Cintica enzimtica

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Imagen generada por ordenador de un modelo de la estructura tridimensional de la enzima purina
nuclesido fosforilasa bacteriana.
La cintica enzimtica estudia la velocidad de las reacciones qumicas que son catalizadas por las
enzimas. El estudio de la cintica de una enzima permite explicar los detalles de su mecanismo cataltico,
su papel en el metabolismo, cmo es controlada su actividad en la clula y cmo puede ser inibida su
actividad por f!rmacos o venenos o potenciada por otro tipo de molculas.
Las enzimas son protenas "macromolculas# con la capacidad de manipular otras molculas,
denominadas sustratos. $n sustrato es capaz de unirse al centro cataltico de la enzima que lo reconozca y
transformarse en un producto a lo largo de una serie de pasos denominados mecanismo enzim!tico.
%lgunas enzimas pueden unir varios sustratos diferentes y&o liberar diversos productos, como es el caso
de las proteasas al romper una protena en dos polipptidos. En otros casos, se produce la unin
simult!nea de dos sustratos, como en el caso de la %'( polimerasa, que es capaz de incorporar un
nucletido "sustrato )# a una ebra de %'( "sustrato *#. %unque todos estos mecanismos suelen seguir
una comple+a serie de pasos, tambin suelen presentar una etapa limitante que determina la velocidad
final de toda la reaccin. Esta etapa limitante puede consistir en una reaccin qumica o en un cambio
conformacional de la enzima o del sustrato.
El conocimiento adquirido acerca de la estructura de las enzimas a sido de gran ayuda en la
visualizacin e interpretacin de los datos cinticos. ,or e+emplo, la estructura puede sugerir cmo
permanecen unidos sustrato y producto durante la cat!lisis, qu cambios conformacionales ocurren
durante la reaccin, o incluso el papel en particular de determinados residuos amino!cidos en el
mecanismo cataltico. %lgunas enzimas modifican su conformacin significativamente durante la
reaccin, en cuyo caso, puede ser crucial saber la estructura molecular de la enzima con y sin sustrato
unido "se suelen usar an!logos que se unen pero no permiten llevar a cabo la reaccin y mantienen a la
enzima permanentemente en la conformacin de sustrato unido#.
Los mecanismos enzim!ticos pueden ser divididos en mecanismo de -nico sustrato o mecanismo de
m-ltiples sustratos. Los estudios cinticos llevados a cabo en enzimas que solo unen un sustrato, como la
triosafosfato isomerasa, pretenden medir la afinidad con la que se une el sustrato y la velocidad con la que
lo transforma en producto. ,or otro lado, al estudiar una enzima que une varios sustratos, como la
diidrofolato reductasa, la cintica enzim!tica puede mostrar tambin el orden en el que se unen los
sustratos y el orden en el que los productos son liberados.
1
.in embargo, no todas las cat!lisis biolgicas son llevadas a cabo por enzimas proteicas. Existen
molculas catalticas basadas en el %/(, como las ribozimas y los ribosomas, esenciales para el splicing
alternativo y la traduccin del %/(m, respectivamente. La principal diferencia entre las ribozimas y las
enzimas radica en el limitado n-mero de reacciones que pueden llevar a cabo las primeras, aunque sus
mecanismos de reaccin y sus cinticas pueden ser estudiadas y clasificadas por los mismos mtodos.
Contenido
) ,rincipios generales
* Ensayos enzim!ticos
o *.) 0actores fsico1qumicos que pueden modificar la actividad enzim!tica
2 /eacciones con un sustrato
o 2.) 3intica de 4icaelis14enten
o 2.* /epresentacin de la ecuacin de 4icaelis14enten
o 2.2 .ignificado de las constantes cinticas
5 /eacciones multisustrato
o 5.) 4ecanismo de comple+o ternario
o 5.* 4ecanismo de ping1pong
6 3inticas no 4icaelianas
7 3intica del estado pre1estacionario
8 4ecanismo qumico
9 Inibicin enzim!tica
o 9.) Inibidores reversibles
o 9.* Inibidores irreversibles
: 4ecanismos de cat!lisis
); /eferencias

Principios generales
2
La velocidad de la reaccin va aumentando a medida que aumenta la concentracin de sustrato asta que
la enzima se satura.
La reaccin catalizada por una enzima utiliza la misma cantidad de sustrato y genera la misma cantidad
de producto que una reaccin no catalizada. %l igual que ocurre en otros tipos de cat!lisis, las enzimas no
alteran en absoluto el equilibrio de la reaccin entre sustrato y producto.
)
.in embargo, al contrario que
las reacciones qumicas, las enzimas se saturan. Esto significa que a mayor cantidad de sustrato, mayor
n-mero de centros catalticos estar!n ocupados, lo que incrementar! la eficiencia de la reaccin, asta el
momento en que todos los sitios posibles estn ocupados. En ese momento se abr! alcanzado el punto de
saturacin de la enzima y, aunque se a<ada m!s sustrato, no aumentar! m!s la eficiencia.
Las dos propiedades cinticas m!s importantes de una enzima son= el tiempo que tarda en saturarse con
un sustrato en particular y la m!xima velocidad de reaccin que pueda alcanzar. El conocimiento de estas
propiedades ace posible ipotetizar acerca del comportamiento de una enzima en el ambiente celular y
predecir cmo responder! frente a un cambio de esas condiciones.
Ensayos enzimticos
Artculo principal: Ensayo enzimtico
3
3urva de saturacin de una reaccin enzim!tica. La pendiente representa, en el perodo inicial, la
velocidad de la reaccin. La ecuacin de 4icaelis14enten describe cmo va variando la pendiente con
la concentracin de sustrato o de enzima.
$n ensayo enzim!tico es un procedimiento, llevado a cabo en un laboratorio, mediante el cual se puede
medir la velocidad de una reaccin enzim!tica. 3omo las enzimas no se consumen en la reaccin que
catalizan, los ensayos enzim!ticos suelen medir los cambios experimentados bien en la concentracin de
sustrato "que va decreciendo#, bien en la concentracin de producto "que va aumentando#. Existen
diversos mtodos para realizar estas medidas. La espectrofotometra permite detectar cambios en la
absorbancia de luz por parte del sustrato o del producto "seg-n la concentracin de estos# y la radiometra
implica incorporacin o liberacin de radiactividad para medir la cantidad de producto obtenido por
tiempo. Los ensayos espectrofotomtricos son los m!s utilizados, ya que permiten medir la velocidad de
la reaccin de forma continua. ,or el contrario, los ensayos radiomtricos requieren retirar las muestras
para medirlas, por lo que son ensayos discontinuos. .in embargo, estos ensayos son extremadamente
sensibles y permiten detectar niveles muy ba+os de actividad enzim!tica.
*
>ambin se puede utilizar la
espectrometra de masas para detectar la incorporacin o liberacin de istopos estables cuando el
sustrato es convertido en producto.
Los ensayos enzim!ticos m!s sensibles utilizan l!seres dirigidos a travs de un microscopio para observar
los cambios producidos en enzimas individuales cuando catalizan una reaccin. Estas medidas pueden
utilizar cambios producidos en la fluorescencia de cofactores que intervienen en el mecanismo de cat!lisis
o bien unir molculas fluorescentes en lugares especficos de la enzima, que permitan detectar
movimientos ocurridos durante la cat!lisis.
2
Estos estudios est!n dando una nueva visin de la cintica y
la din!mica de las molculas individuales, en oposicin a los estudios de cintica enzim!tica
tradicionales, en los que se observa y se mide el comportamiento de una poblacin de millones de
molculas de enzima.
En la figura de la dereca se puede observar la tpica evolucin de una curva obtenida en un ensayo
enzim!tico. Inicialmente, la enzima transforma el sustrato en producto siguiendo un comportamiento
lineal. % medida que avanza la reaccin, se va agotando la cantidad de sustrato y va disminuyendo la
cantidad de producto que se genera por unidad de tiempo "disminuye la velocidad de la reaccin#, lo que
se manifiesta en forma de curva asinttica en la gr!fica. 'ependiendo de las condiciones del ensayo y del
tipo de enzima, el perodo inicial puede durar desde milisegundos asta oras. Los ensayos enzim!ticos
suelen estar estandarizados para que el perodo inicial dure en torno a un minuto, para llevar a cabo las
medidas m!s f!cilmente. .in embargo, los modernos equipos de mezcla r!pida de lquidos permiten llevar
a cabo medidas cinticas de perodos iniciales cuya duracin puede llegar a ser inferior a un segundo.
5

Este tipo de ensayos r!pidos son esenciales para medidas de la cintica del estado estacionario, discutida
m!s aba+o.
La mayora de los estudios de cintica enzim!tica se centran en el perodo inicial, es decir, en la zona
lineal de la reaccin enzim!tica. .in embargo, tambin es posible medir toda la curva de la reaccin y
a+ustar estos datos a una ecuacin no lineal. Esta forma de medir las reacciones enzim!ticas es
denominada an!lisis de la curva de progreso.
6
Esta aproximacin es muy -til como alternativa a las
cinticas r!pidas, cuando el perodo inicial es demasiado r!pido para ser medido con precisin.
Factores fsico-qumicos que pueden modificar la actividad enzimtica
Temperatura: las enzimas son sensibles a la temperatura pudiendo verse modificada su actividad
por este factor. Los rangos de temperaturas ptimos pueden llegar a variar sustancialmente de
unas enzimas a otras. (ormalmente, a medida que aumente la temperatura, una enzima ver!
4
incrementada su actividad asta el momento en que comience la desnaturalizacin de la misma,
que dar! lugar a una reduccin progresiva de dica actividad.
p: el rango de p? ptimo tambin es muy variable entre diferentes enzimas. .i el p? del medio
se ale+a del ptimo de la enzima, esta ver! modificada su carga elctrica al aceptar o donar
protones, lo que modificar! la estructura de los amino!cidos y por tanto la actividad enzim!tica.
Concentraci!n salina: al igual que en los casos anteriormente mencionados, la concentracin de
sales del medio es crucial para una ptima actividad enzim!tica. $na elevada concentracin o una
ausencia de sales en el medio pueden impedir la actividad enzim!tica, ya que las enzimas precisan
de una adecuada concentracin de iones para mantener su carga y su estructura.
"eacciones con un sustrato
Las enzimas que presentan un mecanismo de -nico sustrato incluyen isomerasas, tales como la
triosafosfato isomerasa o la bisfosfoglicerato mutasa, y liasas intramoleculares, tales como la adenilato
ciclasa o la ribozima %/(1liasa.
7
.in embargo, existen ciertas reacciones enzim!ticas de -nico sustrato
que no pertenecen a esta categora de mecanismos, como es el caso de la reaccin catalizada por la
catalasa. La catalasa reacciona inicialmente con una molcula de perxido de idrgeno "agua oxigenada#
y queda en un estado oxidado tras liberar el producto "agua#, y, posteriormente, es reducida por una
segunda molcula de sustrato. %unque durante la reaccin solo participa un sustrato, la existencia de un
intermediario enzim!tico modificado permite incluir al mecanismo de la catalasa en la categora de
mecanismos de ping1pong, un tipo de mecanismo discutido m!s adelante.
Cintica de #ic$aelis-#enten
Artculo principal: Cintica de Michaelis-Menten
3omo las reacciones catalizadas por enzimas son saturables, la velocidad de cat!lisis no muestra un
comportamiento lineal en una gr!fica al aumentar la concentracin de sustrato. .i la velocidad inicial de
la reaccin se mide a una determinada concentracin de sustrato "representado como @.A#, la velocidad de
la reaccin "representado como B# aumenta linealmente con el aumento de la @.A, como se puede ver en la
figura. .in embargo, cuando aumentamos la @.A, la enzima se satura de sustrato y alcanza su velocidad
m!xima "B
max
#, que no sobrepasar! en ning-n caso, independientemente de la @.A.
4ecanismo de unin de -nico sustrato para una reaccin enzim!tica. k
1
, k
-1
y k
2
son las constantes
cinticas para cada una de las etapas de la reaccin.
El modelo de cintica micaeliana para una reaccin de -nico sustrato se puede ver en la figura de la
izquierda. ,rimeramente, tiene lugar una reaccin qumica bimolecular entre la enzima E y el sustrato .,
form!ndose el comple+o enzima1sustrato E.. %unque el mecanismo enzim!tico para una reaccin
unimolecular puede ser bastante comple+o, existe una etapa enzim!tica limitante que
permite que el mecanismo sea simplificado como una etapa cintica -nica cuya constante es k
2
.
5
(Ecuacin 1!
k
2
tambin llamado k
cat
o n-mero de recambio, ace referencia al m!ximo n-mero de reacciones
enzim!ticas catalizadas por segundo.
% ba+as concentraciones de sustrato, la enzima permanece en un equilibrio constante entre la forma libre
E y el comple+o enzima1sustrato E.. %umentando la @.A tambin aumentamos la @E.A a expensas de la
@EA, desplazando el equilibrio de la reaccin acia la dereca. ,uesto que la velocidad de reaccin
depende de la @E.A, la velocidad es sensible a peque<os cambios en la @.A. .in embargo, a altas @.A, la
enzima se satura y solo queda la forma unida al sustrato E.. Ca+o estas condiciones, la velocidad de la
reaccin "" # k
2
@EA
tot
D B
max
# de+a de ser sensible a peque<os cambios en la @.A. En este caso, la
concentracin total de enzima "@EA
tot
# es aproximadamente igual a la concentracin del comple+o E.=
/epresentacin gr!fica de la curva de saturacin de una enzima donde se puede observar como
evoluciona la relacin entre la concentracin de sustrato y la velocidad de la reaccin.
La ecuacin de 4icaelis14enten
8
describe como la velocidad de la reaccin depende del equilibrio entre
la @.A y la constante k
2
. Leonor 4icaelis y 4aud 4enten demostraron que si k
2
es muco menor que k
1

"aproximacin del equilibrio# se puede deducir la siguiente ecuacin=
(Ecuacin 2!
Esta famosa ecuacin es la base de la mayora de las cinticas enzim!ticas de sustrato -nico.
La constante de 4icaelis $
m
se define como la concentracin a la que la velocidad de la reaccin
enzim!tica es la mitad de la B
max
. Esto puede verificarse sustituyendo la concentracin de sustrato por
dica constante "@.A D $
m
#. .i la etapa limitante de la velocidad de la reaccin es lenta comparada con la
6
disociacin de sustrato "k
2
EEE k
1
#, la constante de 4icaelis $
m
ser! aproximadamente la constante de
disociacin del comple+o E., aunque sea una situacin relativamente rara.
La situacin m!s com-n, donde k
2
F k
1
, es denominada cintica de Criggs1?aldane.
9
La ecuacin de
4icaelis14enten a-n se mantiene ba+o estas condiciones m!s generales, como puede derivarse de la
aproximacin del estado estacionario. 'urante el perodo inicial, la velocidad de la reaccin es m!s o
menos constante, indicando que la @E.A tambin se mantendr! constante=
'e esta forma, la concentracin de E. viene dada por la siguiente expresin=
donde la constante de 4icaelis $
m
se define as=
3on lo cual, despus de operar todos los factores, obtenemos una frmula general para la velocidad de la
reaccin que coincide con la ecuacin de 4icaelis14enten=
La constante de especificidad k
cat
% $
m
mide la eficiencia con la que una enzima convierte un sustrato en
producto. $tilizando la definicin de la constante de 4icaelis $
m
, la ecuacin de 4icaelis14enten
podra escribirse de la siguiente forma=
donde @EA es la concentracin de enzima libre. %s, la constante de especificidad se convierte en una
constante bimolecular efectiva de la enzima libre que reacciona con sustrato libre para formar producto.
Esta constante viene definida por la frecuencia con la que el sustrato y la enzima se encuentran en una
solucin, y ronda aproximadamente un valor de );
);
4
1)
s
1)
a *6G 3. 3uriosamente, este m!ximo no
depende del tama<o del sustrato o de la enzima. La proporcin de las constantes de especificidad para dos
sustratos es una comparacin cuantitativa de la eficiencia de la enzima para convertir en productos dicos
sustratos. La pendiente de la ecuacin de 4icaelis14enten a ba+as concentraciones de sustrato "cuando
@.A EE $
m
# tambin proporciona la constante de especificidad.
"epresentaci!n de la ecuaci!n de #ic$aelis-#enten
Artculo principal: &ia'rama de (ine)ea"er-*urke
Artculo principal: &ia'rama de Eadie-+o,stee
7
La gr!fica de LineHeaver1CurIe o del doble recproco muestra el significado de los puntos de corte entre
la recta y los e+es de coordenadas, y el gradiente de la velocidad.
La gr!fica de velocidad frente a @.A mostrada anteriormente no es lineal. %unque a ba+as concentraciones
de sustrato se mantenga lineal, se va curvando a medida que aumenta la concentracin de sustrato. %ntes
de la llegada de los ordenadores, que permiten a+ustar regresiones no lineales de forma sencilla, poda
llegar a ser realmente difcil estimar los valores de la $
m
y la B
max
en las gr!ficas no lineales. Esto dio
lugar a que varios investigadores concentraran sus esfuerzos en desarrollar linearizaciones de la ecuacin
de 4icaelis14enten, dando como resultado la gr!fica de LineHeaver1CurIe y el diagrama de Eadie1
?ofstee. 3on el siguiente tutorial de la cintica de 4icaelis14enten realizado en la $niversidad de
Birginia
%
, se puede simular el comportamiento de una enzima variando las constantes cinticas.
La gr!fica de LineHeaver1CurI o representacin de doble recproco es la forma m!s com-n de mostrar
los datos cinticos. ,ara ello, se toman los valores inversos a ambos lados de la ecuacin de 4icaelis1
4enten. 3omo se puede apreciar en la figura de la dereca, el resultado de este tipo de representacin es
una lnea recta cuya ecuacin es y D mx J c, siendo el punto de corte entre la recta y el e+e de ordenadas
equivalente a )&B
max
, y el punto de corte entre la recta y el e+e de abscisas equivalente a 1)&$
m
.
Kbviamente, no se pueden tomar valores negativos para )&@.AL el mnimo valor posible es )&@.A D ;, que
correspondera a una concentracin infinita de sustrato, donde )&v D )&B
max
. El valor del punto de corte
entre la recta y el e+e - es una extrapolacin de datos experimentales obtenidos en laboratorio.
Meneralmente, las gr!ficas de LineHeaver1CurIe distorsionan las medidas realizadas a ba+as
concentraciones de sustrato y esto puede dar lugar a estimaciones no muy exactas de la B
max
y de la $
m
.
:

$n modelo lineal muco m!s exacto es el diagrama de Eadie1?ofstee, pero en las investigaciones
cientficas actuales, todo este tipo de linearizaciones an quedado obsoletos y an sido sustituidos por
mtodos m!s fiables basados en an!lisis de regresin no lineal. ,ara analizar los datos es conveniente la
normalizacin de los mismos, ya que esto puede ayudar disminuyendo la cantidad de traba+o experimental
a realizar e incrementando la fiabilidad del an!lisis.
);
&ignificado de las constantes cinticas
8
La importancia del estudio de la cintica enzim!tica reside en dos principios b!sicos. En primer lugar,
permite explicar cmo funciona una enzima, y en segundo lugar, permite predecir cmo se comportar!
esa enzima in "i"o. Las constantes cinticas definidas anteriormente, $
m
y B
max
, son los pilares
fundamentales a la ora de intentar comprender el funcionamiento de las enzimas en el control del
metabolismo.
.in embargo, llevar a cabo estas predicciones no es trivial, incluso en los sistemas m!s simples. ,or
e+emplo, la malato desidrogenasa sintetiza, en el interior de la mitocondria, oxalacetato, el cual puede ser
sustrato de diversas enzimas como la citrato sintasa, en el ciclo de los !cidos tricarboxlicos, la
fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, en la gluconeognesis, o la aspartato aminotransferasa, en la biosntesis
de !cido asp!rtico. ,ara ser capaz de predecir cu!nto oxalacetato ser! desviado por cada una de las rutas
es necesario saber tanto la concentracin del oxalacetato como la concentracin y los par!metros
cinticos de cada una de las enzimas. Este e+emplo denota la comple+idad que podemos llegar a encontrar
al intentar predecir el comportamiento de rutas metablicas completas o de organismos enteros, por
medio de modelos matem!ticos. %unque estos ob+etivos a-n no se an alcanzado en eucariotas, se an
obtenido ciertos progresos en bacterias, utilizando modelos del metabolismo de Escherichia coli.
))

)*
"eacciones multisustrato
Las reacciones multisustrato siguen una serie de comple+as ecuaciones que describen cmo se unen los
sustratos y en qu orden lo acen. El an!lisis de estas reacciones es muco m!s sencillo si la
concentracin del sustrato % se mantiene constante y la del sustrato C vara. En estas condiciones, la
enzima se comporta igual que una enzima de -nico sustrato, por lo que en una gr!fica de velocidad la
concentracin de sustrato dar! unos valores aparentes de las constantes cinticas, $
m
y B
max
, para el
sustrato C. .i se realizan una serie de medidas a diferentes concentraciones fi+as de sustrato %, los datos
obtenidos permitir!n saber a qu tipo de mecanismo pertenece la reaccin enzim!tica. ,ara una enzima
que una dos sustratos % y C, y los transforme en dos productos , y N, existen dos tipos de mecanismos
descritos asta aora.
#ecanismo de comple'o ternario
4ecanismo de comple+o ternario al azar para una reaccin enzim!tica. La enzima E une los sustratos % y
C y libera los productos , y N en un orden no definido.
Las enzimas "E# que presentan este mecanismo de reaccin unen al mismo tiempo los dos sustratos "% y
C#, dando lugar a un comple+o ternario E%C. El orden secuencial de unin de los sustratos puede ser al
azar "mecanismo al azar# o seguir un orden en particular "mecanismo ordenado#. .i fi+amos la
concentracin del sustrato % y variamos la de C, y representamos gr!ficamente el comportamiento de la
enzima mediante un diagrama de LineHeaver1CurIe, obtendremos una serie de rectas con un punto de
interseccin com-n a todas ellas.
9
Entre las enzimas que presentan este mecanismo podemos encontrar la glutation .1transferasa,
)2
la
diidrofolato reductasa
)5
y la %'( polimerasa.
)6
Los siguientes enlaces muestran animaciones del
mecanismo de comple+o ternario de la diidrofolato reductasa
(
y de la %'( polimerasa
)
.
#ecanismo de ping-pong
3omo se puede apreciar en la figura de la dereca, las enzimas con un mecanismo de ping1pong pueden
presentar dos estados, la conformacin normal "E# y la conformacin modificada qumicamente "EO# o
conformacin intermedia. En este tipo de mecanismo, el sustrato % se une a la enzima E, que pasa a un
estado intermedio EO, por e+emplo, por transferencia de un grupo qumico al centro activo de la enzima,
pudiendo ya ser liberado en forma de producto ,. Pnicamente cuando el sustrato % ya a sido liberado
del centro activo de la enzima puede unirse el sustrato C, que devuelve a la enzima modificada EO a su
estado original E, y liberarlo en forma de producto N. .i fi+amos la concentracin de % y variamos la de
C, y representamos gr!ficamente una enzima con mecanismo de ping1pong en un diagrama de
LineHeaver1CurIe, obtendremos una serie de rectas paralelas entre s.
4ecanismo de ping1pong para una reaccin enzim!tica. La unin de los sustratos % y C tiene lugar en un
orden definido y secuencial, por medio de un intermediario enzim!tico modificado, EO.
Entre las enzimas con este tipo de mecanismo podemos encontrar alguna oxidorreductasa, como la
tiorredoxima peroxidasa,
)7
transfereasas, como la acil1neuraminato citidil transferasa,
)8
y serin proteasas,
como la tripsina y la quimiotripsina.
)9
Las serin1proteasas conforman una diversa familia de enzimas muy
comunes, que incluyen enzimas digestivas "tripsina, quimiotripsina y elastasa#, varias enzimas del
proceso de coagulacin y mucas otras. En las serin1proteasas, el estado intermedio EO es una especie
acilada en una serina del centro cataltico de la enzima. El siguiente enlace muestra una animacin del
mecanismo cataltico de la quimiotripsina
*
.
Cinticas no #ic$aelianas
10
3urva de saturacin de una enzima alostrica, donde se puede apreciar una cintica sigmoidea.
%lgunas reacciones enzim!ticas dan lugar a curvas sigmoideas, al ser representadas en una curva de
saturacin, lo que suele indicar una unin cooperativa del sustrato al centro cataltico de la enzima. Esto
quiere decir que la unin de una molcula de sustrato influye en la unin de las molculas de sustrato
posteriores. Este comportamiento es el m!s com-n en las enzimas multimricas, que presentan varias
zonas de interaccin con el sustrato.
):
El mecanismo de cooperacin es seme+ante al observado en la
emoglobina. La unin de una molcula de sustrato a una de las zonas de interaccin altera
significativamente la afinidad por el sustrato de las dem!s zonas de interaccin. Las enzimas con este tipo
de comportamiento son denominadas alostricas. La cooperatividad positiva tiene lugar cuando la primera
molcula de sustrato unida incrementa la afinidad del resto de zonas de interaccin. ,or el contrario, la
cooperatividad negativa tiene lugar cuando la primera molcula de sustrato unida reduce la afinidad de la
enzima por nuevas molculas de sustrato.
3omo e+emplos de enzimas con cooperatividad positiva tenemos la aspartato transcarbamilasa
bacteriana
*;
y la fosfofructoquinasa,
*)
y con cooperatividad negativa, la tirosil %/(t1transferasa de
mamferos.
**
La cooperatividad es un fenmeno bastante com-n y puede llegar a ser crucial en la regulacin de la
respuesta enzim!tica a cambios en la concentracin de sustrato. La cooperatividad positiva ace que la
enzima sea muco m!s sensible a la concentracin de sustrato, con lo que su actividad puede llegar a
variar en gran medida aunque se mueva en rangos muy estrecos de concentracin de sustrato. ,or el
contrario, la cooperatividad negativa ace que la enzima sea insensible a peque<os cambios en la
concentracin de sustrato.
La ecuacin de ?ill
*2
suele ser utilizada para describir cuantitativamente el grado de cooperatividad en
cinticas no micaelianas. El coeficiente de ?ill "n# indica cu!ntas de las zonas de unin de sustrato de
una enzima afectan a la afinidad de la unin del sustrato en el resto de las zonas de unin. El coeficiente
de ?ill puede tomar valores mayores o menores que )=
n + ,: indica cooperatividad negativa.
n - ,: indica cooperatividad positiva.
Cintica del estado pre-estacionario
11
/epresentacin gr!fica del estado pre1estacionario de una reaccin enzim!tica donde se puede apreciar la
fase inicial r!pida.
%l realizar un ensayo enzim!tico y mezclar la enzima con el sustrato, existe un breve perodo inicial en el
que no se produce ni sntesis de producto, ni estado intermedio de la enzima. El estudio de los
milisegundos siguientes a la mezcla es denominado cintica del estado pre1estacionario y est! relacionado
con la formacin y consumo de los intermediarios enzima1sustrato "E. o EO# asta el momento en el que
se alcanzan ciertas concentraciones y comienza el estado estacionario.
La primera enzima en la que se estudi este proceso, durante la reaccin de idrlisis, fue la
quimiotripsina.
*5
La deteccin de intermediarios suele ser la principal evidencia necesaria para saber ba+o
qu mecanismo act-a la enzima. ,or e+emplo, al realizar un ensayo de cintica r!pida de una reaccin
enzim!tica gobernada por un mecanismo de ping1pong, podremos acer un seguimiento de la liberacin
de producto , y medir la formacin de intermediarios enzim!ticos modificados EO.
*6
En el caso de la
quimiotripsina, el intermediario enzim!tico se produce por un ataque nucleoflico del sustrato sobre una
serina del centro cataltico, lo que genera una forma intermediaria acilada de la quimiotripsina.
En la figura de la dereca, se puede observar como la enzima pasa r!pidamente a un estado intermedio EO
durante los primeros segundos de la reaccin. ,osteriormente, cuando es alcanzado el estado estacionario,
la velocidad disminuye. Esta primera fase de la reaccin proporciona la tasa de conversin de la enzima.
,or lo tanto, la cantidad de producto liberado durante esta fase "que puede obtenerse prolongando la recta
correspondiente al estado estacionario asta cortar el e+e y# tambin da la cantidad de enzima funcional
presente en el ensayo.
*7
#ecanismo qumico
$no de los ob+etivos m!s importantes en los estudios de la cintica enzim!tica es determinar el
mecanismo qumico que subyace en la reaccin enzim!tica, por e+emplo, determinar la secuencia
ordenada de sucesos que transcurren en la transformacin de sustrato en producto. Las aproximaciones
cinticas discutidas anteriormente pueden proporcionar informacin relacionada con la velocidad de
reaccin de los intermediarios enzim!ticos formados, pero no permitir!n identificar qu intermediarios
son exactamente.
12
3on el fin de determinar la etapa limitante de la reaccin o los intermediarios que se forman durante la
misma, se pueden llevar a cabo ensayos enzim!ticos en diversas condiciones con enzimas o sustratos
ligeramente modificados, que aporten datos al respecto. $n e+emplo caracterstico de etapa limitante de
una reaccin es aquella en la que se rompe un enlace covalente dando lugar a un !tomo de idrgeno. .i
intercambiamos cada !tomo de idrgeno por su istopo estable, deuterio, podremos saber cual de los
posibles idrgenos transferidos es el que determina la etapa limitante. La velocidad sufrir! una variacin
cuando el idrgeno crtico sea reemplazado, debido al efecto isotpico cintico primario, cuyo origen se
encuentra en la mayor estabilidad de los puentes de deuterio, m!s difciles de romper que los puentes de
idrgeno.
*8
>ambin es posible medir efectos similares por medio de otras sustituciones isotpicas, tales
como
)2
3&
)*
3
)9
K&
)7
K, pero los efectos producidos en estos casos son m!s difciles de detectar.
Los istopos tambin pueden ser utilizados para obtener informacin acerca del destino de diversas partes
de la molcula de sustrato cuando este es transformado en producto. ,or e+emplo, a veces es difcil de
determinar el origen de un !tomo de oxgeno en el producto final, ya que puede provenir del agua o de la
molcula de sustrato. Esto puede resolverse mediante la sustitucin sistem!tica de los !tomos de oxgeno
de las molculas que participen en la reaccin, por su istopo estable
)9
K, llevando posteriormente a cabo
una b-squeda del istopo en el producto obtenido. El mecanismo qumico tambin puede ser elucidado
estudiando los efectos cinticos e isotpicos ba+o diferentes condiciones de p?,
*9
alterando los niveles de
iones met!licos u otros cofactores,
*:
por mutagnesis dirigida de amino!cidos conservados, o mediante el
estudio del comportamiento de la enzima en presencia de an!logos del sustrato.
.n$i/ici!n enzimtica
Artculo principal: .nhi/idor enzimtico
Esquema de una reaccin enzim!tica en presencia de un inibidor enzim!tico de unin reversible.
Los inibidores enzim!ticos son molculas que reducen o anulan la actividad enzim!tica. Estos
inibidores pueden unirse a las enzimas de forma reversible "la desaparicin del inibidor restaura la
actividad enzim!tica# o irreversible "el inibidor inactiva permanentemente a la enzima#.
13
.n$i/idores reversi/les
Los inibidores enzim!ticos reversibles pueden ser clasificados como competitivos, acompetitivos, no
competitivos y mixtos, seg-n el efecto que produzcan en las constantes cinticas $
m
y B
max
. Este efecto
depender! de que el inibidor se una a la enzima E, al comple+o enzima1sustrato E. o a ambos, como se
puede observar en la figura de la dereca y en la tabla inferior. ,ara clasificar correctamente un inibidor
pueden llevarse a cabo estudios de su cintica enzim!tica en funcin de la concentracin de inibidor. Los
cuatro tipos de inibicin dan lugar a diagramas de LineHeaver1CurIe y de Eadie1?ofstee
2;
que varan de
diferente forma con la concentracin de inibidor. ,ara abreviar, se usan dos smbolos=
y
donde $
i
y $0
i
son las constantes de disociacin para unirse a la enzima y al comple+o enzima1sustrato,
respectivamente. En presencia de un inibidor reversible, los valores aparentes de la $
m
y la B
max
pasan a
ser "Q&QR#$
m
y ")&QR#1
max
, respectivamente, como se puede apreciar en la tabla inferior para los casos m!s
comunes.
Tipo de
in$i/ici!n
K
m
aparente V
ma0
aparente
solo $
i " #
competitiva
solo $
i
R " # acompetitiva
$
i
D $
i
R
" #
no competitiva
$
i
S $
i
R
" #
mixta
Los a+ustes por regresin no lineal de los datos de cintica enzim!tica
2)
pueden proporcionar estimaciones
muy precisas de las constantes de disociacin $
i
y $
i
R.
.n$i/idores irreversi/les
Los inibidores enzim!ticos tambin pueden unirse e inactivar una enzima de forma irreversible,
generalmente por medio de modificaciones covalentes de residuos del centro cataltico de la enzima.
Estas reacciones decaen de forma exponencial y suelen ser saturables. ,or deba+o de los niveles de
saturacin, mantienen una cintica de primer orden con respecto al inibidor.
#ecanismos de catlisis
14
La variacin de energa como funcin de una coordenada de reaccin muestra la estabilizacin del estado
de transicin cuando dica reaccin es llevada a cabo por una enzima.
El modelo de a+uste inducido es el m!s utilizado al realizar estudios de interaccin enzima1sustrato.
2*
Este
modelo propone que las interacciones iniciales entre la enzima y el sustrato son relativamente dbiles,
pero suficientes para producir ciertos cambios conformacionales en la enzima, que estabilizan e
incrementan la fuerza de la interaccin. Estos cambios conformacionales implican a una serie de
amino!cidos catalticos del centro activo, en los cuales se producen los enlaces qumicos correspondientes
entre la enzima y el sustrato. 'espus de la unin, uno o m!s mecanismos de cat!lisis disminuyen la
energa del estado de transicin de la reaccin, por medio de una ruta alternativa a la reaccin. Los
mecanismos de cat!lisis se clasifican en base a diferentes criterios= cat!lisis covalente, cat!lisis por
proximidad y alineacin de orbitales, cat!lisis !cido1base general, cat!lisis por iones met!licos y cat!lisis
electrost!tica.
Los estudios de cintica enzim!tica no permiten obtener el tipo de cat!lisis utilizada por una enzima. .in
embargo, algunos datos cinticos pueden proporcionar una serie de indicios que lleven a realizar otro tipo
de estudios dirigidos a determinar dico tipo de cat!lisis. ,or e+emplo, en un mecanismo de ping1pong la
cintica del estado pre1estacionario puede estar sugiriendo una cat!lisis de tipo covalente. ,or otro lado,
variaciones en el p? pueden producir efectos dr!sticos en la B
max
pero no en la $
m
, lo que podra indicar
que un residuo del centro activo precisa un estado concreto de ionizacin para que se pueda llevar a cabo
la cat!lisis enzim!tica.
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