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Universidad Nacional de Rosario- Facultad de Ciencias

Bioqumicas y Farmacuticas






Gua de ejercicios

Qumica Biolgica

2013










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QUMICA BIOLGICA - 2013

ESPECTROFOTOMETRA


1. El coeficiente de extincin del NADH a 340 nm es de 6.22 mM
-1
.cm
-1
. Calcular las
concentraciones de las soluciones de NADH cuando los valores de absorbancia obtenidos son: a) 0.6;
b) 0.15. Exprese los resultados en nM y mM. Considere un paso ptico de 1 cm.

2. Una solucin que se encuentra en una cubeta de 1 cm de espesor contiene 2 g/l de una sustancia
absorbente de luz y transmite el 75 % de la luz incidente a una determinada longitud de onda. Calcular
la absorbancia de una solucin que contenga a) 4 g/l; b) 1 g/l. Si el peso molecular del compuesto es
250, calcule el coeficiente de extincin molar.

3. Una solucin de protena (0.3 ml) fue diluida con 0.9 ml de agua. A 0.5 ml de esa solucin
diluida se le agregaron 4.5 ml del Reactivo de Biuret y se esper hasta completarse la reaccin de
color. La absorbancia de la mezcla a 540 nm fue de 0.18 en un tubo de ensayo de 1 cm de dimetro,
luego de restar el blanco. Una solucin standard (0.5 ml conteniendo 4 mg de protena/ml) a la que se
agregaron 4.5 ml del Reactivo de Biuret dio una absorbancia de 0.12 en un tubo de ensayo de iguales
caractersticas. Calcular la concentracin de protena en la solucin desconocida.

4. El cido pirvico puede determinarse colorimtricamente por conversin en su
2,4-dinitrofenilhidrazona seguido de la adicin de lcali. La reaccin se llev a cabo en un volumen
final de 3 ml, con soluciones que contenan 1 ml de diversas cantidades de cido pirvico,
obtenindose los siguientes resultados:

Ac. pirvico (g) 0 20 40 60 70 80 100 125 150
Lecturas 0.01 0.140 0.267 0.400 0.750 0.525 0.638 0.760 0.775

Se analizaron por este mtodo una serie de soluciones desconocidas de cido pirvico (1 ml de cada
una) obtenindose las siguientes lecturas de absorbancia a) 0.565; b) 0.125; c) 0.683; d) 0.889. Por
otro lado, 100 l de una solucin patrn 5 mM de cido pirvico (PM=88.06) mostr una lectura de
0.335 (considerar bco. de reactivos de 0.01) en un volumen final de 3 ml. Grafique la curva de
calibracin con los resultados mostrados en la tabla. Calcule la concentracin en ug/ml de las
soluciones desconocidas usando la curva previamente realizada y el valor de la solucin patrn como
nico dato. Compare los resultados.


AMINOCIDOS


1. Cada uno de los grupos ionizables de un aminocido tiene dos estados posibles de ionizacin:
cargado y no cargado (por ejemplo, -COOH, -COO
-
). Por lo tanto una molcula con n de tales grupos
tiene 2
n
estados posibles de ionizacin. a) Escriba los cuatro estados posibles de ionizacin del
aminocido Ser. b) A simple vista, indique cul estado de ionizacin predomina a valores de pH=1,
pH=3, pH=pI, pH=7, pH=11.

2. a) Una mezcla de los siguientes aminocidos se somete a electroforesis a pH=3,9: Ala, Ser, Phe,
Leu, Arg, Asp, e His. Cul ir hacia el nodo (positivo)? Cul ir hacia el ctodo (negativo)? b) A
menudo los aminocidos con cargas idnticas se separan ligeramente durante la electroforesis: por
ejemplo la Gly se separa de la Leu. Puede sugerir una explicacin para esto?


2

3. El grupo c-amino de la Lys tiene un pKa de 10,8. a) Qu fraccin de estos grupos estar
protonada (es decir, -NH
3
+
en vez de -NH
2
) en una solucin diluida de Lys a pH=9,5? b) A pH=11.5?
c) Explique por qu el pKa del grupo c-amino es mayor que el de un grupo o-amino.

4. El grupo -carboxilo del Glu tiene un pKa de 4,3. a) Qu fraccin de estos grupos podra estar
no protonada (es decir -COO
-
en vez de -COOH) en una solucin diluida de Glu a pH=5,0? b) A
pH=3,8? c) Explique por qu este pKa es mayor que el grupo o-carboxilo.



PPTIDOS


Tabla de pKas de los grupos ionizables:

Aminocido o Carboxilo o Amino Grupo R
Alanina 2.3 9.9 -
Glicina 2.4 9.8 -
Fenilalanina 1.8 9.1 -
Serina 2.1 9.2 -
Valina 2.3 9.6 -
Aspartico 2.0 10.0 3.9
Glutamico 2.2 9.7 4.3
Histidina 1.8 9.2 6.0
Cisteina 1.8 10.8 8.3
Tirosina 2.2 9.1 10.9
Lisina 2.2 9.2 10.8
Arginina 1.8 9.0 12.5

1. Cul de los siguientes oligopptidos es ms soluble en agua?
a)Phe
20
o Gly
20
; b) Asp
20
o Glu
20
a pH = 6.0; c) Phe
20
o Tyr
20


2. Escriba en frmulas el pentapptido Phe-His-Met-Leu-Asp. Calcule su punto isoelctrico.
Sometido el mismo a una electroforesis, hacia qu electrodo migrar, a pH = 7? y a pH = 2? Indique
en cada caso si el aminocido es polar, apolar, cido, bsico, aliftico, aromtico, etc

3. Un tetrapptido de punto isoelctrico 7,7 posee un nico aminocido cargado en su estructura.
Considere los siguientes valores pKa -COOH :2,3; -NH
2
:9,5. a) Prediga el pKa del grupo lateral de
dicho aminocido; b) En base al dato anterior deduzca de qu aminocido se trata y escriba su frmula
estructural; c) Enuncie qu propiedad especial tiene el aminocido en cuestin.

Escisin especfica de cadenas polipeptdicas:



N C C N C C
H
R
1
H
O
H
R
2
O
H

Aminocido 1 Aminocido 2



3


Mtodo Enlaces peptdicos escindidos
Tripsina Aminocido 1 = Lys o Arg
Quimotripsina Aminocido 1 = Phe, Trp o Tyr
Termolisina Aminocido 2 = Leu, Ile o Val
Bromuro de ciangeno Aminocido 1 = Met
V
8
Aminocido 1 = Glu o Asp
Carboxipeptidasa Aminocido 2 = COO
-
terminal libre


4. Considere el pptido cuya estructura primaria aparece en la figura: a) Qu fragmentos son
producidos por la digestin con tripsina? b) Qu fragmentos son producidos por la digestin con
tripsina despus de la reduccin y la alquilacin del enlace disulfuro? c) Qu fragmentos son
producidos por la digestin con termolisina?

Ala-Val-Lys-Leu-Phe-Arg-Cys-Tyr
|
S-S
|
Glu-Met-Lys-Val-Trp-Gly-Cys-Ala


5. Ud. asla un pptido del cerebro que posee la propiedad de unirse a receptores del opio. Su
intencin es encontrar la estructura primaria del pptido aislado. Para ello recurre a mtodos utilizados
en la qumica de pptidos y encuentra que: a) Luego de la hidrlisis cida del pptido, la composicin
en aminocidos es: Arg(1) Phe(2) Gly(2) Met(1) Tyr(1). b) El tratamiento del pptido con
quimotripsina gener un aminocido libre, Phe y dos pptidos cuya composicin en aminocidos
result: Gly(2) Tyr(1) y Arg(1) Phe(1) Met(1). c) El tratamiento del pptido con Bromuro de
ciangeno, seguido de separacin cromatogrfica de los productos, arroja la presencia de dos pptidos
cuya composicin en aminocidos resulta ser: Arg(1) Phe(1) Met(1) y Gly(2) Phe(1) Tyr(1). Cuando
ambos pptidos fueron tratados con Cloruro de dansilo, solamente se encontr Phe dansilada. Deduzca
Ud. la secuencia del pptido.

6. En base a los datos que se detallan, determine la estructura de un antibitico polipeptdico del
Bacilus brevis. Este antibitico forma complejos con iones metlicos y aparentemente destruye el
transporte inico a travs de las membranas, matando a ciertas especies bacterianas. En el anlisis de la
estructura Ud. encuentra que: a) La hidrlisis cida completa del pptido seguida del anlisis de
aminocidos dio cantidades equimoleculares de Leu, Pro, Phe, Orn, Val. b) La estimacin del PM dio
1200 aprox. c) No se hidroliz con Carboxipeptidasa. d) El tratamiento del pptido con
Fluorodinitrobenceno seguido de hidrlisis completa y cromatografa no gener ningn derivado
dinitrofenilado en N alfa. e) La hidrlisis parcial del pptido seguida de separacin cromatogrfica y
secuenciacin gener los pptidos siguientes:




Deduzca la secuencia del pptido
Orn-Leu
Phe-Pro-Val
Val-Orn
Pro-Val-Orn
Leu-Phe
Val-Orn-Leu
Phe-Pro


4


7. Ud. aisl de un homogenado de cerebro un pptido con actividad de encefalina (opioide). Estos
se unen a receptores localizados en el cerebro, que unen drogas derivadas del opio (morfina) que
disminuyen el dolor. Al analizarlo encuentra que: a) La hidrlisis completa en HCl 6 M, 110C
seguida del anlisis de aminocidos indica la presencia de Gly, Leu, Phe y Tyr en una relacin 2:1:1:1.
b) El tratamiento del pptido con 2,4-dinitrofluorobenceno seguido de hidrlisis completa y
cromatografa indic la existencia de Tyr-DNP. No se encontr Tyr libre. c) La hidrlisis con
quimotripsina seguida de cromatografa indic la presencia de Leu y Tyr libres, y un pptido cuya
composicin en aminocidos indic la presencia de Gly y Phe en una relacin 2:1. Determine la
secuencia de esta encefalina.


PROTENAS

1. Mientras la mayora de las bacterias mueren a temperaturas superiores a 50 C, algunas especies
termoflicas sobreviven entre 70 y 80C. De qu modo(s) general(es) esperara que las protenas de
las bacterias termoflicas difieran de las protenas anlogas de las bacterias comunes?

2. Suponga que le han dado cantidades pequeas de tres protenas desconocidas, A, B y C. Su
instructor de Bioqumica le informa que una protena es predominantemente hlice alfa, otra hoja beta
y la tercera de triple hlice de colgeno. Su laboratorio est equipado con un analizador de
aminocidos.

Protenas A B C
Residuos no polares 35 16 17
Residuos polares 20 59 25
Glicina 45 8 33
Prolina + Hidroxiprolina -- 1 22

Asigne la estructura ms probable para cada una de las tres protenas.


3. Como parte de un proyecto de laboratorio de Bioqumica de pregrado, Ud. purific tres
polipptidos de aproximadamente igual peso molecular, a partir de plasma humano. Usando varias
tcnicas fsicas Ud. estableci que en sus estados nativos uno de los polipptidos es monomrico (una
molcula en forma de cigarro), el segundo es monomrico y casi esfrico y el tercero es la subunidad
de un tetrmero de subunidades esfricas idnticas. Su compaero de laboratorio determin las
composiciones aminoacdicas de las tres protenas. Sin embargo, cuando le trae los datos indicados en
la TABLA, Ud. descubre que l no anot la posicin correspondiente a cada protena. Su profesor le
dice que Ud. debera deducir cul es cul, simplemente a partir de las mismas composiciones de
aminocidos. Qu composicin le asignara a cada protena y por qu?








5

Protena A B C
Residuos polares 131 59 99
Residuos no polares 54 118 88
Glicina 9 9 8
Prolina + Hidroxiprolina 8 13 10


4. El anlisis del PM de una protena suministra la siguiente informacin:


Solvente PM
Buffer 200.000
Cloruro de Guanidina 100.000
Cloruro de Guanidina + 2-Mercaptoetanol 25.000 + 75.000

Teniendo en cuenta que el cloruro de guanidina es un agente caotrpico (desnaturalizante) y el 2-
mercaptoetanol es un agente reductor, caracterice la estructura cuaternaria de esta protena.


5. El desplegado de la hlice alfa de un polipptido para formar un ovillo al azar est acompaado
por un gran descenso de la rotacin especfica de la luz polarizada. Estudiando a los pptidos
poliglutamato y polilisina se obtuvo la siguiente grfica:













a) Asigne cual de los grficos corresponde a cada pptido. Prediga las conformaciones de la poliLys y
el poliGlu a pH 2 y 12. b) Explique el efecto de los cambios de pH en la conformacin de los pptidos.
c) Por qu las transiciones conformacionales ocurren en un rango tan estrecho de pH?

6. Un analista determin la concentracin de una solucin pura de una protena desconocida
empleando el mtodo del Biuret y la absorbancia a 280 nm, utilizando para ambos procedimientos una
solucin de albmina srica bovina de 0,5 mg/ml como patrn. Los resultados que obtuvo se muestran
en las tablas siguientes:


6


Mtodo del Biuret
Testigo(patrn) Muestra Incgnita
Alcuota 50 l 40 l
Cubeta(paso de luz) 1 cm 1 cm
Blanco de Rvos. 0,080 UA 0,080 UA
Lectura 0,550 UA 0,350 UA


Absorbancia a 280 nm
Testigo Muestra Incgnita
Cubeta (paso de luz) 0,5 cm 0,5 cm
Lectura 0,310 UA 0,285 UA

a) Calcule la concentracin proteica por ambos mtodos. b) Interprete los resultados considerando
errores experimentales inferiores al 10 %.

7. Un investigador purifica una protena monomrica estructural de msculo a homogeneidad. Con
el objeto de determinar la concentracin de la solucin obtenida, aplica el mtodo de Sedmark y
Grossberg sobre 0.5 ml de la solucin proteica y sobre 0.1 ml de un testigo de albmina, obteniendo
valores de absorbancia (Abs
620
/Abs
465
) de 0.2 y 0.3, respectivamente. La solucin de albmina usada
como testigo present un valor de absorbancia a 280 nm de 0.05 (c
280
= 6.65 (g%)
-1
cm
-1
). a) Exprese
la concentracin de la protena purificada por el investigador en M, sabiendo que el PM de la misma
es 25.000 Da. b) Alcuotas de 1.0 ml de la solucin proteica purificada son sometidos a oxidacin o
reduccin, y luego incubadas con un reactivo especfico de restos sulfhidrilos (-SH)
(Eosin-5-maleimida, c
523
= 85.000 M
-1
cm
-1
), que reacciona en relacin estequiomtrica 1:1 con los
mismos. Luego de que las alcuotas reaccionan totalmente con el reactivo, se las dializa para eliminar
la eosin-5-maleimida que no se uni a la protena (sin cambiar el volumen de la muestra proteica
dializada), y se realizan medidas de absorbancia a 523 nm, obtenindose valores de absorbancia de
0.034 (protena oxidada) y 0.105 (protena reducida). Indique cuntos moles de residuos de cistena
reaccionan por mol de protena. A qu se debe la diferencia de absorbancia obtenida en las distintas
condiciones?


SEPARACIN DE BIOMOLCULAS


1. La cromatografa de filtracin en gel o de tamiz molecular es un mtodo de separacin proteica
basado en sus tamaos (o, ms precisamente, en sus radios efectivos en solucin, los cuales son
proporcionales, para protenas esfricas, a la raz cbica del peso molecular). Una solucin proteica se
coloca en una columna empacada con pequeas esferas de polmeros suficientemente hidratados y
entrecruzados (Sephadex). Las protenas de tamaos diferentes varan en su capacidad de penetrar los
poros hidratados de las esferas. Las protenas ms pequeas penetran ms rpidamente estos poros y a
medida que bajan en la columna lo hacen ms lentamente que las protenas de mayor tamao. Una
segunda tcnica de separacin de protenas es la electroforesis en gel de poliacrilamida donde las
protenas se someten a un campo elctrico. Cuando se lleva a cabo la electroforesis en presencia de un
agente desnaturalizante, el dodecil sulfato de sodio (SDS), las molculas proteicas se separan por
tamao, las ms pequeas migran ms rpidamente. (El SDS desnaturaliza las protenas unindose a
ellas en forma no especfica y dndoles una relacin constante de carga/masa).


7

Gornall
proteina (g)
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
A
b
s

5
3
0
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
Bradford
proteina (g)
0 5 10 15 20 25 30 35
A
b
s

5
9
5
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0
0 . 0 5
0 . 1
0 . 1 5
0 . 2
0 . 2 5
0 . 3
0 . 3 5
0 . 4
0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5
N f r a c c i n
A
b
s

2
8
0

n
m
Ambos procedimientos separan las protenas con base en el tamao y utilizan polmeros entrecruzados
como medio de soporte. Cmo es posible que en la filtracin en gel, las molculas pequeas se
retardan con respecto a las mayores, mientras que en electroforesis en gel de poliacrilamida ocurre lo
contrario?

2. Una mezcla de dos protenas se sembr en una columna cromatogrfica y se obtuvo el perfil de
elucin mostrado. Las dos fracciones correspondientes a los mximos de los dos picos (n 10 y 26) se
sometieron a ensayos de Gornall (0,2 ml muestra + 0,8 ml de H
2
O + 4 ml de reactivo) y Bradford (0,1
ml muestra + 0.4 ml de H
2
O + 0,5 ml de reactivo) para medir la concentracin de protenas, dando los
resultados mostrados en la tabla.


Fraccin Gornall (Abs 530nm) Bradford (Abs 595nm)
10 0.01 0.2
26 0.6 1.2




a)Utilizando las siguientes curvas de calibracin calcule las concentraciones de protenas en mg/ml de
las dos fracciones mencionadas. Si esto no fuera posible, explique cmo procedera experimentalmente
para determinar la concentracin de protenas en dicho caso. b) La muestra con mayor concentracin
de protenas es la que presenta menor absorbancia 280nm? Explique esta aparente contradiccin.













3. Usted tiene una mezcla de tres protenas A, B, C, con pI de 3.5, 6.5 y 10 respectivamente y
quiere separarlas por una columna de DEAE-celulosa. Teniendo en cuenta que el grupo DEAE tiene
un pKa = 9,5. Qu pH usara para la separacin? Qu orden de elucin esperara encontrar eluyendo
con un gradiente de KCl entre 0 a 1 M?

4. La Carboximetilcelulosa es una resina de intercambio catinico con un pKa de 4.5. Ud. tiene
tres protenas A, B y C de pI 5, 8 y 10 (no estrictamente en ese orden). Al sembrarlas en esta resina y
eluir con un gradiente de pH de menor a mayor eluyeron en el siguiente orden: B A C. Estas mismas
protenas, en una columna de Sephadex G-100 eluyeron cmo de un peso molecular 50.000, 100.000 y
75.000 y en el siguiente orden: A, B y C. En un gel con SDS, A y C presentaron una nica banda de
PM 50.000 y B present dos bandas de PM 50.000 y 25.000. Identifique A, B y C.

5. Suponga que desea purificar por cromatografa de intercambio inico una enzima del
metabolismo del ADN, cuyo sustrato es ADN. Seleccionara una resina de intercambio aninico o
catinico? Por qu?



8

6. Un pptido aislado de cerebro tiene la siguiente secuencia:

Lys-Ser-His-Glu-Leu-Asp-Pro-Tyr-Glu-Gly

a)Determine la carga neta de la molcula a pH=3, 8 y 12. b) Estime el punto isoelctrico del pptido.
c) Se somete al pptido a la accin de la termolisina. Escriba la frmula estructural de los pptidos
resultantes. d) Los pptidos obtenidos en el item anterior se someten a una cromatografa de
intercambio inico en sulfonil-celulosa (pKa=1,2). Si la columna est equilibrada a pH=5, qu
pptido eluir y cul quedar retenido? Cmo hara para eluir este ltimo?


7. Se aisl un pptido con actividad biolgica a partir de una cepa de un bacilo:

Tyr-Gly-Arg-Ala-X-Val

a) Escriba la frmula del aminocido X si el pI del pptido es 6,7. b) Determine a que pH no migrara
en una electroforesis para X = Ser. c) Indique que fragmentos obtendra por digestin con:
i)Termolisina para X = Leu, ii) Quimotripsina para X = Phe. d) Los pptidos obtenidos en el item
anterior (en ambas digestiones) se encuentran en una mezcla con un 3
er
pptido (Pptido A con pI = 5)
Mediante que mtodo separara el pptido A. Explique.

8. Tres protenas de puntos isoelctrico 5,2; 7,3 y 6,3 se denominaron con las tres primeras letras
del alfabeto griego segn su posicin en un isoelectroenfoque, siendo alfa la ms cercana al nodo y
gamma la ms cercana al ctodo. a) Cul es el pI de cada uno? b) Cul de las protenas eluir
primero durante una cromatografa en carboximetilcelulosa a pH 6? Por qu? c) Si alguna protena
quedara retenida, cul o cules seran y cmo las eluira? d) Durante una electroforesis en
poliacrilamida a pH 8, beta present la mayor movilidad electrofortica. Es posible? Por qu?

9. Usted recibe en su laboratorio una solucin conteniendo el siguiente pptido:


Glu Cys Lys Phe Cys Ala Gli

S S


Para corroborar que realmente se trata de dicho pptido y para chequear su pureza, decide realizar un
isoelectroenfoque empleando 4 alcuotas que fueron sometidas a distintos procedimientos: A) en
medio oxidante dbil; B) en medio reductor; C) en presencia de tripsina (escinde enlaces peptdicos
del lado carboxilo de Lys o Arg); D) en presencia de tripsina en medio reductor. En base a estos datos
prediga cuales sern los resultados obtenidos al sembrar las 4 alcuotas en un gel de isoelectroenfoque
y esquematice el patrn de bandas que observara finalizada la corrida electrofortica en cada caso.
Justifique su respuesta.


10. El cromatograma de una muestra de protenas en Sephadex G-200 fue el siguiente:


9











Las protenas marcadoras fueron las siguientes:









Se recogieron fracciones de 1,6 ml. y el volumen vaco de la columna previamemte determinado con
azul de dextrano fue de 200 ml. VT = 500 ml. Se quiso determinar el PM de
gliceraldehdo-3-P-dehidrogenasa. Utilizando la misma columna, en las mismas condiciones se
observ que la enzima apareci en la fraccin 244.
Indique el peso molecular de la misma. Cmo procedera experimentalmente si quisiera estudiar la
estructura cuaternaria de dicha protena?.

11. Las protenas denominadas histonas juegan un papel clave en el empaquetamiento del DNA: ste
se enrolla alrededor de las histonas para formar los nucleosomas, partculas engarzadas como las
cuentas de un collar. Una mezcla de tres protenas globulares, entre ellas la histona H4, presenta la
siguiente composicin de aminocidos:

Protena Nmero de Residuos (totales)
Asp y Glu Arg, Lys e His Otros AA
A 90 5 105
B 50 10 60
C 6 27 69

Mediante un isoelectroenfoque se determinaron los puntos isoelctricos de las tres protenas
obtenindose los siguientes valores: 3,0; 5,5 y 9,5 (no respectivamente). Los pesos moleculares
obtenidos por cromatografa de exclusin molecular fueron de 15 kD, 11,3 kD y 21,5 kD. a) lndique el
punto isoelctrico, el peso molecular y el orden de elucin de la columna cromatogrfica de las tres
protenas. b) En qu consiste la cromatografia de exclusin molecular y cmo se pueden obtener
pesos moleculares a partir de ella? c) En base a sus conocimientos, podra decir cul de las tres
protenas sera H4? Fundamente su respuesta.

12. Una protena bacteriana purificada y de PM conocido se someti a una filtracin por gel. Se
recogieron fracciones de 2,5 ml y la protena eluy en la fraccin 8. Previamente se determin que las
protenas marcadoras de 6, 35 y 250 KDa eluyeron en las fracciones 5, 10 y 14. El Vo determinado con
azul de dextrano fue de 1,8 ml, y el Vt de 45 ml. a) Cul es la masa estimada de la protena bacteriana
purificada? b) Para determinar la concentracin de la protena pura se diluye 1:100 la muestra y se
ensaya una alcuota de 20 l por el mtodo de Bradford dando una absorbancia de 0,25 descontado el
175 213 234 285 244
Concentracin
de protena
en el eludo
Aldolasa
Catalasa
Ovoalbum.
Gliceraldehdo
3-P-Deshidrogenasa
Mioglobina
N fraccin
Protena PM (x10
4
) N de fraccin
Aldolasa 16 175
Catalasa 6 213
Ovoalbmina 4 234
Mioglobina 1.6 285


10

blanco. Como testigo se utilizaron 40 l de BSA 1mg/ml (PM 66 kDa) y se obtuvo una absorbancia de
0,85. Exprese la concentracin en g/l de la protena en la muestra.

13. Una alcuota de 0.1 ml de una mezcla de triglicridos y una protena pura se agit en
benceno:agua (3 ml:2 ml). a) En qu fases se distribuyen los distintos componentes de la mezcla? Se
sembr una alcuota de la fase que contena la protena en una columna de Sepharosa 6-B previamente
equilibrada. La curva de calibracin resultante se muestra a continuacin. Se recogieron fracciones de
2 ml. Las protenas marcadoras fueron: A, B, C, D y E con pesos moleculares de 160, 90, 60, 40, 16
kDa, respectivamente. El valor de Kav de la muestra se calcul en 0.28. Adems, se corri una
electroforesis con SDS en las siguientes condiciones: I) la protena se hirvi previamente con DTT
(agente reductor), II) la protena se hirvi sin agente reductor. El patrn electrofortico se muestra en
la figura. b) Indique el peso molecular de la protena nativa. c) Infiera la composicin cuaternaria de la
protena. Por otro lado se estim la concentracin de protena por absorbancia a 280 nm, utilizando un
testigo de BSA de 0.5 mg / ml, con una alcuota de 1 ml y una cubeta de 0,5 cm de paso. Se obtuvo
una Abs. de 0,4 para el testigo y de 0,295 para la muestra. d) Teniendo en cuenta que toda la protena
pas a la fase correspondiente, determine la concentracin de la misma en la mezcla original.


90
60
40
16
kDa PM II I



14. A) Usted copurific 2 enzimas (o y |) que catalizan la misma reaccin (isoenzimas) y con el fin
de separarlas utiliza una columna de exclusin molecular en las siguientes condiciones: i) en presencia
de glicerol 20 % (un estabilizante de la estructura cuaternaria) y ii) en ausencia de ste. Usted
determina el perfil de elucin de estas proteinas a travs de absorbancia a 280 nm.
Esta columna fue previamente calibrada con diferentes protenas generando la siguiente curva de
calibracin. a) Prediga cul sera el peso molecular y la probable estructura de ambas isoenzimas,
sabiendo que o es la de mayor peso molecular. b) Qu otra tcnica utilizara para confirmar este
resultado o bien para obtener ms informacin? Explique.
B) Ud. realiza un isoelectro-enfoque de las protenas puras o y | determinando los puntos isoelctricos
de ambas protenas. Usted sabe por bibliografa que o, tiene un rango de estabilidad de pH entre 6 y
11. a) Como paso alternativo en la purificacin de ambas protenas podra usarse una columna de
CM-celulosa (pKa=4.5) para separar ambas protenas? Si es as, explique qu pH usara para equilibrar
esta columna. b) Cmo hara para elurlas?

Con Glicerol
Sin glicerol
V. elucin
ABS.
280 nm.
7
19 27 (ml)

0.25 0.3 0.35 0.40 0.45
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
Log
PM
K
av


11


15. Se purific una protena estructural a partir de dos bacterias (A y B) aislados de diferentes
fuentes. Con las protenas purificadas se corri una electroforesis de poliacrilamida en presencia de
SDS en las siguientes condiciones, (+): la protena se hirvi 10 minutos en presencia de
2-mercaptoetanol, (-): la protena se hirvi 10 minutos sin agente reductor. Luego de la corrida
electrofortica, el gel se tio con Coomassie Blue y se observ el patrn indicado. Por otro lado, las
preparaciones proteicas se sembraron en una columna de exclusin molecular. La masa molecular de
los marcadores utilizados para calibrar esta columna fueron: 30, 100, 210 y 440 kDa. El cromatograma
obtenido es mostrado abajo. La protena de inters eluy en ambos casos en la fraccin 133. Se
recogieron fracciones de 1,5 ml. a) Indique la masa molecular nativa de las protenas aisladas.
b) Infiera la estructura de ambas protenas c) considerando las estructuras propuestas en el tem
anterior, y teniendo en cuenta que una de las bacterias fue extrada de una fuente termal, prediga cul
protena fue aislada de cada bacteria.



+ - + -
A B
210
70
50
30

117 142 156 190
N de Fraccin
A
b
s

2
8
0

n
m



16. Le han entregado una muestra supuestamente pura de la protena monomrica lactato
deshidrogenasa. Para establecer su PM inyecta la muestra en una columna de Sephacryl (exclusin
molecular) y obtiene un nico pico a un Ve de 34 ml, el cual es comparado con los datos obtenidos
para las protenas marcadoras (fig1). Como paso siguiente realiza una electroforesis en dos
dimensiones de la muestra y luego de tincin por azul de Coomassie para protenas totales, obtiene el
resultado indicado en la fig 2. Para calcular el pI grafica los valores de pH del gel en funcin de la
distancia desde el nodo segn los datos de la tabla. En base a estos experimentos: a) Exprese el PM
aparente de la protena. b) A qu puede deberse el resultado obtenido en base al gel 2D. Qu puede
decir acerca de su muestra? Podra calcular el pI de la lactato deshidrogenasa? Calcule un valor
probable. c) Agregara algn paso en la purificacin de la lactato deshidrogenasa? Cal?






Distancia
desde
el nod
(cm)
PH
6
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
8.5
8.0
7.6
7.1
6.4
6.0
5.6
5.4
4.5
4.0
3.4
3.0
Ve (ml)
24 26 28 30 32 34 36 38 40
L
o
g
P
M
(
K
D
a
)
1
2
FIG 1



12



17. Se aislaron 2 isoenzimas (A y B) a partir de 2 bacterias provenientes de distintas fuentes. Con el
fin de caracterizarlas se llev a cabo una columna de exclusin molecular en presencia y ausencia de
glicerol. En ambas condiciones la protena A present un volumen de elucin (Ve) de 16 ml, mientras
que la protena B present Ve de 16 ml y 26 ml en presencia y ausencia de glicerol, respectivamente.
La curva de calibracin obtenida con diferentes marcadores de masa molecular se indica en el grfico.
Adems, se corri un gel de poliacrilmida en presencia de SDS en las siguientes condiciones: 1)
hirviendo las protenas con DTT (agente reductor), 2) sin DTT. El patrn electrofortico obtenido se
muestra en la figura. Con todos los datos obtenidos determine las posibles estructuras cuaternarias de
ambas isoformas.
La concentracin de protena determinada por Bradford considerando la masa molecular nativa fue de
0,25 M para ambas preparaciones. Alcutas de 1,5 ml de las soluciones proteicas fueron sometidas a
oxidacin y reduccin, y luego se incubaron con Eosin-maleimida (compuesto que reacciona en
relacin estequeomtrica 1:1con grupos SH-, c
523
= 85000 M
-1
cm
-1
). Luego de que las alicuotas
reacionan totalmente con el reactivo, se las dializa y se realizan medidas de absorbancia. Las medidas
de absorbancia a 523 nm de las formas nativas de las enzimas fueron 0,042 para A y 0 para B.
Mientras que las formas reducidas de ambas proteinas presentaron un valor de absorbancia de 0,085.
Indique el estado redox de las Cys presentes en cada protena y la posible disposicin de los puentes
disulfuro.













18. Ud. recibe una muestra pura de protena y procede a determinar su concentracin por el mtodo
de Bradford. Prepara 2 ml de un testigo de albmina pesando 2 mg de la misma. Toma 5 l de esta
solucin y la diluye hasta 500 l de agua destilada y utiliza 150 l de esta solucin como testigo
obteniendo una absorbancia a 610 nm de 0,22. Para 25 l de la solucin proteica en estudio se obtiene
una abs de 0,25. Cuando se realiza una electroforesis en condiciones nativas se obtiene un PM de
600.000 daltons, mientras que cuando se prepara la muestra con cloruro de guanidina se obtiene una
nica banda de 150.000 daltons. El mismo resultado es obtenido si, adems, la muestra se trata con 2-
mercaptoetanol. Una alcuota de 1,5 ml de la solucin proteica se incub con eosinmaleimida
(reacciona con grupos -SH, c
523
= 85.000M
-1
cm
-1
) obtenindose, luego de dilisis exhaustiva, un valor
de absorbancia a 530 nm de 0,0384. Posteriormente, se trat una alcuota de 1,5 ml de la protena con
un agente reductor y luego con eosinmaleimida, obtenindose, en este caso, un valor de absorbancia a
530 nm de 0,1153 luego de dilisis exhaustiva de la muestra. a) Exprese la concentracin de la
protena en M. b) Indique la estructura cuaternaria de la protena sealando el estado de xido-
reduccin de cada Cys y el nmero de Cys por molcula.


19. Usted tiene una mezcla de 4 protenas con las siguientes caractersticas (cada crculo representa
un polipptido y todos los residuos de cistenas se encuentran indicados):

0 10 20 30 40
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
Log PM
Ve
90
60
40
16
A B A B
+DTT -DTT


13

y =-0.01x +6
4
4.5
5
5.5
6
30 50 70 90 110 130 150 170 190
Ve (ml )
l
o
g

P
M









i) Realiza una cromatografa de exclusin molecular en columna de Sephacryl (rango de exclusin:
25000-160000 Da) en las siguientes condiciones: a) con glicerol, b) sin glicerol y con urea, c) dem b)
ms tratamiento con 2-mercaptoetanol. Esquematice el cromatograma que obtendra en cada caso y
justifique. ii) Cmo procedera experimentalmente si quisiera separar la protena D en forma nativa
del resto de las protenas en la mezcla? Para ello, adems de la columna mencionada, Ud. dispone de:
otra columna de exclusin molecular (rango de exclusin es de 70000-350000 Da); resinas de DEAE-
celulosa y carboximetil-celulosa y una solucin saturada de (NH
4
)
2
SO
4
. Justifique su eleccin. Los
valores de pKa de la DEAE- y carboximetil-celulosa corresponden a 9,5 y 4,5, respectivamente. iii) Si
lograra separarlas, qu protenas mostraran un valor positivo de absorbancia luego del tratamiento
con eosinmaleimida? Justifique.

20. Ud ha purificado a homogeneidad la enzima mlica dependiente de NAD, la cual cataliza la
siguiente reaccin: malato + NAD piruvato + CO
2
+ NADH. Al sembrar esta protena en presencia
de 20% glicerol en una columna de exclusin molecular (Sephadex) previamente calibrada (ver
figura), la protena eluy a los 70 ml (fraccin A). Cuando se repiti el procedimiento en ausencia de
glicerol se obtuvieron picos a 115 y 152 ml (fracciones B y C, respectivamente). La fraccin A
present actividad enzimtica, no as B y C. Por otra parte se analiz mediante una electroforesis en
condiciones desnaturalizantes una alcuota de la protena purificada previamentte tratada con SDS y |-
mercaptoetanol, obtenindose una banda correspondiente a 70 kDa y otra de 30 kDa. En base a estos
datos caracterice estructuralmente lo mejor posible esta enzima.

















A
-S-S-
B
-SH
C
SH- -SH
SH- -SH
D
S- -S
S- -S
PI 6 4,5 7,1 5,2
PM nativo (kDa) 60 60 400 650
PM subunidades (kDa) 30 60 100 2x 150
2x 175


14

QUMICA BIOLGICA 2013- ENZIMOLOGA

DETERMINACIN DE LOS PARMETROS CINTICOS



1. Describa mtodos continuos y discontinuos para la determinacin de la actividad enzimtica y d
ejemplos. b) Indique y explique brevemente todos los mtodos a travs de los cuales usted puede
seguir la evolucin de esta reaccin, indicando si se trata de mtodos continuos o discontinuos.
NADH + H
+
+ 3 ADP + 3 Pi + O
2
NAD
+
+ 3 ATP + H
2
O

2. Indique si las siguientes afirmaciones son verdaderas o falsas:

a) La constante de Michaelis, K
m

* Vara con la velocidad de la reaccin enzimtica
* Es constante para una enzima determinada sea cual fuera el sustrato usado.
* Es la constante de velocidad para la descomposicin del complejo ES.
* Es la concentracin de sustrato a la cual se obtiene una velocidad igual a la mxima.

b) Usando una concentracin de sustrato equivalente al 20% de K
m
, se obtuvo en una reaccin
enzimtica una velocidad de reaccin de 1 mol/min. Para esta reaccin enzimtica, el valor de V
max
:
* es igual a 2 mol/min
* es igual a 2K
m

* es igual a 6 mol/min


3. Se estudi para una protena X la dependencia de la actividad enzimtica con la concentracin de
sustrato y se obtuvieron los siguientes valores de velocidad (moles/min.mg):

[S] (mM) 0,25 0,50 0,67 1,00
V 33 50 57 67

Teniendo en cuenta que el peso molecular de la protena es 300.000: a) Calcule los valores de K
m
,
V
max
. b) Exprese el valor de velocidad mxima en Katal/mg. c) Calcule el nmero de recambio y
explique el significado del mismo.

4. Dos estudiantes (A y B) aislaron independientemente la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) de
msculo de caballo. Esta enzima cataliza la siguiente reaccin:

NAD + lactato NADH + piruvato

Una vez obtenida una solucin concentrada de enzima, midieron actividad (mol/min.mg protena) en
funcin de la concentracin de sustrato obteniendo los siguientes datos:


[S] (M)
Act.
2.10
-6

5.10
-6
1.10
-5
5.10
-5
1.10
-4
2.10
-4

1.10
-3

A 16 33 50 83 90 99 100
B 25 50 75 125 136 148 150

a) Sin graficar, estime aproximadamente K
m
y V
max
. Justifique. b) Proponga una explicacin para la
discrepancia observada entre los parmetros cinticos estimados por A y B. c) Qu variables
graficara para obtener K
m
y V
max
? Justifique.


15


5. La actividad de una muestra de la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) pura, de concentracin
2 mg/ml, se ensay por un mtodo discontinuo midiendo la aparicin de piruvato mediante un ensayo
colorimtrico. La dinitrofenilhidrazina (DNFH) y el piruvato forman una hidrazona que luego del
agregado de NaOH presenta un mximo de absorbancia a 505 nm. As, 10 l de la muestra se
incubaron a 30C con concentraciones saturantes de lactato y NAD
+
en un volumen final de 3 ml.
Luego de 3 min la reaccin enzimtica se detuvo por el agregado de 0,5 ml de DNFH. Despus de
10 min se adicionaron 1,5 ml de NaOH 0,4 N y se midi absorbancia de la hidrazona formada a 505
nm, obtenindose un valor de absorbancia de 0,6 una vez restado el blanco.
Para realizar la curva de calibracin del mtodo colorimtrico se trabaj en idnticas condiciones
utilizando una solucin de cido pirvico (PM = 88) 4,4 mg/ml. Los valores obtenidos se muestran en
la tabla.

ml de testigo 0 0,05 0,10 0,20 0,30 0,40
Abs. (505 nm) 0,05 0,15 0,25 0,44 0,66 0,85

Calcule el nmero de recambio de la LDH, considerando que el peso molecular de la enzima es de
130.000 y que posee dos sitios activos por molcula.

6. La actividad de la enzima malato deshidrogenasa (MDH) purificada de maz fue medida por un
mtodo discontinuo. La enzima cataliza la siguiente reaccin:
Oxaloacetato + NADH Malato + NAD
+

La reaccin se llev a cabo en 1 ml de medio de reaccin que contena 50 mM Tris-HCl pH 8;
concentracin saturante de NADH, 10 l de la preparacin enzimtica (0,1 mg/ml de protena) y
10 mM de oxaloacetato (OAA). Luego de 1 min de incubacin a 37C, se agregaron 5 ml de un
reactivo de color que se utiliza para dosar OAA, obtenindose luego de 10 min una absorbancia de 0,2
una vez restado el blanco. Como testigo se utiliz una alcuota de 1 ml de OAA 4,6 mM, al que se le
adicionaron 5 ml de reactivo de color, registrndose una absorbancia (ya restado el blanco) de 0,095
luego de 10 min. a) Calcule las U/ml de enzima que posee la preparacin. b) Sabiendo que el valor de
K
m
para el OAA de la enzima es 10 M, el peso molecular es 200.000 y que la enzima posee 4 sitios
activos por molcula, calcule el ndice de recambio. c) Proponga un mtodo continuo de medida de
actividad para esta enzima.

7. Se purific a homogeneidad la enzima mlica dependiente de NADP (EM-NADP) de PM 15.000
Da que cataliza la siguiente reaccin:
malato + NADP piruvato + CO
2
+ NADPH.
Se estudi la actividad enzimtica a concentraciones de sustratos saturantes midiendo el aumento de
absorbancia a 340 nm (c
NADPH
= 6,22 mM
-1
cm
-1
)
El medio de reaccin contena 20 l de Malato 200 mM, 2 l de NADP 50 mM y 20 l de la
enzima pura (2,2 mg/ml) en un volumen final de 1 ml. Al cabo de 2 min. de reaccin enzimtica se
obtuvo una variacin de absorbancia de 0,78. El ndice de recambio de la protena es de 10,5 min
-1
.
a) Determine la concentracin (mM) de sitios activos de la preparacin enzimtica. b) Determine
cuntos sitios activos posee cada molcula.



16

8. Una enzima cataliza la reaccin S P. Con los siguientes datos estime el valor de K
m
para dicha
enzima: I) Indice de recambio: 3800 min
-1
, II) PM de la enzima: 62 kDa. III) Nmero de sitios activos
por molcula de enzima: 3 IV) la actividad enzimtica, ensayada en un medio de reaccin de 1,5 ml
que contena 10 l de una solucin del sustrato 200 mM y una concentracin de enzima de 1,5 mg/ml,
dio un valor de 12 UI/ml de la preparacin enzimtica.

9. El tejido heptico tanto embrionario como adulto, contiene una enzima que cataliza la reaccin
S P. Se purific a homogeneidad esta enzima a partir de ambos tejidos y se obtuvieron los datos
cinticos que figuran en la tabla. La preparacin de la enzima de origen embrionario utilizada tena una
concentracin de protena de 1 mg/ml, mientras que la de hgado adulto era de 2 mg/ml. En todos los
casos se usaron alcuotas de 100 l para realizar los ensayos. Qu conclusiones puede sacar acerca de
la identidad de las dos enzimas? Qu experimentos haras para verificar si se trata de diferentes
isoformas o modificaciones de la misma enzima? Justifique su respuesta.

Actividad (U/ml)
[S] (mM) Enzima hgado embrionario Enzima hgado adulto
2,0 83,3 83,3
2,5 100,0 100,0
3,3 125,0 125,0
5,0 166,6 166,6
10,0 250,0 250,0

10. En mamferos existen 5 isoenzimas LDH, cada una de ellas con diferentes propiedades cinticas
y movilidad electrofortica. Una de las isoenzimas se localiza en corazn (H
4
-LDH) y otra en msculo
(M
4
-LDH). Se han determinado las siguientes propiedades cinticas para ambas isoenzimas de origen
humano purificadas a homogeneidad:


Isoenzima K
m
Piruvato (mM) Act. Especfica (U/mg)
H
4
-LDH 0,300 2000
M
4
-LDH 0,025 4800

Ante un dao sufrido por un determinado tejido, hay liberacin hacia el torrente sanguneo de la
correspondiente isoenzima. Es as que suele ser importante, para realizar un diagnstico, no solo
determinar un aumento de LDH en suero, sino establecer qu isoenzima est incrementada. Suponga
que usted est en un laboratorio clnico de guardia y le traen un paciente inconsciente, debiendo usted
determinar si ha sufrido un infarto cardaco o si slo se trata de un agotamiento por ejercicio muscular
excesivo. Luego de determinar que los niveles de LDH en suero estn elevados usted realiza un
estudio cintico de la actividad LDH srica. Utilizando alcuotas de 10 l de suero que contena
50 mg/ml de protena usted mide la actividad LDH a distintas concentraciones de piruvato obteniendo
los siguientes resultados:





17

Piruvato (mM) 0,0125 0,0166 0,0250 0,0500
Actividad LDH (U/ml) 0,33 0,40 0,50 0,66

En base a estos datos indique qu diagnstico hara del paciente: infarto de miocardio o
agotamiento por ejercicio muscular excesivo. Justifique su respuesta.

11. Se procedi a purificar a homogeneidad la enzima Glutamato-piruvato transaminasa a partir de
hgado de rata. La enzima cataliza la reaccin:
o-cetoglutarato + alanina glutamato + piruvato

Luego de varios pasos de purificacin se midi actividad enzimtica de la preparacin, para lo cual se
contaba con dos mtodos alternativos.
a) El primer mtodo de medida acopla una segunda reaccin catalizada por la enzima Lactato
dehidrogenasa (LDH): Piruvato + NADH + H
+
Lactato + NAD
+
, midindose la disminucin de la
absorbancia a 340 nm (c
NADPH
= 6,22 mM
-1
cm
-1
). Se incubaron 200 l de la preparacin enzimtica en
un volumen final de 1 ml que contena o-cetoglutarato, Ala, NADH y LDH. La disminucin de la
absorbancia obtenida fue de 0,62 por minuto. Calcule las UI/ml de la preparacin enzimtica; b) Por el
otro mtodo alternativo de medida se preincubaron 100 l de la preparacin enzimtica en un volumen
final de 1 ml con o-cetoglutarato y Ala. A los 10 minutos, la reaccin se detuvo con el agregado de
0,5 ml de 2,4 dinitrofenilhidrazina y adems se agregaron 5 ml de NaOH. Sabiendo que 1 ml de testigo
de piruvato 1 mM presenta con el mismo mtodo de medida una absorbancia de 0,2, calcule la
absorbancia que obtendra en este caso; c) Compare los dos mtodos de medida utilizados.

12. La acetil-CoA carboxilasa (ACCasa) cataliza la carboxilacin, dependiente de ATP, del acetil-
CoA para formar malonil-CoA, primer intermediario en la sntesis de cidos grasos:
Acetil-CoA + ATP + CO
2
Malonil-CoA + ADP + Pi.
La enzima fue aislada a partir de hojas de trigo y se llevaron a cabo los siguientes estudios cinticos:
Se determin la actividad enzimtica en un volumen final de 200 l en las siguientes condiciones:
100 mM Tricina-KOH (pH 8,0), 40 mM ATP, 2,5 mM MgCl
2
, 50 mM KCl, 1mM DTT, 30 mM acetil-
CoA, 30 mM [
14
C] NaHCO
3
(3,33x 10
8
cpm; cpm=cuentas por minuto) y 1,8 g de la protena
purificada. La reaccin comenz con el agregado de la enzima, transcurri durante 10 minutos a 30C
y se interrumpi por la adicin de 50 l de 6 N HCl. La acidificacin del medio provoca la
inactivacin de la enzima y la eliminacin del HCO
3
-
remanente por conversin en CO
2
. Alcuotas de
50 l de la mezcla de reaccin fueron transferidas a discos de papel de filtro. Los papeles se secaron a
temperatura ambiente y su radioactividad se cont en un contador de centelleo. El valor promedio de
radioactividad por disco correspondi a 3,5 x 10
6
cpm. Determine la velocidad de reaccin en U/mg.



TABLAS DE PURIFICACIN


1. La enzima malato deshidrogenasa dependiente de NADP cataliza la siguiente reaccin:
Malato + NADP
+
Oxaloacetato + NADPH
A partir de 500 g de hojas de espinaca se obtuvieron 1500 ml de un extracto crudo con una
concentracin de protenas de 20 mg/ml. La medida de actividad se determin con una alcuota de
30 l midindose, por mtodo continuo la aparicin de NADPH a 340 nm en una cubeta de 3 ml y 1
cm de camino ptico obtenindose un AA/10 min = 1,24, c
NADPH

= 6200 M
-1
.cm
-1



18

Se realiz luego una cromatografa en DEAE celulosa recogindose 180 ml que contenan 1800 U de
actividad enzimtica y 2.250 mg de protena. El paso posterior fue una columna de hidroxilapatita,
recogindose 10 tubos de 4 ml cada uno con actividad deshidrogenasa. La concentracin de protena
en el conjunto fue de 0,94 mg/ml con un rendimiento del 50 % respecto del paso anterior. Como
ltimo paso se realiz una cromatografa en columna de Sepharosa 6B y se recuperaron 750 U de
enzima y 31,4 mg de protena en un volumen de 15 ml.
En base a estos datos a) Construya la Tabla de Purificacin, b) Indique la purificacin y el rendimiento
total alcanzados; c) Cul es la etapa individual que dio mayor purificacin y cul la de mayor
rendimiento? d) Describa el mtodo empleado en el segundo paso de purificacin. e) Seale si todas
las etapas empleadas se justifican. Fundamente su respuesta.

2. Se realiz la purificacin de la enzima glucosa-6-fosfatasa que cataliza la siguiente reaccin:

Glucosa-6-fosfato Glucosa + Fosfato

Se parti de 200 g de hgado de bovino obtenindose un extracto inicial de 1200 ml, que tena una
concentracin de protena de 10 mg/ml. Para medir actividad enzimtica se incub una alcuota de 50
l con el sustrato a 30C en 1 ml de medio. La reaccin se cort directamente a los 10 min por el
agregado de 2 ml de reactivo de color para fosfato. La reaccin de color se lee a 740 nm en una cubeta
de 1 cm de camino ptico. La Abs
740
fue de 0,49 con un blanco de medida de 0,12. El coeficiente de
extincin para la reaccin de color es de 3700 M
-1
.cm
-1
.
Se realiza luego un corte con (NH
4
)
2
SO
4
al 50 % rescatndose la fosfatasa en el precipitado, el que fue
redisuelto en 80 ml, recuperndose 1680 mg de protena con una actividad total de 504 U.
Posteriormente, se realiz una cromatografa en Sephadex G-25 recogindose 10 tubos de 12 ml cada
uno con actividad enzimtica. La concentracin de protena en el conjunto fue de 10,8 mg/ml con un
rendimiento, respecto del paso anterior del 80%. Como ltimo paso se efectu una cromatografa de
afinidad y se obtuvieron 144 U de enzima con actividad especfica de 3,6 U/mg en un volumen de
20 ml.
En base a estos datos a) Construya la Tabla de Purificacin. b) Cul es la purificacin y el
rendimiento total alcanzados? c) Cul es la etapa individual que dio mayor purificacin y cul la de
mayor rendimiento? d) Describa el fundamento del ltimo paso de purificacin empleado. e) Seale si
todas las etapas empleadas se justifican. Fundamente su respuesta f) Explique la importancia de
realizar la cromatografa de exclusin molecular Sephadex G-25.

3. La dihidropicolinato sintetasa (DHDPSasa) se purific y caracteriz a partir de cultivos de trigo
en suspensin. Dicha enzima cataliza la siguiente reaccin, donde ASA y DHDP representan a
aspartato -semialdehdo y cido 2,3 dihidropicolnico, respectivamente.

Piruvato + ASA DHDP + 2 H
2
O

Durante la purificacin de la DHDPSasa se obtuvieron 200 ml de extracto crudo, que contenan 0,5 g
de protena. La actividad se ensay midiendo piruvato remanente. La reaccin se llev a cabo en 3 ml
de medio de reaccin, que contiene 30 l de enzima, Tris-HCl 100 mM pH 8, 40 mM de piruvato
sdico y concentracin saturante de ASA. Luego de 10 minutos a 30C, la reaccin enzimtica se
detuvo por el agregado de 0,5 ml de DNFH (reactivo de color). Despus de 10 minutos se adicionaron
1,5 ml de NaOH 0,4 N y se determin la absorbancia de la hidrazona a 505 nm, en una cubeta de 1 cm
de paso ptico. La absorbancia obtenida a los 10 minutos fue de 0,8. Como testigo se utiliz una
alcuota de 100 l de una solucin de concentracin 31,55 mg/ml de piruvato a la que se le realiz el


19

mismo tratamiento que a la muestra, obtenindose una absorbancia A 505 nm de 0,25. PM Piruvato =
88.
A este extracto se le realiz un corte con (NH
4
)
2
SO
4
, precipitando la enzima entre el 30 y 60 % de
saturacin. El precipitado se redisolvi y luego de desalado se obtuvo un volumen final de 150 ml, con
una concentracin de protena de 2 mg/ml, y un rendimiento de 80 %. La muestra anterior se separ en
dos fracciones. El 60 % se sembr en una columna de DEAE-celulosa obtenindose 50 ml de muestra
conteniendo 75 mg de protena, y un rendimiento con respecto al paso anterior del 45%. El 40%
restante se sembr en una columna de afinidad, obtenindose 25 ml de muestra que contiene 20 mg de
protena, purificndose 5 veces con respecto al paso anterior.
En base a los datos: a) Realice la tabla de purificacin, b) Indique rendimiento y purificacin totales,
c) Justifique cul de las etapas alternativas elegira.

4. Se intenta purificar la enzima gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP que
cataliza la reaccin:

Gliceraldehdo 3-fosfato + NADP + Pi 1,3-Difosfoglicerato + NADPH + H
+

Se parte de 500 g de hojas de espinaca, obtenindose 1.500 ml de un extracto crudo con una
concentracin de protena de 20 mg/ml. La medida de actividad se determin con una alcuota de 30 l
por un mtodo continuo, midindose la aparicin de NADPH (c
NADPH
= 6200 M
-1
.cm
-1
) en una cubeta
de 3 ml y 1 cm de camino ptico, obtenindose un AA/10 min= 1,24.
Se realiz luego una cromatografa en DEAE-celulosa, recogindose 180 ml que contenan 1800 U de
actividad enzimtica y 2250 mg de protena. El volumen total de este paso (180 ml) fue dividido en
dos volmenes iguales. I) Una de las fracciones fue sometida a cromatografa de adsorcin
(hidroxilapatita), recogindose 5 tubos de 4 ml cada uno, con actividad deshidrogenasa. La
concentracin de protena en el conjunto fue de 0,94 mg/ml, con un rendimiento respecto al paso
anterior del 50%. II) La otra fraccin de la columna de DEAE-celulosa fue sometida a una
cromatografa de afinidad; en la que se recuperaron 800 U de enzima y 4 mg de protena en un
volumen de 15 ml.
a) Calcule el rendimiento y la purificacin para cada uno de los procedimientos alternativos empleados
b) La electroforesis en gel de poliacrilamida mostr que la enzima proveniente de uno de los
procedimientos migraba como una nica banda de protena (Rf = 0,33), mientras que la proveniente
del otro procedimiento mostraba la presencia de tres bandas proteicas (Rf = 0,25; Rf = 0,325 y Rf =
0,65). En base a la tabla de purificacin podra adjudicar a qu procedimiento de purificacin
corresponde cada electroforesis obtenida. Justifique su respuesta.

5. Dos grupos de trabajo presentan independientemente protocolos para la purificacin de una
enzima desde un mismo tejido de plantas. Para medir la actividad enzimtica se incuba una alcuota de
30 l de enzima con el sustrato en 1 ml de medio de reaccin. La reaccin se corta a los 5 minutos por
el agregado de 2 ml de reactivo de color especfico para el producto de la reaccin (c =3700 M
-1
cm
-1
)
Se utiliza una cubeta de 1 cm de camino ptico. La medida del blanco de reaccin da un valor = 0,1.
Los volmenes indicados se refieren a la cantidad recuperada en cada paso.

Protocolo 1: I) Extracto Crudo: 200 ml, Abs=0,56, [protena]= 50 mg/ml; II) Fraccionamiento con
PEG: 300 ml. Se purifica 10 veces la enzima, con un rendimiento de 80%; III) Cromatografa en
DEAE-celulosa: 280 ml, Act Especfica = 5 y 280 U de enzima; IV) Cromatografa en columna de
Hidroxilapatita: 25 ml, 84 U de enzima y 8,4 mg de protenas.

Protocolo 2: I) Extracto Crudo: 400 ml 2,5 U/ml y una Act Especfica = 0,05; II) Columna de
Sephadex: 500 ml Se purifica 2 veces la enzima, con un rendimiento del 50%; III) Precipitacin con


20

(NH
4
)
2
SO
4
y desalado: 200 ml, 1 U/ml y 0,3 U/mg; IV) Cromatografa en Affigel Blue: 30 ml.
Purificacin parcial de 10 veces, y un rendimiento parcial del 80%

a) Indique la purificacin y rendimiento de cada protocolo y comprelos. b) Indique la purificacin
parcial y rendimiento parcial de cada paso. c) Proponga un posible protocolo alternativo (consistente
en extracto crudo ms tres pasos) para mejorar la purificacin. Justifique brevemente.

6. Durante la purificacin de la enzima ureasa (Urea + H
2
O 2 NH
4
+
+ CO
2
) se obtuvo 900 ml de
Extracto Crudo (EC) con una concentracin de protena de 3,33 mg/ml. Su actividad se midi
siguiendo la disminucin de la Absorbancia a 340 nm utilizando la reaccin acoplada NH
4
+
+ oKG +
NADH + H
+
Glu + NAD
+
(c
NADH
= 6200 M
-1
cm
-1
) El agregado de 20 l de EC a 1 ml de la mezcla
de reaccin produjo un AA = - 0,800 en 4 minutos en una cubeta de 1 cm de camino ptico. Un corte
con (NH
4
+
)
2
SO
4
dio lugar a un precipitado que se redisolvi con buffer hasta 150 ml de volumen final.
De esta manera la ureasa se purific 10 veces con un rendimiento del 82,8 %. Luego de pasados por
una columna de Sephadex G-25 se recolectaron 80 ml con 45 mg de protena, purificndose 50 veces
respecto del EC con un rendimiento del 90 % respecto del paso anterior. Su actividad se determin por
el mtodo discontinuo (NH
4
+
+ Fenol + Hipoclorito Azul de Indofenol) cuya curva de calibracin
de NH
4
+
present una pendiente de 0,6557 UA/mol NH
4
+
. Las condiciones de la colorimetra fueron
las mismas para la curva y la muestra. a) Cul fue la absorbancia medida por este ltimo mtodo para
la muestra si se emplearon 40l de ureasa obtenida en la ltima etapa? Tenga en cuenta que para la
ureasa una unidad de actividad enzimtica (1 UI) se define como la cantidad de enzima que cataliza el
consumo de 1 mol de sustrato (urea) por minuto en las condiciones especificadas. b) Realice la tabla
de purificacin. Considere que una Unidad de actividad Ureasa de define como la cantidad de enzima
que cataliza el consumo de 1 mol de sustrato por minuto.

7. La enzima mlica cataliza la reaccin: Malato + NADP
+
Piruvato + CO
2
+ NADPH + H
+
. Se
intent purificar esta enzima a partir de hojas de maz. Para ello se realizaron distintas etapas que
incluyeron la preparacin de un extracto crudo, precipitacin con (NH
4
)
2
SO
4
, cromatografa de
exclusin molecular en Sephadex G-100 y cromatografa de intercambio inico en DEAE-celulosa. La
medicin de protenas se realiz por el mtodo de Gornall. Para ello, alcuotas de 20 l de la
preparacin enzimtica se incubaron con 2 ml del reactivo de Biuret durante 15 min a 37C. El testigo
de ovoalbmina (10 mg/ml) procesado de la misma manera produjo un valor de absorbancia de 0,650
medido a 545 nm. La actividad enzimtica se determin en 1 ml de medio de reaccin que contena
50 mM Tris-HCl pH 8,0, cantidades saturantes de los sustratos y 10 l de la preparacin enzimtica. A
los 10 min de incubacin a 30C, la reaccin se detuvo por el agregado de 2 ml de
dinitrofenilhidracina. Como testigo se utiliz 1 ml de piruvato (PM=88) de 0,5 mg/ml que produjo un
valor de absorbancia de 0,040 medido a 505 nm. En base a los datos suministrados, a) Construya la
tabla de purificacin calculando el rendimiento y la pureza total alcanzados; b) Proponga otros dos
mtodos de medida de la actividad enzimtica. Explquelos brevemente.










Etapa Volumen
(ml)
Abs 545 nm Abs 505 nm
Extracto crudo 30 0,390 0,050
(NH
4
)
2
SO
4
8 0,253 0,166
Sephadex G-100 4 0,163 0,208
DEAE-celulosa 2 0,097 0,375


21

8. Se intenta purificar la enzima Gliceraldehdo 3P deshidrogenasa que cataliza la siguiente
reaccin:
Gliceraldehdo-3P + NADP
+
3P-Glicerato + NADPH + H
+

Luego de obtener el extracto crudo y realizar varios pasos de purificacin a partir de hojas de espinaca
se obtuvieron 75 ml con una concentracin de protena de 2 mg/ml. La medida de actividad se realiz
con una alcuota de 20 l midindose por mtodo continuo la aparicin de NADPH a 340 nm
(= 6200 M
-1
. cm
-1
) en una cubeta de 4 ml y 1 cm de camino ptico, obtenindose un AA de 0,31 en
4 minutos.

9. Con el fin de elegir qu paso era ms conveniente para continuar la purificacin, se toman
distintas alcuotas de la muestra y se procede de la siguiente manera:
1. 40 ml fueron sometidos a una cromatografa de exclusin molecular en la que se recuperaron
100 ml que contenan 100 U de actividad y 80 mg de protena.
2. 25 ml fueron sometidos a una cromatografa de adsorcin obtenindose un rendimiento del 50%
y recogindose 10 tubos de 1 ml, con una concentracin de protena de 0.03125 mg/ml.
3. Con los ltimos 10 ml se realiz una DEAE-celulosa obtenindose 5 ml con una actividad
especfica de 2.5 U/mg y 5 mg de protena.

En base a los datos: a) Calcule rendimiento y purificacin para cada uno de los tres procedimientos.
b) Qu procedimiento elegira si su objetivo fuera obtener la enzima lo ms pura posible?



INHIBICIN ENZIMTICA


1. Luego de purificar la enzima gliceraldehdo 3-fosfato deshidrogenasa se procedi a determinar el
valor de V
max
y K
m
para el gliceraldehdo 3-fosfato a pH 8,0. Los valores obtenidos fueron los
siguientes: V
max
= 20 U/ml; K
m
= 1 mM. Luego se volvieron a determinar estos parmetros cinticos
en presencia de cuatro sustancias conocidas A, B, C y D, obtenindose en cada caso los siguientes
valores:

K
m
(mM) V
max
(U/ml)
En presencia de A 2,0 20
En presencia de B 0,5 10
En presencia de C 1,0 10
En presencia de D 6,0 10

En base a estos datos, indique que tipos de sustancias son A, B, C y D. Justifique.

2. La enzima hexoquinasa cataliza la siguiente reaccin: Glucosa + ATP Glucosa-6-P + ADP.
Al observar que la enzima es inhibida por piruvato, se intent estudiar el mecanismo de la inhibicin.
Para ello se determin la velocidad de reaccin a distintas concentraciones de glucosa, en ausencia y
en presencia del inhibidor y a concentraciones saturantes de ATP. Los resultados obtenidos se
muestran en la tabla que sigue:




22

Piruvato (mM)
0 0,4
Glucosa (mM) Actividad (U/mg)
0,1 9,98 7,14
0,2 15,02 10,72
0,3 17,89 12,86
0,4 20,05 14,28

a) Determine qu tipo de inhibicin presenta el piruvato con respecto a la glucosa sobre la enzima y
esquematice el mecanismo de inhibicin. b) Calcule K
m
, V
max
y la constante de disociacin del
complejo hexoquinasa-piruvato. c) Calcule la velocidad de reaccin cuando la concentracin de
glucosa es igual al valor de Km aparente, si el piruvato est presente a una concentracin de 0,4 mM.

3. Sobre una enzima que cataliza la reaccin S P se prueba el efecto de dos inhibidores X e Y,
obtenindose los siguientes datos de velocidad. Determine la naturaleza de cada inhibidor haciendo un
esquema de la inhibicin. Calcule Km, Vmax y Ki.

Velocidad (U/ml)
[S] (mM) Sin agregado + 12 M X + 60 M Y
2,00 50,00 40,00 33,33
2,50 55,56 45,45 37,04
3,33 62,47 52,63 41,67
4,00 66,67 57,14 44,44
5,00 71,42 62,50 47,62


4. Cuando la reaccin enzimtica catalizada por la LDH (lactato deshidrogenasa) se lleva a cabo en
presencia de una concentracin 0,3 mM de un inhibidor X, tanto Km como Vmax disminuyen a un
tercio del valor obtenido en ausencia del inhibidor. Responda el siguiente cuestionario: a) Qu tipo de
inhibicin presenta X sobre el sistema enzimtico? b) Cmo es la afinidad aparente de la enzima por
su sustrato en presencia del inhibidor, comparada con la afinidad real que se observa en ausencia del
inhibidor? Por qu se produce ese cambio en la afinidad? c) Estime Ki del inhibidor X lo ms
exactamente que pueda con los datos disponibles. Si usted necesitase calcular Ki con una exactitud
mayor qu experimentos realizara?

5. En un estudio de inhibicin por GMP de la malato deshidrogenasa dependiente de NADP
(MDH) que cataliza la reaccin:

Oxaloacetato + NADPH + H
+
Malato + NADP
+

se obtuvieron los valores de AA
340 nm
/min que figuran en la tabla. La actividad enzimtica se midi con
10 l de la MDH en una cubeta de 1 ml y 1 cm de camino ptico y concentraciones saturantes de
Oxaloacetato. En base a la misma: a) Indique qu tipo de inhibidor es GMP con respecto a NADPH. b)
Calcule K
i
mendiate grficos secundarios y de Dixon c) Calcule K
m
para NADPH y V
max
de la enzima.
(c
340
= 6200 M
-1
. cm
-1
).






23

NADPH (mM) 0,25 0,50 0,67 1,00
GMP (mM) AA
340 nm
/min
0,0 0,365 0,564 0,654 0,775
1,0 0,248 0,413 0,497 0,620
2,0 0,188 0,326 0,401 0,517
3,0 0,151 0,270 0,336 0,443
4,0 0,127 0,230 0,289 0,388
5,0 0,109 0,200 0,254 0,344


6. La enzima mlica dependiente de NADP es una protena homotetramrica que cataliza la
reaccin: L-malato + NADP CO2 + piruvato + NADPH.
Para determinar el modo de accin de succinato con respecto a malato, se estudi la velocidad de la
reaccin enzimtica en ausencia y en presencia de distintas concentraciones del mismo, a
concentraciones saturantes de NADP. Los resultados se resumen en la siguiente tabla. En base a los
datos: a) Determine grficamente los valores de Km Malato y Vmax de la enzima. b) Indique que tipo
de inhibidor es el succinato con respecto a malato y calcule su Ki. c) Represente los grficos
secundarios y de Dixon para ste sistema.

Tabla
succinato
(mM)
0 0,4 0,8 1,2 1,6
malato
(mM)
Actividad (U/mg)
0,1 9,98 7,14 5,55 4,55 3,85
0,2 15,02 10,72 8,33 6,82 5,77
0,3 17,89 12,86 10,02 8,18 6,92
0,4 20,05 14,28 11,11 9,09 7,69


7. Para el tratamiento de una enfermedad, un laboratorio farmacutico est tratando de desarrollar
un nuevo medicamento consistente en un inhibidor que se combine nicamente con la forma libre de la
enzima E involucrada en dicha enfermedad. Para ello analiza a los inhibidores X e Y obteniendo los
siguientes resultados:
V (moles min
-1
mg
-1
)
1/ |S| ( M )
-1
|X|= 0mM |X|= 2 mM
0,33 10,4 6,0
0,20 14,5 9,1
0,10 22,5 15,15
0,03 33,8 28,4
0,01 40,5 37,9

Al medir velocidad inicial de la reaccin enzimtica (U/mg) en funcin de la concentracin de sustrato
S en ausencia y en presencia de 2 mM de Y y luego de realizar la representacin de Lineweaver-Burk,
se obtuvieron dos rectas intersectantes en un mismo punto en el eje de las ordenadas. La pendiente de
la recta obtenida en presencia de Y fue de 0,66.
En base a los datos: a) Calcule K
m
y V
mx
de la enzima E. b) Qu tipo de inhibidores son X e Y?
Justifique. Indique los valores de K
m
y V
mx
en presencia de X e Y. C) Cul/es de los inhibidores sera


24

til para el tratamiento de la enfermedad? En caso de que ambos lo sean, diga cul sera el ms
efectivo. Justifique su respuesta teniendo en cuenta el valor de Ki.

8. La metabolizacin del etilenglicol conduce a la formacin de cido oxlico, altamente txico
para el rin. La primera etapa en la generacin del oxlico es catalizada por una enzima heptica: la
alcohol deshidrogenasa (ADH). Este tipo de envenenamiento puede contrarrestarse administrando
grandes dosis de Etanol o Proinebrium, una droga que acta como inhibidor de la ADH. Se estudi el
efecto del etanol y el Proinebrium como inhibidores de la ADH utilizando etilenglicol como sustrato.
La actividad enzimtica se ensay por un mtodo discontinuo: el aldehdo obtenido como producto de
la reaccin enzimtica se oxida a cido oxlico el cual reacciona con difenilamina dando azul de
anilina que absorbe a 600 nm. En todos los casos se incub el enzima en un volumen final de 3 ml con
el sustrato en presencia o ausencia de inhibidor, a las concentraciones indicadas en las tablas 1 y 2, a
37C. A los 3 minutos la reaccin se detuvo por el agregado de 2 ml de reactivo de trabajo (oxidante +
difenilamina) y a los 10 min. se midi la absorbancia a 600 nm contra blanco de agua. Una alcuota de
3 ml de un testigo de cido oxlico 25 mM dio una absorbancia de 0,1 cuando fue ensayada por el
mismo mtodo.
Los datos obtenidos se detallan a continuacin:







Tabla 1 Tabla 2




a) Determine grficamente K
m
y V
max
de la enzima b) Indique que tipo de inhibidores son el etanol y el
Proinebrium. c) Determine grficamente la K
i
del Proinebrium.


9. Se estudia el efecto de dos inhibidores X e Y sobre la actividad de una enzima. Los resultados
del ensayo utilizando 5 l de la solucin enzimtica se muestran en el grfico. Adems, se determina la
actividad en funcin de la cantidad de enzima en presencia de una concentracin constante de cada
inhibidor y se obtienen los datos de velocidad que se detallan en la tabla. Explique los resultados
obtenidos.
Proinebrium
(M)


1,0 x 10
-6


2,0 x 10
-6


3,0 x 10
-6

Etilenglicol
(mM)

Actividad (mol/min)
1,70 41,7 31,3 25,0
2,50 55,6 41,7 33,3
5,00 83,3 62,5 50,0
etanol(M)

0 1x10
-5

etilenglicol (mM)
(absorbancia a 600 nm)
1,70 0,250 0,138
2,50 0,333 0,195
5,0 0,480 0,320

C H
2
O H
C H
2
O H
C H
C H
2
O H
O
C O O H
C O O H
E t i l e n g l i c o l
O x l i c o
A D H


25















EFECTO DEL PH Y LA TEMPERATURA



1. El grfico adjunto muestra el efecto de la temperatura sobre la actividad de una enzima.
a) Indique las causas por las que vara la actividad enzimtica en funcin de la temperatura
estableciendo efectos directos y efectos indirectos. b) Qu experimento le permitira distinguir entre
efectos reversibles e irreversibles? c) Indique que zona del grfico utilizara para obtener la energa de
activacin (Ea) de la reaccin y como la calculara. Defina Q10. Cul metodologa considera ms
apropiada para el clculo de la Ea?

Temperatura (C)
0 10 20 30 40 50 60 70 80
A
c
t
i
v
i
d
a
d

(

m
o
l
/
m
i
n
.
m
g
)
0
10
20
30
40



2. Al ensayar la actividad de una enzima a diferentes temperaturas se obtuvieron los datos
mostrados en la lnea A. Cuando la enzima se preincub a distintas temperaturas durante 15 min y
luego se determin actividad a temperatura ptima, se obtuvieron los datos de la lnea B. Ambos
experimentos se realizaron a concentraciones de sustratos iguales a 100 veces los valores de Km.

T (C
Act. (U/mg)
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
A
1,1 2 4 10 15 22 30 30 20 12 6 1,5
B
2,5 2,5 5 30 30 30 30 20 10 7,5 2,5 2,5

Actividad (U)
l de Enzima 100 M X 100 M Y Sin inhibidor
1 0 7,5 10
2 0 15 20
3 0 22,5 30
4 10 30 40
5 20 37,5 50
6 30 45 60
1/v
1/[S]
[Y]=100M
[X]=100M
Sin inhibidor
1/v
1/[S]
[Y]=100M
[X]=100M
Sin inhibidor


26

En base a estos datos: a) Indique la T ptima de la enzima. b) Por qu la actividad enzimtica cuando
se ensay a la temperatura ptima no fue constante para todas las muestras previamente incubadas a
las distintas temperaturas? c) Calcule el Q
10
y la energa de activacin.

3. La ureasa cataliza la hidrlisis de la urea para dar CO
2
y NH
4
+
. Cuando se realiz el estudio de
dependencia de la actividad enzimtica con la temperatura, se obtuvieron los datos que figuran en la
grfica. Los experimentos se llevaron a cabo bajo las siguientes condiciones: I- en un medio
medianamente reductor, II- en un medio fuertemente reductor y III en un medio no reductor. En base
al grfico de Arrhenius que se muestra, hipotetice acerca del comportamiento de esta enzima en las
distintas condiciones.


1/T (*10
5
)
310 320 330 340 350 360
L
o
g

V
m
a
x
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
2.6
No Reductor
Reductor Fuerte
Reductor Moderado


4. La enzima nucletido pirofosfatasa de Proteus vulgaris es completamente inactivada cuando se
la incuba durante 10 minutos a 70
o
C y puede ser completamente reactivada por enfriamiento a 37
o
C.
Se ha establecido que un inhibidor de la enzima copurifica con la misma. Debido a que el mencionado
inhibidor es termolbil, se decide calentar a 100
o
C para eliminarlo. Un estudiante realiza este
procedimiento y encuentra que la enzima se desnaturaliza. Decide repetir el procedimiento, esta vez en
presencia de una sustancia X (cuya unin a la enzima ha sido previamente descripta), observando que
en esta ocasin la enzima no pierde su actividad. a) Explique estos resultados. b) Qu tipo de
sustancia puede ser X?

5. Se ha purificado a homogeneidad la enzima ATPasa de hgado de rata (ATP ADP + Pi) y se
midi su actividad a concentraciones de ATP subsaturante (10 M) a distintas temperaturas. Los
resultados obtenidos se indican en la Tabla. En un experimento de preincubacin de la enzima a
distintas temperaturas y medida de la actividad a 25C, se concluye que la enzima pierde actividad a
temperaturas mayores a 35C. a) Sabiendo que el ndice de recambio de la enzima a 30C es de
104 min-1 y que la enzima (PM=50 kDa) posee un solo sitio activo, estime el valor de Km para ATP a
30C. b) Podra estimar el valor de Energa de Activacin de la enzima a partir de estos datos? Si es
as, indique el valor obtenido. (R=2 cal/mol.K).

Temperatura Act. Esp. (mol/min.mg)
20C 25
30C 40
40C 20

6. El grfico adjunto muestra el efecto del pH sobre la actividad de una enzima medida a
concentraciones de sustrato constante y saturante. a) Enumere las causas por las que la actividad


27

enzimtica puede variar en funcin del pH. b) Plantee un diseo experimental para distinguir entre los
posibles efectos del pH. c) De acuerdo al grfico a qu pH trabajara para realizar los estudios
cinticos de esta reaccin enzimtica? d) Si la enzima es estable y el sustrato no sufre cambios de
ionizacin en el rango de pH estudiados, a qu corresponderan los puntos de inflexin de la curva
(pH 4 y 8)?



7. Indique si los grficos que se muestran sugieren ionizacin de la enzima libre o ionizacin del
complejo enzima-sustrato. Suponga que en ese rango de pH no hay desnaturalizacin de la enzima,
como as tampoco del sustrato. Justifique brevemente.










8. Un investigador purifica a homogeneidad la enzima malato deshidrogenasa y realiza un estudio
de la actividad de la enzima en funcin del pH utilizando una concentracin de sustrato subsaturante.
Obtiene la grfica A. Sin embargo cuando preincuba la enzima a distintos valores de pH entre 2 y 10 y
luego mide la actividad a pH ptimo observa que la enzima presenta actividad mxima entre pH 4.0 y
8.0. Con el fin de determinar qu aminocidos estaban implicados en la catlisis determina la actividad
de la enzima a concentraciones variables de sustrato y a tres valores de pH, obteniendo el grfico B.
Teniendo en cuenta que el sustrato no sufre cambios de protonacin en el rango de pH estudiado,
indique: a) El rango de estabilidad de la malato deshidrogenasa, el pH ptimo de la enzima. b)
Proponga un modelo (con un esquema) que explique los resultados obtenidos en la grfica B.
c) Cuando el investigador grafica los distintos valores de Km a distintos valores de pH, obtiene que un
grupo con un pKa de 6,2 est implicado en la catlisis. Sin embargo, al estudiar la secuencia primaria
de la enzima y compararla con otras secuencias encuentra que, de todos los residuos ionizables, slo
un residuo de Glu est conservado (pKa o
COO
-
=4,0). Podra ser dicho grupo el responsable de los
cambios de la actividad de la enzima? Por qu podra presentar ese valor de pKa?








2 4 6 8 10 12
4
6
8
10 A
pH
A
c
t
i
v
i
d
a
d

(
U
/
m
g
)

1/[S] (mM)
-1
0 1 2 3 4
0
3
6
9
12
pH 4.0
pH 6.0
pH 8.0
B
1
/
A
c
t
i
v
i
d
a
d

(
U
/
m
g
)
-
1

A B


28



A
pH
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
0
20
40
60
80
100 MDH mitocondrial
MDH glioxisomal
B
pH
3 4 5 6 7 8 9 10 11
0
20
40
60
80
100
120
MDH mitocondrial
MDH glioxisomal





















A
c
t
i
v
i
d
a
d

(
%
)






















A
c
t
i
v
i
d
a
d

(
%
)

9. El grfico A muestra los resultados de los estudios de la estabilidad de la enzima malato
deshidrogenasa purificada de mitocondrias y glioxisomas a distintos pH. Cuando se procedi a realizar
la determinacin del pH ptimo se obtuvo el grfico B a) Indique el pH ptimo de las isoenzimas y
establezca el rango de pH en el cual ambas enzimas son estables. b) Analice las posibles causas de la
disminucin de la actividad a pH mayores y menores al pH ptimo en cada caso. c) Explique como
realizara el estudio de estabilidad en funcin del pH, especificando todos los parmetros a tener en
cuenta. d) Segn los resultados obtenidos en el caso de la enzima mitocondrial a pH mayores a 8,5
indique qu grupo/s ionizable/s de la enzima podra/n estar implicado/s en los cambios de actividad
observados. Qu estado de ionizacin presenta dicho grupo en la enzima activa?













CINTICA DE DOS SUSTRATOS


1. Describa tres modelos cinticos para una reaccin enzimtica en la que participan dos sustratos.
Describa tambin mtodos de diagnstico para determinar el modelo cintico seguido por una reaccin
enzimtica que involucre dos sustratos.

2. La glutamato-oxaloacetato aminotransferasa, llamada comnmente transaminasa GOT, es una
enzima que interviene en el metabolismo de los aminocidos y posee importancia clnica para el
diagnstico de patologas hepticas. La enzima posee fosfato de piridoxal como grupo prosttico y
cataliza la siguiente reaccin:
Glutamato + Oxaloacetato Aspartato + 2-Cetoglutarato.
En una investigacin sobre el mecanismo cintico se analiz la dependencia de la actividad enzimtica
con la concentracin de glutamato, a dos concentraciones diferentes de oxaloacetato. Los resultados
obtenidos se resumen en la tabla:

Glutamato (mM)
Experimento
0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,8
Velocidad (U/mg)
+ 0,1 mM oxaloacetato 2,0 3,4 4,4 5,0 5,8 6,6
+ 0,2 mM oxaloacetato 2,2 4,2 5,8 6,6 8,0 10,0

Por otra parte, el aspartato se comport como un inhibidor competitivo respecto del glutamato, cuando
se agreg oxaloacetato en concentraciones saturantes. Proponga en forma esquemtica un modelo
cintico que sea compatible con estas observaciones experimentales.



29

3. Una enzima cataliza la reaccin S
1
+ S
2
P
1
+ P
2
. Cuando se mide la actividad a
concentraciones variables de S
2
, manteniendo constante la concentracin de S
1
se obtienen los valores
de velocidad (moles/min.mg) que se presentan en la siguiente tabla:

[S
2
] (mM) 1 2 4 6 10
[S
1
] (mM) Velocidad (moles/min.mg)
5 8,7 14,5 21,5 25,6 30,3
10 13,9 22,5 32,5 38,2 44,4


El efecto de los productos se resume en la tabla siguiente:

S
1
Variable S
2
Variable
S
2
Subsat. S
2
Sat. S
1
Subsat. S
1
Sat.
P
1
NC --- C C
P
2
NC NC NC AC

a) Indique si la reaccin sigue un mecanismo secuencial o ping-pong. Justifique brevemente. b) En
caso que corresponda indique el orden de adicin de sustratos y de salida de los productos.
Esquematice el modelo de reaccin.

4. La enzima citrato sintasa de mitocondrias participa en el metabolismo catablico de los hidratos
de carbono en todos los organismos aerbicos, catalizando la siguiente reaccin:
Oxaloacetato + Acetil-CoA Citrato + CoA
En una investigacin sobre el mecanismo cintico de esta enzima se llev a cabo un estudio de la
variacin de la actividad enzimtica en funcin de la concentracin de oxaloacetato, a dos
concentraciones diferentes de Acetil-CoA. Los resultados obtenidos se resumen en la tabla:

OAA (mM) 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 4,0
Experimento V (U/mg)
+ 0,1 mM Acetil-CoA 0,67 1,10 1,45 1,65 1,85 2,2
+ 0,2 mM Acetil-CoA 2,00 3,35 4,15 5,00 5,55 6,65

Por otra parte, el citrato se comport como un inhibidor competitivo tanto respecto a oxaloacetato
como respecto a acetil-CoA, y otro tanto ocurri con la Coenzima A. Proponga en forma esquemtica
un modelo cintico que sea compatible con estas observaciones experimentales.

5. Un estudiante purifica una quinasa de un sustrato A (A + ATP A-P + ADP) y decide estudiar
su mecanismo de reaccin. As, incuba la enzima con ATP marcado con
32
P. Al cabo de 1 h precipita
la enzima, observando que la radiactividad inicial en el sobrenadante ha disminuido un 50%,
detectndose tambin ADP no marcado. a) Plantee un mecanismo de reaccin posible de esta quinasa.
b) Indique qu tipo de grficos esperara obtener al graficar 1/v vs 1/[A] a distintas concentraciones de
ATP. c) Esperara obtener radiactividad en la fraccin proteica? Explique su respuesta.



30

6. Una vez purificada la enzima L-Aspartato aminotransferasa, enzima que cataliza la reaccin:
aspartato + oxoglutarato glutamato + oxaloacetato
Se procedi a estudiar el efecto de la concentracin de aspartato a concentraciones constantes de
Oxoglutarato sobre la velocidad inicial. Los valores de velocidad inicial obtenidos (mol/min.mg) se
transcriben a continuacin:

[Aspartato]
[Oxoglutarato]
0,5 mM 1 Mm 2,5 mM 5 mM 10 mM
Velocidad (mol/min.mg)
Saturante 18,2 33,4 66,6 100,0 125,0
5 mM 16,7 28,6 50,0 66,6 77,0
1 mM 15,4 25,0 40,0 50,0 55,0

a) Determine grficamente los valores de V
max
y K
m
para el aspartato. Indique el valor de V
max
en
UI/mg y en katal/mg. b) Cul es el ndice de recambio, asumiendo que la enzima posee un PM de 50
kDa y que posee 2 sitios activos por molcula. c) Indique el mecanismo de reaccin de esta enzima.
Fundamente brevemente.

7. En un sistema enzimtico multisustrato del siguiente tipo:

A + B P + Q

Los reactivos A y B se adicionan al enzima E completamente al azar. Cuando se representa 1/v vs
1/[A] a distintas concentraciones de B, se obtienen rectas que se intersectan en un punto cuyo valor
sobre el eje de las abscisas es de 10 mM
-1
. El valor de o (el factor de interaccin entre A y B) es
0,28. a) Esquematice el mecanismo de la reaccin catalizada enzimticamente. b) Calcule el valor de
K
m
para A y el valor de K
A
. c) La enzima posee 4 subunidades de 200 kDa cada una, con 1 sitio activo
por subunidad. Calcule el nmero de recambio, sabiendo que V
max
es 500 M/min. Considere que la
velocidad de reaccin se mide por un mtodo continuo en una cubeta de volumen final de 1 ml, y que
se utilizaron 20 l de una preparacin enzimtica pura de concentracin 2 mg/ml. d) Qu otros
experimentos deben realizarse para confirmar el mecanismo de la reaccin enzimtica?

8. La enzima malato deshidrogenasa (MDH) cataliza la reaccin:

Malato + NAD Oxaloacetato (OAA) +NADH

Para caracterizar el mecanismo de reaccin y el sitio activo de la enzima se llevaron a cabo dos
experimentos. En el 1 experimento se estudi el efecto de los productos de la reaccin sobre la
actividad enzimtica a concentraciones subsaturantes de malato obtenindose los datos que figuran en
la Tabla 1. En el 2 experimento, 150 g de enzima preincubada durante 30 min en presencia de los
productos de la reaccin o en ausencia de los mismos fueron tratadas 2 hs con N-etilmaleimida (agente
modificador de residuos de cistena) obtenindose los datos de la Tabla 2. En base a los resultados:
a) indique el posible mecanismo de reaccin de la enzima, justifique; b) Qu puede concluir acerca de
los aminocidos involucrados en el sitio cataltico?







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Tabla 1 Actividad (U/ml)
NAD (mM) Sin agregados + NADH + OAA
0,025 33,3 20,0 16,7
0,033 40,0 25,0 20,0
0,050 50,0 33,3 25,0
0,100 66,7 50,0 33,3

Tabla 2 Actividad (U/ml)
Sin agregados 16
+ NADH 91
+ OAA 34