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Chagatest
ELISA recombinante v.3.0
Ensaio imunoenzimtico (ELISA) de 3 gerao para a
deteco de anticorpos contra o Trypanosoma cruzi
SIGNIFICADO CLNICO
A enfermidade de Chagas, uma infeco parasitria produ-
zida pelo Trypanosoma cruzi.
O diagnstico de laboratrio depende do estgio no qual se
encontra a enfermidade. Durante a fase aguda, o diagnstico
se efetua diretamente mediante a comprovao dos parasi-
tas no sangue ou por mtodos imunolgicos que detectem
IgM. Durante a fase crnica, podem ser utilizados os mto-
dos imunolgicos como a reao de fixao de complemen-
to de Machado e Guerreiro, ou aglutinao de ltex, floculao,
hemaglutinao, aglutinao direta, imunofluorescncia e ul-
timamente, ELISA.
FUNDAMENTOS DO MTODO
Nesta tcnica qualitativa para a deteco de anticorpos anti-
T. cruzi, a amostra diluda num suporte onde se encontram
imobilizados antgenos recombinantes (1, 2, 13, 30, 36 e
SAPA), provenientes de protenas especficas das formas tri-
pomastigota e epimastigota, constituindo-se em um mtodo
de 3 gerao. Estes antgenos so obtidos pela tcnica de
ADN recombinante partindo de protenas especficas dos es-
tgios epimastigota e tripomastigota do T. cruzi, correspon-
dentes a zonas altamente conservadas entre diferentes ce-
pas. A tecnologia empregada permite assegurar uma mistura
antignica de composio conhecida e constante lote a lote,
oferecendo resultados reproduzveis, especficos e com alta
sensibilidade. Se as amostras de soro contm os anticorpos
especficos, estes formaro um complexo com os antgenos
e permanecero unidos ao suporte. A frao no ligada
eliminada por lavagem e aps se acrescentam anticorpos
anti-imunoglobulina humana conjugados com peroxidase. No
caso de ocorrer a reao na primeira etapa do processo, o
conjugado ento se ligar. Aps uma nova lavagem se acres-
centa o substrato enzimtico. A peroxidase presente no con-
jugado reagir com o substrato promovendo o desenvolvimento
de colorao azul. A reao interrompida com cido sulf-
rico, que muda a colorao do azul para o amarelo.
REAGENTES FORNECIDOS
Policubeta sensibilizada: policubeta de tiras removveis
com cubetas que contm antgenos recombinantes de Try-
panosoma cruzi imobilizados.
Conjugado: anti-imunoglobulinas humanas (cabra) conjuga-
dos com peroxidase.
Revelador A: perxido de hidrognio 60 mmol/l em tampo
citrato 50 mmol/l pH 3,2.
Revelador B: tetrametilbenzidina (TMB) 0,01 mol/l em ci-
do clordrico 0,1 N.
Stopper: cido sulfrico 2 N.
Tampo de Lavagem concentrado: cloreto de sdio
1,4 mol/l em tampo fosfatos 100 mmol/l e tensioativo no
inico 0,1 g/l.
Diluente de Amostras: albumina bovina em soluo fisiol-
gica tamponada com tampo fosfatos pH 7,2.
Controle Positivo: diluio de soro inativado contendo anti-
corpos contra o Trypanosoma cruzi.
Controle Negativo: diluio de soro no reativo, inativado.
INSTRUES PARA USO
Tampo de Lavagem: diluir 1+4 com gua destilada (1 par-
te de Tampo de Lavagem concentrado + 4 partes de gua
destilada). A baixa temperatura os componentes do reagente
podem precipitar. Neste caso, colocar em banho-maria a 37
o
C
alguns minutos, misturando aps por inverso.
Policubeta sensibilizada: pronta para uso.
Conjugado: pronto para uso.
Revelador A: pronto para uso.
Revelador B: pronto para uso.
Stopper: pronto para uso.
Diluente de Amostras: pronto para uso. A cor do Diluente
de Amostras pode variar lote a lote sem que isto afete a capa-
cidade reacional do mesmo.
Controle Positivo e Controle Negativo: prontos para uso.
PRECAUES
- Todas as amostras de pacientes devem ser manipuladas
como se fossem capazes de transmitir infeco. Os con-
troles encontram-se inativados. No entanto, devem ser usa-
dos como se tratando de material infectante.
- Os soros controles foram examinados para antgenos de
superfcie da hepatite B (HBsAg), vrus da imunodeficincia
humana (HIV) e da hepatite C, encontrando-se no reativos.
- Todos os materiais empregados no ensaio devem ser des-
trudos a fim de assegurar a inativao dos agentes patog-
nicos. O mtodo recomendado para este procedimento
autoclavar durante 1 hora a 121
o
C. Os lquidos de dejeto
podem ser desinfetados com hipoclorito de sdio (concen-
trao final 5%) durante no mnimo 60 minutos.
- No misturar reagentes de diferentes kits e lotes.
- No usar reagentes de outra origem.
- As policubetas devem ser incubadas em estufa. No usar
banho-maria. Deve-se evitar abrir a estufa durante este pro-
cesso.
- Evitar que vapores de hipoclorito provenientes dos recipien-
tes para dejetos biolgicos entrem em contato com a
policubeta, j que o hipoclorito afeta a reao.
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- Os reagentes so para uso diagnstico in vitro.
- Evitar o contato do cido sulfrico com a pele ou mucosas.
R36/38: irrita os olhos e a pele. R34: provoca queimaduras.
S24/25: evitar o contato com os olhos e a pele. S26: caso
de contato com os olhos, lavar imediatamente com abun-
dante gua e acudir ao mdico. S28: caso de contato com
a pele, lavar imediatamente com abundante gua. S37/39:
utilizar luvas adequadas e proteo apropriadas para os
olhos/cara.
- Evitar derramar os lquidos e a formao de aerossis.
ESTABILIDADE E INSTRUES DE
ARMAZENAMENTO
Reagentes Fornecidos: so estveis sob refrigerador (2-10
o
C)
at a data de vencimento indicada na embalagem. No con-
gelar.
Tampo de Lavagem: estvel 3 mses a temperatura am-
biente.
Policubeta sensibilizada: as tiras de cubetas com antge-
no imobilizado so fornecidas fechadas no vcuo e com
dessecante. No abrir o envoltrio at o momento de uso,
nem antes que esteja a temperatura ambiente, pois ao con-
trrio se favorecer a humectao do contedo. As tiras de
cubetas no utilizadas devem ser conservadas na embala-
gem com o dessecante, fechado e a 2-10
o
C. As tiras con-
servadas nestas condies podem ser utilizadas nos 5
meses posteriores desde que no se ultrapasse a data de
vencimento do kit.
AMOSTRA
Soro ou plasma
a) Coleta: obter soro da maneira usual. No devem ser usa-
das amostras inativadas pelo calor. Vide LIMITAES DO
PROCEDIMENTO.
b) Aditivos: no so necessrios para soro. Ao empregar
plasma poder ser utilizado qualquer anticoagulante de uso
corrente na prtica transfusional.
c) Substncias interferentes conhecidas: a hemlise, hi-
perlipemia e outras causas de turbidez podem ser causa de
resultados errneos. Estas amostras devem ser clarificadas
por centrifugao.
d) Estabilidade e instrues de armazenamento: as amos-
tras no diludas podem ser conservadas durante 7 dias entre
2-10
o
C. Para conservao por perodos mais prolongados de-
vem ser congelados a -20
o
C ou temperaturas menores. Evitar
os congelamentos e descongelamentos reiterados. Existem
evidncias que mostram que os congelamentos sucessivos
podem ser causa de resultados errneos.
Se as amostras precisam ser transportadas, embalar de acor-
do com as especificaes legais relativas ao envio de materi-
ais infecciosos.
MATERIAL NECESSRIO (no fornecido)
- Micropipetas para medir os volumes indicados.
- Relgio alarme ou cronmetro.
- Estufa a 37
o
C.
- Espectrofotmetro para leitura de policubetas.
- Lavadora de policubetas.
CONDIES DE REAO
- Comprimento de onda primria: 450 nm
- Comprimento de onda secundria (bicromtica): 620 nm
- Calibrao do instrumento: levar a zero o espectrofotmetro
com Branco de Reagente, processado da mesma forma que
uma determinao, mas omitindo a colocao da amostra.
- Tempo de reao: varivel conforme o procedimento seleci-
onado.
- Temperatura de reao: 37 2
o
C e temperatura ambiente
(18-25
o
C).
- Volume de amostra: 10 ul
PROCEDIMENTO
I- TCNICA COM REVELADORES SEPARADOS
Levar os reagentes e amostras a temperatura ambiente
antes de iniciar a prova. Uma vez iniciada a anlise deve
ser completada sem interrupo.
Processar simultaneamente 2 Controles Positivos (CP), 3
Negativos (CN) e os Desconhecidos (D). Ao dispensar as
amostras e/ou Controles sobre o Diluente de Amostras,
deve assegurar-se de colocar os mesmos no centro do
lquido e no sobre as paredes ou o fundo da cubeta.
Enxaguar a pipeta com o Diluente dispensado na cube-
ta, para assegurar a correta homogeneizao.
Nas cubetas a utilizar da policubeta colocar:
D CP CN
Diluente de Amostras 200 ul 200 ul 200 ul
Controle Positivo - 10 ul -
Controle Negativo - - 10 ul
Amostra 10 ul - -
Misturar aplicando batidas suaves nas laterais da policu-
beta durante 10 segundos aps pipetadas as amostras
em cada tira. No procedimento manual, para evitar a eva-
porao, cobrir a placa e incubar em estufa 30 2 minu-
tos a 37

2
o
C. Aps, aspirar cuidadosamente o lquido de
cada cubeta desprezando-o em um recipiente para deje-
tos biolgicos que contenha hipoclorito de sdio a 5%. Na
continuao, lavar 5 vezes com Tampo de Lavagem (pre-
parado conforme as instrues de uso da pgina. 1) em-
pregando aproximadamente 300 ul/vez/cubeta. Aps cada
lavagem o lquido deve ser descartado no recipiente com
hipoclorito. Empregar lavador automtico. Ao finalizar a
ltima lavagem, eliminar completamente o lquido residu-
al, invertendo a policubeta e batendo-a vrias vezes sobre
papel absorvente, exercendo uma leve presso com a mo
nas laterais maiores do suporte, para evitar a cada das
tiras de cubetas. Aps adicionar em cada cubeta:
Conjugado 50 ul 50 ul 50 ul
Pode-se colocar 1 gota, utilizando o frasco gotejador for-
necido.
Misturar aplicando batidas suaves nas laterais da policu-
beta durante 10 segundos. No procedimento manual, para
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evitar a evaporao, cobrir a placa e incubar durante 30 2
minutos em estufa a 37 2
o
C. Aps, aspirar o lquido das
cubetas, desprezando-o no recipiente com hipoclorito e
lavar conforme se indicou anteriormente. Ao finalizar a lti-
ma lavagem, eliminar completamente o lquido residual,
invertendo a policubeta e batendo-a vrias vezes sobre papel
absorvente, exercendo uma leve presso com a mo so-
bre as laterais maiores do suporte, para evitar a cada das
tiras de cubetas. Aps adicionar em cada cubeta respei-
tando a ordem dos reagentes:
Revelador A 50 ul 50 ul 50 ul
Revelador B 50 ul 50 ul 50 ul
Pode-se colocar 1 gota de cada Revelador, utilizando o
frasco gotejador fornecido.
Misturar aplicando batidas suaves nas laterais da poli-
cubeta durante 10 segundos. Incubar 30 2 minutos a
temperatura ambiente (18-25
o
C), aps adicionar:
Stopper 50 ul 50 ul 50 ul
Pode-se colocar 1 gota, utilizando o frasco gotejador for-
necido.
Misturar aplicando batidas suaves nas laterais da policubeta
durante 10 segundos. Ler em espectrofotmetro a 450 nm
ou efetuar leitura bicromtica a 450/620 nm.
II- TCNICA COM REVELADORES PRE-MISTURADOS
Levar os reagentes e amostras a temperatura ambiente
antes de iniciar a prova. Uma vez iniciada a anlise deve
ser completada sem interrupo.
Processar simultaneamente 2 Controles Positivos (CP), 3
Negativos (CN) e os Desconhecidos (D). Ao dispensar as
amostras e/ou Controles sobre o Diluente de Amostras,
deve assegurar-se de colocar os mesmos no centro do
lquido e no sobre as paredes ou o fundo da cubeta.
Enxaguar a pipeta com o Diluente dispensado na cube-
ta, para assegurar a correta homogeneizao.
Nas cubetas a utilizar da policubeta colocar:
D CP CN
Diluente de Amostras 200 ul 200 ul 200 ul
Controle Positivo - 10 ul -
Controle Negativo - - 10 ul
Amostra 10 ul - -
Misturar aplicando batidas suaves nas laterais da poli-
cubeta durante 10 segundos aps pipetadas as amos-
tras em cada tira. No procedimento manual, para evitar a
evaporao, cobrir a placa e incubar em estufa 30-35
minutos a 37

2
o
C. Aps, aspirar cuidadosamente o
lquido de cada cubeta desprezando-o em um recipiente
para dejetos biolgicos que contenha hipoclorito de s-
dio a 5%. Na continuao, lavar 5 vezes com Tampo de
Lavagem (preparado conforme instrues de uso da
pgina. 1) empregando aproximadamente 300 ul/vez/cu-
beta. Aps cada lavagem o lquido deve ser descartado no
recipiente com hipoclorito. Empregar lavador automtico.
Ao finalizar a ltima lavagem, eliminar completamente o
lquido residual, invertendo a policubeta e batendo-a vrias
vezes sobre papel absorvente, exercendo uma leve pres-
so com a mo sobre as laterais maiores do suporte, para
evitar a cada das tiras de cubetas. Aps adicionar em
cada cubeta:
Conjugado 50 ul 50 ul 50 ul
Pode-se colocar 1 gota, utilizando o frasco gotejador
fornecido. Misturar aplicando batidas suaves nas late-
rais da policubeta durante 10 segundos. No procedi-
mento manual, para evitar a evaporao, cobrir a placa e
incubar durante 20-25 minutos em estufa a 37 2
o
C.
Aps, aspirar o lquido das cubetas, desprezando-o no
recipiente com hipoclorito e lavar conforme se indicou
anteriormente. Ao finalizar a ltima lavagem, eliminar
completamente o lquido residual, invertendo a policu-
beta e batendo-a vrias vezes sobre papel absorvente,
exercendo uma leve presso com a mo sobre as late-
rais maiores do suporte, para evitar a cada das tiras de
cubetas. Aps adicionar uma mistura de partes iguais
de Revelador A + Revelador B (estvel 24 horas):
Reveladores misturados 100 ul 100 ul 100 ul
Misturar aplicando batidas suaves nas laterais da poli-
cubeta durante 10 segundos. Incubar 20-25 minutos a
temperatura ambiente (18-25
o
C), aps adicionar:
Stopper 50 ul 50 ul 50 ul
Pode-se colocar 1 gota, utilizando o frasco gotejador
fornecido. Misturar aplicando batidas suaves nas late-
rais da policubeta durante 10 segundos. Ler em espec-
trofotmetro a 450 nm ou efetuar leitura bicromtica a
450/620 nm.
ESTABILIDADE DA MISTURA FINAL DE REAO
A cor da reao estvel durante 30 minutos, portanto os
resultados devem ser observados durante este perodo.
CRITRIOS DE VALIDAO DA PROVA
A prova considerada vlida se cumpridas simultaneamen-
te as seguintes condies:
a) As leituras de pelo menos 2 dos 3 Controles Negativos
corrigidas contra o Branco de Reagente devem ser meno-
res ou iguais a 0,150 D.O.
b) A leitura mdia dos Controles Positivos corrigida deve
ser maior ou igual a 0,600 D.O.
Se uma ou ambas as condies no se cumprirem, repetir a
prova. Para ambos os casos lembrar que as leituras obtidas
dependero da sensibilidade do aparelho empregado.
INTERPRETAO DOS RESULTADOS
A presena ou ausncia de anticorpos anti-T. cruzi deter-
minada relacionando a absorbncia da amostra com o valor
do Cut-off.
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Cut-off = CNx + 0,300 D.O.
onde CNx: mdia das leituras do Controle Negativo.
Zona de indeterminao: Cut-off 10%
Amostras No Reativas: so consideradas aquelas com
absorbncias menores que o limite inferior da zona de inde-
terminao.
Amostras Reativas: so consideradas aquelas com ab-
sorbncias maiores que o limite superior da zona de inde-
terminao.
Amostras Indeterminadas: so consideradas aquelas com
absorbncias que caem dentro da zona de indeterminao.
Estas amostras devem ser ensaiadas novamente.
LIMITAES DO PROCEDIMENTO
Vide Substncias interferentes conhecidas em AMOSTRA.
- Constituem causas de resultados errneos:
Lavagem incorreta das cubetas de reao.
Contaminao cruzada de amostras No Reativas com an-
ticorpos procedentes de uma amostra Reativa.
Contaminao da soluo cromognica com agentes oxi-
dantes (cloro, etc.).
Contaminao do Stopper.
Conservao inadequada das tiras de cubetas no utilizadas.
Utilizar banho-maria para a incubao.
Contaminao do Tampo de Lavagem diludo: recomenda-
se conferir a limpeza dos frascos onde preparado e arma-
zenado. Se for observada turbidez ou precipitao na pre-
parao, despreza-lo.
- Um resultado negativo no exclui a possibilidade de exposi-
o ou infeco por T. cruzi.
- Ocasionalmente, ao realizar leituras bicromticas, podem
obter-se absorbncias negativas que no interferem na de-
terminao, isto porque algumas amostras podem resultar
com leituras abaixo do Branco de Reagente.
- Dependendo da sensibilidade do espectrofotmetro usa-
do, so encontradas amostras que podem ter valores
acima da faixa numrica de leitura. Estes resultados de-
vem-se interpretar como reativos. Nestes casos particu-
lares, para obter valores numricos, pode-se realizar a
leitura a 490 nm ou 490/650 nm.
- No devem ser utilizadas amostras inativadas pelo calor
j que podem ocasionar resultados falsos positivos.
- Certifique-se que o sistema de lavagem que est sendo usa-
do aspire totalmente o contedo e que o volume da soluo
de lavagem dispensada seja regular.
PERFORMANCE
No se observa diferena significativa nos resultados obtidos
na performance, utilizando os dois procedimentos anteriores.
a) Sensibilidade: num painel de 70 amostras com xeno-
diagnstico e sorologia positivos a sensibilidade estima-se
em 100%.
Em outro painel de 144 amostras com sorologia positiva com
mtodos de hemaglutinao indireta, imunofluorescncia in-
direta e outros ELISA, a sensibilidade estima-se em 99,5%.
b) Especificidade: num painel de 75 amostras com xeno-
diagnstico e sorologia negativos, a especificidade estima-se
em 98,7%.
Em outro painel de 200 amostras com sorologia negativa por
mtodos de hemaglutinao indireta, imunofluorescncia in-
direta e outros ELISA, a especificidade estima-se em 100%.
c) Estudo populacional: em uma populao geral que inclui
indivduos sadios, doadores, chagsicos e com outras pato-
logias, a correlao em relao a mtodos confirmatrios foi
de 99,6%.
A sensibilidade do mtodo (seus resultados) ao igual que
os de qualquer mtodo sorolgico, s constituem mais um
dado auxiliar em termos de probabilidade. Por essa razo
os informes devem ser considerados provveis. Neste caso,
maior ou menor probabilidade de parasitose por T. cruzi.
Qualquer resultado Reativo, deve ser conferido por outra
tcnica. Deve-se lembrar o critrio recomendado pelo "Ins-
tituto Fatala Chaben" segundo o qual o imunodiagnstico
da infeco deve ser feito pelo menos por dois dos seguin-
tes mtodos: imunofluorescncia indireta, hemaglutinao
indireta, ELISA, aglutinao de partculas (ltex), devidamen-
te validados pelo Centro Nacional de Referncia.
PARMETROS PARA ANALISADORES AUTOMTICOS
Vide as adaptaes especficas para cada tipo de analisador,
que devero ser solicitadas ao setor Atendimento ao Cliente
Wiener lab/Labinbraz.
APRESENTAO
Kit para 96 determinaes (Cd. 1293254).
REFERNCIA
- Frasch, A.; Reyes, M. - Parasitol. Today 6/4, 1990.
- Affranchino, J. et al. - Mol. Biochem. Parasitol. 34:221, 1989.
- Pastini, A.C.; Iglesias, S.R.; Carricarte, V.C.; Guerin, M.E.;
Snchez, D.O.; Frasch, A.C. - Clin. Chem. 40/10:1893, 1994.
- Iglesias, S.R. - Instituto de Investigaciones Bioqumcas
"Fundacin Campomar", Buenos Aires, 1991.
- Knecher, L.M.; Rojkn, L.F.; Capriotti, G.A.; Lorenzo, L.E.-
Int. J. Parasitol. 24/2: 207-211 (1994).
- Knecher, L.M.; Capriotti: G.A.; Rojkn, L.F.; Lorenzo, L.E. -
Rev. Asoc. Bioq. Arg. 58/3:125, 1994.
- Capriotti, G.A.; Felcaro, M.V.; Toplikar, E.M.; Gariglio, R.C.
- Congreso A.A.C.C., 23-27 julio San Francisco, California -
U.S.A., 2000.
- Ministerio de Salud y Accin Social, Instituto Nacional de
Parasitologa "Doctor Mario Fatala Chabn" - Normas para
el diagnstico de la infeccin chagsica - Resolucin minis-
terial 523/97, 1998.
- Capriotti, G.A.; Felcaro, M.V.; Toplikar, E.M.; Gariglio, R.C.
- 52 Annual Meeting AACC, San Francisco, CA - Clin. Chem.
46/S6:A51, Abs 190A, 2000.
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2000 Rosario - Argentina
Wiener lab.
Importador exclusivo
Labinbraz Comercial Ltda.
C.G.C. 73008682/0001-52
Av. Guido Caloi, 1935 - blocos A e B - Trreo
CEP 05802-140 -SoPaulo -SP -Brasil
Resp. Tcnico:
Dr. Celso G. de Oliveira
CRF/SP n 13.784
SETOR DE APOIO AO CLIENTE
ASSESSORIA TCNICA EM
PRODUTOS E MTODOS:
Fone: (011) 2162-0200
Fax: (011) 2162-0359
120531
EXPLICAO DOS SMBOLOS
Policubeta Sensib. Diluyente Muestra
Policubeta sensibilizada Diluente de Amostra
Conjugado Buf. Lavado Conc.
Conjugado Tampo de Lavagem Concentrado
Revelador A Revelador B
Revelador A Revelador B
Control + Control -
Controle Positivo Controle Negativo
Stopper
Stopper
Os seguintes smbolos so utilizados nos kits de reagentes
para diagnstico da Wiener lab.
C CC CC
Este produto preenche os requisitos da Diretiva Euro-
pia 98/79 CE para dispositivos mdicos de diagns-
tico "in vitro"
P PP PP
Representante autorizado na Comunidade Europia
V VV VV
Uso mdico-diagnstico "in vitro"
X XX XX
Contedo suficiente para <n> testes
H HH HH
Data de validade
l ll ll
Limite de temperatura (conservar a)
No congelar
F FF FF
Risco biolgico
Volume aps da reconstituio
Contedo Cont.
g gg gg Nmero de lote
M MM MM
Elaborado por:
Nocivo
Xn
Corrosivo / Castico
Irritante
Xi
i ii ii
Consultar as instrues de uso
Calibrador Calibr.
Controle b bb bb
b bb bb Controle Positivo
c cc cc Controle Negativo
h hh hh
Nmero de catlogo

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