Universidad Autnoma del Estado de Mxico.

Facultad de Qumica.


Licenciatura: Qumico Farmacutico Bilogo.


Laboratorio de Toxicologa



Informe de la prctica #5: Efectos de la
administracin de plomo en la sangre



Equipo #9:
Gama Domnguez Yunun
Gmez Ruiz Eduardo
Prez De Len Rafael Alain
Vilchis Rito Angel Omar



Grupo 82



Toluca, Mxico. 14 de Marzo de 2013

Reporte de la prctica no. 4: Efectos de la administracin de plomo en sangre
Fecha de realizacin: 07/03/13
Fecha de entrega: 14/03/13

Objetivo: Demostrar la relacin entre alteraciones morfolgicas en eritrocitos, y la
administracin de diferentes concentraciones de plomo en el organismo, as como sus efectos
inmediatos en valores de hemoglobina y hematocrito.
Fundamento
El plomo ha sido objeto de amplios estudios, tanto en animales de experimentacin como en
humanos, los cuales han permitido el conocimiento de su toxicologa. El plomo inorgnico es
transportado en la sangre, y se une al estroma del eritrocito; su concentracin est en
equilibrio con los tejidos blandos, pero no as con el hueso, sitio donde se acumula
preferentemente (t1/2 > 20 aos).
1

Efectos en sangre
En el sistema hematopoytico se observan concentraciones menores de plomo que en otros
sistemas. Los efectos que ocasiona, por orden de sensibilidad, son los siguientes: inhibicin de
D-alanina eritrocitaria, elevacin de la protoporfirina IX eritrocitaria, aumento en excrecin
urinaria de cido d-aminolevulnico y de coproporfirinas, inhibicin de la sodio-potasio
adenosintrifosfatasa eritrocitaria y disminucin de la concentracin de hemoglobina.
1

Otros efectos
A medida que el plomo se distribuye en sangre hacia el resto del organismo, puede ocasionar
severos daos en los diversos sistemas orgnicos.
Sobre el SNC origina una encefalopata saturnina (cuya frecuencia es mayor en nios), esto
debido a que el metabolismo del plomo (tetraalquil plomo a trialquil plomo y este a plomo
inorgnico), es dependiente del citocromo P-450 y se realiza en hgado, la forma trialquilada se
transporta al cerebro, donde inducir los efectos neurotxicos.
Sobre el sistema nervioso perifrico, el plomo produce signos neurolgicos tales como
aminoramiento de la velocidad de conduccin motriz de las fibras de los nervios cubitales,
degeneracin de las clulas de Schwann y posible degeneracin axonal walleriana.
Los efectos renales son de dos tipos: tubular esclertico-fibrtico. El primero consiste en
aminoaciduria, hiperfosfaturia y glucosuria, es reversible y es producido ante exposiciones
breves. El segundo reduce la capacidad de filtracin, es caracterizado por esclerosis y fibrosis
intersticial. Estas alteraciones pueden culminar en insuficiencia renal.
1

Los efectos del plomo en el organismo de acuerdo a su concentracin se muestran en la
siguiente tabla (Tabla 1).

Concentracin de Pb en sangre (g/dL) Efectos
80-100 Signos y sntomas de encefalopata, neuropata
crnica, daos al corazn, infertilidad.
70 Anemia, disfuncin testicular
60 Neuropatas perifricas, complicaciones en el
embarazo
50 Esperma anormal
40 Nacimiento prematuro, problemas cromosmicos.
30 Presin sangunea alta
10 Disminucin en el crecimiento del feto
Tabla 1. Efectos del plomo en la sangre
2

Materiales y Reactivos
Material biolgico
4 ratones
Material
Jeringas de insulina
Tijeras y pinzas de diseccin
Tabla de diseccin
Tubos de ensaye de 13x100
Tubos capilares para
microhematocrito
Pipeta Shali
Pipetas de 5mL
Portaobjetos
Equipo
Centrfuga clnica
Espectrofotmetro uv-visible
Microscopio
Reactivos
Acetato de plomo
Acetato de sodio
Solucin salina al 0.9%
Solucin de Drabkin
Kit o reactivo para la cuantificacin
de hemoglobina
Estndar de cianometahemoglobina
Colorante de Wright
ter
Solucin de heparina
Metodologa

Administrar ratones va
I.P. por una semana
(soluc. salina)
Anesteciar a ratones
con ter y extraer
sangre por puncin
cardiaca
Dividir la sangre en dos
tubos con EDTA
Cuantificar hematocrito
y Hb de uno de los
tubos
De la sangre restante,
hacer un frote y hacer
tincin de Wright
Observar al microcopio
posibles alteraciones
morfolgicas
eritrocitarias
Elaborar una tabla de
resultados

RESULTADOS EXPERIMENTALES
Se pesaron cuatro ratones (controles) a los cuales se les administr durante 5 das, 0.2 ml de
Solucin salina. El da de la prctica se les administr la ltima dosis de solucin salina a los
ratones y se les extrajo sangre para determinar la concentracin de hemoglobina y
hematocrito, arrojando los siguientes resultados.
Tabla 1 Pesos de los ratones control a los cuales se les administro 0.2 ml de solucin
salina
Ratn Peso del ratn (mg)
Ratn 1 10.5
Ratn 2 8.5
Ratn 3 11.9
Ratn 4 9.8

Determinacin de Hemoglobina por el mtodo de la Cianometahemoglobina


Tabla 2 Concentracin de hemoglobina obtenida en ratones control
Ratn Absorbancia obtenida Concentracin de Hemoglobina
Obtenida (g/dL)
Ratn 1 0.261 9.5
Ratn 2 0.216 8.31
Ratn 3 0.212 8.16
Ratn 4 0.284 10.44

Para la determinacin del hematocrito se utilizaron tubos capilares, los cuales se llenaron con
muestra sangunea hasta un 70-80% de su capacidad, posteriormente se tap un extremo del
capilar con plastilina y metieron a la microcentrifuga. Los valores del hematocrito fueron los
siguientes.
Tabla 3 Hematocrito obtenido (%) de los ratones control
Ratn Hematocrito obtenido (%)
Ratn 1 40
Ratn 2 30
Ratn 3 35
Ratn 4 38


Tabla 4. Resultados experimentales de hematocrito y hemoglobina de los ratones de los
diferentes equipos
EQUIPO 1
Hematocrito %
Hemoglobina
g/dL
Conc. Plomo
Ratn 50 mg/Kg p.c.
1 43 17.98 50
2 38 11.8 50
3 - - 50
EQUIPO 2
Hematocrito %
Hemoglobina
g/dL
Conc. Acet. Na
Ratn 50mg/Kg p.c.
1 9.8 5.22 50
2 15.38 4.11 50
3 19.44 5.11 50
4 21.42 3.56 50
EQUIPO 3
Hematocrito %
Hemoglobina
g/dL
Conc. Plomo
Ratn 50 mg/Kg p.c.
1 62.9 30.07 50
2 66.6 12.06 50
3 69.09 12.6 50
4 79.62 17.9 50
EQUIPO 4
Hematocrito %
Hemoglobina
g/dL
Conc. Acetato Na
Ratn 50 mg/Kg p.c.
1 21.5 7.2 50
2 23.7 9.04 50
3 - - 50
4 50
EQUIPO 5
Hematocrito %
Hemoglobina
g/dL
Conc. Acetato Pb
Ratn 100 mg/Kg p.c.
1 35.8 11.7 100
2 43.8 14.4 100
3 38.3 12.5 100
EQUIPO 6 Hematocrito %
Hemoglobina
g/dL
Conc. Acetato Na
Ratn 100 mg/Kg p.c.
1 31.66 15.6 100
2 31.48 14.86 100
3 21.56 9.73 100
EQUIPO 7
Hematocrito %
Hemoglobina
g/dL
Conc. Plomo 100
Ratn mg/Kg p.c.
1 14.6 7.09 100
2 22.2 10.47 100
EQUIPO 8
Hematocrito %
Hemoglobina
g/dL
Conc. Acetato Na
Ratn 100 mg/Kg p.c.
1 20.68 4.118 100
2 28.95 4.3 100
3 22.22 4.19 100
EQUIPO 9
Hematocrito %
Hemoglobina
g/dL
Sol. Salina mg/Kg p.c.
Ratn
1 40 9.5
2 30 8.31
3 35 8.16
4 38 10.44

Anlisis estadstico de los grupos expuestos al acetato de plomo (dosis alta y baja)
Variable 1 Variable 2
Media 10.99166667 17.06833333
Varianza 6.266536667 48.67417667
Observaciones 6 6
Coeficiente de correlacin de Pearson -0.187902557
Diferencia hipottica de las medias 0
Grados de libertad 5
Estadstico t -1.897969036
P(T<=t) una cola 0.058082841
Valor crtico de t (una cola) 2.015048373
P(T<=t) dos colas 0.116165682
Valor crtico de t (dos colas) 2.570581836





DISCUSIN DE RESULTADOS
De acuerdo a los resultados obtenidos de manera experimental, no se pudo comprobar que los
ratones que fueron expuestos a concentraciones de acetato de plomo, a una dosis de 50mg/Kg
y 100mg/Kg de peso corporal respectivamente, mostraran alteraciones en los niveles de
hematocrito y hemoglobina, ya que como se puede ver en la tabla 4, el equipo nmero 1 que
administr dosis bajas de acetato de plomo a los ratones, reporta valores de Hemoglobina(Hb)
y Hematocrito (Hto) que se encuentran dentro de los intervalos de referencia que reporta la
bibliografa. Mientras que el equipo 3 que tambin administr dosis bajas de acetato plomo,
reporta valores de Hb que se encuentran dentro de los valores de referencia a excepcin de un
ratn; sin embargo sus valores de hematocrito son elevados Por otro lado el equipos 5
encargado de la administracin de dosis altas de acetato de plomo, reporta datos de
hemoglobina y hematocrito normales, mientras que el equipo 7 reporta concentraciones de
Hb y Hto normales en un ratn, y en otro se observa una concentracin de hemoglobina baja
al igual que el hematocrito.
Por otro lado, los resultados nos muestran que los ratones administrados con acetato de sodio
ya sean en dosis bajas o altas, presentan una concentracin de hemoglobina y hematocrito por
debajo de los valores de referencia.
Los ratones control a los cuales se les administr solucin salina muestran porcentaje de
hematocrito que entran en los intervalos de referencia reportados en la bibliografa, sin
embargo la concentracin de hemoglobina en un solo ratn se encuentra dentro del intervalo
de referencia, los tres restantes se encuentran muy cercanos pero por debajo de los valores
que maneja la bibliografia.
Al hacer el anlisis microscpico de los frotes de los ratones control, se pudo observar que en
tres de ellos los eritrocitos eran normocrmicos normociticos, sin encontrarse alteraciones
morfolgicas considerables que indicaran algn dao, y en el frote del ratn 4 se observ una
poblacin de eritrocitos normales, mezclada con una pequea poblacin de eritrocitos que
presentaban hipocroma.
De acuerdo a los resultados se puede ver que hay una variacin que no concuerda con la
hiptesis, entre las concentraciones de Hb de los ratones expuestos al agente toxico y de los
ratones control. Todo ello se puede deber a diversos factores como son: las condiciones en las
cuales se encuentran los ratones, la alimentacin, el estrs, la posible presencia de rias entre
ellos, las condiciones en las que llegan inicialmente los modelos experimentales, ya que no se
sabe si desde un inicio los ratones estaban dbiles o presentaban una mala alimentacin, lo
cual modificara los niveles de hemoglobina y hematocrito. Adems de que no se realiz la
pesada de los ratones, despus de la administracin de las diferentes sustancias, lo cual nos
hubiera ayudado a ver en qu condiciones estuvo viviendo el ratn.
CONCLUSIONES
No se puede comprobar que la presencia de plomo en la sangre de los ratones se vea reflejada
en la alteracin de las concentraciones plasmticas de hemoglobina y ni de hematocrito.
En el frote se observaron alteraciones morfolgicas, que pueden o no, ser producto de la
administracin de acetato de plomo o de sodio, o en su defecto a la realizacin de un mal frote
o una mala tincin.
Los clculos realizados para calcular la t de Student muestran que hay variaciones
estadsticamente representativas en la concentracin de Hb, por la exposicin de plomo entre
los dos grupos expuestos a diferentes concentraciones del agente txico.
El grupo control es ms pequeo a comparacin de los que estuvieron expuestos al agente
toxico. El tener un grupo control ms grande, o en su defecto, otro grupo control, nos podra
dar datos ms representativos en nuestro estudio lo que beneficiaria la identificacin de las
variaciones en los niveles de hemoglobina y hematocrito a causa del agente toxico.
Se sugiere la utilizacin de un modelo experimental ms grande (como un conejo), para poder
hacer la determinacin de hemoglobina antes y despus de la administracin del agente
toxico, para ver los efectos producidos en el mismo.

CUESTIONARIO.

1.- Qu relacin existe entre la Hb-L y las alteraciones morfolgicas encontradas?
Al bloquear la sisntesis del grupo hem por el plomo, la membrana del eritocito se vuelve ms
rgida, por lo cual al pasar por los sinusoides, se va a alterar la membrana del eritrocito y se van
a romper, liberando la hemoglobina que se encuentra del eritrocito, que ser detectada en la
sangre como hemoglobina libre. Ademas esta deformacin se podr observar en el frote como
eritrocitos irregulares como acantocitos o equinocitos.


2.- Con qu informacin se cuenta en la actualidad para explicar lo observado en esta
sesin? (Efectos del plomo a nivel de la membrana plasmtica).
El plomo tiene gran afinidad por grupos imidazol, sulfhdrico, amino, carboxilo y fosfato, y
como consecuencia de ello presenta una fuerte unin a las membranas biolgicas, protenas y
numerosas vas metablicas como la fosforilacin oxidativa y la sntesis de la hemoglobina. La
inhibicin de la pirimidin-5'-nucleotidasa podran ocasionar depsitos de cidos nucleicos en
los hemates ocasionando el punteado basfilo de los hemates.
En la membrana citoplasmtica, adems de causar daos peroxidativos en lpidos y protenas ,
el plomo afecta funcionalmente a protenas extracelulares.
El plomo se concentra y produce daos en la mitocondria, reduciendo el metabolismo
energtico celular y favoreciendo la generacin de radicales libres. Tambin inhibe la captura
mitocondrial del calcio citoplsmico a la vez que favorece la liberacin del calcio contenido en
esta organela. Al promover la apertura del poro de transicin mitocondrial, con la consiguiente
liberacin de citocromo C al citoplasma, induce la muerte celular por apoptosis . La sntesis del
grupo hemo, otra tarea de la mitocondria, tambin resulta afectada.
Por su capacidad para sustituir el calcio y otros cationes divalentes en la maquinaria molecular,
los efectos del plomo abarcan prcticamente la totalidad del ambiente celular, lo que permite
rastrear sus secuelas desde la matriz extracelular hasta el ncleo. Si bien muchos de estos
efectos son producto de la interaccin directa del plomo con el componente celular en
cuestin, otros son resultado del mal funcionamiento de procesos ms complejos como la
regulacin gentica, la sntesis de protenas o el metabolismo energtico, en los cuales el
plomo altera la operacin de alguno de sus componentes y amplifica con ello sus efectos a
protenas y sistemas que estructuralmente no son susceptibles a su accin. E



3.- Qu papel juega el acetato de sodio del grupo 3 en la interpretacin de los resultados
obtenidos?

Sirve para demostrar que el anin acetato no tiene efecto toxico a las dosis administradas en
ratones ya que solo sirve de vehculo para trasportar al plomo, pues al estar ste en el
estmago del organismo, debido a que el pH cido hace que se disocie en acetato y plomo
+2
, lo
cual le permite una mayor absorcin en su forma ionizada para despus ser distribuido a la
circulacin sangunea y realizar su efecto en la inhibicin de la sntesis de la protoporfirina.

4.- Investigue y describa los fundamentos de los mtodos que actualmente se emplean para
cuantificar plomo en sangre y orina. As como de los biomarcadores de efecto que son
empleados en el diagnstico de la intoxicacin con plomo.
PLOMO EN SANGRE

Existen diferentes mtodos de laboratorio para determinar las concentraciones de plomo
en la sangre. Los ms comunes son la espectrometra de absorcin atmica, la
voltamperometra de redisolucin andica y la espectrometra de masa con fuente de
plasma de acoplamiento inductivo. Adems, hay un dispositivo porttil, fcil de usar, que
emplea la tecnologa de la voltamperometra de redisolucin andica para realizar
determinaciones de plomo en la sangre en el lugar de consulta.

Espectrometra de absorcin atmica
La espectrometra de absorcin atmica se basa en el principio de que los tomos libres
absorben la luz a longitudes de onda caractersticas del elemento que se desea estudiar. La
cantidad de luz absorbida se correlaciona linealmente con la concentracin del analito en la
muestra Para realizar una determinacin mediante espectrometra de absorcin atmica, la
muestra que contiene plomo se debe p rimero procesar para generar tomos en estado
fundamental en forma de vapor en la trayectoria del haz luminoso del instrumento.

Espectrometra de absorcin atmica por llama
La espectrometra de absorcin atmica por llama utiliza una llama de flujo laminar de una
mezcla de acetileno y aire o de xido nitroso, acetileno y aire para atomizar el plomo a
temperaturas de entre 2000 y 3000 C, segn la mezcla de gases. El lmite de deteccin
depende de la preparacin de la muestra y del mtodo utilizado.

Dispositivos de voltamperometra de redisolucin andica
Para realizar determinaciones mediante voltamperometra de redisolucin andica, se colocan
en la muestra de sangre un electrodo de referencia y un electrodo de grafito con pelcula fina
de mercurio. Luego se aplica un potencial negativo al electrodo de mercurio durante algunos
segundos, lo que hace que el plomo y otros cationes presentes en la muestra se concentren en
la superficie del electrodo de mercurio cargado negativamente. Luego se invierte la direccin
del potencial para aplicar un potencial cada vez mayor durante algunos minutos. Cuando el
voltaje alcanza el voltaje especfico y caracterstico para el plomo, el electrodo libera todos los
iones (redisolucin) y, por lo tanto, produce una corriente que se puede medir. La corriente
producida es proporcional al nmero de iones de plomo liberados y se puede comparar con
soluciones de calibracin para determinar la concentracin de plomo en la muestra.

Espectrometra de masa con fuente de plasma de acoplamiento inductivo
La espectrometra de masa con fuente de plasma de acoplamiento inductivo es una tcnica
que permite analizar mltiples elementos y utiliza una fuente de plasma de acoplamiento
inductivo (un gas ionizado a temperatura muy alta compuesto de electrones e iones con carga
positiva) para atomizar la muestra y posteriormente ionizar los tomos que se desea analizar.
Los iones se extraen del plasma y se hacen pasar por un espectrmetro de masa, en el cual se
los separa y mide sobre la base de s u relacin masa/carga. Con este mtodo, el lmite de
deteccin para la determinacin directa de la concentracin de plomo en la sangre es de
aproximadamente 0,1 g/dl.

Otra prueba disponible para la determinacin de plomo en sangre es la medicin del nivel
de protoporfirina eritroctica (PE). La protoporfirina es el sustrato de la hierroquelasa que
constituye la ltima enzima del grupo hem. Este grupo est distribuido de manera ubicua.
Por ende, los niveles de PE constituyen un indicador de los efectos del plomo en todos los
tejidos. En general, existe una correlacin entre estos niveles y los de la sangre cuando
estos ltimos superan los 20 g/dl.
PLOMO EN ORINA
El mtodo "Determinacin de plomo en orina Mtodo de quelacin-
extraccin/Espectrofotometra de Absorcin Atmica" es un es un mtodo aceptado por
el Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo (INSHT). Como mtodo aceptado
se entiende: un mtodo utilizado en el INSHT y que ha sido sometido a un protocolo de
validacin por organizaciones oficiales competentes en el tema, o bien ha sido adoptado
como mtodo recomendado por entidades profesionales; as como, aquellos mtodos
recomendados por la UE o basados en mtodos ampliamente conocidos y utilizados por
especialistas en este tipo de anlisis. La muestra de orina se recoge en un frasco de
polietileno, utilizando cido ntrico como conservante. El plomo se compleja con
pirrolidinditiocarbamato de amonio (APDC) y el complejo se extrae con isobutilmetilcetona
(MIBK). El plomo contenido en la fase orgnica s determina por espectrofotometra de
absorcin atmica con llama a una longitud de onda de 283,3 nm, utilizando un mtodo
directo de cuantificacin.
La concentracin del cido-delta aminolevulnico (ADAL) precursor de las porfirinas,
puede detectarse en sangre total como un indicador de exposicin aguda al plomo y en
orina, principalmente en recoleccin de 24 horas, una muestra aleatoria de orina no es
confiable, ya que las concentraciones aumentan hasta que el Pb alcanza valores de 40
mcg/dl (1.92 mmol/L).
Determinacin de coproporfirina. En el saturnismo existe principalmente elevacin de la
coproporfirina del tipo II, con una elevacin concominante del tipo I. La excrecin de ms
de 500 mcg/24 horas indica un exceso de contenido de plomo.
Referencias:
1. Repetto Manuel. Toxicologa avanzada. Daz de Santos. Mxico. 1995. Pp. 308-309
2. Jimenez B. E. La Contaminacin Ambiental en Mxico. Limusa. Mxico. 2002. Pp. 342
3. http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/77917/1/9789243502137_spa.pdf