CMA 2014 - Aula prtica: tcnicas de anlise cromossmica

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Tcnicas de anlise cromossmica




Sumrio
I. Cultura de clulas para anlise cromossmica
II. Tcnicas de marcao cromossmica por citogentica
convencional (tcnicas de bandeamento)
III. Tcnicas de marcao cromossmica por citogentica
molecular (hibridizao in situ)
IV. Estabelecimento do caritipo
V. Tcnicas citogenticas para estudos de instabilidade
cromossmica (biomarcadores)







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Tcnicas de anlise cromossmica

As tcnicas de anlise citogentica permitem observar o complemento
cromossmico de um organismo, ou segmentos especficos de cromossomas, sendo um dos
seus principais objetivos, em cincias do meio aqutico, a identificao de alteraes
cromossmicas associadas a evoluo e especiao. Outro objetivo importante ser a
identificao de instabilidade cromossmica associada a genotoxicidade.
Os cromossomas observam-se em clulas que se encontram em metafase. Assim
sendo, necessrio obter clulas em diviso para fazer um estudo cromossmico. Podem-se
obter clulas em diviso espontnea (p. ex., a partir das brnquias dos bivalves), ou a partir
de culturas cuja diviso induzida, como sangue perifrico.

Sero descritos os fundamentos da tcnica de cultura de linfcitos, por ser a tcnica
de rotina mais utilizada para o estabelecimento do caritipo constitucional e porque inclui
procedimentos que so comuns a todos os tipos de cultura.


Cultura celular para anlise cromossmica
Amostra
Colheita de sangue perifrico em seringa heparinizada (anticoagulante que no
impede o crescimento celular). A cultura poder ser feita a partir de amostras de sangue
total, ou dos linfcitos isolados com Histopaque.
Meio de cultura
O meio de cultura constitudo por:
- meio de suporte celular basal;
- nutrientes, obtidos a partir de soro fetal bovino, para enriquecimento do meio;
- antibiticos (penicilina e estreptomicina) em percentagem reduzida para no inibirem o
crescimento;
- fitohemaglutinina (PHA): agente mitognico extrado da planta do feijo vermelho
(Phaseolus vulgaris) que induz especificamente o crescimento dos linfcitos T.
Incubao
As clulas so inoculadas no meio de cultura previamente colocado em tubos
estreis (todas as manipulaes so feitas em cmara assptica de fluxo laminar); esta
suspenso celular ento incubada em estufa a 37
0
C e com um ambiente de 5% de CO
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durante 3-5 dias de cultura, dependendo do tipo de organismo em questo.

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Bloqueio das clulas em metafase
Ao fim da incubao adiciona-se colcemide (ou colchicina) ao meio de cultura; esta
substncia vai impedir a formao do fuso acromtico (por dissoluo da tubulina) e
consequentemente paragem do ciclo celular em metafase, com espalhamento dos
cromossomas pelo ncleo e contrao gradual dos cromossomas. O tempo de atuao da
colcemide (1-2 horas) um parmetro fundamental: tempo a menos pode no bloquear um
nmero suficiente de metafases para fazer o estudo cromossmico adequado; tempo a mais
pode dar origem a uma contrao exagerada dos cromossomas.
Tratamento das clulas com soluto hipotnico
Aps centrifugao para retirar o meio com colcemide, a suspenso celular vai ser
sujeita a um tratamento com um soluto hipotnico (KCl a 0,075M); este vai provocar a lise
da membrana plasmtica dos linfcitos e desprezar o citoplasma, obtendo-se uma
suspenso nuclear; alm disso vai provocar o entumescimento dos ncleos permitindo um
maior espalhamento dos cromossomas.
Fixao
Aps centrifugao para retirar o soluto hipotnico, as clulas so fixadas em cido
actico:metanol. Seguem-se vrias lavagens com o mesmo fixador para eliminar restos
celulares e citoplasmticos que se encontram na suspenso. Ao fim da ltima lavagem
suspendem-se as clulas numa quantidade de fixador que seja adequada para a obteno de
um nmero suficiente de clulas por gota de suspenso.
Espalhamento cromossmico
Coloca-se uma gota de suspenso numa lmina de vidro muito bem limpa (para que
haja um bom deslize ao longo da lmina). A gota deve ser atirada, com o uso de uma pipeta
Pasteur, a uma determinada altura da lmina para melhor espalhamento dos cromossomas.
Este passo crucial porque fundamental obter em lmina cromossomas suficientemente
separados para uma boa visualizao, mas suficientemente prximos para no haver mistura
de cromossomas de clulas contguas. As lminas assim obtidas designam-se por
preparaes cromossmicas.
Colorao
Uma vez obtidas as preparaes cromossmicas, estas podem ser imediatamente
coradas para visualizao dos cromossomas; a colorao com Giemsa a mais utilizada em
tcnicas citogenticas de rotina. Este tipo de colorao, por si s, uniforme ao longo do
cromossoma, no permitindo a identificao individual dos cromossomas (permite apenas
detetar variaes de nmero); no entanto, como deixa visvel a constrio centromrica,
permite identificar grupos de cromossomas de acordo com a sua morfologia e identificar
alteraes de largo espectro, tais como grandes variaes de forma e quebras
cromossmicas.


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II. Tcnicas de marcao cromossmica por citogentica convencional
(tcnicas de bandeamento)

Se o objetivo de estudo a deteo de alteraes cromossmicas, os cromossomas
devem ser marcados de uma forma especfica, de modo a que cada um dos pares seja
identificado individualmente. Esta marcao pode ser obtida atravs de diferentes tcnicas
de bandeamento diferencial. Existem tambm mtodos que marcam regies especficas dos
cromossomas, que se designam por tcnicas de bandeamento seletivo.

Tcnicas de bandeamento diferencial
Bandas Q
Foi o primeiro mtodo de diferenciao longitudinal a ser utilizado, e baseia-se na
colorao dos cromossomas pela mostarda de quinacrina e observao da fluorescncia
emitida usando luz ultra-violeta. Os cromossomas so corados sem qualquer tipo de pr-
tratamento, preservando assim a sua morfologia. Apresentam ento um padro de bandas
brilhantes e plidas, especfico para cada cromossoma.
Esta tcnica apresenta, contudo, uma desvantagem: a fluorescncia desvanece
rapidamente. Assim sendo, para a anlise citogentica de rotina este mtodo foi substitudo
por tcnicas de bandeamento no fluorescente.
Bandas G
As bandas G podem ser obtidas fazendo um pr-tratamento dos cromossomas com
uma soluo salina a 60
0
C ou com enzimas proteolticas, tais como a tripsina, seguido de
colorao com Giemsa. Os cromossomas apresentam, ento, um padro de bandas claras e
escuras especfico para cada cromossoma. O padro das bandas G coincidente com o das
bandas Q, ou seja: as bandas G escuras correspondem s bandas Q brilhantes; as bandas G
claras correspondem s bandas Q plidas.
As bandas G so as que se utilizam mais frequentemente em qualquer laboratrio de
rotina, pois o mtodo simples de executar e a colorao permanente.
Bandas R
Tal como o nome indica, as bandas R so o reverso das bandas G. A tcnica envolve
pr-tratamento alcalino a elevada temperatura (80-90
0
C), seguido de colorao com Giemsa.
Bases moleculares das bandas
As bandas refletem a organizao funcional do genoma que regula a
replicao do DNA, a reparao, a transcrio e a recombinao gentica. As bases
moleculares das tcnicas de bandas envolvem a composio de bases do DNA, as protenas
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associadas e a organizao funcional do genoma. De um modo geral, as bandas G escuras (R
claras) so ricas em bases AT, replicam tardiamente e so pobres em genes; as bandas G
claras (R escuras) so ricas em bases CG, replicam precocemente e so ricas em genes.
Bandas de alta resoluo
Todas as tcnicas de bandas descritas at aqui so aplicadas a cromossomas que se
encontram em metafase, e que esto j fixados e espalhados nas preparaes
cromossmicas. Os cromossomas em prometafase so muito mais longos, mas tambm
podem ser bandeados. Este tipo de marcao pode ser obtido fazendo um tratamento in
vivo, durante o tempo de cultura, com agentes bloqueadores do perodo S (metotrexato ou
bromodeoxiuridina). Quando o bloqueio libertado (com meio rico em timidina), o ciclo
celular fica sincronizado, permitindo ento fazer a paragem das clulas na fase que se
pretende (neste caso, em prometafase).
Este tipo de marcao permite aumentar o nmero de bandas visveis, e da a
designao de bandas de alta resoluo. Ele permite localizar com maior rigor alteraes
cromossmicas subtis, difceis de detetar em cromossomas metafsicos (microdelees,
p.ex.).
Tcnicas de bandeamento seletivo
Bandas C
Este mtodo marca seletivamente a heterocromatina constitutiva. Esta est
localizada primordialmente nas regies centromricas dos cromossomas. Assim, as bandas C
so aplicadas ao estudo dos polimorfismos que envolvem a regio justacentromrica. As
bandas C podem ser obtidas atravs de vrios mtodos, mas o mais comum consiste num
breve tratamento com cido, seguido de tratamento alcalino (hidrxido de brio, p. ex.) e
posteriormente colorao com Giemsa.
Bandas NOR
As bandas NOR correspondem marcao das regies dos organizadores nucleolares
que se encontram geralmente nos braos curtos dos cromossomas acrocntricos. O mtodo
mais utilizado o da precipitao de nitrato de prata sobre aquelas regies. A precipitao
no se d sobre o DNA ribossmico; resulta antes da reduo de uma (ou vrias) protenas
cidas argirfilas que se encontram associadas quelas regies, onde se localizam os genes
que codificam as subunidades 18S e 28S do rRNA. O precipitado localiza-se, por isso, no
exterior do cromossomas e s aparece se os referidos genes estiverem ativos.
Bandas T
Tal como o nome indica, as bandas T coram especificamente os segmentos terminais
dos cromossomas (bandas telomricas). Este mtodo baseia-se numa modificao do
mtodo das bandas R.


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III. Tcnicas de marcao cromossmica por citogentica molecular
(hibridizao in situ)
O estudo do caritipo por tcnicas de citogentica convencional o mais utilizado
pois permite, com muita resoluo e de forma simples e prtica, observar todo o
complemento cromossmico. No entanto, em determinadas situaes (como p. ex. nas
culturas de clulas malignas) a m qualidade dos cromossomas pode no permitir a
identificao correta de todo o complemento cromossmico. Nestes casos, e se o que se
pretende identificar so cromossomas especficos e no o complemento cromossmico
total, podem-se utilizar tcnicas de citogentica molecular, que se baseiam na marcao de
cromossomas ou segmentos cromossmicos por hibridizao in situ. Destas, aquela que se
aplica mais frequentemente a tcnica de marcao por FISH (fluorescent in situ
hybridization).
A tcnica de FISH baseia-se no uso de sondas, isto , sequncias de DNA ligadas a
fluorocromos que por sua vez se ligam a sequncias de DNA que lhe so complementares.
Tipos de sondas
Sondas de painting
Ligam-se a todas as posies de um cromossoma especfico. Permitem detetar
aneuploidias, delees, translocaes e identificar cromossomas marcadores.
Sondas centromricas
Permitem identificar alteraes a nvel do centrmero. Ao marcarem regies
centromricas de cromossomas especficos tambm podem ser utilizadas para deteo de
aneuploidias sem necessidade de utilizar sondas de painting.
Sondas de sequncia nica (gnicas)
Permitem identificar microdelees, alteraes envolvendo genes especficos e
oncogenes, que no so detetados por citogentica convencional.
Sondas subtelomricas
Permitem identificar translocaes atpicas que envolvem regies subtelomricas.
Tcnica de marcao por FISH
A tcnica de FISH envolve basicamente os seguintes passos:
- desnaturao da sonda especfica de DNA e sua marcao com um fluorocromo; o mtodo
de marcao pode ser direto (a prpria sonda marcada com o fluorocromo) ou indireto (a
sonda ligada a um anticorpo que por sua vez se liga a outro que transporta o fluorocromo),
que tem a vantagem de amplificar o sinal de fluorescncia.
- desnaturao do DNA dos cromossomas alvo de estudo; estes encontram-se em placas
metafsicas fixadas e espalhadas em lmina.
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- hibridizao da sonda com os cromossomas.
- observao dos cromossomas marcados em microscpio de fluorescncia, com filtros
adequados para o tipo de fluorocromo que se utiliza.
Sob condies de temperatura e concentrao salina altamente restringentes, a
sonda hibrida unicamente com segmentos complementares de DNA e no com a imensa
quantidade de segmentos de outras partes do genoma. Sob estas condies, as pontes que
se formam entre sequncias que no emparelham perfeitamente tornam-se instveis, e as
que se formam entra sequncias que emparelham perfeitamente so estveis.
FISH aplicado a clulas em interfase (IFISH)
Esta tcnica refere-se visualizao de alteraes cromossmica em ncleos inteiros.
A IFISH particularmente til na identificao de alteraes cromossmicas que se
encontram em pequenas percentagens de clulas (mosaicismo) e que so difceis de detetar
por citogentica convencional ou mesmo por tcnicas de FISH. Tambm se utiliza este
mtodo quando no possvel obter um nmero suficiente de cromossomas em metafase.
Apesar da grande sensibilidade e versatilidade da IFISH, sempre um mtodo
citogentico indireto e necessita de controlo, para salvaguardar falsos positivos e/ou
negativos. A disponibilidade de diferentes tipos de sondas especficas para uma grande
variabilidade de sequncias de DNA e de sistemas de deteo de fluorescncia permitem a
visualizao simultnea de mltiplas sondas no mesmo ncleo.
Outras tcnicas de marcao cromossmica por citogentica molecular
A tcnica de FISH a tcnica de citogentica molecular mais utilizada em anlises de
rotina. No entanto, outras tcnicas moleculares so aplicadas tambm quando as alteraes
so submicroscpicas, embora na maioria dos casos apenas para estudos de investigao.
Hibridizao genmica comparativa (CGH)
A CGH uma tcnica de citogentica molecular que se utiliza para fazer um screening
de todo o genoma, com o objetivo de detetar diferenas no nmero de cpias de qualquer
sequncia de DNA de um indivduo.
Sondas obtidas a partir de DNA do organismo a testar e de DNA de um organismo
normal sero marcadas de forma diferente (a verde o DNA do organismo a testar e a
vermelho o DNA do organismo normal). Estas duas sondas sero ento co-hibridadas com
cromossomas metafsicos normais. As diferenas no nmero de cpias sero detetadas
atravs dos diferentes ndices de intensidade das cores verde e vermelho. O ndice ser
calculado ao longo de cada cromossoma por um sistema de anlise de imagem digital.
Esta tcnica utilizada para estudos de alteraes submicroscpicas, que por isso
no podem ser identificadas por citogentica convencional ou mesmo por FISH. Com o
mtodo de CGH descrito, regies que aparecem a verde refletem ganhos de DNA e
amplificao; regies que aparecem a vermelho refletem perdas e delees.

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SKY ou FISH espectral
Este mtodo permite fazer a deteo simultnea de todos os cromossomas de uma
metafase. Utilizando sondas de painting para cada cromossoma e associar o mesmo n de
fluorocromos possvel fazer um esquema de marcao combinada que permite marcar de
forma diferente cada um dos autossomas, o X e o Y.

IV. Estabelecimento do caritipo
Observao ao microscpio para estabelecimento do caritipo
O caritipo s pode ser estabelecido a partir da observao de um nmero de
metafases que seja realmente representativo do tecido em questo. A escolha das
metafases a analisar crucial para que o estudo seja feito correctamente:
- s devem ser escolhidas metafases que tenham qualidade suficiente para que seja feita a
identificao de todos os cromossomas de uma forma inequvoca.
- no devem ser escolhidas metafases que estejam muito prximas umas das outras (pode
haver sobreposio de cromossomas pertencentes a metafases diferentes).
- no devem ser escolhidas metafases cujos cromossomas estejam muito espalhados e
distribudos de uma forma irregular, no circular (pode haver perda de cromossomas por
artefacto tcnico).
Estabelecimento do caritipo por citogentica convencional:
- observao de 15-20 metafases marcadas com bandeamento.
- organizao do caritipo em 3-5 metafases.
Deteco de mosaicismo:
- contagem de 15 metafases para despiste de 20% de mosaicismo.
- contagem de 30 metafases para despiste de 10% de mosaicismo.
- contagem de 60 metafases para despiste de 5% de mosaicismo.
Estabelecimento do caritipo por citogentica molecular:
- observao de 30 metafases para pesquisa de alteraes em metafases.
- observao de 100 metafases para pesquisa de alteraes em ncleos interfsicos.



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V. Tcnicas citogenticas para estudos de instabilidade cromossmica (IC)
A anlise citogentica permite fazer uma avaliao dos danos genticos que ocorrem
em organismos sujeitos a uma exposio ambiental a agentes mutagnicos.
Os mtodos citogenticos convencionais permitem detetar trs tipos de alteraes
cromossmicas: aberraes cromossmicas, microncleos e sister chromatid exchanges.

Aberraes cromossmicas (AC)
As AC detetadas em estudos de IC incluem vrios tipos de alteraes estruturais
adquiridas. possvel identificar quebras cromossmicas ou cromatdicas e rearranjos
assimtricos, que incluem: figuras tri e tetra-radiais; anis acntricos ou com centrmero;
cromossomas dicntricos (formados por fuso telomrica); minutes. Delees, translocaes
e inverses no so visveis em cromossomas sem bandas, e por isso no so contabilizadas
na IC.

Estas alteraes tanto podem ocorrer espontaneamente como induzidas, durante
uma cultura celular, por agentes especficos.
Microncleos (MN)
Os microncleos so formados por condensao de fragmentos de cromossomas
acntricos (efeito clastognico) ou por cromossomas inteiros que se atrasam em relao aos
outros na anafase (efeito aneugnico). Na telofase estes fragmentos ou cromossomas so
envolvidos por um invlucro nuclear formando estruturas tipicamente arredondadas, com
cor e textura semelhantes ao ncleo principal (da a designao de microncleos).
Os MN s podem ser observados em clulas em interfase que completaram uma
diviso nuclear. Adicionando, durante uma cultura celular, citocalasina-B (Cyt-B) ao meio de
cultura, as clulas vo ser bloqueadas em citocinese, apresentando-se ento binucleadas.


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Sister chromatid exchanges (SCE)
As SCE so manifestaes citogenticas da ocorrncia de troca de informao
gentica durante a replicao, atravs da quebra das cadeias de DNA e posterior juno, em
locais aparentemente equivalentes nos dois cromatdios de um mesmo cromossoma.
A tcnica para deteo das SCE baseia-se no princpio da replicao semiconservativa do
DNA. Fazendo uma incorporao de BrdU durante dois ciclos de diviso consecutivos, com
posterior colorao dupla com Hoescht 33258 (fluorocromo que se liga BrdU) e Giemsa,
possvel obter cromossomas com os cromatdios marcados desigualmente:
- ao fim do 1 ciclo com BrdU cada cromossoma ter cada cromatdio monosubstitudo, ou
seja, com um brao da cadeia de DNA normal e outro com a BrdU incorporada; assim o
Giemsa cora igualmente os dois cromatdios.
- ao fim do 2 ciclo consecutivo com BrdU, cada cromossoma ter um cromatdio
monosubstitudo (que cora com Giemsa) e um bisubstitudo (que no cora com Giemsa).


As SCE correspondem a um fenmeno biolgico que ocorre nas clulas normais. Elas
s so consideradas IC quando a frequncia significativamente superior ao padro normal.