C18 Spanish

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Shodex
Gua del Usuario de la columna C18

Ver. Marzo 2012

INTRODUCCIN

La columna C18 o de octadecilo es la ms usada de las columnas HPLC,
debido a su amplia utilidad. Se emplea para el modo de separacin de fase reversa
(FR), en la cual los componentes de una muestra son separados basados en la
diferencia de sus polaridades que crea interacciones de fuerzas especficas entre el
gel, la fase movible y el analito. El modo de fase reversa es el ms adecuado para el
anlisis de compuestos hidrofbicos orgnicos, aunque tambin se pueden analizar
molculas inicas a travs de la optimizacin de la fase movible.

El material de empaque de la columna de fase reversa es, tpicamente, gel de
slice, y se modifica con varios grupos funcionales hidrofbicos, entre los cuales el
octadecilo es el ms comnmente empleado; por ello, las columnas C18 son
tambin llamadas frecuentemente columnas ODS (octadecyl silica). El grupo
funcional es una cadena recta de 18 carbonos; un gran nmero de hidrocarburos de
esta cadena est atado en la superficie del gel de slice como tambin dentro de sus
poros. Hay una amplia gama de columnas C18 de diferentes fbricas que estn
disponibles en el mercado; sin embargo, no todas son intercambiables. Cada una es
diferente en la caracterstica del silanol, en la carga de carbono, en el tamao de las
partculas, de los poros, etctera. Esta publicacin est hecha para presentar las
columnas Shodex C18.

CARACTERSTICAS DE LA COLUMNA SHODEX C18

Las columnas Shodex C18 estn llenas de gel de slice esfrico de alta
pureza totalmente porosa y qumicamente modificada con el grupo funcional C18
(Carga de carbono 17%). El gel tiene un tapado final fully end-capped para
suprimir la influencia de los residuos de sinalol. Las columnas estn disponibles en
tres tamaos con dos diferentes tamaos de partculas. Debido a que las columnas
Shodex C18 no tienen un costo elevado en comparacin con las columnas de base
de polmero, no requieren de un guarda-columna, pues su costo no sera efectivo.

Nmero de Platos Tericos (TPN) calculado usando n-Amylbenzene peak.

Solvente de envo: Metanol/agua = 75/25.
2

Las columnas Shodex C18 son adecuadas para el uso con los sistemas
HPLC ms disponibles comercialmente. El material de cubierta de la columna es
acero inoxidable SUS316; sin embargo, las tuercas de compresin y frulas podran
ser de dos tipos de material SUS316 o de PEEK (N 10-32 UNF). Igualmente las
tuberas de conexin, pueden ser de SUS316 con medidas de 1/16 OD x 0.010 ID
(dimetro interior) o las tuberas de material PEEK. Por lo general, se utilizan las
tuberas PEEK que son ms fciles de manejar que las SUS316, ya que aquellas
evitan crear espacio muerto o montajes sueltos en las conexiones. Adems, por la
misma razn, es siempre recomendable usar las tuberas ms cortas en tamao.
Las tuberas PEEK se emplean para los solventes orgnicos y fase mvil acuosa.
3

Generalmente, las partculas esfricas de 3 y 5 m de gel de slice son los
ms usados. La columna de gel de 5 m es el tipo ms empleado y de un costo ms
accesible. Sin embargo, la columna C18-4C, con partculas de 3 m, est
empaquetada en una cubierta de columna ms corta que las columnas de 5 um, lo
cual proporciona un anlisis ms rpido y, a la vez, mantiene una resolucin ms
alta. Se debe seleccionar el tamao de la columna teniendo en consideracin tanto
el tipo de muestra, matriz, tamao del analito, como los requerimientos del anlisis
(por ejemplo, la resolucin versus el tiempo analtico).

En su mayor parte, el material de relleno de gel de slice est hecho para
tener un gran nmero de poros, de modo que provee una mayor rea de superficie
que incrementa la interaccin de los solutos con el gel. El tamao del poro de la
columna Shodex C18 es de 120 , el cual proporciona una condicin analtica
adecuada para propsitos generales de separacin con fase reversa.

La presin mxima para las columnas C18-4D y 4E es de 19.6 MPa, y para la
columna C18-4C, de 25 MPa. Exceder estos lmites puede producir una presin
excesiva en la cabeza de la columna y empujar la cama estacionaria, lo cual genera
problemas cromatogrficos como picos amplios, baja eficiencia y/o asimetra en los
picos. Asimismo, aplicar una presin demasiado alta sobre la columna puede
generar la disminucin de su vida til.

Las columnas Shodex C18 pueden tener una vida til bastante larga, pues su
presin es ms baja que la presin creada por columnas tradicionales ODS (vase
la figura 1). La contrapresin es un buen indicador de la condicin de la columna;
por lo tanto, es recomendable tener un rcord del historial de uso de la columna. Si
la presin empieza a incrementar, un procedimiento de lavado de columna podra
resolver el problema.

Figura 1. Contrapresin de la columna observada bajo diferentes condiciones de eluyente.
Columna: Shodex C18-4D. Eluyente: metanol o acetonitrilo (ACN), y agua. Flujo: 1.0 ml/min.
Temperatura de la columna: 30 C.

4

Por lo general, el gel de slice tiene buena estabilidad fsica y qumica. Sin
embargo, tiene que ser manejado bajo ciertas condiciones para asegurar una larga
vida a la columna y un rendimiento constante.

La slice ms ampliamente usada funciona de manera estable en un rango de
pH entre 2 y 7.5. En un pH menor a 2, el enlace de siloxano se hidroliza y genera
enlaces de fase perdida. El grupo creado de silanol expuesto, es de cargas
negativas; por lo tanto causa una fuerte atraccin de compuesto de cargas positivas
o metales de iones que vienen en la muestra. Esto puede generar una cola en el
pico o una permanente absorcin de los compuestos en el gel. Por otro lado, en el
caso de un pH arriba de 7.5, la slice se disuelve y ello causa la creacin de un
vaco en la cama estacionaria de la columna, el cual, obviamente, va a afectar su
rendimiento. Por eso, cuando se usa un bfer acuoso, se requiere un cuidado en el
ajuste del pH.

La durabilidad de las columnas Shodex C18 en condiciones cidas (pH 2.0) y
alcalinas (pH 9.0) ha sido probada. Como eluyente cido, se us 0.1% de cido
trifluoroactico y, como un eluyente alcalino, 0.1 M de Na
2
PO
4
/Metanol=60/40. Se
inyect difenilo (20 ug/ml, 1.5 ul) varias veces para monitorear el tiempo de
retencin y la disponibilidad del nmero de platos tericos sobre un tiempo. Los
resultados muestran que no haba cambios considerables (<10%) en el rendimiento
de la columna, incluso despus de 600 horas de uso (vase la figura 2).

Figura 2. Durabilidad probada en condiciones (a) cidas y (b) alcalinas
Columna: Shodex C18-4D. Muestra: 2 ug/ml difenilo, 1,5 ul. Eluyente: (a) 0.1% cido trifluoroactico
(pH 2.0); (b) 0.1 M Na HPO
4
(pH 9.0)/metanol=60/40. Proporcin de flujo: 0.7 ml/min. Temperatura de
la columna: 40 C. Detector: UV (254 nm).

Ntese que esto no garantiza el uso de la columna en un pH de 9.0.

5

Idealmente, toda la superficie del gel de slice est modificada con el grupo
funcional C18; sin embargo, quedan espacios que no son modificados, llamados
residuos de silanol. Su presencia puede influir en el rendimiento y la forma del
pico cromatogrfico; por ello, frecuentemente, al gel se le aplica un tope final para
inmovilizar dichos residuos, al cual se le conoce como end capping. Las columnas
Shodex C18 estn llenas con un gel con un tope final completo, tal como la mayora
de las columnas ODS de hoy en da. El beneficio de esta caracterstica est
comprobado por la forma del pico observado con una sustancia bsica como es la
amitriptyline. La figura 3 demuestra el clculo de los nmeros de platos tericos de
la columna Shodex C18, que proporciona un rendimiento competitivo de separacin,
en comparacin con las columnas C18 de otras industrias lderes.

Figura 3. Comparacin del rendimiento de la columna C18 en anlisis de compuestos cidos,
alcalinos y neutros. Eluyente: ACN/50 mM KH
2
PO
4
(pH 3.0)=50/50. Flujo: 1.0 ml/min. Temperatura de
la columna: 35
o
C. Detector: UV (254 nm)

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La variacin en el rendimiento de la columna de un lote de fabricacin a otro
es muy estable con las columnas Shodex ya que se producen bajo un estricto
control de calidad: cada uno de los lotes y cada columna pasa por un proceso de
prueba. Todas las columnas cuentan con un certificado de anlisis (CoA) que
certifica la prueba de calidad. La figura 4 presenta los resultados consistentes
obtenidos en tres lotes probados. La reproducibilidad del tiempo de retencin y las
formas de los picos obtenidos, se debe a la mnima influencia de los metales, al
buen control y a la eficiencia del tapado final.

Figura 4. Columna: Shodex C18-4D. Flujo: 1.0 ml/min. Temperatura de la columna: 40
o
C. Detector:
UV (254 nm)

7

GUA DE USO GENERAL DE LA COLUMNA SHODEX

Fase movible
Una mezcla de una solucin amortiguadora acuosa y solventes orgnicos
polares, como el metanol y el acetonitrilo, es comnmente usada para la fase
reversa. La separacin de sustancias inicas puede ser mejorada usando una
solucin amortiguadora de pH, o agregando sal y/o reactivos de iones. Los reactivos
para el apareamiento de iones recomendados son tetrabutilamonio para muestras
de cido, y pentano sulfonato para muestras bsicas (Ver ejemplos de aplicaciones
para otros reactivos y sales usados). Si el anlisis requiere reactivos para el
emparamiento de iones, se recomienda reservar una columna exclusivamente para
este mtodo, pues es muy difcil remover completamente un reactivo de este tipo
para restaurar la columna a su condicin original. El pH de la fase movible debe ser
ajustado entre pH 2.0 y 7.5. La filtracin y la desgasificacin de la fase movible son
altamente recomendadas. Pequeas partculas presentes en la fase movible pueden
daar la columna, as como la presencia de gas puede interferir en el rendimiento
analtico.

Primer uso de la columna
1. Revise la columna cuidadosamente para ver si ha habido dao durante el
transporte (conserve la caja para guardar la columna ms adelante).
2. Antes de conectar la columna, reemplace el solvente en el sistema de HPLC,
con la fase movible que se usar.
3. Conecte las lneas de tuberas a un terminal de la columna, siguiendo la
direccin del flujo indicada en la etiqueta.
4. Si slo se requiere emplear una simple muestra de agua y solventes
orgnicos como fase movible, se pueden introducir en la columna
directamente. Si la solucin que se va usar tiene una solucin amortiguadora,
primero enjuague la columna con agua y luego reemplcela con la fase
movible.
5. Introduzca la fase movible con un flujo bajo (<0.2 ml/min) y cuando el
disolvente est brotando de otro terminal de la columna, conecte la columna
al detector.
6. Gradualmente, incremente la proporcin del flujo, hasta que alcance la
velocidad adecuada.
7. Tenga cuidado de no exceder la presin mxima propuesta anteriormente.
8. Es recomendable que se revise el rendimiento de la columna, usando los
mismos estndares y ajustes indicados en el certificado de anlisis.

El tiempo requerido para acondicionar una columna depende de su tamao.
Por lo general, se requiere de 10 a 20 veces el volumen de la columna para
equilibrarla. Este volumen es alrededor de 20 ml, 25 ml y 40 ml para las columnas
de 4.6 x 150 mm, 4.6 x 150 mm y 4.6 x 250 mm respectivamente (10 veces el
volumen de la columna). Durante el equilibrio de la columna, se recomienda usar
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flujo lento (0.3 ml/min); cuando el mtodo es de emparejamiento de iones, el
equilibrio toma ms tiempo.

Al terminar el anlisis
1. Si la fase movible es un simple eluyente de solvente orgnico y agua, se
puede apagar la bomba y se puede dejar la columna en el sistema por un
corto tiempo (durante la noche). Tambin es posible dejar la columna en el
sistema, simplemente bajando la proporcin del flujo.
2. Si el eluyente usado contiene bfer, enjuague la columna con el eluyente sin
bfer para remover la sal.
3. Si la columna no ser usada por ms de 3 das, remuvala del sistema de
HPLC.
4. Cierre bien las entradas de la columna con los tapones, para prevenir que se
sequen.
5. Guarde la columna en la caja original y colquela en un cuarto a temperatura
ambiente.
6. Algunas veces, se requieren temperaturas altas, para mejorar la solubilidad
de los compuestos de la muestra. La temperatura mxima de uso para la
columna Shodex C18 es de 80 C; ms arriba de esta temperatura, la slice
comienza a degradarse, lo cual debe ser evitado. Si la columna fue calentada
durante el anlisis, primero se debe apagar el horno y slo cuando la
columna est fra, se puede parar detener la bomba.

Desarrollo del mtodo
Como se ha mencionado antes, la columna C18 funciona bajo el modo de
fase reversa, en el cual la separacin se basa en la polaridad de los diferentes
componentes: las sustancias con menor polaridad sern retenidas a mayor tiempo
dentro de la columna que las sustancias ms polares. El tiempo de retencin puede
ser controlado por la composicin de la fase movible. Para la optimizacin de esta
fase, se recomienda un enfoque sistemtico.

El requerimiento ms importante para la seleccin de la fase movible, es
disolver completamente la muestra. El ratio del solvente orgnico y del solvente
acuoso, controla el tiempo de retencin y la agudeza del pico. Tambin se debe
tener en cuenta que la proporcin y el tipo de solvente orgnico, influyen en la
viscosidad de la fase movible y por lo tanto, en la contrapresin de la columna
(figura 1).

Las columnas C18 pueden ser usadas por los dos mtodos: isocrticos y de
lnea de gradiente. El bfer casi siempre ayuda a mejorar la separacin y la forma
del pico de anlisis, de sustancias inicas. Tener conocimiento del PKa de cada
analito, ayudar a decidir el pH de la fase movible. Condiciones cidas de pH 2-4,
generalmente favorecen al anlisis de los compuestos cidos. La concentracin
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tpica de un bfer es de 10-25 mM. Demasiada sal tiende a erosionar el gel e
incrementa la solubilidad de la slice; por lo tanto, ello debe ser evitado.

La presencia de pequeas partculas en la muestra, puede causar que la
columna se dae y se tape. Se recomienda siempre filtrar la muestra usando un
filtro de membrana de <0.45 um antes de cada inyeccin.

Indicacin de alteracin de la columna
Algunos indicadores de alteracin en la columna, son cambios en la forma del
pico (pico ancho, separacin del pico, cola/frente, etctera), disminucin de la
eficiencia en la separacin, cambio en tiempo de retencin, ruido en la base de
lnea, entre otros. Algunos de estos problemas pueden ser resueltos limpiando la
columna.

El incremento de la presin, es otro indicador de una alteracin de la
columna. Sin embargo, este problema tambin puede ser consecuencia del bloqueo
de los tubos de conexin, del inyector o de los tubos del detector. Por lo tanto, antes
de limpiar la columna, es siempre una buena idea averiguar el origen del incremento
de la presin.

Sugerencias para la limpieza de las columnas Shodex C18
El uso de un solvente ms fuerte (solvente menos polar para la fase reversa
que el de la fase mvil ayuda, generalmente a remover las sustancias absorbidas. Si
esto falla, se pueden agregar solventes no polares como tetrahidrofurano al
eluyente metanol/agua para ayudar a la elucin. Otra opcin es el uso de 100% de
tetrahidrofurano o cloroformo. Cuando se usa el reactivo de par inico de amino (por
ejemplo, trimetilamina o tetrabutilamonio), se recomienda enjuagar con una mezcla
de metanol/0.05% cido fosfrico 50/50 antes de introducir metanol. Adems, se
sugiere no cambiar de bfer a solvente orgnico o viceversa, pues ello puede
causar la precipitacin del bfer. Use solventes intermediarios (eluyente sin bfer o
agua) para cambiar de uno a otro.

Por lo general, es recomendable usar un flujo bajo aproximadamente 1/3
del flujo regular, e introducir entre 5 y 10 veces el volumen de la columna por cada
solvente (cerca de 20 ml por 250 mm de columna). No es recomendable poner las
columnas Shodex al revs. Siempre es conveniente disponer de una columna de
respaldo, ya que, si una empieza a fallar, la puede reemplazar por la segunda
columna y, cuando tenga tiempo, trate de limpiar la que presenta problemas. De
esta manera, adems, podr probar si el origen del inconveniente es la columna o si
este se encuentra en otro lugar del sistema de HPLC o del detector.

Largo tiempo de almacenado (ms de una semana)
1. Despus de limpiar la columna, reemplace el eluyente de la columna con
metanol/agua (75/25), metanol puro o ACN.
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2. Nunca deje un solvente orgnico para guardar la columna.
3. Cierre bien las entradas de la columna con los tapones para prevenir que se
seque.
4. Guarde la columna en su caja original y colquela en un cuarto a temperatura
ambiente.

Otras precauciones generales
1. No remueva los ajustes terminales (end fittings) bajo ninguna circunstancia.
Las columnas Shodex no estn hechas para ser rellenadas.
2. No permita que las columnas reciban algn impacto fuerte como golpes o
cadas al piso.

Por ltimo
Siempre que una columna ODS no sea la adecuada o sea incapaz de
analizar sus compuestos objetivos, Shodex presenta una gran gama de columnas
polimricas para la fase reversa, as como columnas para otros modos de
separacin que pueden resolver su problema analtico.

APNDICE: EJEMPLO DE UNA HOJA DE REGISTRO DE COLUMNA

Como se mencion en el texto, es una buena prctica de laboratorio
mantener un cuaderno de registro. Es recomendable hacer una hoja de registro y
mantener una por cada columna. Abajo se presenta un ejemplo.

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1. Acetylacetone 2. Acidic sample (Benzoic, Toluic acids)
5. Anticonvulsant 6. Anti-inflammatory agent
Sample: 10 uL
1. Benzoic acid 10 ppm
2. p-Toluic acid 5 ppm
3. p-Ethyl benzoic acid 5 ppm
Eluent: ACN/0.1% Phosphoric acid=50/50
Flow rate: 1.0 mL/min
Column temp.: 30
o
C
Detector: UV (240 nm)
3. Acidic sample (Hydrobenzoic acids) 4. Acidic sample (Salicylic acids)
Sample: 10 uL, 10 ppm each
1. p-Hydroxybenzonate methyl
2. p-Hydroxybenzoic acid ethyl
3. p-Hydroxybenzoic acid propyl
4. p-Hydroxybenzoic acid butyl
Eluent: ACN/H2O=50/50
Column temp.: 30
o
C
1. p-Methylsalicylate
2. p-Salicylic acid ethyl
3. p-Salicylic acid propyl
4. p-Salicylic acid butyl
Column temp.: 30
o
C
Sample: 20 uL
1. Ethosuximide 100 ppm
2. Phenytoin 10 ppm
3. Phenobarbital 10 ppm
4. Primidon 10 ppm
5. Carbamazepine 10 ppm
Eluent: 100 mM Phosphate buffer (pH 2.1)/MeOH/ACN=4/2/1
Column temp.: 40
o
C
Sample: 10 uL
1. Salicylic acid 5 ppm
2. Diphenhydramine 5 ppm
3. Methyl salicylate 5 ppm
4. dl-Camphor 2000 ppm
5. Thymol 5 ppm
Eluent: 10 mM Phosphate buffer (pH 2.6) + 20 mM Heptane Na
sulphonate/MeOH/ACN=3/2/2
Column Temp.: 45
o
C
Sample10 uL
Acetylacetone 10 ppm
Eluent: 20 mM Phosphate buffer (pH 7.6)/MeOH= 30/70
Column temp.: 40
o
C
12

c

9. Basic sample (Scopolamine, Atropine)
11. Berberine 12. Bile acid
1. Scopolamine
2. Atropine
Eluent: 10 mM Phosphate buffer (pH 2.6)/ACN=5/1
Column temp.: 40
o
C
Sample: 20 uL
Berberine 10 ppm
Eluent: 3.4 g K dihydrogenphosphate and 1.7 g Na lauryl
sulfate dissolved in water to make up 1 L solvent/ACN=1/1
Column temp.: 40
o
C
1. Cholic acid
2. Glucocholic acid
3. Taurocholic acid
4. Chenodeoxycholic acid
Eluent: ACN/30 mM (NH4)2HPO4 (pH 7.2 NH4H2PO4)
A=10/90, B=50/50 Gradient; 30% B 85% B (55 min)
Column temp.: 40
o
C
7. Arbutin 8. Asulam
Sample: 20 uL
1. Arbutin 200 ppm
2. Hydroquinone 100 ppm
3. Gallic acid 100 ppm
Eluent: 100 mM Phosphate buffer (pH 2.1)/MeOH=40/1
Column temp.: 35
o
C
Sample: 5 uL
Asulam 10 ppm
Eluent: 50 mM Phosphate buffer (pH 3.3)/ACN=90/10
Column Temp.: 40
o
C
5. Glucochenodexycholic acid
6. Deoxycholic acid
7. Taurochenodeoxycholic acid
8. Taurodeoxycholic acid

10. Basic sample
(Procainamide, N-Acetylprocainamide)
Column Temp.: 40
o
C
1. Procainamide
2. N-Acetylprocainamide
13

14. Cold remedy (1)
15. Cold remedy (2)
Eluent: ACN/H2O/Phosphoric acid= 510/490/1
+0.5% Na dodecyl sulfate
Column temp.: 50
o
C
Sample: 10 ug
1. Thiamine 5 ppm
2. Noscapine 20 ppm
3. Dextromethorpban 10 ppm
Sample: 5 uL
1. Acetaminophen 50 ppm
2. Caffeine 20 ppm
3. Riboflavin 20 ppm
4. Potassium guaicol-4-sulfonate 50 ppm
5. Phenol 50 ppm
Eluent: H2O/ACN/50 mM Tetrabutylammonium hydrogensulfate
=15/2/1, pH=2.7
Column temp.: 50
o
C
18. Glycyrrhizin
Sample: 10 uL
1,5-dihydroxyanthraquinone 10 ppm
Column temp.: 40
o
C
Sample: 10 uL
1. Hypoxanthine 5 ppm
2. IMP 10 ppm
3. ADP 30 ppm
4. AMP 30 ppm
5. Inosine 10 ppm
6. ATP 50 ppm
Eluent: 24 mM 2-Diethylaminethanol in 16 mM Citric acid (aq)
Column temp.: 40
o
C
13. Catecholamine
Sample: 10 uL
1. Norepinephrine 20 ppm
2. Epinephrine 30 ppm
3. 3,4-Dihydroxyphenylacetic acid 30 ppm
4. Normetanephrine 50 ppm
5. Dopamine 50 ppm
6. 5-Hydroxyindole-3-acetic acid 5 ppm
7. Isoproterenol 50 ppm
8. Homovanilic acid 50 ppm
9. 5-Hydroxytriptamine 50 ppm

Eluent: 0.1 M Citric acid,
0.1 M Na acetate (pH
4.0), 17% MeOH, 1-
Octane Na sulphonate
160 mg/L, EDTA 5 mg/L
Column Temp.: 25
o
C
Eluent: 1+14 diluted acetic acid/ACN=3/2
Column temp.: 30
o
C
Sample: 10 uL
1. Glycyrrhizin 100 ppm
2. Propyl paraben 10 ppm
16. 1, 5-dihydroxyanthraquinone
17. Freshness K value
14

19. Hippuric acid
21. Nucleic acid base, Nucleoside
Sample: 10 uL
1. Hippuric acid 50 ppm
2. o-Methyl hippuric acid 100 ppm
3. p-Methyl hippuric acid 50 ppm
4. m-Methyl hippuric acid 100 ppm
Eluent: 20 mM Phosphate buffer (pH 2.5) + 10 mM -Cyclodextrin/ACN=8/1
Column temp.: 50
o
C
23. Organic acids
20. Iprodione, Bensulide
24. Paeoniflorin
22. Nucleoside, Nucleotide
Eluent: 0.1 M KH2PO4 (pH 5.8) 20 mM Na2SO4
Column temp.: Ambient
Eluent: 5 mM H3PO4
Column temp.: 40
o
C
Eluent: 10 mM Na acetate (pH 4.8)/ACN=5/1
Column temp.: 40
o
C
Sample: 5 uL
1. Iprodione 10 ppm
2. Bensulide 10 ppm
Sample: 10 uL
1. Cytosine 5 ppm
2. Uracil 10 ppm
3. Guanine 5 ppm
4. Adenine 2 ppm
5. Cytidine 10 ppm
Sample: 10 uL
1. Tartaric acid 50 ppm
2. Malic acid 50 ppm
3. Acetic acid 80 ppm
4. Citric acid 100 ppm
5. Succinic acid 80 ppm
6. Propionic acid 100 ppm
Sample: 20 uL
Paeoniflorin 10 ppm

Column temp.: 40
o
C
Eluent: 100 mM Phosphate buffer (pH 2.1) 0.2 M NaClO4
Column temp.: 50
o
C
6. Uridine 10 ppm
7. Thymine 10 ppm
8. Adenosine 5 ppm
9. Guanisine 20 ppm
10. Thymidine 20 ppm

Sample: 10 uL
1. Cytidine 5-monophosphate 50 ppm
2. Uradine 5-monophosphate 10 ppm
3. Guanosine 5-monophosphate 5 ppm
4. Adenosine 5-triphosphate 20 ppm
5. Cytidine 20 ppm
6. Uridine 20 ppm
7. Adenosine 5-monophosphate 50 ppm
8. Inosine 20 ppm
9. Guanosine 50 ppm
15

25. Paraben
Column Temp.: 40
o
C
26. Phenolic antioxidant
27. Saccharine, Aspartame, Benzoic acid,
Sorbic acid
30. Vitamin (Water-soluble)
Eluent: A; 10 mM Phosphoric acid buffer (pH 2.6) B; A/ACN=1/9
Gradient; 40% B (0-4 min) 73% B (4.01-10 min)
100% B (10.01-16 min) 40% B (16.01-25 min)
Column temp.: 40
o
C
Sample: 20 uL
1. PG 1 ppm
2. THMB 5 ppm
3. NDGA 3 ppm
4. BHA 5 ppm

Sample: 10 uL
1. Saccharin 2 ppm
2. Benzoic acid 0.5 ppm
Eluent: 40 mM Acetate buffer (pH 4.0)/MeOH=65/35
Column temp.: 40
o
C
28. Thiuram
29. Vitamin (Fat-soluble)
Sample: 5 uL
Thiuram 10 ppm
Column temp.: 40
o
C
Sample: 10 uL
1. Pyridoxal 10 ppm
2. Pyridoxine 10 ppm
3. Pyridoxamine 20 ppm
Eluent: 100 mM Phosphate buffer (pH 2.1)
+ 50 mM Hexane Na sulphate/ACN=9/1
Column temp.: 45
o
C
Sample: 20 uL
1. Vitamin A 50 ppm
2. Vitamin D2 25 ppm
3. Vitamin D3 25 ppm
Eluent: 100% ACN
Column temp.: 40
o
C
Sample: 10 uL
1. Methyl paraben 10 ppm
2. Ethyl paraben 10 ppm
3. Isopropyl paraben 10 ppm
4. Propyl paraben 25 ppm
5. Isobuthyl paraben 25 ppm
6. Butyl paraben 50 ppm
5. OG 2 ppm
6. HMBP 5 ppm
7. DG 2 ppm
8. BHT 5 ppm

3. Aspartame 50 ppm
4. Sorbic acid 0.5 ppm

4. Vitamin E 100 ppm
5. Tocopherol acetate 100 ppm

16

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420 Lexington Avenue Suite 2850
New York, NY, 10170
Contact: support@shodex.net
Web: www.shodex.net

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1

Gua del Usuario de la columna C18

Nmero de Platos Tericos (TPN) calculado usando n-Amylbenzene peak.

Ntese que esto no garantiza el uso de la columna en un pH de 9.0.

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