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UNIVERSIDADE PAULISTA FARMCIA

DISCIPLINA: MTODOS INSTRUMENTAIS DE ANLISE


TPICO 4: Espectrofotometria de Absoro Molecular UV/Visvel
A espectrofotometria uma tcnica de anlise baseadas na interao entre a radiao
eletromagntica e a matria.
Conceitualmente, a radiao eletromagntica pode ser definida como um fenmeno ondulatrio
que no necessita de nenhum veculo de transmisso sendo bastante lembrada pela sua
capacidade de propagao no vcuo.

A propagao da radiao eletromagntica resulta de uma oscilao dos campos eltricos e
magnticos e pode ser considerado, fisicamente, como um fluxo de partculas de energia
(ftons). A energia irradiada (ftons) provm de cargas eltricas que, ao manterem movimentos
vibratrios, causam as oscilaes eletromagnticas.

Figura: Propagao da radiao eletromagntica.
Fonte: http://www.infoescola.com/fisica/radiacao-eletromagnetica/.
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Estas vibraes se propagam ao longo de uma direo radial a partir de onde esta oscilao
iniciou. O campo eltrico oscila perpendicularmente ao campo magntico.
A propagao da radiao eletromagntica ocorre em movimento ondulatrio e ter como
parmetros fsicos o seu comprimento de onda () e a sua freqncia (f).
Espectro Eletromagntico:
Trata-se da ampla faixa de comprimentos de onda ou freqncia que uma radiao
eletromagntica pode assumir:

Figura: Espectro Eletromagntico. Fonte: http://quimicaambiental.com/aquecimento-
global/efeito-estufa/espectro-eletromagnetico.

Como observado, as radiaes eletromagnticas podem ser classificadas como ondas de rdio,
microondas, luz infravermelho, luz visvel, luz ultravioleta, raios X e raios Gama. As tcnicas
espectrofotomtricas trabalham com a faixa do ultravioleta (1 nm a 380 nm, sendo a faixa
utilizada para anlise entre 200 e 380 nm) ao visvel (400 a 700 nm).
Interao da Radiao com a Matria:
A radiao interage com a matria sem, no entanto, ocorrer transferncia permanente de
energia.
O fenmeno ocorrido pode ser descrito como uma polarizao temporria das espcies
atmicas e moleculares presentes na matria. Esta polarizao provoca uma deformao
temporria das nuvens eletrnicas causado pelo campo eltrico da radiao.
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No momento em que a radiao retida pela matria (intervalo de 10
-14
segundos) ocorre uma
excitao atmica ou molecular para ser, em seguida, reemitido para o meio.

Espalhamento e Polarizao da Radiao:
As radiaes eletromagnticas possuem como caractersticos alguns fenmenos:
1. Difrao da Luz: Desvio de um feixe de radiao ao passar por uma fenda (barreira
estreita). A interao entre as partculas (na regio da fenda) e a radiao produz
franjas (bandas) claras e escuras.

2. Espalhamento da Luz: Radiao transmitida retida (momentaneamente) pelos
tomos, ons ou molculas e, em seguida, reemitido em todas as direes. tomos e
molculas apresentam baixo espalhamento (chamado espalhamento Rayleigh). J as
macromolculas apresentam grande Espalhamento (Mie).
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3. Refrao da Luz: Mudana abrupta de direo do feixe de radiao na interface entre 2
meios.

Fonte:http://www.passeiweb.com/na_ponta_lingua/sala_de_aula/fisica/optica/optica
/otica_refracao_da_luz
4. Reflexo da Luz: Parte da radiao refletida ao cruzar a interface entre 2 meios.

Fonte: http://www.sofisica.com.br/conteudos/Otica/Reflexaodaluz/reflexao.php
A radiao ao atravessar um meio que absorva, emita, refrate ou reflita, seletivamente, a
radiao se torna polarizada e direcionada a um nico plano.

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Absoro Molecular:
A absoro de energia proveniente de uma radiao gera espectros mais complexos e com
maior nmero de estados energticos em relao ao tomo isolado.
A absoro molecular de energia avaliada a partir de bandas, ou seja, faixas de
comprimentos de onda onde ocorre a maior absoro de radiao. A energia de uma banda
ser:
E
total
= E
eletrnica
+ E
vibracional
+ E
rotacional
Cada molcula ou conjunto de molculas (substncia) capaz de absorver radiao (energia)
em diferentes comprimentos de onda. Entretanto, cada molcula ter um comprimento de
onda (banda) de radiao onde esta absoro ser mxima. Ser esta banda ou faixa de
comprimento de onda a ser definida no equipamento para que se alcancem os resultados mais
precisos em uma anlise. Para eliminar a interferncia da absoro de energia por outras
molculas em uma amostra necessrio analisar um branco, contendo todos os componentes
exceto aquele que se deseja analisar.

Figura: Varredura do espectro UV/Visvel de radiao para o beta-caroteno (vermelho) e
licopeno (azul). Fonte: http://www.cromatografialiquida.com.br/carotespec.htm
O grfico acima mostra a relao entre a absoro de energia (indicada pelo parmetro de
absorbncia) e o comprimento de onda da radiao. Cada molcula apresentar um espectro
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de Absoro caracterstico e uma banda de absoro mxima a ser utilizada para sua anlise
pelo equipamento. As setas indicam as possveis bandas de absoro mxima para o
betacaroteno e para o licopeno. A absoro mxima do licopeno em acetona ocorre em
474nm, enquanto a do beta-caroteno ocorre em 454nm. Portanto, caso se deseje analisar
apenas o licopeno, o comprimento de onda ideal seria de 474 nm enquanto para anlise do
betacaroteno, o mesmo deveria ocorrer empregando radiao com comprimento de onda de
454 nm.

Fundamentos da Espectrofotometria:

Baseia-se na interao da energia radiante com a matria, atravs de excitaes energticas
nas molculas.


Entre as vantagens da tcnica tem-se:
Baixo custo de operao e anlise.
Robustez do equipamento.
Boa sensibilidade
Baixo Custo de manuteno (durabilidade mdia das lmpadas)

Figura: Espectrofotmetro UV/Vis Thermo. Fonte: Thermo
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Figura: Espectrofotmetro UV/Vis Shimadzu.
Fonte: http://www.shimadzu.com.br/analitica/produtos/espectrofotometros/uv-vis/uv-
2450_2550.aspx.

O espectro de absoro de radiao por uma substncia o principal parmetro a ser
verificado para uma boa condio de anlise. Toda molcula capaz de absorver energia a
partir da radiao emitida pelo aparelho. Entretanto, a quantidade de energia absorvida ir
variar de acordo com a energia emitida (para cada comprimento de onda, existe uma
quantidade especfica de energia absorvida pela molcula).

A anlise espectrofotomtrica baseada na teoria de Beer-Lambert:
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Lei de Lambert: A quantidade de energia transmitida depende do caminho ptico seguido
pela radiao.


O caminho ptico, por sua vez, ser influenciado pelas dimenses e material da cubeta
(vidraria utilizada para acondicionar a amostra a ser analisada pelo aparelho). Lambert
elaborou uma equao que expressasse a relao entre o caminho ptico e a quantidade de
energia transmitida aps o contato com o analito. Assim: I
T3
menor que I
T1


Onde:
I
T
= energia radiante transmitida (sada do analito)
I
0
= energia radiante inicial (entrada do analito)
K = constante de Lambert
l = largura da cubeta ou caminho ptico.

Lei de Beer: A quantidade de energia transmitida depende da quantidade de molculas
presentes, ou seja, da concentrao da substncia analisada.
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A concentrao de analito influenciar na intensidade de radiao transmitida uma vez que o
aumento no nmero de molculas modifica a absoro de energia pelo meio. Assim, para o
exemplo acima, I
T2
ser menor que I
T1
pois o aumento da concentrao provoca aumento na
quantidade de energia absorvida no analito.


Onde:
I
T
= energia radiante transmitida (sada do analito)
I
0
= energia radiante inicial (entrada do analito)
K = constante de Beer
c= concentrao no analito.
A unio das duas leis que regem a espectrofotometria deu origem ao conceito empregado
hoje para qualquer anlise espectrofotomtrica UV/Vis:
A espectroscopia de absoro molecular (espectrofotometria) est baseada na medida de
absorbncia (A) ou transmitncia (T), que esto relacionadas atravs das equaes:

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A absorbncia corrige desvios gerados pela determinao da transmitncia sendo hoje o
principal parmetro de quantificao espectrofotomtrica. A unio das Leis de Lambert e
Beer gerou a equao de absorbncia:
A = .b.c
Onde:
A : Absorbncia
e: Coeficiente de Extino Molar
b: largura da cubeta
c: concentrao da substncia
Caso a anlise espectrofotomtrica seja efetuada no mesmo equipamento e com a mesma
cubeta, os fatores e e b sero constantes e absorbncia s ir variar com a concentrao da
substncia (de maneira linear). A maior importncia da medida de absorbncia est em sua
proporcionalidade com a concentrao de analito. Tal proporcionalidade mantida para
valores de absorbncia abaixo de 1,000.

Figura: Grfico de Proporcionalidade entre Absorbncia (A) e Concentrao (C)
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Estabelecer a proporcionalidade entre a absorbncia e a concentrao para sua anlise
possvel atravs da construo da chamada Curva de Calibrao do mtodo.
A Lei de Beer-Lambert apresenta, porm, algumas limitaes reais que devem ser levadas em
conta:
A Lei vlida somente para baixas concentraes.
Em Altas concentraes a interao entre as molculas afeta a distribuio de
radiao, alterando o coeficiente de absortividade molar (e). (Manter
Absorbncia inferior a 1,000)
Pode-se diluir a amostra para manter a absorbncia dentro da Lei de Beer e,
assim, garantir a preciso na anlise.
DESVIO INSTRUMENTAL: A lei s vlida para radiao monocromtica, ou
seja, para um nico comprimento de onda (). Como minimizar o desvio?
Escolher a regio onde o constante na regio selecionada (pico de
absoro)



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O espectrofotmetro constitudo pelas seguintes partes:
Fontes de radiao (responsvel pela emisso do feixe de luz UV-Visvel)
Monocromador (responsvel pela seleo do comprimento de onda adequado para
ser levado em contato com a amostra)
Compartimento de amostra (nica parte com contato externo e onde a cubeta
contendo o analito ser acondicionada)
Detector (responsvel pela deteco da radiao transmitida a partir da cubeta
contendo o analito e tambm pela converso desta energia em um sinal eltrico a ser
convertido no aparelho em um valor de absorbncia).

Os Monocromadores so instrumentos pticos de construo muito robusta, destinado a
selecionar faixas do espectro de emisso de luz, ou seja, seleciona apenas um comprimento
de onda. O monocromador ser tanto melhor quanto menor for a banda de passagem (a
largura de banda tpica para uma abertura de fenda de 1mm na regio de 500nm de 12nm).
O comprimento de onda da luz transmitida atravs do monocromador pode ser
continuadamente variado e o espectro resultante analisado. Uma fonte de luz branca (UV +
VIS + IRP + IR) e um monocromador formam uma fonte de luz cujo comprimento de onda
ajustvel para estudos de excitao ou absoro.

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As fontes de radiao utilizadas no aparelho so lmpadas de tungstnio (empregada para
anlises no espectro visvel) e de deutrio (empregadas para anlises no espectro
ultravioleta).


Fonte: Princpios de Anlise Instrumental. (Holler, Skoog, Crough)
Como visto no grfico, a maior intensidade da lmpada de deutrio obtida na faixa entre
200-300 nm , correspondente ao espectro ultravioleta. Entretanto, para a lmpada de
tungstnio, a maior intensidade ocorre entre 500 e 900nm, correspondente ao espectro
visvel. O erro na escolha da lmpada a ser utilizada acarreta em medidas incorretas e deve
se ter grande ateno do analista.

As cubetas de medida podem ser de quartzo, empregada tanto para anlises em UV quanto
visvel, pois, apresenta baixa absoro de radiao na faixa entre 150 e 3000 nm. Entretanto,
cubetas de vidro ou plstico s devem ser empregadas para anlises no espectro visvel, pois,
apresentam baixa absoro de radiao apenas na faixa entre 380-800 nm (plstico) e 375
2000 nm (vidro).
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As anlises quantitativas buscam determinara concentrao de uma ou mais substncias
presentes em uma amostra. O uso da espectrofotometria na obteno de uma concentrao
possvel graas a aplicao da Lei de Beer que, por sua vez, garante proporcionalidade
entre absorbncia (A) e concentrao (C).
Existem trs mtodos principais para anlise quantitativa em espectrofotmetro:
- Tcnica da Adio de Padro: adio de concentrao conhecida do padro da
substncia que se deseja analisar e comparao com a amostra.
- Tcnica da anlise direta de mistura de substncias: determinam-se as absortividades
e absorbncias das molculas presentes na mistura amostral e, por clculo, obtm-se
cada concentrao.
- Tcnica do fator de correo: muito empregado em mtodos bioqumicos e
imunoclnicos. Multiplica-se a absorbncia da amostra por um fator de correo
determinado pela medida da absorbncia do padro.
- Curva de Calibrao: muitos protocolos trabalham com a elaborao de uma equao
de curva que relacione Absorbncia e concentrao.
Estabelecimento de uma Curva de Calibrao:
efetuada a medida da absorbncia de vrias concentraes de padro. Em seguira se
estabelece uma reta relacionando os valores de absorbncia e concentrao. Ao se estabelecer
a equao desta reta possvel converter os resultados de absorbncia (A) do
espectrofotmetro em concentrao do analito.
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Figura: Concentraes de Padro de Albumina para estabelecimento de uma curva de
calibrao para dosagem de protenas por espectrofotometria UV/Vis.
TUBO [Protena] (g/mL) Absorbncia
1/1' 10 0,040
2/2' 20 0,087
3/3' 30 0,133
4/4' 40 0,188
5/5' 50 0,242
6/6' 60 0,319
7/7' 70 0,379
8/8' 80 0,428
9/9' 90 0,493
10/10' 100 0,547

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Figura: Curva de Calibrao
A equao da reta corresponde a A = 0,0058. C -0,0317.
O coeficiente de determinao (r
2
) dever sempre estar prximo a 1,000 sendo um indicativo
da forte linearidade (proporcionalidade) obtida entre os valores de absorbncia e
concentrao.
partir de um resultado de anlise possvel converter o mesmo em um valor de
concentrao de analito empregando a equao da curva. Exemplo: para uma absorbncia de
0,520, qual a concentrao de protenas totais?
0,520 = 0,0058.C 0,0317
(0,520 + 0,0317) = 0,0058 . C
0,5517 = 0,0058 . C
(0,5517/0,0058) = C
95,12 = C

Ou seja, a anlise indicou concentrao de protenas totais igual a 95,12 g/mL.
y = 0,0058x - 0,0317
R = 0,9975
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0 20 40 60 80 100 120
D
A
b
s
[Protena] (g/mL)
Concentrao de Protenas