CAPTULO 2

RUTAS FERMENTATIVAS
Carlos D. Esteban y Gaspar Prez Martnez

Instituto de Agroqumica y Tecnologa de Alimentos, Consejo Superior de
Investigaciones Cientficas, Burjassot, Valencia.

INDICE

INTRODUCCIN

GLUCOLISIS (VA HOMOFERMENTATIVA)

Fermentacin homolctica de la glucosa.
Modulacin alostrica de los enzimas de la gluclisis.
Regulacin gentica de la gluclisis.

RUTA DE LAS PENTOSAS FOSFATO (VA HETEROFERMENTATIVA)
Fermentacin heterofermentativa de la glucosa.
Regulacin gentica de la ruta heterofermentativa.
Metabolismo de pentosas, gluconato y pentitoles.

RUTA BIFIDUS

METABOLISMO DE OTRAS HEXOSAS Y DE DISACRIDOS: RUTAS DE
LELOIR Y TAGATOSA-6-P
Metabolismo de hexosas y hexitoles.
Metabolismo de disacridos.
Ruta de Leloir.
Ruta de la Tagatosa-6-P.

RUTAS ALTERNATIVAS DEL PIRUVATO
Ruta del diacetilo / acetoina.
Ruta de la piruvato-formato liasa.
Ruta de la piruvato deshidrogenasa.
Ruta de la piruvato oxidasa.

EQUILIBRIO REDOX Y NADH OXIDASAS.

BIBLIOGRAFA
INTRODUCCIN

Las bacterias lcticas se caracterizan por producir una gran cantidad cido lctico
(de donde viene su denominacin) y otros cidos orgnicos a partir de azcares con gran
eficacia. Esta condicin de acidificar rpidamente el medio donde se desarrollan les
confiere importantes ventajas competitivas en los medios naturales de los que
normalmente se reproducen, como son productos vegetales en descomposicin
(incluyendo zumos y extractos), carne, leche y subproductos lcteos, as como en las
mucosas y tubo digestivo de casi todos los vertebrados. Gracias a su capacidad de
acidificar el entorno y a la inocuidad del cido lctico para el ser humano este grupo
bacteriano posee de su importancia industrial, participando en numerosas
fermentaciones alimentarias como productos lcteos, crnicos y vegetales, mejorando su
conservacin y seguridad sanitaria, pues inhiben el crecimiento de patgenos y de
microorganismos que alteran los alimentos. Adems, confieren a los alimentos
fermentados caractersticas sensoriales y organolpticas distintivas gracias al lactato y
otros metabolitos producidos.
Algunos organismos, como todos los eucariotas y bacterias aerobias, obtienen su
energa a partir de azcares a travs de la gluclisis (ruta de Embden-Meyerhoff) y del
complejo proceso de transferencia de protones llamado respiracin. De esta forma, se
conseguir la oxidacin neta de la glucosa gracias a un aceptor externo de electrones
como el oxigeno. La respiracin tiene un gran rendimiento energtico, pero no todos los
microorganismos pueden realizarla, como es el caso de las bacterias lcticas, por carecer
de los mecanismos bioqumicos necesarios. La capacidad de respiracin es una
adquisicin evolutiva reciente, pues los primeros seres vivos probablemente se
desarrollaron en una atmsfera carente de oxigeno, por lo que la degradacin anaerbica
de la glucosa debe ser la forma ms antigua de obtener energa de las molculas
orgnicas.
Se entiende por fermentacin el conjunto de reacciones bioqumicas asociadas a la
gluclisis (Figura 1) que conducen a la degradacin (catabolismo) de la glucosa o de
otros compuestos orgnicos para obtener energa en forma de ATP, con la particularidad
de que en el proceso no interviene el oxgeno ni otro aceptor externo de protones.
Durante la fermentacin no se produce la oxidacin completa de la cadena carbonada
que constituye la glucosa, mantenindose el equilibrio redox del proceso gracias a que
el exceso de protones generado se canaliza hacia los propios metabolitos de la
gluclisis, como el piruvato, en cuyo caso se reduce a L o D-lactato y se denomina
fermentacin lctica.
La fermentacin lctica de la glucosa se puede realizar a travs de varias rutas
enzimticas. En bacterias, las ms comunes son la gluclisis, tambin llamada va
homofermentativa u homolctica, por la que un mol de glucosa es transformado en dos
moles de cido lctico, y las rutas heterofermentativas (o heterolcticas) que dan lugar a
una mezcla de metabolitos produciendo un mol de cido lctico, un mol de etanol y un
mol de CO
2
por cada mol de glucosa fermentado. Esta via heterofermentativa se asocia
frecuentemente a la falta de funcionalidad de la primera parte de la gluclisis,
utilizndose la ruta de las pentosas fosfato o de la fosfocetolasa (xilulosa-5-fosfato
fosfocetolasa, EC 4.1.2.9, o fructosa-6-fosfato fosfocetolasa, EC 4.1.2.22). Relacionada
con sta, tambin debe mencionarse la existencia de la denominada ruta bifidus, tpica
del gnero Bifidobacterium y que supone la formacin de tres moles de cido actico y
dos de cido lctico por cada dos moles de glucosa.
La capacidad de fermentar azcares y determinar sus productos es tcnicamente
fcil de analizar, siendo las propiedades ms ampliamente utilizadas en identificacin
bacteriana. Estos caracteres dependen de las rutas fermentativas existentes, pero
tambin de la presencia de transportadores especficos para cada uno de los azcares
utilizados (Captulo 1). En el caso de las bacterias lcticas, los patrones de fermentacin
de azcares son siempre utilizados para identificacin taxonmica a nivel de especie
(ver Captulo 15), pero es ms importante conocer el tipo de ruta fermentativa utilizado
de forma preferente. En taxonoma clsica, las bacterias lcticas se dividen en tres
grupos, en funcin de la ruta metablica utilizada de forma preferente (27; 28): la
primera categora incluye especies homofermentativas obligadas, que slo pueden
fermentar los azcares por la gluclisis (poseen el enzima fructosa-1,6-bifosfato
aldolasa y carecen de fosfocetolasa); la segunda categora est integrada por las
heterofermentativas obligadas, que slo pueden utilizar la ruta de las pentosas fosfato
(poseen fosfocetolasa y carecen de fructosa-1,6-bifosfato aldolasa); y la tercera
categora engloba el resto de bacterias lcticas que presentan un metabolismo mixto
(heterofermentativas facultativas), pues poseen tanto fructosa-1,6-bifosfato aldolasa
como fosfocetolasa y normalmente se comportan como homofermentativos frente a las
hexosas y heterofermentativos con las pentosas.
Las bifidobacterias son bacterias Gram-positivas, anaerobias estrictas, no
esporulantes y no patgenas. Estn presentes en la microbiota intestinal normal y son
especialmente abundantes en el intestino de nios lactantes. Se agrupan
tradicionalmente con las bacterias lcticas por sus caractersticas metablicas, pero
filogenticamente estn separadas del resto de bacterias de este grupo. Por
secuenciacin de los genes del RNA ribosomal 16S y estudio de la homologa (58) se
pueden ubicar las bacterias lcticas junto a la familia bacilli dentro de la subfamilia
Clostridiaceae de los Gram-positivos, que incluye organismos con un contenido en
G+C del DNA inferior al 50% (ver Captulo 15). A diferencia de stas, el gnero
Bifidobacterium, con un contenido en G+C superior al 50%, se agrupa en la rama de los
Actinomycetales (58). Tambin se diferencian del resto de bacterias lcticas en su
metabolismo, pues aunque producen cido lctico, no utilizan la va homolctica ni la
heterolctica tpicas sino una secuencia metablica que les es exclusiva, denominada
ruta lanzadera de la fructosa-6P, o ruta bfidus, en la que dos moles de glucosa son
fermentados a dos moles de lactato y tres de acetato (27).
En este captulo se tratar de describir de forma detallada las principales rutas
utilizadas por las bacterias lcticas para la asimilacin de azcares. Para ello, hemos
apostado por estudiar cada una de ellas de forma independiente y separada, en ocasiones
subdividindolas en partes (ver glucolisis o ruta heterofermentativa). Sin embargo, no se
debe de interpretar que las bacterias tambin las utilizan de forma inconexa como
mdulos estancos, muy al contrario, la clula bacteriana se debe de entender como un
todo interconectado y autoregulado con un equilibrio dinmico casi perfecto
(homeostasis). As, la introduccin de mutaciones en enzimas bsicas en una de las
rutas conlleva normalmente reajustes en la expresin gnica y activacin de enzimas de
forma que el flujo metablico contina de la forma ms eficaz y que altera
mnimamente el crecimiento celular (69). Cuando lactobacilos homofermentativos o
heterofermentativos facultativos se cultivan en quimiostato continuo, la acumulacin de
cido lctico da lugar a la utilizacin la ruta heterofermentativa y cido-mixta (30; 67).
Gracias a transcriptmica se ha visto que en Lactobacillus plantarum, en condiciones de
acumulacin excesiva de lctico, se inducen casi todas las rutas que forman otros cidos
orgnicos, incluyendo la lanzadera de bifidus (43).

GLUCOLISIS (VA HOMOFERMENTATIVA)

Como se ha descrito con anterioridad, gran cantidad de bacterias lcticas utilizan
la gluclisis (ruta de Embden-Meyerhoff) como ruta prioritaria para el catabolismo de
azcares. A diferencia de otros microorganismos aerobios y organismos superiores
respiratorios, este grupo bacteriano no posee ni ciclo de Krebs ni los cofactores y
citocromos que permiten el trasiego de protones hacia el oxgeno, de modo que
necesitan otro aceptor del exceso de protones que se genera por accin de la
gliceraldehdo-3-fosfato deshidrogenasa, y lo encuentran en el piruvato. En ste
apartado se tratar de dar una visin general de la gluclisis en microorganismos
fermentativos y se detallarn los pasos enzimticos de la ruta (2.1), el sistema que
controla su propio funcionamiento segn la concnetracin de metabolitos intermedios y
efectores, tambin llamada regulacin alostrica (2.2), y su regulacin gentica (2.3).
Dado que existe abundante informacin de estos procesos en la bacteria modelo,
Escherichia coli, los datos publicados en bacterias lcticas se completarn y compararn
con los de esta bacteria y otras, especialmente del gnero Bacillus.

Fermentacin homolctica de la glucosa.

En trminos globales la fermentacin de azcares (glucosa) es un proceso que se
puede dividir con fines funcionales y didcticos en tres fases:
- Fase I: Reacciones preparatorias. Consiste en una serie de reacciones y
reordenamientos en la molcula de hexosa que no implican reacciones de oxido-
reduccin ni liberacin de energa. Finaliza con la formacin de forman dos molculas
de gliceraldehdo-3P.
- Fase II: Oxidacin y beneficios. Se libera energa en forma de ATP durante la
oxidacin del sustrato, se reduce el cofactor NAD
+
a NADH y se producen dos
molculas de piruvato.
- Fase III: Reduccin del sustrato y reoxidacin del cofactor. Se regenera en
NAD
+
para que la ruta pueda continuar.

En la Figura 1 se puede ver un esquema de la fermentacin homolctica de la
glucosa (40). Las dos primeras fases (la ruta que va de glucosa a piruvato) constituyen
la gluclisis o ruta Embden-Meyerhof. Es necesario aportar energa a la glucosa para
activar la ruta, por ello, durante las reacciones preparatorias (fase I) se dan dos
fosforilaciones de la molcula de hexosa, la primera a expensas de ATP por el enzima
glucokinasa si la glucosa ha sido transportada por una permeasa. Si en cambio el
transporte ocurre por el sistema PTS (46) la fosforilacin es simultanea al transporte y
en este caso el fosfato proviene del fosfoenolpiruvato (intermedio de la fase II de la
glucolisis) a travs de una serie de intermediarios proteicos (ver Captulo 1). La
glucosa-6P formada es isomerizada a fructosa-6P por la fosfoglucosa isomerasa y
experimenta una segunda fosforilacin catalizada por la fosfofructokinasa dependiente
de ATP, para dar fructosa-1,6-DP, una reaccin irreversible en condiciones fisiolgicas.
Esta molcula es escindida por el enzima fructosa-1,6DP aldolasa en dos triosas fosfato,
dihidroxiacetona fosfato y gliceraldehido-3P, siendo interconvertibles por medio de la
triosa fosfato isomerasa. A partir de este momento debe tenerse en cuenta que la
proporcin molar se duplica en las reacciones que se describen abajo, dado que la
glucosa se ha transformado en dos molculas de gliceraldehido-3P.
El nico paso de oxidacin (fase II) de la gluclisis en bacterias fermentativas es
la transformacin de gliceraldehido-3P a 1,3DP-glicerato. En enzima gliceraldehido-3P
deshidrogenasa cataliza esta reaccin utilizando NAD
+
como cofactor. El grupo
aldehdo del gliceraldehido-3P es deshidrogenado a un anhdrido de cido carboxlico
con cido fosfrico, lo que permite conservar la energa de oxidacin del grupo aldehido
con la incorporacin de fosfato inorgnico a un enlace acil-fosfato rico en energa.
Durante la deshidrogenacin del gliceraldehido-3P el NAD
+
utilizado como cofactor de
la reaccin es reducido a NADH. El enzima fosfoglicerato kinasa cataliza la
transferencia de un grupo fosfato del 1,3-DP-glicerato al ADP, producindose una
molcula de-3P-glicerato y una de ATP por fosforilacin a nivel de sustrato. La
fosfoglicerato mutasa cambia la posicin del grupo fosfato en la molcula, de-3P-
glicerato a 2P-glicerato, y la enolasa promueve la deshidratacin de 2P-glicerato a
fosfoenolpiruvato. Las dos reacciones anteriores tienen como consecuencia el aumento
de la energa de hidrlisis del grupo fosfato, siendo suficiente como para que la piruvato
kinasa catalice una segunda fosforilacin a nivel de sustrato produciendo piruvato y
ATP. La energa contenida en el fosfoenolpiruvato tambin puede ser aprovechada por
la enzima I del sistema de transporte PTS de azcares (ver Captulo 1) (46). El balance
neto de la gluclisis es la produccin de dos moles de ATP por cada mol de glucosa que
entra en la ruta.
Durante la gluclisis, por cada mol de gliceraldehido-3P oxidado se consume un
mol de NAD
+
que se convierte en NADH. La cantidad de NAD
+
presente en la clula es
limitada y el NADH tiene un alto poder reductor y no puede almacenarse en grandes
cantidades, de modo que para que la gluclisis pueda continuar es necesario regenerar el
NAD
+
(fase III). Para poder oxidar el NADH a NAD
+
debe emplearse algn aceptor de
electrones. Como se ha mencionado, esta molcula es el piruvato producido al final de
la gluclisis, que es reducido a cido lctico por el enzima lactato deshidrogenasa con la
oxidacin simultnea de NADH a NAD
+
. Esta reaccin permite equilibrar el balance
redox de la gluclisis y que el flujo de metabolitos de carbono que discurre por la ruta
no se interrumpa.
El balance global de la va homolctica es la produccin de dos moles de lactato
y un rendimiento energtico de dos moles de ATP por mol de glucosa fermentada.

Modulacin alostrica de los enzimas de la gluclisis.

Dado que esta ruta es esencial para la obtencin de energa a partir de azcares,
la gluclisis est sujeta a una estricta regulacin alostrica por sus propios metabolitos
intermedios y finales, as como por el p
i
, fructosa 1,6-DP, fosfoenol piruvato (PEP),
ADP, ATP y NAD
+
/NADP
+
. Precisamente, la belleza de esta ruta se basa en su robustez
y flexiblilidad, de forma que siempre funciona al ritmo que exija la demanda de energa
en la clula. Todos los estudios demuestran que ello se debe, en gran parte, a que la
actividad global de la ruta est controlada por sus propios metabolitos. En general, la
fructosa 1,6-DF acta como modulador positivo de las enzimas de la parte baja de la
gluclisis (metabolismo de las triosas fosfato) como la piruvato kinasa y lactato
deshidrogenasa y el PEP inhibe la actividad fosfofructo kinasa (PFK) Tambin se ha
podido observar que existen tres actividades enzimticas clave en la regulacin de la
ruta, por ser especialmente sensibles a la modulacin alostrica: fosfofructo quinasa,
gliceraldehdo-3P deshidrogenasa (GAPDH) y piruvato quinasa. La fosfofructo kinasa
es fuertemente inhibida por PEP y la actividad piruvato kinasa se inhibe por p
i
en L.
lactis (66) y se estimula por ADP y fructosa 1,6-DF en E. coli y L. bulgaricus (57; 6) o
en Bacillus stearothermophilus es activada por ribosa 5-fosfato e inhibida por ATP
(Tanaka et al., 1995). En realidad, hoy da se cuenta con un profundo conocimiento
sobre la transicin alostrica de la estructura de los enzimas en E. coli (57; 2; Mattevi et
al., 1995; 35; 68) y en Bacillus stearothermophilus (70). Experimentos en la bacteria
lctica Lactococcus lactis, mostraron que la gliceraldehdo-3P deshidrogenasa tiene un
papel muy importante en la modulacin del flujo de carbono (44). En esta bacteria,
tambin se observ que la relacin NADH/NAD
+
regula la actividad de la
gliceraldehdo-3P deshidrogenasa, as como la de la enzima L-lactato deshidrogenada,
condicionando la canalizacin de metabolitos entre la formacin de lactato y rutas
alternativas del catabolismo del piruvato (16; 19). Mediante NMR, se pudo tambin
confirmar que los niveles intracelulares de ATP causa la acumulacin de fructosa 1,6-
DF, posiblemente por una limitacin en NAD
+
(41).

Regulacin gentica de la gluclisis.

Como se ha descrito, existen mecanismos generales de modulacin de la
actividad enzimtica por efectores alostricos en bacterias, sin embargo, parece que,
tanto la estructura gnica, como los mecanismos y elementos que regulan la expresin
de estos enzimas en diferentes especies bacterianas son muy distintos. En E. coli,
existen dos copias de los genes que codifican los tres enzimas claves en la gluclisis
(pfk, gap, pyk). Cada copia expresa enzimas con distinta especificidad de sustrato, que
pueden incluso pertenecer en algunos casos a la gluclisis o la gluconeognesis. Sin
embargo, a pesar del profundo conocimiento sobre los efectores y la transicin
alostrica de la estructura de los enzimas, an quedan muchas incgnitas sobre los
procesos que regulan la expresin de los genes de esta ruta. FruR es un
represor/activador que se une al DNA en presencia de fructosa 1,6-DF y est implicado
en la regulacin de genes del transporte y fosforilacin de la fructosa, as como del
catabolismo de otros azcares y recientemente ha sido renombrado como, Cra. En
ausencia de fructosa 1,6-DF, este regulador activa diversos genes de la gluconeognesis
(proceso anablico inverso a la gluclisis), incluyendo el gen pykF (piruvato quinasa
catablica) pudiendo ser uno de los principales reguladores de la gluclisis en E. coli,
pues deja de reprimir sus genes en presencia de fructosa 1,6-DF (Bledig et al., 1996;
49). Otro regulador involucrado en el control de la gluclisis es CsrA (inicialmente
descrito como carbon storage regulator). Se trata de un regulador posttranscripcional
global que controla la expresin de los factores de invasin, motilidad, sntesis de
glucgeno, ciclo de Krebbs, etc. en diversos Gram-negativos. En E. coli, reprime la
sntesis de glucgeno y genes implicados en gluconeognesis, como los que codifican al
fosfoglucomutasa, fructosa 1,6 difosfatasa, PEP sintasa, piruvato quinasa anablica
(pykA) y fosfofructo quinasa anablica (pfkB), y a su vez activa los genes glucolticos
pgi, tpi, eno, pykF y pfkA (Sabnis et al., 1995).
En Gram-positivos, los elementos que regulan la expresin de los genes glucolticos son
de naturaleza distinta a los descritos en E. coli, con ciertas diferencias entre los gneros
de este grupo. Se ha descrito un elemento regulador responsable de la represin
catablica denominado CcpA (ver Captulo 4) que, por responder especficamente a la
presencia de glucosa en el medio, podra tener un importante papel en la regulacin de
la gluclisis en estas bacterias. As, en B. subtilis la glucosa activa la expresin de los
genes ack, pta, gap y del operon pgk (pgk-pgm-tpi-eno), y este efecto desaparece en un
mutante ccpA (Tobish et al., 1999) indicando que, en efecto, este elemento controla su
expresin en glucosa. En Lactococcus lactis, tambin hay resultados que sugieren que
CcpA acta como inductor sobre el opern las, formado por los genes pfk-pyk-ldh (33).
Pero en cambio, estos genes que no estaban controlados por CcpA en Bacillus subtilis.
En la bacteria lctica Lactobacillus casei, estos dos genes esenciales para la gluclisis,
pfk y pyk, constituyen un opern no ligado al gen de la L-lactato deshidrogenasa (ldh)
(38; 69) y lo mismo se ha encontrado en B. stearothermophilus (51) y en Lactobacillus
bulgaricus (6). Adems, contrariamente a lo observado en Lactococcus lactis, un
trabajo preliminar en Lactobacillus casei indic que CcpA ejerce una funcin represora,
pues la cantidad de mRNA del opern pfk,pyk detectado en un mutante ccpA es mucho
mayor que en la cepa silvestre (38). Adems, en este mutante la expresin del opern se
activa en presencia de glucosa, por lo que es posible que exista otro mecanismo
adicional de regulacin, an por determinar.
En Gram-positivos, tan solo se ha caracterizado otro mecanismo de regulacin
de expresin de algunos genes glucolticos. En l interviene un nuevo regulador, esta
vez de la familia SorC/DeoR, denominado CggR y que es codificado por el gen cggR
(antes yvbQ), situado delante del grupo de genes gapA, tpi, pgk, pgm, eno, en B. subtilis
y en Lactobacillus delbrueckii (Fillinger et al., 2000; 6). Estos genes estn organizados
en dos unidades transcripcionales, gapA y pgk-tpi-pgm-eno, que se inducen por medio
de CggR cuando la gluclisis est activa (Fillinger et al., 2000).
En estos momentos se dispone de dos secuencia genmicas completas de
Lactococcus lactis, la bacteria lctica mejor estudiada hasta el momento. Una bsqueda
en sta nos indica que los genes glucolticos caracterizados en este mapa estn
altamente dispersos, no encontrndose ms que la estructura del opern las. Aunque con
las precauciones debidas, ello podra confirmar que la estructura gnica y posiblemente
la regulacin de estos genes sea diferente en esta especie.
Cuando se estudia la regulacin de estos genes, no puede olvidarse que la
regulacin gnica y modulacin alostrica de sus actividades enzimticas estn muy
armonizadas. As, cuando se sobreexpresan ligeramente (2-4 veces sus niveles
normales) y de forma individual genes como pfk, pyk, pdc y adh, en E.coli, las
variaciones del flujo global de metabolitos son poco significativas, y mucho menores
que las detectadas como respuesta a cambios ambientales (53).

Perm
glucosa
glucosa-6P
fructosa- 6P
1,3 P-glicerato
3 P-glicerato
2 P-glicerato
PEP
piruvico
glucosa
PTS
Lactato
ATP
ADP
ADP
ATP
NAD+
NADH
NAD+
NADH
11
6
10
3
ATP
ADP
ATP
ADP
fructosa- 1,6-BP
glucosa
P
dihidroxiacetona-P gliceraldehido-3-P
EI
EI
HPr
HPr
P
EIIA
P
EIIA
5
2
9
8
7
1
4


Figura 1. Va Homofermentativa. Gris claro, reacciones de la fase I; gris, reacciones de
la fase II, gris oscuro, reacciones de la fase III. 1, glucokinasa; 2, fosfoglucosa
isomerasa; 3, fosfofructokinasa; 4, fructosa-1,6-BP aldolasa, 5, triosa fosfato isomerasa;
6, glicerladehido-3P-deshidrogenasa; 7, fosfoglicerato kinasa; 8, fosfoglicerato mutasa;
9, enolasa; 10, piruvato kinasa; 11, lactato deshidrogenasa. Las reacciones de
transferencia de fosfato dentro del sistema PTS se indican con flechas punteadas


RUTA DE LAS PENTOSAS FOSFATO (VA HETEROFERMENTATIVA)

Fermentacin heterolctica de la glucosa.

Algunas bacterias fermentativas como Acetobacter, Thiobacillus (Meille et al
2001), ciertas bacterias lcticas y bifidobacterias, pueden metabolizar las hexosas por
rutas alternativas a la gluclisis, en ocasiones incluso carecen del enzima fructosa 1,6-
bifosfato aldolasa. Para ello, se deben incorporar a la ruta de las pentosas fosfato (22)
conservando cierto paralelismo entre esta ruta y la gluclisis. Las reacciones son
diferentes, pero se pueden estructurar en fases con las mismas funciones, como puede
observarse en el esquema de la ruta de las pentosas fosfato de la figura 2.
En una primera etapa (tipo fase I: reacciones preparatorias), la glucosa es
normalmente transportada por una permeasa y fosforilada por la hexokinasa. En este
punto debe matizarse que desde hace aos se pensaba que las bacterias
heterofermentativas estrictas carecan de sistema general de transporte de hexosas por
PTS (ver Captulo 1), como ocurre en el heterofermentativo estricto Lactobacillus
fermentum (23). Sin embargo, en algunas especies como en L. brevis y L. reuteri, se ha
demostrado que al menos la fructosa es transportada via PTS (50; 61). En cualquier
caso, la glucosa-6P sufre dos deshidrogenaciones consecutivas catalizadas,
respectivamente, por la glucosa-6P deshidrogenasa y la 6-fosfogluconato
deshidrogenasa, formando dos moleculas de NADH por molcula de glucosa. La
deshidrogenacin del 6-fosfogluconato va acompaada de su descarboxilacin, dando
como resultado ribulosa-5P y la liberacin de CO
2
. La ribulosa-5P es epimerizada a
xilulosa-5P que es sustrato de la xilulosa 5-fosfato/fructosa 6-fosfato fosfocetolasa y
como producto de su escisin rinde gliceraldehido-3P y acetil-P. Esta enzima posee un
dominio de unin al efector tiamina difosfato (TPP), como otros enzimas catablicos
del tipo de la transcetolasa, piruvato oxidasa y

piruvato decarboxilasa (39). Las
reacciones de la fase I normalmente consisten en fosforilaciones e isomeraciones que
preparan la molcula para su escisin en compuestos que entran en las reacciones de
produccin de energa de la fase II, pero no incluyen reacciones de oxidoreduccin. En
realidad esta es una va de metabolizacin de pentosas y en el caso de asimilacin de
una pentosa las reacciones de fase I no incluyen las reacciones redox necesarias para
convertir hexosas en pentosas.
El gliceraldehdo-3P se incorpora a la fase II de la gluclisis dando como
resultado dos molculas de ATP, una de NADH y una de piruvato. En la fase III hay
que oxidar tres moleculas de NADH. Igual que en la ruta homolctica, la lactato
deshidrogenenasa reduce el piruvato a lactato con la oxidacin simultnea de un NADH
a NAD
+
. Para reoxidadar las otras dos molculas de NADH se emplea el acetil-P
producido en la fase I. La fosfotransacetilasa transfiere el grupo acetilo del acetil-P a
una molcula de coenzima A para dar acetil-CoA. Por accin de la acetaldehido
deshidrogenasa y la alcohol deshidrogenasa se pasa el acetil-CoA a etanol en dos
reducciones sucesivas que oxidan una molecula de NADH cada una, dando como
resultado la regeneracin de dos NAD
+
.
El balance global de la fermentacin de un mol de glucosa por la va
heterofermentativa es un mol de lactato, uno de etanol y uno de CO
2
y un rendimiento
energtico de un mol de ATP.

Regulacin de la ruta heterofermentativa.

Existe muy poca informacin disponible sobre el posible control alostrico y la
regulacin gentica en la ruta de la fosfocetolasa, especialmente comparado con la
gluclisis, donde la mayor parte de la informacin procede de estudios en Escherichia
coli. En este caso, la poca informacin existente proviene de investigaciones realizadas
en bacterias lcticas. Los genes que codifican los dos primeros pasos de la asimilacin
de fructosa por esta ruta, la fructo kinasa y la glucosa-6 fosfato isomerasa, forman un
opern (fruIK) reprimido por catabolito y posiblemente regulado por sustrato (fructosa)
a travs de un represor tipo LacI/GalR (unkR) (23). En lactobacilos heterofermentativos
facultativos, como Lactobacillus pentosus, la expresin de los genes que rigen la ruta de
la fosfocetolasa parece estar regulada negativamente por la presencia de glucosa o
fructosa como ocurre en otros genes bajo represin catablica (ver Captulo 4), pero a
su vez podra estar inducida por algn catabolito de la propia ruta, posiblemente por la
xilulosa-5 fosfato (45).

Metabolismo de pentosas, gluconato y pentitoles.

La mayora de las bacterias lcticas pueden fermentar las pentosas, que
normalmente son transportadas por permeasas especificas. Una vez en el interior
celular, son fosforiladas y convertidas en ribulosa-5P o xilulosa-5P por la accin de
epimerasas o isomerasas (27). Estos compuestos son metabolizados por la ruta de las
pentosas fosfato, por lo que la necesidad de la fosfocetolasa para el metabolismo de las
pentosas podra sugerir que solo las bacterias lcticas heterofermentativas son capaces
de fermentar las pentosas, pero no es as. Una gran cantidad de bacterias lcticas que
habitualmente fermentan la glucosa de modo homofermentativo tambin pueden
metabolizar las pentosas por la ruta de la fosfocetolasa, excepto los homofermentativos
estrictos como el grupo I de los lactobacilos. En estas bacterias, denominadas
heterofermentativas facultativas, la fosfocetolasa es un enzima inducible por la
presencia de pentosas (27). La fermentacin heterolctica de pentosas da un patrn de
productos finales diferente al de la fermentacin de glucosa. Dado que no es necesario
ningn paso de deshidrogenacin ni descarboxilacin hasta llegar al intermediario
xilulosa-5P, no se produce CO
2
y la reduccin del acetil fosfato se vuelve innecesaria al
no haberse producido NADH que tenga que oxidarse a NAD+. El enzima acetato kinasa
cataliza una fosforilacin a nivel de sustrato produciendo ATP y acetato a partir del
acetil fosfato y ADP. En conclusin la fermentacin heterolctica de pentosas produce
una un mol de lactato y un mol de acetato por mol de pentosa fermentada y el
rendimiento energtico de dos moles de ATP.
Algunas bacterias lcticas pueden fermentar el gluconato por la va
heterofermentativa. El metabolismo de este compuesto ha sido bien estudiado en
Enterococcus faecalis, donde el gluconato es transportado por un PTS especfico
inducible y el gluconato-6P resultante entra directamente en la ruta de las pentosas
fosfato (31). Dado que es necesario un paso de deshidrogenacin, por el nivel de
incorporacin a la ruta, una parte del acetil-P debe ser reducido a etanol para mantener
el balance redox. Muchos de los lactobacilos de los grupos II y III tambin fermentan el
gluconato (27), probablemente de un modo similar a E. faecalis, aunque el transporte
puede ser mediado por una permeasa en algunos casos.
Unas pocas especies de bacterias lcticas, por ejemplo Lactobacillus casei y
Lactobacillus plantarum, son capaces de crecer a partir de pentitoles. Estos son
transportados por un PTS especifico del pentitol, el pentitol fosfato producido es
oxidado a pentosa fosfato por una deshidrogenasa y metabolizado a travs de la ruta de
las pentosas fosfato (31). Igual que en la fermentacin del gluconato, una parte del acetil
fosfato es reducida a etanol para reoxidar el NADH producido durante la
deshidrogenacin del pentitol fosfato.

1,3 P-glicerato
3 P-glicerato
2 P-glicerato
PEP
piruvico
Lactato
NAD+
NADH
NAD+
NADH
ATP
ADP
ATP
ADP
6-P-gluconato
ribulosa-5-P
xilulosa-5-P
acetil-P
acetil-CoA
acetaldehdo
Etanol
NAD+
NADH
NAD+
NADH
7
8
Acetato
ADP
ATP
5
Perm
ATP
ADP
glucosa
glucosa-6P
glucosa
11
NAD+
NADH
NAD+
NADH
CO
2
gliceraldehido-3-P
6
4
2
1
3
pentosas-P
pentosas
Perm
pentosas
ATP
ADP
10
9


Figura 2. Ruta de las Pentosas Fosfato (Va Heterofermentativa). Gris claro, reacciones
tipo fase I; gris, reacciones tipo fase II, gris oscuro, reacciones tipo fase III. 1,
hexokinasa; 2, glucosa-6P deshidrogenasa; 3, 6-fosfogluconato deshidrogenasa; 4,
ribulosa-5P 3-epimerasa; 5, xilulosa-5P fosfocetolasa; 6, fosfotransacetilasa; 7,
acetaldehido deshidrogenasa; 8, alcohol deshidrogenasa; 9, pentosa kinasa; 10, pentosa
fosfato epimerasa o isomerasa; 11, acetato kinasa. En el resto de reacciones intervienen
los mismos enzimas que en la va homofermentativa. Las reacciones indicadas con
flechas discontinuas ocurren solo durante el metabolismo de pentosas.


RUTA DE BIFIDUS PARA LA FRUCTOSA 6-FOSFATO.

Como se ha mencionado anteriormente, las bifidobacterias son bioqumica y
taxonmicamente diferentes a las bacterias lcticas y aunque producen cido lctico, no
utilizan la va homolctica ni la heterolctica anteriormente descritas sino una secuencia
metablica que exclusiva, denominada ruta lanzadera de la fructosa-6P o
coloquialmente ruta bfidus, cuyo enzima clave, al igual que en la ruta
heterofermentativa es la fosfocetolasa, pero que en este caso puede ser una fructos-6P
fosfocetolasa o xilulosa 5-fosfato/fructosa 6-fosfato fosfocetolasa como en bacterias
lcticas (36). En cualquier caso los productos de la reaccin son a dos moles de lactato y
tres de acetato por cada dos moles de glucosa fermentados (27).
En la figura 3 pueden observarse todos los pasos enzimticos de la ruta de
bfidus para la fructosa-6P (22). Si la dividimos en las tres fases que hemos utilizado
anteriormente, vemos que hay una primera fase muy interesante de reacciones
preparatorias. Sin la presencia de pasos de oxido-reduccin se obtienen tres molculas
de acetil-P y dos de gliceraldehido-3-P a partir de dos molculas de glucosa gracias a la
accin de dos fosfocetolasas que actan sobre la fructosa-6-P y sobre la xilulosa-5-P. La
descripcin completa de la secuencia de reacciones es como sigue: dos molculas de
glucosa transportadas por una permeasa son transformadas en fructosa-6-P por la accin
consecutiva de la hexoquinasa y la glucosa-6-P isomerasa; una de las molculas de
fructosa-6P es escindida en eritrosa-4P y acetil-P por la fructosa-6P fosfocetolasa; la
eritrosa-4P y la fructosa-6P que no haba sido sustrato de la fosfocetolasa sufren una
transaldolacin y dan como resultado gliceraldehido-3P y sedoheptulosa-7P que son
transcetolados dando xilulosa-5P y ribosa-5P; la ribosa-5P es transformada en xilulosa-
5P por medio de la ribosa-5P isomerasa y la ribulosa-5P 3-epimerasa; por ltimo la
xilulosa-5P fosfocetolasa escinde las los molculas de xilulosa-5P en dos molculas de
gliceraldehido-3P y dos de acetil-P.
En las reacciones de la fase II, se produce oxidacin y rendimiento energtico,
obtenindose ATP y acetato por fosforilacin a nivel de sustrato del ADP con el acetil-P
y el gliceraldehido-3P, que sigue las mismas reacciones de la fase II de la gluclisis. Del
mismo modo que en la fermentacin homolctica, el NAD
+
convertido en NADH en la
oxidacin del gliceraldehido-3P es regenerado por la lactato deshidrogenasa, fase III,
que reduce el piruvato a lactato y oxida el NADH a NAD
+
.
El balance global de la ruta bfidus es la produccin de dos moles de lactato y
tres de acetato por cada dos moles de glucosa. Cabe destacar que el rendimiento
energtico, con 2.5 moles de ATP por mol de glucosa fermentada, es ms alto que el de
las vas homo y heterofermentativas del resto de bacterias lcticas.


Regulacin de la ruta bifidus para la fructosa-6P.

En el caso de la regulacin de la ruta lanzadera de la fructosa-6P de los bifidus,
se han realizado tambin pocos estudios, la mayor parte en Bifidobacterium longum. Se
ha podido determinar que la fructokinasa es imprescindible y suficiente para que se
inicie la asimilacin de fructosa por esta ruta y se induce por fructosa (9). Los datos
obtenidos a travs de las nuevas tcnicas de genmica y protemica dan informacin
ms amplia, mostrando que en B. longum, la expresin de genes del catabolismo de
azcares se ve incrementada en presencia de sales biliares (como ocurrir en el tracto
digestivo) (Snchez et al., 2005), al tiempo que la glucosa y fructosa inducen los
mismos enzimas, por lo que deben ser utilizadas por la misma ruta, aunque la fructosa,
adems, tambin induce un transportador tipo ABC (52; 72).

2 1,3 P-glicerato
2 3-P-glicerato
2 2-P-glicerato
2 PEP
2 piruvico
2 Lactato
2 NAD+
2 NADH
2 NAD+
2 NADH
2 ATP
2 ADP
2 ATP
2 ADP
2 acetil-P
2 Acetato
Perm
ATP
ADP
2 glucosa
fructosa-6-P
glucosa
2 gliceraldehido-3-P
ribosa-5-P
ribulosa-5-P
sedoheptulosa-7-P
fructosa-6-P
gliceraldehido-3-P
2 xilulosa-5-P
acetil-P Acetato
ADP
ATP
eritrosa-4-P
2 ATP
2 ADP
ATP
ADP
1
2
8
3
8
7
6
5
4
Pi
2 Pi


Figura 3. Ruta bfidus para la fructosa-6P. Gris claro, reacciones tipo fase I; gris,
reacciones tipo fase II, gris oscuro, reacciones tipo fase III. 1, hexokinasa y glucosa-6P
isomerasa; 2, fructosa-6-P fosfocetolasa; 3, transaldolasa; 4, transcetolasa; 5, ribosa-5P
isomerasa; 6, ribulosa-5P 3-epimerasa; 7, xilulosa-5P fosfocetolasa; 8, acetato kinasa.
En el resto de reacciones intervienen los mismos enzimas que en la va
homofermentativa.


METABOLISMO DE OTRAS HEXOSAS Y DE DISACRIDOS: RUTAS DE LE
LOIR Y TAGATOSA-6P

Metabolismo de hexosas y hexitoles.

A parte de la glucosa, las bacterias lcticas pueden fermentar otras hexosas como
manosa, galactosa y fructosa. Estos azcares normalmente entran en las vas principales
del metabolismo a nivel de glucosa-6P o fructosa-6P despus de ser fosforilados y/o
isomerizados. Una notable excepcin es el caso de la galactosa, que despus de ser
transportada y fosforilada por el sistema PTS sigue la ruta de la tagatosa-6P (4), al
contrario que el resto de hexosas que entran en las rutas comunes del metabolismo tras
solo uno o dos pasos especficos. Las cepas que transportan la galactosa por una
permeasa suelen convertirla en glucosa-6P a travs de la ruta de Leloir (63). Estas dos
rutas sern descritas con ms detalle a continuacin (5.3. y 5.4).
Adems, las bacterias lcticas que pueden metabolizar hexitoles, como sorbitol y
manitol poseen sistemas de transporte PTS especficos, por lo que se encuentran en el
citosol bacteriano en forma manitol-6P o sorbitol-6P. El siguiente paso lo catalizan,
respectivamente, la sorbitol-6P deshidrogenasa y la manitol-6P deshidrogenasa, para
convertirlos en fructosa-6P con la consiguiente formacin de NADH. De esta manera
estos azcares alcohol se pueden incorporar en la parte alta de las rutas generales de
metabolismo de hexosas, pero aumenta la cantidad de NADH que se ha de regenerar. El
metabolismo del sorbitol en Lactobacillus casei induce el aumento de la actividad
NADH oxidasa (71) y reconduce el flujo metablico de piruvato hacia la ruta de la
piruvato-formato liasa (60), para mantener el equilibrio redox. Sin embargo, el
aspecto ms llamativo del metabolismo de los pentitoles, es el hecho de que las
reacciones catalizadas por las pentitol-6P deshidrogenasas son reversibles, y por tanto la
reaccin reversa puede utilizarse en condiciones ambientales especiales como sumidero
del exceso de protones, para formar pentitoles a partir de fructosa-6P. Efectivamente en
lactobacilos y Lactococcus se observa la formacin de manitol cuando se inactiva la
lactato deshidrogenasa (21; 42), as como en una cepa silvestre de Oenococcus oeni. Es
este caso, O. oeni acumulaba manitol como consecuencia del cultivo en condiciones
aerobias, cuando la ruta de formacin de etanol quedaba inactivada (34). Pero esto
corresponde al autoajuste de los niveles de potencial reductor (NADH), que se
describir en detalle ms abajo (7).

Metabolismo de disacridos.

La fermentacin de productos de gran importancia econmica como los quesos y
el yogur dependen del metabolismo de este disacrido. Por tanto, el catabolismo de la
lactosa por bacterias lcticas de inters industrial ha sido objeto de un intenso estudio.
La lactosa puede ser transportada y fosforilada por un sistema PTS, como ocurre en
cepas de L. lactis y L. casei (64; 11). Posteriormente la lactosa-P es hidrolizada por una
fosfo--D-galactosidasa en galactosa-6-P, que se metaboliza por la ruta de la tagatosa-6-
P, y glucosa, que es canalizada a la gluclisis al ser fosforilada por la glucokinasa.
Tambin se puede transportar la lactosa por una permeasa (3; 17; 47) y ser hidrolizada
por una -galactosidasa en galactosa y glucosa. En este caso la galactosa se metaboliza
por la ruta de Leloir. Algunas baterias lcticas, como S. thermophilus, L. delbrkii y L.
acidophilus, solo metabolizan la glucosa despus de hidrolizar la lactosa, la galactosa es
expulsada al medio (24; 26). Para ms informacin sobre el metabolismo de la lactosa
en particular y disacaridos en general, consultar el Captulo 3. Transporte y catabolismo
de disacaridos: el paradigma de la lactosa.

La fermentacin de la maltosa en bacterias lcticas se ha estudiado
principalmente en el gnero Lactococcus, donde es transportada por una permeasa (29;
55). Una caracterstica interesante del metabolismo de la maltosa en Lc. lactis 65.1 es
que la maltosa es escindida por una maltosa fosforilasa en glucosa y -glucosa-1-P.
Slo la glucosa pasa a la gluclisis, la -glucosa-1-P probablemente se una como
precursor en la biosntesis de pared celular (55).

La sacarosa transportada por una permeasa es escindida por la sacarosa
hidrolasa, dando glucosa y fructosa que se incorporan a las vas metablicas principales.
En algunos lactococos existe un PTS especifico y una sacarosa-6-P hidrolasa inducibles
por sacarosa que producen glucosa-6-P y fructosa (65). La sacarosa tambin puede
actuar como donador de monosacaridos para la formacin de exopolisacaridos en
algunas bacterias lcticas. En la produccin de dextrano por Ln. mesenteroides, la
sacarosa es escindida por una enzima asociada a la pared celular, la dextransacarasa; la
glucosa se emplea en la sntesis de dextrano y la fructosa es fermentada del modo
habitual (10).

La fermentacin de otros disacaridos como celobiosa, melobiosa y trealosa no ha
sido excesivamente estudiado. La habilidad de metabolizar estos azucares vara entre
especies y probablemente esta mediado por transportadores e hidrolasas especficos que
producen los respectivos monosacaridos (o monosacaridos fosfato) que se fermentan
por las vas principales.

Ruta de Leloir

El metabolismo de la lactosa a travs de la ruta de Leloir es un rasgo ubicuo en
las bacterias. Puede servir como una ruta catablica para la utilizacin de la galactosa
como fuente de carbono y energa y como una va anablica del metabolismo de
carbohidratos dado que los galactsidos suelen ser unidades estructurales necesarias
para la construccin de, por ejemplo, lipopolisacridos, componentes de la pared celular
(ver captulo 10) y exopolisacridos (ver captulo 11). En ausencia de una fuente externa
de galactosa, la ruta de Leloir es el nico medio para proporcionar este azcar por
medio de la interconversin de glucosa a galactosa (18).

La ruta de Leloir (ver figura 2.4) comienza con la fosforilacin por la
galactokinasa de la galactosa transportada al interior celular por una permeasa o
producida por hidrlisis de la lactosa por la -galactosidasa. La enzima galactosa-1-P
uridiltransferasa cataliza el intercambio de glucosa-1P por galactosa-1-P en la UDP-
glucosa (uridina difosfato glucosa), dando como productos UDP-galactosa y glucosa-1-
P. La fosfoglucomutasa se encarga de isomerizar la glucosa-1-P en glucosa-6-P que se
incorpora a la gluclisis. En la reaccin de la galactosa-1-P uridiltransferasa, se ha
consumido UDP-glucosa y se ha producido UDP-galactosa, pero el enzima UDP-
glucosa 4-epimerasa es capaz de interconvertir la una en la otra.

Ruta de la Tagatosa-6-P

Se puede considerar a la ruta de la tagatosa-6-P como un anlogo de la fase I de
la gluclisis para la galactosa (figura 2.4). Las reacciones enzimticas tienen la misma
funcin, se conduce la molcula hasta la formacin de una hexosa bifosforilada capaz
de ser escindida en triosas fosfato. De hecho la tagatosa es un esteroisomero de la
fructosa, pero requiere enzimas especficos para su metabolismo (galactosa fosfato
isomerasa, tagatosa fosfato kinasa y tagatosa bifosfato aldolasa). Una vez formado el
gliceraldehdo-3-P el flujo metablico se conduce por la fase II de la glucolsis.

Perm
glucosa
glucosa-6P
fructosa- 6P
dihidroxiacetona-P gliceraldehido-3-P
galactosa
PTS
ATP
ADP
ADP
ATP
tagatosa-1,6-BP
fructosa- 1,6-BP
galactosa-6-P
tagatosa-6P
lactosa
glucosa-1-P
Perm
ATP
ADP
galactosa
galactosa-1-P
galactosa
lactosa lactosa-6-P
lactosa
PTS
dihidroxiacetona-P
Ruta de Leloir
Ruta de la tagatosa-6-P
Fase II de
la gluclisis
UDPglc
UDPgal
ATP
ADP
8
7
4
3
2
9
Sntesis
de EPS
5
1 6


Figura 4. Rutas de Leloir (izquierda) y de la Tagatosa-6P (derecha), canalizacin de la
galactosa hasta la gluclisis. 1, -galactosidasa; 2, galactokinasa; 3, galactosa-1-P
uridiltransferasa; 4, UDP-glucosa 4-epimerasa; 5, fosfoglucomutasa; 6, fosfo--
galactosidasa; 7, galactosa fosfato isomerasa; 8, tagatosa fosfato kinasa; 9, tagatosa
bifosfato aldolasa. En el resto de reacciones intervienen los mismos enzimas que en la
va homofermentativa.


RUTAS ALTERNATIVAS DEL PIRUVATO

Durante la anterior descripcin de las rutas metablicas que emplean las
bacterias lcticas para el metabolismo de azcares, siempre se ha considerado que todo
el piruvato producido es reducido a lactato para mantener el balance redox de los
procesos fermentativos. Ahora veremos que eso no necesariamente es siempre as.
Ciertas condiciones ambientales, como la presencia / ausencia de oxigeno, la
concentracin de azcar disponible y el pH del medio, pueden influir en el metabolismo
de las bacterias lcticas redirigiendo el flujo de carbono de piruvato a lactato hacia otras
rutas y resultando en un patrn de compuestos finales diferente del observado durante la
fermentacin de glucosa en condiciones normales (ausencia de oxgeno, alta
concentracin de azcar y pH neutro o ligeramente cido). En la figura 5 aparece un
esquema con las rutas alternativas del metabolismo del piruvato (27), cada cepa no lleva
a cabo todas estas reacciones, estn representadas como el conjunto de posibles destinos
alternativos del piruvato dentro del grupo de las bacterias lcticas, el que una ruta se
utilice o no depender de la especie/cepa concreta y de las condiciones ambientales en
las que se encuentre. En el captulo 3 (Metabolismo del citrato) se trata en profundidad
y por especialistas la ruta de utilizacin del citrato una va metablica de gran
importancia industrial en bacterias lcticas, por lo que no se tratar en este captulo.

Ruta del diacetilo / acetoina.

La produccin de diacetilo y acetoina / 2,3-butanodiol es comn en las bacterias
cido lcticas (27). Pero solo se da en un grado significativo cuando existe un exceso de
piruvato en la clula en relacin con las necesidades de regeneracin de NAD
+
. Esto
puede ocurrir de dos formas: que exista en el medio una fuente de piruvato adicional al
carbohidrato fermentado o que otro compuesto acte como aceptor de los electrones del
NADH. En la leche hay una considerable cantidad de citrato (~1.5 mg/mL), las
bacterias lcticas pueden transformar el citrato en piruvato, va oxalacetato, y producir
diacetilo y acetona (25). De las dos rutas posibles mostradas en la figura 2.5 hay
evidencias de que la ms importante es la que pasa por el -acetolactato, ya que puede
detectarse este compuesto como intermediario en cultivos que producen diacetilo y se
ha identificado el enzima -acetolactato sintasa en diversas bacterias lacticas (25). El -
acetolactato puede dar diacetilo por medio de una descomposicin qumica no
enzimtica (descarboxilacin oxidativa favorecida por aireacin y pH bajo) o acetoina
por una descarboxilacin enzimatica.

Ruta de la piruvato-formato liasa.

El enzima piruvato-formato liasa cataliza la reaccin entre el piruvato y el
coenzima A para dar acetilCoA y formato (54). El acetilCoA puede ser utilizado como
aceptor de electrones para reoxidar el NADH o como compuesto rico en energa para
producir ATP (fosforilacin a nivel de sustrato del acetil-P), los compuestos finales que
se originan son etanol en el primer caso y acetato en el segundo. Este sistema es activo
en diversas bacterias lacticas (27), por ejemplo en cepas de Lactobacillus casei y
Lactococcus lactis crecidas en cultivo continuo bajo limitacin de sustrato y
anaerobiosis (14; 62) o cepas de L. lactis creciendo sobre galactosa (63) o maltosa (55).
En estas condiciones se pasa de una fermentacin homolactica a una fermentacin
heterolctica (cido mixta), formndose como compuestos finales lactato, acetato,
formato y etanol. El cambio en el patrn de fermentacin es debido a la ralentizacin
del flujo glucoltico y la consecuente disminucin del nivel de los intermediarios
fructosa-1,6-P (62; 63; 55) y triosas fosfato (63). Las lactato deshidrogenasa de L. casei
y L. lactis son enzimas alostricos que requieren fructosa-1,6-P para su actividad (20) y
las triosas fosfato son inhibidores de la piruvato-formato liasa (59). Debido a la
fosforilacin oxidativa de parte del acetil-P, se obtiene un mayor rendimiento molar
(obtencin de ms ATP por mol de glucosa) a tasas de crecimiento bajas y fermentacin
cido mixta que a mayores velocidades de crecimiento y fermentacin homolctica (62).
Esta ruta solo funciona en condiciones de anaerobiosis dado que el oxigeno inactiva el
enzima piruvato-formato liasa (54).

Ruta de la piruvato deshidrogenasa

Se ha demostrado que el complejo enzimatico de la piruvato deshidrogenasa
(produce acetilCoA, CO
2
y NADH a partir de piruvato, coenzima A y NAD
+
) es activo
en lactococci (7; 12; 56). En condiciones aerobicas esta actividad enzimtica desempea
una funcin anablica produciendo acetilCoA para la biosntesis de lpidos (12). En
condiciones anaerbicas esta funcin probablemente es realizada por la piruvato-
formato liasa. La piruvato deshidrogenasa tambin puede desempear una funcin en el
catabolismo, pero principalmente en condiciones aerobias donde las NADH oxidasas
pueden reoxidar el exceso de NADH producido. Cultivos aireados de clulas sin
crecimiento de L. lactis pueden realizar una fermentacin homoactica en condiciones
de limitacin de sustrato (56), en estas condiciones la enzima lactato deshidrogenasa
presenta una muy baja actividad y prcticamente todo el piruvato producido en la
gluclisis es metabolizado por la piruvato deshidrogenasa. El compuesto final de este
metabolismo es el acetato (y CO
2
), pero para que pueda darse es necesario que todo el
NADH producido durante la gluclisis y la reaccin de la piruvato deshidrogenasa
pueda ser reoxidado por las NADH oxidasas (56).

Ruta de la piruvato oxidasa.

Esta enzima puede metabolizar el piruvato a acetil-P (susceptible de
fosforilacin a nivel de sustrato), CO
2
y H
2
O
2
. La piruvato oxidasa desempea un papel
importante en el metabolismo aerobio de Lactobacillus plantarum (Sedewitz et al.,
1984). Durante el inicio de la fase estacionaria se da el mximo de actividad piruvato
oxidasa, detectandose un fuerte incremento en la produccin de acetato. La actividad
aumenta en presencia de oxigeno y se reduce en presencia de glucosa. La piruvato
oxidasa permite la obtencin de una cantidad de energa suplementaria (en forma de
ATP) en condiciones de limitacin de la fuente de carbono gracias a la produccin de
acetil-P para la fosforilacin a nivel de sustrato por la acetato kinasa.

EQUILIBRIO REDOX Y NADH OXIDASAS.

Dada la importancia del equilibrio redox en bacterias lcticas y otros
microorganismos fermentativos, este apartado merece especial antencin.
Estas enzimas catalizan la transferencia de electrones desde el NADH al
oxigeno. El producto de la reaccin es NAD
+
y H
2
O o H
2
O
2
, dependiendo de si el
enzima cataliza la transferencia de 2 o 4 electrones. Muchas bacterias lacticas tambien
disponen de una NADH peroxidasa que utiliza el H
2
O
2
como aceptor de electrones para
la formacin de agua. Las NADH oxidasas pueden competir con la lactato
deshidrogenasa por el NADH, esto origina un exceso de piruvato disponible para ser
metabolizado por la ruta de la acetoina / diacetilo. Se ha demostrado un incremento en
la produccin de acetoina en cultivos en aireacin comparados con cultivos anaerobios
de L. lactis (12), lactobacilos homofermentativos y Carnobacterium (5). Esto no ocurre
as en bacterias lcticas heterofermentativas. En ellas las NADH oxidasas no compiten
con la lactato deshidrogenasa sino con las acetaldehido y alcohol deshidrogenasas. No
se crea un exceso de piruvato y el producto principal de su metabolismo continua siendo
lactato, pero si que hay un exceso de acetil-CoA que al no necesitarse como aceptor de
electrones puede utilizarse para producir ATP (va fosforilacin oxidativa del acetil-P).
Cepas de Leuconostoc sp. en glucosa y aireacin aumentan su velocidad de crecimiento,
dejan de producir etanol y aumenta la cantidad de acetato producida por la acetato
kinasa, lo que incrementa la produccin de ATP y el rendimiento (32).

Si el medio de cultivo contiene hemoglobina o hematina, algunas bacterias
lacticas, especialmente enterococos y carnobacterias, pueden producir citocromos y
utilizar el oxigeno como aceptor final de electrones, cambiando su metabolismo de
fermentativo a respiratorio y obteniendo una mayor cantidad de ATP por fosforilacin
oxidativa (8; 37; 48).

El oxigeno tiene una fuerte incidencia en el metabolismo de las bacterias
lcticas, pero hay que tener en cuenta que no tienen el mismo potencial para protegerse
de los efectos txicos del oxigeno que las bacterias aerobias. Las bacterias lcticas
carecen de catalasa, aunque algunas cepas puedes descomponer el H
2
O
2
por medio de
una pseudocatalasa o por una verdadera catalasa si existe grupo hemo en el medio de
cultivo (15). Como las NADH oxidasas producen H
2
O
2
, su acumulacin puede llegar a
niveles autoinhibitorios en algunas cepas (13). Algunas bacterias lcticas, como
lactococi y enterococi, poseen superoxido dismutasa, pero no otras, como lactobacilli.
Lactobacillus plantarum ha desarrollado un sistema de proteccin contra el superxido
que consiste en la acumulacin intracelular de Mn
2+
a altas concentraciones (30-35 mM)
que tiene un efecto de detoxificacin contra este radical (1). Este sistema tambin puede
ser utilizado por otras bacterias lcticas en habientes vegetales (ricos en Mn
2+
), como
otros lactobacillos, leuconostocs y pediococos.

PIRUVATO
acetil-CoA
acetil-P
formato
acetona
2,3-butanodiol
-acetolactato
diacetilo
Hidroxietil-TPP
etanol acetato
acetaldehdo
lactato
CO2
CO2
CO2
CO2
CO2
ADP
ATP
NAD+
NADH + H+
NAD+
NADH
NAD+
NADH + H+
NADH
NAD+
2NADH + 2H+
2NAD+
O2
H2O2
CoA
CoA
CoA
CoA
Pi
O2
TPP
CoA
PFL
ACK
ADH
PDH
Pox
ALS
TPP
DS
ADC
LDH
biosntesis de
aminocidos
acetato
acetil-P
ATP
ADP
ACK
biosntesis de
lpidos


Figura 5. Destinos alternativos del piruvato. ACK, acetato kinasa; ADC, acetolactato
descarboxilasa; ADH, alcohol deshidrogenasa; ALS, acetolactato sintasa; DS, diacetilo
sintasa; LDH, lactato deshidrogenasa; PDH, piruvato deshidrogenasa; PFL piruvato
formato liasa; POX, piruvato oxidasa. CoA, coenzima A.



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