el portalminas.
Cubrirlo con fucsina fenicada por 5 minutos, mientras pasa por debajo de la lmina la llama de un
mechero, hasta la emisin de vapor, evitando que la fucsina hierva, agregue ms colorante si se
consumi con la evaporacin.
Enjuagar la lmina con agua de cao.
Decolorar con alcohol cido por 1 minuto.
Enjuagar la superficie con agua de cao.
Cubrir el frotis con azul de metileno durante 1 minuto.
Enjuagar con agua de cao y dejar secar.
Observar al microscopio con objetivo de 100X.
Identificar los bacilos BAAR que se colorean de color vino tinto.
3. Baciloscopa:
Realizar la observacin al microscopio de la lmina coloreada con Ziel Neelsen contando el nmero de
BAAR.
Reportar lo observado guindose de la tabla a continuacin
N DE BACILOS OBSERVADOS
REPORTE
No se observan BAAR en 300 campos Negativo ( - )
De 1 a 2 bacilos en 300 campos Dudoso(repetir)
De 1 a 9 bacilos /campo en promedio en 100 campos observados Positivo (+)
De 1 a 9 bacilos en promedio /campo en 10 campos observados Positivo (2+)
De 1 a 9 bacilos en promedio/campo Positivo (3+)
Ms de 9 bacilo en promedio /campo Positivo (4+)
ACTIVIDADES:
1. Analizar el procedimiento de toma de muestra.
2. Esquematizar y rotular los procedimientos de las tcnicas de coloracin.
3. Colocar el reporte de la lmina positiva para M. tuberculosis.

Prueba :..
Muestra :..
Coloracin :..
Aumento :..
Observacin :..


- 71 -
CUESTIONARIO:
1. Qu pruebas bioqumicas se pueden realizar para diferenciar M. tuberculosis?
2. En qu medios de cultivo se desarrolla M. tuberculosis, durante cunto tiempo y en qu condiciones
fsicas?

- 72 -
PRACTICA 13
METODOS DE LABORATORIO EN
MICOLOGIA
La micologa trata del estudio de los hongos. Existen ms de 50000 especies de hongos, de los cuales la
mayor parte son benficos para la humanidad. Las infecciones causadas por hongos son las micosis. La
mayor parte de hongos patgenos son exgenos, siendo sus hbitats naturales el agua, el suelo y los
desechos orgnicos. Las micosis ms frecuentes son la candidiasis, y la dermatofitosis, causada por flora
microbiana normal que est muy adaptado para sobrevivir en el hospedero humano.
Bsicamente existen dos formas de crecimiento de los hongos : levaduras , las cuales son unicelulares y
presentan pared celular gruesa y mohos (hongos filamentosos) los cuales son multicelulares formando
filamentos denominadas hifas y esporas que son estructuras para la reproduccin.
La mayor parte de hongos crece con facilidad sobre fuentes simples de nitrgeno y carbohidratos.
Clsicamente se usa agar de Sabourand que contiene glucosa y peptona a pH 7.0 debido a que no apoya
fcilmente el crecimiento de bacterias. El protocolo de laboratorio para el diagnstico de estos organismos
incluye:
1. Demostracin directa de clulas micticas contenidas en tejidos o fluido sanguneo.
2. Aislamiento del hongo en cultivo puro.
3. Identificacin por procedimientos convencionales, tales como la observacin de formacin de micelio o
levaduras.
OBJETIVOS:
1. Aislar hongos en cultivo de agar Sabourand y otros cultivos.
2. Identificar y observar la morfologa de hongos levaduriformes realizando la coloracin de Gram.
3. Identificar y observar la morfologa de hongos filamentosos realizando la coloracin de azul de lactofenol.
MATERIALES:
Material biolgico: frutos o plantas hongueadas
Material biolgico: placas con cultivo de
Candida albicans, placas con cultivo de
hongos filamentosos.
Batera de coloracin azul de lactofenol.
Hidrxido de potasio al 10%.
Microscopio ptico.
Pipetas Pasteur.
Asas microbiolgicas en escuadra y en aro.
Estufa.
Mecheros.
Lamina portaobjetos y cubreobjetos.
Aceite de inmersin.
Guantes, barbijo.
Papel toalla.
Lpiz de cera.
PROCEDIMIENTO:
1. Levaduras.
Colocarse guantes y barbijo, utilizar material estril.
Con el asa microbiolgica en aro tomar una a dos colonias de Candida albicans.
Realizar un frotis y fijar.
Realizar la coloracin de Gram.
Observar al microscopio 100X.
2. Hongos filamentosos.
Tomar una muestra de un fruto hongueado con el asa microbiolgica en escuadra.

- 73 -
Cultivar a 37 C por 4 das.
Luego con el asa microbiolgica en escuadra tomar una muestra del cultivo en agar Sabourand.
Realizar un frotis y fijar.
Realizar la coloracin de Gram.
Observar al microscopio a 100X.
3. Hongos dermatofitos.
Realizar un raspado de uas o piel.
Colocar las muestras en un portaobjetos en una gota de KOH al 10 a 20 %.
Colocar un cubreobjetos y examinar la muestra al microscopio.
Repetir el examen 20 minutos despus.
ACTIVIDADES:

Muestra :.. Muestra :
Coloracin :.. Coloracin :
Aumento :.. Aumento :
Observacin :.. Observacin :
Hongo :.. Hongo :

Muestra :
Coloracin :
Aumento :
Observacin :
Hongo :


- 74 -

Hongo :.. Hongo :

Hongo :.. Hongo :


- 75 -

Hongo :.. Hongo :

Hongo :.. Hongo :

CUESTIONARIO:
1. Qu caractersticas contiene el agar Saboraund?
2. En qu medios de cultivo se desarrollan las levaduras?
3. A qu temperatura pueden desarrollarse los hongos filamentosos?
4. A qu temperatura pueden desarrollarse los hongos dermatofitos?

- 76 -
PRACTICA 14
DIAGNOSTICO PRASITOLOGICO
La parasitologa estudia a la biologa de los parsitos y sus relaciones con el hospedero. Entre los parsitos
de humanos estn los protozoarios y los metazoarios. Los primeros son unicelulares y se dividen en
diversos grupos de los cuales algunos flagelados, amebas y esporozoarios parasitan al ser humano; los
segundos son pluricelulares y pertenecen a los helmintos (nematodos, cstodos y tremtodos) y a los
artrpodos.
El diagnstico de parsitos causantes de enfermedades se puede realizar mediante 2 mtodos, los directos
y los indirectos. Los mtodos directos con los cuales se observa directamente al parsito en una o ms
formas de transmisin. Estos incluyen al examen directo macroscpico (observacin de partes o la totalidad
de algunos helmintos y artrpodos) y microscpico (huevos, quistes, larvas, trofozotos de parsitos), los
que pueden ser al fresco, muestras preservadas o mediante coloraciones, mediante cultivo de las muestras
biolgicas o la inoculacin experimental de animales que multipliquen o faciliten la deteccin del parsito.
Los mtodos indirectos, los que generalmente son serolgicos ponen de manifiesto la respuesta del
hospedero frente al parsito, como por ejemplo la deteccin de anticuerpos. Es importante conocer bien el
ciclo biolgico del parsito en relacin con las fases de la enfermedad parasitaria, para interpretar y validar
los resultados de laboratorio.
Las muestras biolgicas son diversas dependiendo del tipo de parasitosis: enteroparasitosis (causado por
parsitos del sistema digestivo y anexos), hemoparasitosis, parasitosis cutnea y parasitosis hsticas.
OBJETIVOS:
1. Conocer Las diferentes tcnicas de diagnstico para la identificacin de parsitos.
2. Observar la morfologa microscpica de protozoarios parsitos en muestras preservadas y frescas.
3. Observar la morfologa macroscpica y microscpica de helmintos parsitos en muestras preservadas.
MATERIALES:
Material biolgico:
Muestras frescas y/o preservadas de heces
conteniendo enteroparsitos.
Lminas preservadas de Entamoeba sp.
Lminas preservadas de Trichomonas
vaginalis en secrecin,vaginal.
Muestras preservadas de helmintos.
Lminas preservadas de huevos de
Enterobius vermicularis.

Microscopio ptico
Suero fisiolgico (o ClNa al 0,85 % )
ter etlico
Aceite de inmersin
Tubos de ensayo con tapn
Lminas portaobjetos y cubreobjetos
Pipetas Pastear
Pipetas graduadas
Gasa quirrgica
Bajalenguas
Guantes, barbijo
PROCEDIMIENTO:
1. Concentracin de parsitos en muestras fecales:
Las tcnicas de concentracin de heces concentran y recuperan los elementos parasitarios que se
hallan dispersos en las muestras frescas de heces.
Una tcnica que sedimenta los parsitos por fuerza de gravedad es la tcnica de Telemann
modificado, que consiste en:
Tomar la muestra de heces en emulsin y tamizarla a travs de una gasa quirrgica.
Llevarla a un tubo de ensayo y centrifugarla a 1500 rpm durante 3 minutos.
Eliminar el sobrenadante.
Suspender el sedimento con una pipeta Pasteur en suero fisiolgico.

- 77 -
Repetir las centrifugaciones hasta obtener un sobrenadante relativamente limpio.
Tomar 1 a 2 gotas y hacer una preparacin directa sin tincin y observar al microscopio.
Luego verter aproximadamente 10 ml de la emulsin fecal tamizada en un tubo de centrfuga,
agregarle 2 ml de ter etlico y agitar enrgicamente.
Centrifugar por 4 minutos a 1500 rpm.
Eliminar el sobrenadante.
Preparar 2 muestras concentradas, realizar el frotis y teirlas con lugol.
Observar al microscopio ptico a 40 y 100X.
2. Observacin de enteroparsitos:
Observar la lmina preparada de Entamoeba sp. en el microscopio con el objetivo de 40 y 100X.
Identificar la especie.
Identificar las estructuras celulares.

Muestra :
Coloracin :
Parsito :
Forma :
Aumento :..
Parasitolsis :..

3. Observacin de Trichomonas:
Observar la lmina preparada de Trichomonas en el microscopio con el objetivo de 40 y 100X.
Identificar la especie.
Identificar las estructuras celulares.

Muestra :
Coloracin :
Parsito :
Forma :
Aumento :..
Parasitosis :..


- 78 -
4. Observacin de Platelmintos: Observar la muestra preservada del helminto macroscpicamente,
identifique la especie e identifique sus estructuras.

Muestra : Muestra :.
Parsito : Parsito :.
Clase . Clase :.
Forma : Forma :.
Aumento : Aumento :.
Parasitosis : Parasitosis :.
Hospedero : Hospedero :.

Muestra : Muestra :
Parsito : Parsito :
Clase . Clase :.
Forma : Forma :
Aumento : Aumento :
Parasitosis : Parasitosis :

- 79 -
5. Observacin de nematodos: Observar la muestra del nematodo microscpicamente con el objetivo de
40X, identifique la especie e identifique las estructuras.

Muestra : Muestra :
Coloracin : Coloracin :.
Parsito : Parsito :
Forma : Forma :
Aumento : Aumento :

Muestra : Muestra :
Coloracin : Coloracin :.
Parsito : Parsito :
Forma : Forma :
Aumento : Aumento :

- 80 -
ACTIVIDADES:
Esquematizar y rotular los procedimientos

Parsito : Parsito :.
Phyllum : Phyllum :.
Clase : Clase :.
Forma evolutiva :. Forma evolutiva :...
Importancia : Importancia :.

Parsito : Parsito :
Clase : Clase :.
Forma evolutiva :. Forma evolutiva :...
Importancia : Importancia :.
Parasitosis : Parasitosis :.....


- 81 -
CUESTIONARIO:
1. Qu y Cules son los enteroparsitos de mayor difusin en nuestro medio?
2. Qu tcnicas diagnsticas se realizan para identificar al hemoparsito de la enfermedad de Chagas?
3. Qu elementos parasitarios se identifican con la tcnica de Telemann Modificado?
4. Qu parsitos cutneos conoce?

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