RESUMEN

Recientemente se introdujo en el diagnstico de malaria una tcnica llamada ampliacin

isotrmica de cidos nucleicos, que usa el material gentico plasmodial. Este escrito revisa la
informacin disponible sobre ampliacin isotrmica de cidos nucleicos, especialmente en el
campo del paludismo. Metodologa: se revisaron las bases electrnicas Lilacs, Scielo, PubMed
(Medline) y Ovid. Resultados: solo se encontraron tres referencias sobre ampli cacin isotrmica
de cidos nucleicos y malaria pero hubo abundante informacin sobre ampli cacin isotrmica de
cidos nucleicos en otras infecciones y campos de la medicina, en especial la infectologa. La
reaccin de ampli cacin isotrmica de cidos nucleicos requiere de una ADN polimerasa con
actividad de desplazamiento de cadena y cuatro cebadores especialmente diseados para
reconocer seis secuencias distintas. Esto garantiza alta especi cidad para la ampli cacin. Varias
alternativas de ampli cacin isotrmica de cidos nucleicos se han desarrollado para la identi
cacin de virus, bacterias, micoplasmas, protozoos, hongos y levaduras. Ventajas de ampli cacin
isotrmica de cidos nucleicos son capacidad de ampli car cidos nucleicos bajo condiciones
isotrmicas (60-65 C); posibilidad de lectura y semicuanti cacin a simple vista y de cuanti
cacin con un turbidmetro; altas sensibilidad y especi cidad y, en general, capacidad diagnstica;
rapidez, bajo costo y facilidad de aplicacin; tolera los componentes de los medios de cultivo y las
sustancias biolgicas. Entre las desventajas estn que la baja concentracin de ADN molde
disminuye la e cacia del reconocimiento de los cebadores; la observacin de la turbidez fue
menos sensible que la visualizacin de los productos en gel de agarosa teidos con bromuro de
etidio y es crtica la prevencin de la contaminacin. (MD.UIS. 2008;21(3):158-75).Palabras clave:
Ampli cacin isotrmica. Malaria. Plasmodium. Diagnstico.
VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LAMP
Pueden sealarse las ventajas y desventajas de LAMP, varias de las cuales han
sidorecientemente sealadas por Snounou, un investigador del Museo de Historia Natural de Pars
(Francia), sin nexos con los promotores de LAMP
- Ventajas
1. Alta capacidad diagnstica: en varios estudios realizados el mtodo LAMP ha sido altamente
sensible, especfico y extremadamente rpido en el diagnstico molecular de infecciones. La
tcnica es altamente especfica para la secuencia de inters, lo cual es atribuible al reconocimiento
de la secuencia blanco en seis sitios independientes con cuatro cebadores
2. Amplificacin isotrmica: una caracterstica de LAMP es su capacidad de amplificar cidos
nucleicos bajo condiciones isotrmicas a temperaturas entre 60 y 65C. La eficacia de la
amplificacin del mtodo LAMP es extremadamente alta debido en parte a su naturaleza
isotrmica, pues no se pierde tiempo para realizar el cambio trmico y la reaccin se puede
conducir en la temperatura ptima para el funcionamiento de la enzima

. Esta caracterstica exige solo un bloque de calentamiento o bao mara
3. Rapidez, bajo costo y facilidad de aplicacin: LAMP no requiere de la extraccin de ADN que
desperdicia tiempo y aumenta los costos, tampoco utiliza equipos sofisticados como el
termociclador. Las reacciones de amplificacin de LAMP se realizan entre 35 y 60 minutos. La
amplificacin mxima ocurre en menos de una hora. No requiere desnaturalizacin. Adems, el
molde de ADN se prepara por tratamiento directo con calor constante de las muestras de sangre
21,61,62,64
4. Inspeccin visual y cuantificacin: uno de los hechos atractivos de la prueba LAMP es su
capacidad para generar una gran cantidad de precipitado blanco de pirofosfato de magnesio en
una reaccin positiva 52,63,65
5. A medida que la reaccin de LAMP progresa, los iones de pirofosfato del producto se unen a los
iones de magnesio y forman un precipitado blanco de pirofosfato de magnesio. arroyo mi, morales
gp, sosa pa, carmona-fonseca j, maestre a MD. UIS. 2008;21:158-75 170
Por lo tanto, la turbidez causada en el tubo de reaccin determina el punto final del proceso de
amplificacin, permitiendo la visualizacin de los resultados positivos a simple vista 61
Alternativamente, el tubo con el producto de la reaccin de LAMP puede ser visualizado con una
fuente de luz ultravioleta (UV), aadiendo un colorante de fluorescencia en la mezcla de la
reaccin. Se ha observado que la deteccin visual de la fluorescencia es concordante con la
deteccin de la turbidez en tiempo real de la prueba. Adems, debido a que la turbidez es
proporcional a la cantidad de DNA amplificado, es posible hacer una cuantificacin de los
productos
6. Menor inhibicin: los inhibidores en sangre pueden afectar seriamente la amplificacin del ADN
en los anlisis por PCR. No se sabe, sin embargo, por qu estos inhibidores de PCR tienen poco
impacto en las reacciones de LAMP; se sospecha que la ADN polimerasa Bst usada en las
reacciones de LAMP es ms resistente. Se ha informado que LAMP tolera mejor que la PCR los
componentes de los medios de cultivo y las sustancias biolgicas.
7. Puede usar muestra de sangre fresca o almacenada en papel de filtro, siendo esto ltimo una
gran ventaja sobre la gota gruesa y una enorme facilidad para el trabajo de campo con centenares
de muestras captadas en pocas horas, pero esto implica que la preparacin del molde se prolonga
por horas.
Desventajas
1. La baja concentracin de ADN molde disminuye la eficacia del reconocimiento de los cebadores,
lo cual puede causar retraso en el tiempo del umbral de deteccin.
2. Aunque LAMP es un mtodo eficaz en la amplificacin de ADN viral, la observacin de la
turbidez fue menos sensible que la visualizacin de los productos en gel de agarosa y teidos con
bromuro de etidio. Sin embargo, en comparacin con la electroforesis en gel de agarosa, la prueba
de turbidez permite una reduccin en el tiempo de operacin y disminuye los riesgos de
contaminacin. Aunque recientemente se observ que el suero puede tener un ligero efecto
inhibidor en las reacciones de LAMP, una pequea cantidad de ADN se detect directamente en el
suero humano utilizando este mtodo. No obstante se necesita un estudio ms a fondo para
determinar si LAMP sera til para la deteccin del ADN viral en otras muestras clnicas tales como
clulas mononucleares de sangre perifrica y suero.
3. Es crtica la prevencin de la contaminacin.
4. Debe sealarse que los reactivos qumicos necesarios en la gota gruesa pueden ser enviados,
almacenados y transportados a temperatura ambiente, mientras que los de LAMP (ADN
polimerasa, oligonucletidos, etc.) deben mantenerse a -20 C, lo que obligara al uso de
congeladores cuando se est en el campo. Snounou seala estas otras ventajas/desventajas de
LAMP:
La automatizacin de LAMP puede ser muy til en estudios epidemiolgicos, porque se pueden
procesar las muestras en lotes, pero no en los hospitales, donde se requiere un diagnstico
individual en el momento del ingreso.
En reas de alta endemia, la elevada sensibilidad de LAMP puede resultar contraproducente,
debido a que una proporcin variable de personas alberga infecciones inaparentes.
La cuantificacin de parsitos con LAMP exige costosos turbidmetros.
LAMP puede aplicarse para evaluar el efecto de medidas de control, sobre todo si llega a
desarrollarse para detectar ADN plasmodial en muestras de saliva, como lo hace la PCR agregado.
LAMP debera ser ideal para estudios de transmisin con anlisis de vectores, donde un gran
nmero de mosquitos debe ser evaluado, y que ha sido un gran impedimento.