ESTUDIO DEL EFECTO ANTIMICROBIANO DEL ACEITE ESENCIAL DE
Minthostachys mollis COMBINADO CON INACTIVACIN TRMICA,
SOBRE CEPAS DE Listeria monocytogenes y Bacillus cereus.
DIANA DEL PILAR GIZA PREZ LINA MARA RINCN PRIETO
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Bogot, D.C. Octubre de 2007 ESTUDIO DEL EFECTO ANTIMICROBIANO DEL ACEITE ESENCIAL DE Minthostachys mollis COMBINADO CON INACTIVACIN TRMICA, SOBRE CEPAS DE Listeria monocytogenes y Bacillus cereus.
DIANA DEL PILAR GIZA PREZ LINA MARA RINCN PRIETO
TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial para optar el ttulo de:
MICROBILOGO INDUSTRIAL
ANA KARINA CARRASCAL. Directora
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Bogot, D.C. Octubre de 2007 Artculo 23 de la Resolucin No 13 de Julio de 1946
La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velar porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral catlica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia. ESTUDIO DEL EFECTO ANTIMICROBIANO DEL ACEITE ESENCIAL DE Minthostachys mollis COMBINADO CON INACTIVACIN TRMICA, SOBRE CEPAS DE Listeria monocytogenes y Bacillus cereus.
DIANA DEL PILAR GIZA PREZ LINA MARA RINCN PRIETO
APROBADO
_______________________________ ANA KARINA CARRASCAL CAMACHO. MSc Directora
_________________ __________________ NADENKA MELO ADRIANA PEZ Jurado Jurado ESTUDIO DEL EFECTO ANTIMICROBIANO DEL ACEITE ESENCIAL DE Minthostachys mollis COMBINADO CON INACTIVACIN TRMICA, SOBRE CEPAS DE Listeria monocytogenes y Bacillus cereus.
DIANA DEL PILAR GIZA PREZ LINA MARA RINCN PRIETO
APROBADO
______________________ ____________________ ANGELA UMAA MUOZ JANETH ARIAS PALACIOS BIOLOGA PhD MICROBILOGA MSc. Decana Acadmica Director de Carrera AGRADECIMIENTOS
A la Dra. Ana Karina Carrascal por su direccin, apoyo y oportunidades que nos brind para complementar los conocimientos en la realizacin de este trabajo.
A Luz Marina Melgarejo por su oportuna colaboracin.
A Nathalia Chica por su paciencia, optimismo y gran ayuda.
A Fabin Torres por su valiosa asesora.
A Aura Marina Pedroza por su contribucin en el anlisis estadstico.
A Inesita y al personal de lavado y esterilizacin por su paciencia y colaboracin. A Dios, por iluminarme y acompaarme en todos mis proyectos A mi mam, por ser mi amiga, por tanto amor y por estar siempre ah A mi pap por sus consejos y apoyo A Yiya, por compartir tantas cosas A mis tos y primos por su ayuda y apoyo incondicional A Luz Amanda por ser tan especial A Diana, por su amistad y por vivir conmigo la gran experiencia de iniciar y culminar este trabajo.
Lina Mara.
A Dios, por darme la sabidura, fuerza y paciencia en la culminacin de este trabajo y de esta etapa de mi vida. A mi mam y mi pap por esa confianza que depositaron en m, por ser mis amigos y por darme todo su apoyo y amor. A mi hermano por desearme lo mejor. A Luis Gabriel Rivera Mora por ese amor y compaa incondicionales. A mis familiares y amigos por su inters. A Lina, por su amistad, por su comprensin y por hacer posible la finalizacin de este trabajo.
Diana del Pilar.
1 TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIN ........................................................................................... 3 2. MARCO TERICO ......................................................................................... 5 2.1 Enfermedades transmitidas por alimentos ................................................ 5 2.1.1 Mtodos de prevencin de enfermedades transmitidas por alimentos . 8 2.2 Tratamiento trmico .................................................................................. 8 2.2.1 Esterilizacin comercial ......................................................................... 9 2.2.2 Pasteurizacin ..................................................................................... 10 2.2.3 Causas de la muerte trmica y mecanismo de termorresistencia ........ 11 2.2.4 Valores D y Z ....................................................................................... 12 2.2.5 Factores que influyen sobre la determinacin de la termorresistencia. 13 2.2.6 Las conservas y el tratamiento trmico ................................................ 13 2.2.7 Transmisin del calor en el alimento envasado ................................... 14 2.3 Productos de plantas como agentes antimicrobianos ............................ 15 2.3.1 Principales compuestos antimicrobianos derivados de plantas ........... 16 2.3.2 Mtodos para evaluar la actividad antimicrobiana de aceites esenciales ...................................................................................................................... 18 2.3.2.1 Mtodo de difusin en agar .............................................................. 19 2.3.2.2 Mtodo de dilucin ............................................................................ 19 2.4 Minthostachys mollis ............................................................................... 20 2.5 Listeria monocytogenes .......................................................................... 23 2.5.1 Generalidades ..................................................................................... 23 2.5.2 Termorresistencia de L.monocytogenes .............................................. 24 2.6 Bacillus cereus ........................................................................................ 25 2.6.1 Generalidades ..................................................................................... 25 2.6.2 Termoresistencia de Bacillus cereus ................................................... 25 3. JUSTIFICACIN .......................................................................................... 28 4. OBJETIVOS ................................................................................................. 29 4.1 Objetivo general ...................................................................................... 29 4.2 Objetivos especficos .............................................................................. 29 5. MATERIALES Y MTODOS ........................................................................ 30 2 5.1. Obtencin de cepas ............................................................................... 30 5.2 Elaboracin del banco de clulas primario (BCP) ................................... 30 5.3 Curvas de crecimiento ............................................................................ 30 5.4 Evaluacin de la termorresistencia ......................................................... 32 5.4.1 Elaboracin de curvas de inactivacin trmica .................................... 32 5.4.2 Elaboracin de la salsa y evaluacin de termorresistencia en salsa. .. 32 5.5 Obtencin de la planta ............................................................................ 33 5.5.1 Obtencin del aceite esencial de Minthostachys mollis ....................... 33 5.6 Evaluacin de la actividad antimicrobiana. ............................................. 33 5.6.1 Mtodo difusin en agar con disco para bacterias ............................... 33 5.6.1.1. Preparacin del inculo ................................................................... 33 6. RESULTADOS Y DISCUSIN ..................................................................... 35 6.1 Prueba de pureza y viabilidad de los bancos de clulas. ........................ 35 6.2 Cintica de crecimiento de Listeria monocytogenes y Bacillus cereus. .. 37 6.3 Elaboracin de la conserva ..................................................................... 41 6.4 Evaluacin de la termorresistencia de L. monocytogenes y B. cereus (en caldo BHI y sobre alimento) .......................................................................... 43 6.4.1 Inactivacin trmica de L. monocytogenes .......................................... 43 6.4.2 Inactivacin trmica de Bacillus cereus ............................................... 46 6.5 Extraccin del aceite esencial de Minthostachys mollis y evaluacin de la actividad antimicrobiana ................................................................................... ...................................................................................................................... 51 7. RECOMENDACIONES ................................................................................ 59 8. CONCLUSIONES ......................................................................................... 59 9. REFERENCIAS ............................................................................................ 60 Recursos electrnicos .................................................................................. 71
3 1. INTRODUCCIN
La mayora de las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA), son de origen microbiano, siendo uno de los problemas con mayor impacto en el mundo. Debido a que estas enfermedades se adquieren por el consumo de alimentos y/o agua contaminados, representan un gran riesgo para la poblacin en general.
De acuerdo con lo anterior, es importante considerar la existencia de microorganismos de carcter patgeno que son los principales responsables de dichas enfermedades y la aparicin de graves intoxicaciones alimentarias. Algunos de los microorganismos que se han asociado a las ETA son Listeria monocytogenes y Bacillus cereus, ya que han tenido gran impacto en salud pblica. L. monocytogenes, tiene mayor trascendencia ya que el consumo de este microorganismo, puede generar tasas de mortalidad altas (30 %). (Vzquez et al, 2001). Por otra parte, B. cereus tiene un efecto mayor en cuanto a la cantidad de personas que afecta, porque no tiene grupos blanco especficos, generando tasas de morbilidad altas (ICMSF, 2000).
Por lo anterior, la presencia de estos microorganismos en los alimentos conduce a buscar alternativas de inhibicin y eliminacin con una mayor posibilidad de aplicacin como pueden ser las sustancias naturales, y al mismo tiempo fusionarlas con mtodos convencionales como el tratamiento trmico con altas temperaturas.
El estudio de la inactivacin trmica es importante pues es uno de los mtodos ms aplicables, con una efectividad comprobada en el control y prevencin de la transmisin de estas enfermedades, al mismo tiempo puede reemplazar otros mtodos ms complejos como la irradiacin, almacenamiento a bajas temperaturas, conservantes qumicos, entre otros. No obstante el tratamiento a temperaturas altas modifica el valor nutricional de los alimentos, lo que explica 4 la tendencia actual a utilizar sustancias antimicrobianas debido a su conocido efecto microbicida.
De acuerdo con esto, es importante resaltar que el estudio de sustancias de origen natural tales como extractos y aceites vegetales se ha llevado a cabo para evaluar su efecto antimicrobiano, fungicida, insecticida y plaguicida.
Algunas especies vegetales tales como Minthostachys mollis se han reportado como poseedoras de caractersticas antimicrobianas, antifngicas y fitoteraputicas, las cuales la hacen una especie promisoria para su uso en actividades farmacuticas, control de plagas en el sector agrcola y la preservacin de los alimentos para evitar la proliferacin de microorganismos causantes de enfermedades. Esto conlleva a la realizacin de una investigacin con el propsito de evaluar la actividad bactericida del aceite esencial extrado de M. mollis sobre dos microorganismos causantes de enfermedades transmitidas por alimentos como L. monocytogenes y B. cereus. Lo anterior debido a que M. mollis ha sido utilizada en Colombia como condimento para alimentos, por lo que podra utilizarse como antimicrobiano en la industria de alimentos.
Por lo descrito anteriormente, se pretende llevar a cabo la obtencin del aceite esencial de M. mollis por medio de una tcnica de hidrodestilacin, para su posterior evaluacin mediante un protocolo donde se evaluar el aceite en una prueba in Vitro determinando la actividad antimicrobiana frente a los microorganismos mencionados anteriormente; luego probarlo en un producto inoculado y al mismo tiempo alternar este protocolo con un mtodo ms convencional como el tratamiento trmico.
5 2. MARCO TERICO
2.1 Enfermedades transmitidas por alimentos
La enfermedad transmitida por alimentos (ETA) ha sido definida por la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) como una enfermedad de carcter infeccioso o txico causada por, o que se cree que es causada por, el consumo de alimentos o de agua (Adams, 1997). Las ETA pueden manifestarse a travs de: Infecciones transmitidas por alimentos: son enfermedades que resultan de la ingestin de alimentos que contienen microorganismos perjudiciales vivos. Por ejemplo: salmonelosis, hepatitis viral tipo A y toxoplasmosis (www.panalimentos.org).
Intoxicaciones causadas por alimentos: ocurren cuando las toxinas o venenos de bacterias u hongos estn presentes en el alimento ingerido. Estas toxinas generalmente no poseen olor o sabor y son capaces de causar enfermedades despus que el microorganismo es eliminado. Algunas toxinas pueden estar presentes de manera natural en el alimento, como en el caso de ciertos hongos y animales como el pez globo. Ejemplos: botulismo, intoxicacin estafiloccica o por toxinas producidas por hongos (www.panalimentos.org).
Toxi-infeccin causada por alimentos: es una enfermedad que resulta de la ingestin de alimentos con una cierta cantidad de microorganismos causantes de enfermedades, los cuales son capaces de producir o liberar toxinas una vez que son ingeridos. Ejemplos: clera (www.panalimentos.org)
6 Las enfermedades causadas por el consumo de alimentos contaminados tienen un amplio impacto en la salud pblica y en la economa en todo el mundo (Gandhi y Chikindas. 2007). Entre los factores asociados a estos cambios globales se pueden sealar el crecimiento de la poblacin, la pobreza, la urbanizacin en los pases subdesarrollados, el comercio internacional de alimentos para humanos y animales as como tambin la aparicin de nuevos agentes productores de ETA o nuevas mutantes con una mayor patogenicidad. Otros factores importantes en cuanto a la manipulacin incorrecta de los alimentos que contribuyen a los brotes producidos por estos se muestran a continuacin en la figura 1 (McCabe-Sellers y Beattie. 2004). La temperatura inadecuada es el principal factor reportado que contribuye a la transmisin de enfermedades producidas por alimentos (Olsen, et al, 2000).
Figura 1. Factores que contribuyen a los brotes producidos por los alimentos a partir de 1993 - 1997 Fuente: McCabe-Sellers y Beattie. 2004 7 Por esta y otras razones en pases latinoamericanos, donde estos problemas se intensifican desde 1989, la Organizacin Panamericana de la Salud (OPS) ha estado trabajando con sus Estados Miembros para formar la capacidad nacional de vigilancia de ETA. Las debilidades todava persisten en muchos pases en la vigilancia epidemiolgica: notificacin de enfermedades, deteccin e investigacin de los brotes y el anlisis de datos para la toma de decisiones en las polticas y programas. Es por consiguiente difcil evaluar adecuadamente la situacin de las ETA en la regin latinoamericana (www.aam.org.ar). En el caso particular de Colombia y de la capital del pas, las enfermedades transmitidas por alimentos constituyen un grave problema de salud pblica (www.comunidadandina.org), pues se ha demostrado un incremento en los ltimos aos. Entre 1991 y 1998 se han reportado 21443 casos individuales de ETA. En cuanto al reporte de brotes de las ETA, ha mostrado un leve incremento desde 1998 hasta el ao 2000. Para 1998 fueron reportados por el Sistema Alerta Accin un total de 28 brotes de ETA, y para los siguientes dos aos un total de 35 y 37 brotes, con rangos de variacin de dos a cuatrocientas personas afectadas (http://www.saludcapital.gov.co). Para el 2007 se notificaron al sistema nacional de vigilancia 1594 casos de enfermedades transmitidas por alimentos, lo que representa una disminucin del 22.65 % con respecto al mismo periodo del ao anterior en el cual se notificaron 2061 casos. Hasta el tercer periodo epidemiolgico del 2007, se present el mayor nmero de casos, debido a la ocurrencia de cuatro brotes, uno en el Municipio de Soledad (Atlntico) que aport 199 casos, otro en el municipio de Tena (Cundinamarca) que aport 69 casos, otro en Maicao (La Guajira) que aport 53 casos y otro en el municipio de Chinchin (Caldas) que aport 48 casos de los 469 notificados en esa semana.
De las 36 Unidades Notificadoras Departamentales y Distritales, el 80.55% notific casos de ETAs al SIVIGILA: La Secretara de Salud de Atlntico notific el 14.49 %, siendo el mayor notificador, seguida de Bogot D.C con el 8.59 %, Cundinamarca con el 7.15 %, Sucre con el 6.34, Caldas con el 5.90 %, Antioquia con 5.83 %, La Guajira con el 5.58 %, Crdoba con el 4.33 %, Bolvar 8 con el 4.27 %, Magdalena con el 4.20%, Boyac con el 4.14 % y en menor porcentaje: Santander, Quindo, Meta, Valle, Huila, Vichada, Arauca, Cesar, Casanare, Nario, Choc, Cauca, Putumayo, Amazonas, Barranquilla, Risaralda, Norte de Santander, Cartagena. No notificaron casos de ETA: Caquet, Guaina, Guaviare, San Andrs, Santa Marta, Tolima y Vaups. Por lo anterior es necesario que la comunidad en general tenga y maneje algunos elementos mnimos que le permita prevenir estas enfermedades. (ttp://www.ins.gov.co).
2.1.1 Mtodos de prevencin de enfermedades transmitidas por alimentos
Se han utilizado diversos procesos que tienen como fin evitar la proliferacin microbiana en los alimentos, evitando as la aparicin de ETA. Dentro de los mtodos de control ms utilizados se encuentran el tratamiento trmico (pasteurizacin, esterilizacin), irradiacin (radiacin UV), almacenamiento a bajas temperaturas (congelacin, refrigeracin), conservantes qumicos (nitritos), conservacin por medio de sustancias naturales que poseen actividad antimicrobiana, tales como los aceites esenciales derivados de plantas, entre otros (Adams, 1997).
2.2 Tratamiento trmico
Desde hace varias dcadas, el tratamiento de conservacin por calor, ha sido la tecnologa ms utilizada para la conservacin de alimentos. A travs de los aos, se ha conseguido la elaboracin de alimentos microbiolgicamente seguros y con baja actividad enzimtica (Torres, 2007).
El objetivo primordial de un tratamiento trmico consiste en la destruccin de microorganismos capaces de multiplicarse en el producto a la temperatura prevista de distribucin o de poner en peligro la salud del consumidor. Para un nmero cada vez mayor de productos, el tratamiento trmico representa 9 solamente una parte del proceso de conservacin, y suele aplicarse en combinacin con otros procesos. Actualmente, el tratamiento trmico es uno de los tratamientos que hacen posible la existencia de productos sanos de larga vida comercial. El tratamiento trmico permite que las conservas se puedan almacenar a temperatura ambiente garantizando su seguridad (Rees, 1994). Las formas vegetativas de bacterias, levaduras y hongos se destruyen casi instantneamente a 100C y normalmente no constituyen ningn problema en el tratamiento trmico de las conservas, pero las esporas de ciertas especies bacterianas son extraordinariamente resistentes al calor y para su destruccin se necesita exponerlas, durante periodos prolongados de tiempo a altas temperaturas. La velocidad de destruccin es funcin del tiempo y la temperatura y varia con las diferentes especies; permaneciendo constantes los dems factores, la destruccin es tanto mas rpida cuanto ms alta sea la temperatura. Por ello, las condiciones letales para un microorganismo no pueden expresarse diciendo que muere a tal temperatura, si no que es preciso sealar un tiempo de exposicin a una temperatura determinada. (Herson, 1980).
Los dos mtodos mas utilizados hoy en da para la conservacin de alimentos son la esterilizacin y la pasteurizacin (Torres, 2007).
2.2.1 Esterilizacin comercial
La esterilizacin comercial es un tratamiento de conservacin por calor que tiene como objetivo inactivar la totalidad de microorganismos patgenos y alteradores, y de enzimas presentes en el alimento permitiendo prolongar la vida til del producto en condiciones microbiolgicamente seguras a temperatura ambiente. Por lo general este tratamiento se denomina tambin HTST (high temperature-short time) o UHT (ultra high temperature) que supone aplicar temperaturas de proceso entre 100-120 C durante un periodo corto de tiempo (2-5 s) (Torres 2007). 10 La esterilizacin, como mtodo de conservacin se aplica con el fin de evitar la entrada de microorganismos y de oxgeno. El objetivo de la conserva, cuyo punto principal es la esterilizacin comercial, es destruir todos los microorganismos patgenos que puedan existir en el producto y prevenir el desarrollo de aquellos que puedan causar deterioro (Paltrinieri y Figuerola, 1993). La esterilizacin evita que sobrevivan los organismos patgenos o productores de enfermedades cuya existencia en el alimento y su multiplicacin acelerada durante el almacenamiento, producira serios daos a la salud de los consumidores. Los microorganismos se destruyen por el calor, pero la temperatura necesaria para destruirlos vara. Muchas bacterias pueden existir en dos formas, vegetativa o de menor resistencia a las temperaturas, y esporulada, o de mayor resistencia. Los microorganismos esporulados son los ms difciles de destruir mediante tratamientos trmicos, de manera que si el tratamiento es eficiente con ellos lo ser con mayor razn con aquellos microorganismos ms termosensibles (Paltrinieri y Figuerola, 1993).
2.2.2 Pasteurizacin
La pasteurizacin es una de las ms antiguas tcnicas sabidas para la preservacin de alimentos, basado en la degradacin trmica parcial de microorganismos y en la desnaturalizacin de enzimas que presentan un riesgo potencial para los alimentos. Los procesos industriales de la pasteurizacin tienen que asegurar la prolongacin del curso de la vida del alimento, mientras que por otra parte la calidad del producto debe ser preservada. La realizacin de ambos propsitos depende de las condiciones del proceso que aseguran el curso adecuado de la temperatura durante el proceso, donde est la consideracin del perfil de temperatura dentro del producto de gran importancia (Plazl, 2006).
11 2.2.3 Causas de la muerte trmica y mecanismo de termorresistencia
Estudios realizados por algunos autores reportan diferentes aspectos de la lesin trmica y recuperacin de formas vegetativas. Estos autores concluyen que los datos que relacionan la estabilidad trmica de los ribosomas con la mxima temperatura de crecimiento indican que el RNA ribosmico juega un papel clave. Estudios recientes han demostrado que las alteraciones del DNA de las bacterias despus de su choque trmico, son debidas posiblemente a la accin de las nucleasas nativas que se liberan o activan con tratamientos trmicos suaves. La lesin de la membrana citoplasmtica que da lugar a una salida de los componentes celulares tambin se ha sealado como una causa que lleva a la incapacidad de recuperarse de la lesin trmica de las formas vegetativas. (Herson y Hulland, 1980).
Durante el desarrollo de las esporas aumenta la termorresistencia de los microorganismos. Se han avanzado una serie de teoras en torno a la diferencia entre las clulas vegetativas y las esporas. Una de esas teoras es la deshidratacin protoplasmtica y la corteza contrctil y la otra teora es la que implica el papel del cido dipicolnico (DPA). Se ha descrito que la termorresistencia esporular es debida a que una gran porcin de su contenido acuoso se encuentra en forma no disponible para participar en la coagulacin de la protena celular. La termorresistencia aumenta de forma gradual a medida que la concentracin de agua del entorno disminuye. La gran resistencia de ciertas esporas en medios acuosos exige que la cubierta esporular tenga una permeabilidad acuosa muy baja, lo que es difcil por la permeabilidad de los materiales orgnicos. Por esta razn, otros autores postularon la corteza contrctil, segn la cual la corteza de la espora se mantiene en un estado seco ejerciendo presin hidrosttica a continuacin de la contraccin. Murrel y Warth lo interpretaron como apoyo a que la contraccin de la corteza esporular estaba relacionada con la termorresistencia; sugirieron que en el mecanismo de contraccin poda estar implicada la significativa relacin entre cociente Mg/Ca y termorresistencia (Herson y Hulland, 1980). 12 Por otro lado Powell y Starng comprobaron que la sal clcica del DPA constituye hasta 15% del peso seco de la espora, pero no de las formas vegetativas. Despus de la germinacin se libera esta sustancia con perdida de termorresistencia. Otras teoras apoyan la explicacin que se basa en la deshidratacin osmtica del protoplasma por la corteza que lo rodea, que es expansible e impermeable a los cationes multivalentes. Las condiciones ms rigurosas exigidas para la destruccin de las esporas por calor seco son probablemente necesarias para los efectos deshidratantes suplementarios y la temperatura mayor que la necesaria puede lesionar el DNA de la espora. (Herson y Hulland, 1980).
2.2.4 Valores D y Z
Para establecer la reduccin en el nmero de microorganismos se requiere conocer el nmero inicial de microorganismos presentes en el alimento y someter los productos a diferentes mtodos de eliminacin. La grfica que representa el logaritmo del nmero de clulas que permanecen vivas, en una suspensin bacteriana o esporular, en funcin del tiempo de exposicin, a una temperatura constante, se le conoce como curva de supervivencia trmica (Herson y Hulland, 1980). En el caso de la inactivacin trmica como es el secado (calor-seco) y coccin (calor-hmedo), la mortalidad de los microorganismos necesita ser determinada estimando el valor total de la destruccin (valor F 0 ). La destruccin de microorganismos por calor es uno de los objetivos en el secado y la coccin. Estimar los valores F 0 en las condiciones especificas de proceso, es importante para conocer los valores D y Z. El valor D es el tiempo de reduccin decimal (h), indica el tiempo requerido para matar al 90% de poblacin bacteriana a una temperatura especfica. Otros autores resaltan que es el tiempo requerido para una reduccin unidad log 10 en el nmero de microorganismos a una temperatura del sistema (James, 2006). Valor Z, es la constante de resistencia trmica (C), es la medida del incremento de temperatura requerida para causar una reduccin del 90% en el 13 tiempo de reduccin decimal, se puede calcular si la inactivacin trmica de las pruebas se realiza con diferentes temperaturas (James, 2006). Estos dos valores ofrecen la base para calcular el tiempo en los procesos del sector alimenticio. (Rahmana, 2004).
2.2.5 Factores que influyen sobre la determinacin de la termorresistencia.
Por otra parte, la disponibilidad del agua tiene tambin un gran impacto en la transferencia del calor a los microorganismos. La influencia de la actividad de agua en los microorganismos es compleja, combinando los factores intrnsecos (el potencial nutritivo, el pH, y los compuestos antimicrobianos como el SO 2 , nitratos, y nitritos) y factores extrnsecos (temperatura, oxgeno, tratamientos qumicos, e irradiacin), que varan en funcin de las clases de alimentos y de microorganismos. Los estudios han demostrado que la resistencia trmica de microorganismos aumenta mientras que su contenido en agua disminuye y ese nivel ptimo de la resistencia ocurre entre aw = 0.20 y 0.50, dependiendo del microorganismo estudiado (Larochea et al, 2005).
Con independencia de las influencias evidentes del medio de suspensin, pH, actividad de agua, concentraciones de sal, etc. El factor ms importante a tener en cuenta en un estudio de termorresistencia es la velocidad y el mecanismo de transferencia de calor. La penetracin de calor es ms lenta en alimentos ms viscosos que en los tampones o en agua (Rees, 1994).
2.2.6 Las conservas y el tratamiento trmico
Las conservas son productos que se mantienen durante largo tiempo contenidos en recipientes (de metal, vidrio o material flexible) hermticamente cerrados. La capacidad de conservacin se logra con preferencia mediante tratamiento trmico, cuya accin consiste en reducir, destruir o frenar el notable desarrollo de los microorganismos presentes en las materias primas 14 conservadas (Sielaff, 2000). Durante el proceso es necesario, conservar las cualidades organolpticas y nutritivas (Hersom y Hulland, 1980).
Para alcanzar la deseada capacidad de conservacin resultan determinantes la temperatura utilizada y el tiempo de actuacin de sta. Los mtodos ms importantes de conservacin son la pasteurizacin y la esterilizacin. En ellos, la temperatura y el tiempo de actuacin son distintos. En la pasteurizacin se suelen aplicar temperaturas inferiores a 100C y no se logran destruir las esporas de los gneros Bacillus y Clostridium, pero si se garantiza la muerte de los microorganismos vegetativos. La esterilizacin se realiza con temperaturas superiores a 100C, con lo cual se logra la eliminacin de las esporas de los gneros mencionados (Sielaff, 2000).
2.2.7 Transmisin del calor en el alimento envasado
La velocidad con que se difunde el calor en el producto, depende decisivamente de la composicin de ste. Los principales factores de influencia son la estructura, densidad, proporcin entre componentes slidos y lquidos, viscosidad y tamao de los trozos o partculas. Atendiendo al mecanismo de transmisin del calor, los contenidos de las conservas pueden clasificarse as: 1. Productos en los que el calor se transmite por conveccin sin obstculos. Entre ellos se cuentan por ejemplo, la leche condensada sin azcar y determinadas salsas y sopas. 2. Productos calentados por conduccin, como el jamn cocido y embutidos escaldados. 3. Productos calentados simultneamente por conduccin y conveccin. En este grupo se incluyen la mayora de los productos crnicos y preparados de pescado, fruta y verduras (Sielaff, 2000).
15 2.3 Productos de plantas como agentes antimicrobianos
Las sustancias esenciales naturales, se han utilizado desde pocas antiguas, como sustancias aromticas y como preservantes. Los aceites esenciales cubren un amplio espectro de actividades tales como efectos farmacolgicos, antiinflamatorios, antioxidantes y anticancergenos. Otros son biocidas contra una amplia gama de organismos como bacterias, hongos, virus, protozoos, insectos y plantas. Tambin se ha estudiado la importancia de estos aceites debido a su disponibilidad, a los pocos efectos secundarios o a la toxicidad que puedan causar, as como la mejor biodegrabilidad comparado con antibiticos y preservativos disponibles (Kalemba, 2003). Por todas estas propiedades, se ha evaluado el control que pueden ejercer estos compuestos contra microorganismos patgenos en alimentos, y por tanto, la posibilidad de ser utilizados como un mtodo de eliminacin.
Muchas hierbas y especias han sido usadas durante siglos para proporcionar sabores diferentes a los alimentos y stas pueden presentar tambin actividad antimicrobiana (Ultee et al, 2002). Los compuestos responsables de esta actividad son a menudo fracciones del aceite esencial, las cuales consisten principalmente en compuestos fenlicos (Conner, 1993). Los aceites esenciales de plantas y sus componentes que presentan actividad antimicrobiana (Akgul y Kivanc, 1988), tienen gran aplicacin para el control del crecimiento de patgenos de alimentos por lo que se utilizan como mtodo de preservacin (Hao et al, 1998). Se ha reportado que la actividad antimicrobiana se deriva de terpenoides y compuestos fenlicos en los aceites (Yamazaki et al, 2003).
Las plantas producen una gran cantidad de compuestos secundarios como proteccin contra ataques microbianos e insectos. De hecho muchos de stos compuestos han sido usados en forma pura o extractos vegetales como alimento o aplicaciones mdicas en humanos (Wallace, 2004). 16 Los aceites esenciales comnmente se concentran en una regin particular como hojas, corteza o frutos; y cuando esto ocurre en diferentes rganos en la misma planta, frecuentemente su composicin es diferente (Oussalah et al, 2005). Aunque comnmente se piensa que son derivados de hierbas y especias, estn presentes hasta cierto punto en muchas plantas con un papel protector contra el ataque de bacterias, hongos o insectos. stos comprenden principalmente monoterpenos, hidrocarburos cclicos y su alcohol, aldehdo o derivados esteres.
Recientemente, por ejemplo, se han demostrado los efectos positivos contra bacterias patgenas (Wallace, 2004). Se ha comprobado que los aceites de Cinnamomum osmophloeum poseen actividad antimicrobiana frente a Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Salmonella spp y Vibrio parahemolyticus, donde el cinamaldehdo es el principal componente de la mezcla (Chang et al, 2001). E.coli O157:H7 es inhibido por el aceite del organo (Elgayyar et al, 2001), de la hierbabuena (Imai et al, 2001) y aceites esenciales de otras plantas (Marino et al, 2001). Helicobacter pylori es altamente sensible al aceite de la menta verde (Imai et al, 2001).
2.3.1 Principales compuestos antimicrobianos derivados de plantas
Las plantas tienen una capacidad casi ilimitada para sintetizar sustancias aromticas, siendo la mayora fenoles o sus derivados oxgeno sustitudos. En general son metabolitos secundarios (es decir, que no tienen un papel esencial en el metabolismo de las plantas) (Walton et al, 1999), de los cuales por lo menos el 10% se han aislado. En muchos casos, estas sustancias sirven a la planta como mecanismos de defensa contra el ataque de microorganismos, insectos y herbvoros. Algunos como los terpenoides, proporcionan a la planta sus olores, otros (quinonas y taninos) son responsables del pigmento de la planta (Murphy, 1999).
17 Dentro de los compuestos presentes en los extractos vegetales que poseen actividad antimicrobiana, se pueden mencionar el timol, el carvacrol, o el eugenol; algunos autores como Conner en 1993, reportaron la alta actividad antimicrobiana de stos compuestos en forma pura.
Con respecto al carvacrol, se ha visto que se encuentra presente en aceites esenciales de organo (60% a 70% de carvacrol) y tomillo (45% de carvacrol). La inhibicin del crecimiento de muchos patgenos por el carvacrol, ha sido reportada en varios artculos, sin embargo no se ha definido el mecanismo de accin de ste. Usando B. cereus, un esporoformador patgeno en alimentos, como organismo modelo, se ha demostrado que la exposicin de las clulas vegetativas a concentraciones de carvacrol mayores a 1 mM, conduce a una extensin de la fase de latencia, una tasa baja de crecimiento mximo especfico y una densidad final de poblacin baja. Tambin se ha visto que a concentraciones por encima de 1 mM, la viabilidad de B. cereus decrece exponencialmente. Al mismo tiempo hay un incremento en la fluidez de la membrana y salida de protones e iones potasio, conduciendo a una disminucin en el gradiente de pH a travs de la membrana citoplasmtica, un colapso en el potencial de membrana e inhibicin de la sntesis de ATP. Finalmente estos eventos, son seguidos por la muerte celular (Ultee et al, 2002).
Por otra parte, el timol es un ismero del carvacrol que se ha visto implicado en la desintegracin de la membrana externa y en el incremento de la permeabilidad de la membrana citoplasmtica al ATP en clulas de Escherichia coli y Salmonella thyphimurium. El timol y el cimol (precursor biosinttico del timol) son ejemplos de preservativos naturales que han sido reportados por tener efectos inhibitorios sobre bacterias y hongos (Delgado et al, 2003).
Otros de los compuestos derivados de plantas que poseen actividad antimicrobiana son los fenlicos y polifenoles dentro de los cuales se encuentran: quinonas; flavonas, flavonoides y flavonoles; taninos; y cumarinas. 18 Otros son los terpenoides y aceites esenciales, los alcaloides, lecitinas y polipptidos, entre otros (Murphy, 1999).
2.3.2 Mtodos para evaluar la actividad antimicrobiana de aceites esenciales
Para la evaluacin antimicrobiana de aceites esenciales, se aplican generalmente mtodos convencionales probados con capacidades antibiticas. Hay dos tcnicas bsicas usadas para la valoracin de ambas actividades, antibacteriales y antimicticas de los aceites esenciales: 1. El mtodo de difusin en agar (pozo o disco de papel) y 2. El mtodo de dilucin (agar o caldo lquido). Las pruebas y evaluacin de la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales son difciles debido a su volatilidad, insolubilidad en agua y complejidad (Kalemba y Kunicka, 2003). Los aceites esenciales son de naturaleza hidrofbica y de gran viscosidad. Estas caractersticas pueden reducir la capacidad de la dilucin o pueden causar distribucin desigual del aceite a travs del medio, an si se usa un agente correcto disgregante o solubilizante. Se tiene que comprobar si las concentraciones aplicadas del emulsor o del solvente no afectan el crecimiento y la diferenciacin de los microorganismos de prueba (Kalemba y Kunicka, 2003). Los cultivos de microorganismos se realizan en medios lquidos, bajo condiciones fsicas ptimas para las especies individuales. Los microorganismos tienen que alcanzar una fase apropiada del crecimiento, y un nmero especificado de clulas tiene que ser utilizado para la prueba (Kalemba y Kunicka, 2003).
19 2.3.2.1 Mtodo de difusin en agar
El mtodo permite estimar el grado de inhibicin del crecimiento de los microorganismos y sus cambios morfolgicos de una manera simple. En las cajas de Petri con agar se inocula el microorganismo de prueba; existen dos mtodos posibles para la incorporacin del aceite esencial que son: en un disco de papel (Omer et al, 1998.) o en un pozo hecho en medio del agar (Lis- Balchin et al, 1998).
El aceite esencial no se usa a menudo en forma pura, generalmente se utilizan sus soluciones. Se preparan en cajas de Petri, soluciones del aceite esencial en diferentes concentraciones y los discos de papel son sometidos a inmersin. Las placas se almacenan durante algn tiempo para permitir que todos los componentes del aceite esencial se difundan dentro del agar, despus se incuban. La eficacia del aceite esencial es demostrada por tamao de la zona de inhibicin del crecimiento del microorganismo alrededor del disco y se expresa generalmente como el dimetro de esta zona (milmetros o centmetros) (Kalemba, 2003).
2.3.2.2 Mtodo de dilucin
El mtodo de dilucin en serie en agar se utiliza para bacterias y hongos y su modificacin con caldo lquido se usa solo para hongos. Los cultivos de agar se realizan en cajas de Petri o en tubos, mientras que los cultivos lquidos se realizan en frascos cnicos con un volumen de 100 ml de medio. Para el caldo lquido en frascos cnicos, el ndice de crecimiento inhibitorio se calcula (% de los cambios en la biomasa del hongo comparando con el cultivo control) (Kalemba y Kunicka, 2003).
Los resultados se pueden presentar en dos maneras: *El ndice de inhibicin de crecimiento definido como la proporcin porcentual para el cultivo de crecimiento de control sin aceite esencial. 20 * La concentracin mnima inhibitoria (MIC) o la mxima dilucin inhibitoria (MID). La restriccin en el crecimiento de los microorganismos (anlisis de la actividad bacteriosttica y fungisttica) o la concentracin mnima letal (MLC) (anlisis de la actividad bactericida y fungicida) (Kalemba, 2003).
La actividad de aceites esenciales contra hongos puede ser tambin investigada comprobando la inhibicin de la esporulacin (Akgl et al, 1988) y productividad de la toxina. La concentracin mnima inhibitoria se define como la concentracin ms baja del aceite esencial en el caldo, dando por resultado la carencia de los cambios visibles del crecimiento del microorganismo (Kalemba, 2003).
Para estimar la actividad letal del aceite esencial, los microorganismos se transfieren del caldo lquido o al agar donde no se observa crecimiento en un nuevo medio. La concentracin ms baja del aceite esencial que da por resultado la inhibicin total del crecimiento, se reconoce como la concentracin mortal mnima, MCB para las bacterias (concentracin mnima bactericida) y MCF para los hongos (mnima concentracin fungicida). A veces MCL (concentracin mnima letal) se define como la concentracin resultante dando por resultado una reduccin del >99.9% del nmero de microorganismos en el inculo (Kalemba, 2003).
2.4 Minthostachys mollis
Una especie promisoria por sus aceites esenciales es Minthostachys mollis (Lamiaceae), planta nativa de la cordillera de los Andes desde Venezuela hasta Bolivia, con amplio rango altitudinal (1000-3400 m). Es un subarbusto aromtico de hasta 50 cm de altura, leoso hacia la base, con hojas ovadas y pubescentes e inflorescencias axilares en cimas (Alkire et al, 1994) (Figura 2). En Colombia sta se encuentra en las tres cordilleras y la Sierra Nevada de Santa Marta (Chica-Balaguera et al, 2006).
21
Figura 2. Fotografa de Minthostachys mollis Fuente: Autores
M. mollis es conocida como mua en el Per, peperina en Argentina y organo en Colombia, y es utilizada en medicina popular para tratar los clicos estomacales y ciertos trastornos gripales (White, 1985; Acero Coral y Rive, 1994; Beltrn y Cedillo, 1994). El uso ms conocido tiene que ver con la preservacin de la papa en condiciones de almacenamiento; se ha sealado que los campesinos de la sierra peruana la han utilizado desde hace muchos aos con este fin, igualmente ha tenido uso como condimento y preservativo de alimentos. En Colombia es utilizada en forma similar por los campesinos del altiplano cundiboyacense. De otro lado, Raman y Booth (1987) encontraron que posee propiedades repelentes que controlan la polilla de la papa (Phthorimaea operculella); adems segn Aliaga y Feldeheim (1985) reduce el brotamiento y dao de este tubrculo al ser almacenado en cmaras que contengan esta planta. En algunos lugares de Colombia la emplean como repelente contra las pulgas y podra igualmente utilizarse para el control del gorgojo del frjol, Acanthoscelide obtectus (Chica-Balaguera et al, 2006).
22 Diferentes estudios de la composicin qumica del aceite esencial de Minthostachys han reportado los compuestos carvacrol , pulegona, mentona, isomentona, -pineno y limoneno, mentol en cantidades relativas que varan desde 9.3% hasta 65.8% (Figura 3)
Figura 3. Algunos de los componentes de Minthostachys mollis determinada por Chica, et al 2006, con su respectiva estructura. Fuente: (Kalemba y Kunicka, 2003)
23 2.5 Listeria monocytogenes
2.5.1 Generalidades
Listeria monocytogenes es un bacilo Gram positivo, aerobio, psicrtrofo, halo tolerante, no mvil, no esporulado, este microorganismo se ha aislado de muchos alimentos, tales como carnes y productos crnicos, quesos blandos, helados, verduras y hortalizas y alimentos de origen marino (ICMSF, 2000). L. monocytogenes es un microorganismo que no era considerado como un importante patgeno transmitido a travs de los alimentos hasta hace relativamente poco tiempo y, en consecuencia, no haba recibido mucha atencin por parte de la industria alimentaria (Bell et al, 2000); sin embargo actualmente L. monocytogenes es un microorganismo zoontico emergente en la industria de alimentos (Torres et al, 2004), es un contaminante ambiental ampliamente distribuido cuyo medio primario para la transmisin al hombre es a travs de la contaminacin de los alimentos en cualquier punto de la cadena alimentaria, desde el origen hasta la cocina y ha sido reportada como la causante de la listeriosis humana, por esta razn resulta de gran inters para la salud pblica (Bell et al, 2000). Es importante enfocarse en la enfermedad producida por el consumo de alimentos contaminados con este microorganismo, pues la listeriosis humana ha sido reportada y es considerada de grave naturaleza desde la dcada de los 80, puesto que cursaba con altos ndices de mortalidad, en particular sobre los miembros mas vulnerables de la poblacin como son los nios neonatos, los ancianos y los inmunosuprimidos. (Bell, et al, 2000).
Los individuos susceptibles tienden a ser muy jvenes, mayores o mujeres embarazadas quienes son particularmente susceptibles a la listeriosis. 24
2.5.2 Termorresistencia de L.monocytogenes
L. monocytogenes ha causado una considerable preocupacin en la industria alimenticia, a funcionarios reguladores de la salud y consumidores (Selby et al, 2006), pues este microorganismo puede adaptarse para sobrevivir, crecer en una gran variedad de condiciones ambientales y causar listeriosis (Mead et al. 1999), entre stas condiciones se encuentra la capacidad de crecer sobre una amplia gama de temperaturas (2-45C), su supervivencia y crecimiento en las temperaturas de refrigeracin (2-4C) (Gandhi y Chikindas, 2007) y la mayor resistencia trmica concerniente a otros patgenos transmitidos por los alimentos (Piyasena, 1998).
Se sabe que las clulas contienen varios blancos para la accin trmica, pero ha sido propuesto por Miller, et al (2006) que la resistencia basal de calor de estos microorganismos podra ser debida a la estabilidad intrnseca de macromolculas, o sea ribosomas, cidos nucleicos, enzimas y protenas dentro de la clula y la membrana (Miller et al, 2006).
Los lpidos en las membranas de las clulas bacterianas son un fluido, su condicin cristalina y sta condicin fsica es importante para mantener la fluidez y la funcin de la membrana. Los cambios en la temperatura conducen a una alteracin en la composicin de los lpidos de la membrana para mantener la fluidez ideal requerida para la actividad enzimtica y el transporte de solutos a travs de la membrana. Una proporcin alta de cidos grasos iso y anteiso con nmeros impares de cadenas conectadas, caracterizan la membrana de la clula de Listeria (Gandhi y Chikindas. 2007).
25 2.6 Bacillus cereus
2.6.1 Generalidades
B. cereus es un microorganismo esporoformador, aerobio facultativo, Gram positivo, mvil que se puede aislar de una variedad de sitios diferentes. (Kotiranta et al, 2000). Este microorganismo es capaz de causar enfermedad transmitida por alimentos. Dos sndromes pueden ser distinguidos, un sndrome emtico y un sndrome diarreico. El sndrome emtico es causado por la toxina cereulida, un pptido estable al calor y al pH. El sndrome diarreico es causado por enterotoxinas que son producidas durante el crecimiento de B. cereus en el intestino delgado. Se presentan tres enterotoxinas capaces de causar el sndrome diarreico y pueden ser descritas como: hemolisina BL (HBL), enterotoxina no hemoltica (NHE) y citotoxina K. HBL Y NHE tienen tres componentes proteicos, mientras que la cititoxina K es una sola protena. El mecanismo del sndrome se cree que es: el consumo de comida contaminada con las esporas y/o las clulas vegetativas de B.cereus. Las esporas pasan a travs del estmago y alcanzan el intestino delgado, germinan, crecen y de este modo se producen las enterotoxinas. Las clulas vegetativas se cree que son muy susceptibles a las condiciones del estmago por lo tanto es difcil el alcance al intestino delgado. (Wijnands et al, 2006).
La forma clsica de intoxicacin alimentaria por B .cereus se conoce desde comienzos del siglo, pero es a partir de 1950 cuando se han escrito numerosos brotes atribuibles de forma definitiva a este microorganismo (ICMSF, 2000).
2.6.2 Termorresistencia de Bacillus cereus
Los microorganismos aerbicos formadores de esporas como las especies de Bacillus reciben especial atencin en produccin de alimentos, por su amplia distribucin en el ambiente. Se ha demostrado la resistencia de sus endosporas a condiciones adversas y a varias condiciones de estrs debido a 26 su aislamiento de muchos alimentos crudos y procesados alrededor del mundo (Claus y Berkeley, 1986).
Debido a la capacidad de B. cereus para producir esporas que sobreviven a altas temperaturas y crecer a bajas temperaturas (Gonzles et al, 1995), este microorganismo representa un riesgo asociado a enfermedad transmitida por alimentos (Amodio et al, 1998). Se ha reportado que la resistencia al calor de las esporas bacterianas depende de la actividad del agua del medio en el cual stas son suspendidas durante el calentamiento. La mxima termoestabilidad para esporas de muchos microorganismos fue encontrada en una actividad de agua de un rango entre 0.2 0.4 (Pfeiffer y Kessler, 1994); tambin se ha visto que la resistencia al calor de las esporas microbianas incrementa cuando se someten al calor en presencia de altas concentraciones de soluciones de sales y azcares ( Bell y De Lacy, 1984).
En general, las esporas son resistentes a los tratamientos de pasteurizacin, el tratamiento trmico en productos procesados (90-95C por 6-10 min) usualmente no es suficiente para inactivar todas las esporas (Rozier y Carlier, 1997). Es importante conocer y predecir la habilidad de las esporas para sobrevivir al tratamiento trmico y el efecto de las condiciones ambientales en su subsiguiente crecimiento en alimentos. La resistencia trmica y la duracin de la fase de germinacin despus del tratamiento trmico son dos parmetros importantes para estimar la seguridad de los alimentos (Laurent et al, 1999). Se ha reportado que las esporas Bacillus cereus son capaces de resistir una temperatura de 95C (Byrne et al, 2006; Anonymous, 2000). Adems se ha visto que las condiciones del medio como pH, naturaleza de los acidulantes y temperatura, tambin se relacionan con la resistencia al calor de las esporas (Laurent et al, 1999).
La termorresistencia de las esporas bacterianas se ve muy influenciada por factores ambientales durante: (1) la esporulacin; (2) el tratamiento trmico y (3) la recuperacin. Adems, cuanto mayor sea el nmero inicial de esporas, 27 mayor ser el tiempo necesario para llevar a cabo su destruccin (Hersom y Hulland 1980).
28 3. JUSTIFICACIN
Los alimentos pueden ser un vehculo de transmisin de microorganismos patgenos y por tanto tienen gran trascendencia en la salud de los consumidores. La adquisicin de enfermedades por el consumo de alimentos contaminados con microorganismos como L. monocytogenes y B. cereus ha hecho que cada vez ms pases reconozcan la necesidad de someter estos productos a ciertas pruebas o estudios enfocados a evaluar su inocuidad y su calidad. Actualmente se conocen muchas tcnicas para el control e inhibicin de microorganismos con el fin de preservar los alimentos, una de stas es la adicin de sustancias de origen natural que le provean al alimento calidad microbiolgica y al mismo tiempo permitan sustituir los aditivos qumicos. Igualmente el tratamiento trmico ha sido uno de los mtodos ms comnmente utilizados para la conservacin de los alimentos, especialmente en conservas. Por lo anterior, en el presente estudio se quiso evaluar la actividad antimicrobiana del extracto de Minthostachys mollis sobre L. monocytogenes y B. cereus y determinar el tiempo y temperatura necesarios para inactivar stos microorganismos mediante curvas de inactivacin tanto en medio de cultivo como directamente en el alimento, en este caso una conserva.
29 4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo general
Evaluar el efecto de la inactivacin trmica y el aceite esencial de M. mollis sobre cepas de Bacillus cereus y Listeria monocytogenes.
4.2 Objetivos especficos
Determinar el tiempo que requieren las cepas de Listeria monocytogenes y Bacillus cereus para llegar a la fase estacionaria, mediante curvas de crecimiento.
Evaluar la termorresistencia de las cepas, mediante la elaboracin de curvas de muerte trmica en caldo BHI y en conserva a base de tomate.
Obtener el aceite esencial de la planta, mediante una tcnica de hidrodestilacin.
Establecer el efecto bacteriosttico o bactericida del aceite esencial obtenido de Minthostachys mollis, sobre Listeria monocytogenes y Bacillus cereus en conservas a base de tomate.
Combinar la inactivacin trmica y el aceite esencial sobre las cepas a evaluar para realizar la prueba en conservas.
30 5. MATERIALES Y MTODOS
5.1. Obtencin de cepas
Se trabaj con las cepas 146, 142, y 196 de Listeria monocytogenes aisladas previamente de productos crnicos y la cepa de Bacillus cereus que se obtuvo de una coleccin del cepario de la Pontificia Universidad Javeriana (Correa, 2004).
5.2 Elaboracin del banco de clulas primario (BCP)
Las cepas de L. monocytogenes se recuperaron en agar Oxford. Para su posterior criopreservacin fue necesario tomar una parte de este cultivo, inocularla en 36 mL de caldo BHI adicionado con 0.5% de glucosa y llevar a incubacin durante 24 horas a 37C, 130 rpm. Finalizado este tiempo, se le adicion al cultivo 4 mL de glicerol estril y se distribuy en tubos eppendorf cada uno conteniendo un volumen de 1 mL (Molina et al, 2005). Los tubos fueron almacenados a 70C durante todo el estudio. Por otra parte la cepa de B. cereus se recuper en agar Bacillus cereus y se procedi de la misma forma para su criopreservacin sustituyendo la glucosa al 0.5% por almidn al 1% , para su posterior almacenamiento.
Durante los 6 meses del estudio se realizaron pruebas de pureza a las cepas utilizadas; esto se hizo mediante tinciones de Gram.
5.3 Curvas de crecimiento
Se realizaron curvas de crecimiento para cada una de las 3 cepas de L. monocytogenes por triplicado. Para esto se descongel un vial de cada cepa y se inocul en 20 mL caldo BHI adicionado de 0.5% de glucosa (preinculo), despus se incub a 37C con agitacin de 130 rpm durante toda la noche. Posteriormente se adicionaron los 20 mL de cultivo crecido en 200 mL del 31 mismo caldo para iniciar la curva de crecimiento, en el transcurso de este tiempo se tomaron muestras del inculo, las dos primeras horas cada 15 minutos y despus de estas dos horas cada 30 minutos, este procedimiento seguido de la medicin por duplicado de la absorbancia del inculo a 620 nm, utilizando caldo BHI estril con glucosa al 0.5% como blanco, al finalizar las 12 horas, se observ que el cultivo alcanz la fase estacionaria (Romn, 2004., Rojas, 2007).
Para B. cereus la cintica de crecimiento se obtuvo como se describe a continuacin: las curvas se llevaron a cabo durante 24 horas, bajo agitacin 130 rpm y una temperatura de 30C. Para esto fue necesario descongelar las cepas, inocularlas en 20 ml de caldo BHI con almidn al 1% y dejar en incubacin durante toda la noche, posteriormente se transfiri el cultivo a 200 mL de caldo BHI con almidn al 1%, se tomaron muestras y se hizo lectura de absorbancia y recuento en placa, (Delgado et al, 2003). Adicionalmente se realiz un modelo matemtico de la cintica de crecimiento de B. cereus en Combase predictor, para identificar las fases de crecimiento del microorganismo bajo condiciones estndar (caldo tripticasa de soya, pH 7, temperatura de 30 C, Aw de 0.997).
Durante la realizacin de las curvas de crecimiento se hicieron diluciones seriadas en agua peptonada al 0.1 % y se sembraron en profundidad las diluciones 10 -7 y 10 -8 en agar TSAYE y TS para L. monocytogenes y B. cereus respectivamente, para luego hacer recuentos.
32 5.4 Evaluacin de la termorresistencia
5.4.1 Elaboracin de curvas de inactivacin trmica
Para realizar las curvas de inactivacin trmica de B. cereus fue necesario descongelar los viales y colocarlos a crecer durante 18 horas en caldo BHI con almidn al 1% para que el cultivo alcanzara la fase estacionaria (Romn, 2004). Posteriormente, se sirvieron tubos con 10 mL de cultivo para someterlos a las temperaturas a evaluar (55C, 60C y 70C) durante 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 y 60 minutos. De cada tiempo se realizaron diluciones seriadas de 10 -1 a 10 -10
en agua peptonada al 0.1% para hacer recuentos en profundidad en agar TS por duplicado. Cada curva se realiz por triplicado para cada temperatura. (Molina et al, 2006)
Por otra parte, las curvas de L. monocytogenes se realizaron de la misma forma pero evaluando temperaturas de 52, 55 y 57C y, tiempos de 1, 2, 5, 10, 15, 20, 30 y 60 minutos. Los recuentos se realizaron de la misma manera que con las curvas de B.cereus, reemplazando el agar TS por TSAYE.
5.4.2 Elaboracin de la salsa y evaluacin de termorresistencia en salsa.
Para la elaboracin de la salsa sobre la cual se evalu la termorresistencia se pesaron diferentes cantidades de los ingredientes a utilizar (tomate, cebolla, ajo, aceite, sal, salsa de tomate y azcar) hasta obtener el sabor, color y contextura deseada. Se obtuvieron 11 conservas con caractersticas distintas y se realiz una seleccin de una de ellas con base en las caractersticas organolpticas requeridas y al mismo tiempo teniendo en cuenta las opiniones de las personas del laboratorio de microbiologa de alimentos de la Universidad Javeriana, acerca de sabor, color, etc. Despus de seleccionar la salsa, se llev a esterilizacin y se sirvieron 200 mL en frascos de vidrio; para despus inocular 20 mL del cultivo crecido previamente durante 12 y 24 horas para L.monocytogenes y B.cereus respectivamente. Luego, se procedi a evaluar 33 las mismas temperaturas usadas durante la elaboracin de las curvas ya mencionadas. Igualmente se realizaron diluciones seriadas en agua peptonada de cada tiempo y recuentos en agar TS para B. cereus y TSAYE para L. monocytogenes. Para esto fue necesario pesar 10 g de salsa e inocularlos en 90 mL de agua peptonada para seguir haciendo las diluciones (Carrascal y col. 2003)
5.5 Obtencin de la planta
Las plantas de M. mollis se recolectaron en el jardn botnico de la Universidad Nacional, Bogot, Colombia. Este procedimiento de recoleccin se realiz en compaa de un asesor experto en la obtencin de Minthostachys mollis.
5.5.1 Obtencin del aceite esencial de Minthostachys mollis
De una misma poblacin de individuos de M. mollis propagados bajo condiciones controladas, se tomaron muestras frescas (500 g) de la parte area de plantas en el mismo estado de desarrollo (vegetativo, floracin o fructificacin), se sometieron a hidrodestilacin por 2 horas. La fraccin de aceite esencial extrada se recolect en un vial, para congelarlo a -10 C y centrifugarlo a 12000 rpm durante 10 min, con el fin de separar la fase acuosa de la oleosa, y se almacenaron a 4 C para los anlisis posteriores (Chica- Balaguera et al, 2006., Tepe et al, 2005).
5.6 Evaluacin de la actividad antimicrobiana.
5.6.1 Mtodo difusin en agar con disco para bacterias
5.6.1.1. Preparacin del inculo
Para la obtencin del inculo de L. monocytogenes se realiz un pool con las cepas 146, 142 y 196, las cuales se adicionaron en 200 mL de caldo BHI con 34 glucosa al 0.5% y se llevaron a incubacin durante 12 horas a 37C, 130 rpm. En el caso de B. cereus, se inocul en 200 mL de caldo BHI adicionado con almidn al 1% y se llev a incubacin durante 18 horas a 30C, 130rpm.
Transcurrido el tiempo de incubacin para cada microorganismo, se ajust la concentracin del inculo haciendo diluciones con caldo BHI adicionado de 0.5% de glucosa o 1% de almidn para L. monocytogenes y B. cereus respectivamente, y se midi su absorbancia con el espectrofotmetro GENESYS, hasta obtener un valor de 0.25 equivalente a concentracin de 10 8 clulas/ mL (Molina et al, 2005). A partir de este inculo se realiz una siembra masiva en cajas de Petri; para L. monocytogenes se utiliz agar para antibitico adicionado de sangre al 5% y extracto de levadura al 0.5% (comunicacin personal Gallegos, 2006) y para B. cereus agar para antibitico. Las placas de Petri se utilizaron de la siguiente forma: se realizaron 5 rplicas donde una caja contena el disco impregnado con el aceite esencial puro, otra caja el disco con el control positivo (ampicilina o vancomicina para Listeria monocytogenes y Bacillus cereus respectivamente) y la ltima caja el control negativo que en este caso se utiliz un disco estril. Los discos utilizados se cortaron de papel Whatman No 3 (6mm) y se esterilizaron previamente (Bauer-Kirby, 1966; NCCLS, 2003).
5.7. Anlisis estadstico
Se realiz una comparacin de medias para establecer si exista diferencia estadsticamente significativa entre las diferentes temperaturas utilizadas para cada una de las cepas de inactivacin trmica, usando el programa SAS-9 para Windows.
35 6. RESULTADOS Y DISCUSIN
6.1 Prueba de pureza y viabilidad de los bancos de clulas.
Los resultados de pureza y viabilidad de las cepas evaluadas, se muestran en las tablas 1 y 2 respectivamente.
Tabla 1. Pruebas de pureza
FECHA DE PRUEBA 14 de Enero de 2007 20 de Febrero de 2007 17 de Marzo de 2007 10 de Abril de 2007 22 de Mayo de 2007 8 de Junio de 2007 CEPA COLORACIN DE GRAM L. monocytogenes cdigo 146 Bacilo pequeo positivo Bacilo pequeo positivo Bacilo pequeo positivo Bacilo pequeo positivo Bacilo pequeo positivo Bacilo pequeo positivo L. monocytogenes cdigo 142 Bacilo pequeo positivo Bacilo pequeo positivo Bacilo pequeo positivo Bacilo pequeo positivo Bacilo pequeo positivo Bacilo pequeo positivo L. monocytogenes cdigo 196 Bacilo pequeo positivo Bacilo pequeo positivo Bacilo pequeo positivo Bacilo pequeo positivo Bacilo pequeo positivo Bacilo pequeo positivo Bacillus cereus
Bacilo positivo esporula- do Bacilo positivo Bacilo positivo Bacilo positivo Bacilo positivo esporula- do Bacilo positivo esporula- do
Tabla 2. Pruebas de viabilidad de los BCP. CEPA
Fecha de prueba : 14 de Enero de 2007 Recuento (UFC/mL) Listeria monocytogenes cdigo 146 30x10 8
Listeria monocytogenes cdigo 142 17x10 8
Listeria monocytogenes cdigo 196 21x10 8
Bacillus cereus 12x10 9
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Figura 4. Fotografa de coloracin de Gram de L. monocytogenes. Fuente: Autores
Figura 5. Fotografa de la coloracin de Gram de B.cereus. Fuente: Autores
En la tabla 1 se muestran los resultados de las pruebas de pureza realizadas durante el estudio, en las cuales se obtuvieron las morfologas que se muestran en la figura 4, coincidiendo con lo reportado por Bell et al, 2000 para Listeria monocytogenes, que corresponden a bacilos Gram positivos en algunos casos en forma de Y o V. En el caso de la morfologa de B. cereus (figura 5), se observaron bacilos Gram positivos esporulados, coincidiendo con lo reportado por Delgado et al, 2004. Lo anterior demuestra que el mtodo de preservacin
37 utilizado en este caso, criopreservacin con glicerol, fue favorable ya que es un mtodo que protege a las bacterias durante el almacenamiento en congelacin (Lynn, 2004). El glicerol acta a nivel de membrana celular limitando el efecto de la deshidratacin celular, disminuyendo el punto de congelacin de lquidos biolgicos intra y extracelulares y promoviendo la vitrificacin en lugar de la formacin de cristales de hielo intracelulares (Rojas, 2007).
Con relacin a L. monocytogenes, podra decirse tambin que su tolerancia al fro se relaciona con la lipoprotena OppA, pues sta media el transporte de ologopptidos dentro de la pared celular, involucrndose en la crioproteccin por medio de la acumulacin de osmolitos como la glicina betana (Borezee et al, 2000). Se ha reportado que L. monocytogenes acumula glicina betana para adaptarse a bajas temperaturas (Molina et al, 2006).
Un banco de clulas es un cultivo microbiano puro, homogneo; almacenado bajo condiciones que aseguran su estabilidad gentica (Meza, 2004), evita la alteracin de las caractersticas bioqumicas, secuencia nucleotdica, estabilidad plasmtica, reconocimiento inmunolgico, actividad biolgica, caractersticas morfolgicas, retarda la muerte de los microorganismos, previene la contaminacin y mantiene la viabilidad de los microorganismos (Monroy et al, 2002). De acuerdo a lo anterior, se evidenci que las cepas de L. monocytogenes y B. cereus conservaron sus caractersticas y mantuvieron estabilidad, pues durante todo el estudio hubo poblaciones de 10 8 UFC/mL y 10 9 UFC/mL para L. monocytogenes y B. cereus respectivamente (tabla 2).
6.2 Cintica de crecimiento de L. monocytogenes y B. cereus.
Con la realizacin de las curvas de crecimiento de las 3 cepas de L. monocytogenes en estudio, se evidenci que todas alcanzaron la fase estacionaria en 12 horas (Fig. 6), lo cual corresponde con lo mencionado por Aldana, 2000 y Robinson et al, 2001. En este estudio se pretenda conseguir la fase estacionaria ya que se ha reportado que es el momento en el cual los 38 microorganismos adquieren mayor resistencia; adems en esta fase se han encontrado ciclos de divisin reductiva, incremento en la estabilidad del ARN y en la resistencia a condiciones de estrs en bacterias patgenas (Arraz et al, 2002). Segn Robinson et al, 2001, las clulas en fase exponencial son generalmente ms frgiles y susceptibles a la injuria que en la fase estacionaria.
L. monocytogenes en fase estacionaria aumenta la expresin del gen prfA, el cual proporciona un mecanismo por el que las clulas pueden responder a condiciones adversas de crecimiento. Tambin se sabe que las clulas contienen varios blancos para la accin trmica, pero ha sido propuesto por Miller et al, 2006, que la resistencia basal de calor de estos microorganismos podra ser debida a la estabilidad intrnseca de macromolculas, o sea ribosomas, cidos nucleicos, enzimas y protenas dentro de la clula y la membrana (Rojas, 2007).
39
Figura 6. Curvas de crecimiento de Listeria monocytogenes Curva crecimiento Listeria monocytogenes Cepa 142 curva 2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Tiempo (horas) A b s
a
6 2 0
n m
Curva crecimiento L i s t er i a mo n o cy t o gen es Cepa 196 0 0, 2 0, 4 0, 6 0, 8 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Ti e mpo (hora s) A b s
6 2 0
n m
Curva crecimiento Listeria monocytogenes Cepa 146 0 0,2 0,4 0,6 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Tiempo (horas) A b s
6 2 0
n m
40 Por otra parte, B. cereus alcanz su fase estacionaria en un tiempo de 18 horas como se puede observar en la figura 7. Al comparar los datos obtenidos en el programa Combase predictor, donde B. cereus en condiciones ideales alcanza la fase estacionaria en 12 horas, los resultados obtenidos en esta investigacin difieren por la siguiente razn: el medio utilizado en el programa es caldo tripticasa de soya, mientras que en este estudio se utiliz caldo BHI suplementado con almidn, lo que podra explicar el alargamiento de la fase logartmica; B. cereus posee amilasas que son activadas en presencia de almidn, y como sucedi en este estudio, la cepa inici una segunda fase (fase de diauxia), una vez terminado el consumo de glucosa en el medio, pues en este caso tena dos sustratos alternativos (Fernndez, 1999). Es posible que si en esta investigacin no se hubiera adicionado almidn al medio, la fase estacionaria se hubiera obtenido en 12 horas. La razn por la que se adicion almidn, fue simular las condiciones de las conservas donde se usan almidones modificados que mantienen la estabilidad reolgica del producto, pues este microorganismo causa deterioro en las conservas (Hersom y Hulland, 1980) el cual se evidencia por la aparicin de vetas blancas y acidez en el producto (Rees y Bettison, 1994).
Cabe resaltar que en estudios para evaluar actividad antimicrobiana o temperaturas altas, se trabaja con las cepas en fase estacionaria ya que stas corresponden a condiciones adversas y como ya se mencion, los microorganismos son ms resistentes durante la fase estacionaria (Robinson et al, 2001).
41
Figura 7. Curva de crecimiento de B. cereus
6.3 Elaboracin de la conserva
En la figura 8 se muestran los componentes, cantidades y apariencia de la salsa escogida. Como se mencion en la metodologa, se prepararon conservas con diferentes cantidades de ingredientes y se seleccion la que cumpliera con las caractersticas requeridas como viscosidad, olor, sabor, color, etc. para una conserva a base de tomate. La valoracin de la calidad sensorial puede servir para determinar los efectos del tratamiento trmico sobre los alimentos, o sobre su aceptabilidad (gustan-no gustan). Por ejemplo, el sabor se valora mediante el sentido del gusto (dulce, salado, amargo, cido) y del olfato (compuestos voltiles), y suele ser valorado en la boca a la temperatura en que el alimento (o bebida) es consumido normalmente. La textura puede ser valorada visualmente, por ejemplo la viscosidad mediante el tacto (Rees y Bettison, 1994). Otros requerimientos para salsa de tomate por ejemplo, son: su aspecto debe ser completamente homogneo; su color rojo uniforme, no deber presentar partes decoloradas o ennegrecimiento, su olor y
Curva de crecimiento Bacillus cereus 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Tiempo (horas) A b s
6 2 0
n m
42 sabor deben ser propios del producto (Quintero, 2003). Con base en esto, se seleccion la salsa nmero 10 y se descartaron las otras 10 obtenidas (anexo 3).
Figura 8. Salsa seleccionada a base de tomate.
Ingrediente Cantidad Tomate 150 g Azcar 1 g Cebolla 5 g Ajo 0.5 g Color 0.2 g Agua 20 mL Aceite 2 mL Salsa de tomate 4 g Sal 0.1 g 43 6.4 Evaluacin de la termorresistencia de L. monocytogenes y B. cereus (en caldo BHI y sobre alimento)
6.4.1 Inactivacin trmica de L. monocytogenes
Al analizar los datos obtenidos en las curvas de inactivacin trmica (figura 9) se puede observar que durante la evaluacin en las diferentes temperaturas, la cepa mostr una mayor termorresistencia cuando se someti a la temperatura en caldo BHI adicionado de 0.5% de glucosa, que lo obtenido en la evaluacin directamente sobre el alimento (conserva a base de tomate). Aunque podra esperarse una mayor termorresistencia en la conserva debido a su composicin, viscosidad, Aw que al ser menor induce una mayor termorresistencia (Hersom y Hulland, 1980); no fue as probablemente porque esta resistencia por parte de la clula pudo verse afectada por el pH del medio, pues el alimento evaluado posea un pH cido (5.0) y se ha demostrado que la mayora de microorganismos generalmente presentan su resistencia mxima a pH neutro, disminuyendo su termorresistencia a medida que el pH aumenta o disminuye (Hersom y Hulland, 1980); en este caso se pudo dar una mayor destruccin de los microorganismos debido a la acidez del medio. Se ha demostrado que el comportamiento de L. monocytogenes en los alimentos, depende de la interaccin de los efectos de temperatura, pH, tipo de acidulante, contenido de sal, Aw, as como tipos y concentraciones de aditivos presentes (Ryser, 1999), y en este estudio se present la interaccin de 3 factores: temperatura, pH y concentracin de NaCl.
Es importante sealar, que en los 2 medios evaluados (medio de cultivo y conserva) la transferencia de calor es igual, es decir, la viscosidad del fluido no afecta la transferencia de calor porque en los 2 casos se da por conveccin; con lo cual se puede afirmar que el pH del medio afect en gran medida la resistencia celular al calor.
44 Otros factores que probablemente pudieron afectar la termorresistencia en la conserva, fueron las sustancias antimicrobianas presentes en algunos de los componentes de la salsa como son la cebolla, el ajo y la sal, pues se ha reportado que estas sustancias poseen un efecto antimicrobiano. Se sabe que existen diversos productos de origen botnico los cuales poseen una actividad antimicrobiana como el ajo, organo, mostaza, canela, albahaca, tomillo, pimienta, mejorana, chile, achiota, cebolla, cilantro, t, limn y naranja (Barboza et al, 2004).
Por ejemplo el ajo es comnmente utilizado como saborizante y condimento en los alimentos. El ajo (Allium savitum), pertenece a la familia de las lilceas junto con la cebolla, el puerro y el tulipn. Es probablemente el alimento con potencial antimicrobiano mas consumido. Las propiedades medicinales del ajo han sido estudiadas desde hace ya varios siglos. Sin embargo, es hasta los aos cuarentas, que aparecen evidencias cientficas de sus propiedades antimicrobianas; Cavallito y Bailey en 1944, fueron los primeros en aislar el componente antimicrobiano del ajo a partir de bulbos frescos y lo identificaron como alicina o cido dialitiosulfnico, el cual es el responsable del olor caracterstico del ajo y la cebolla. Se ha estudiado que en concentraciones de 1:85,000, tiene actividad bactericida frente a microorganismos Gram positivos y Gram negativos (Hernndez, 2003). Adicionalmente, la presencia de sal en el alimento tambin pudo haber afectado la resistencia de las clulas al calor; pues estudios realizados por Lynn y col en 1991 en carne de cerdo, demostraron que el aumento en las concentraciones de NaCl (1-3%), result en una disminucin en la inactivacin trmica de L. monocytogenes a una temperatura de 60C.
Otro factor que pudo verse implicado fue la tasa de calentamiento. Las tasas de calentamiento rpidas o lentas, influyen en el grado de destruccin de L. monocytogenes. En estudios realizados sobre muestras de cerdo molido inoculado, se observ que un calentamiento lento (1.3C/min) permiti que una 45 mayor concentracin de L. monocytogenes sobreviviera, que en un calentamiento rpido (Doyle, 2001).
Figura 9. Curvas de inactivacin trmica de L. monocytogenes a 52, 55 y 57 C en caldo BHI y salsa.
Curvas de inactivacin trmica a 52, 55 y 57 C en caldo BHI L. monocytogenes 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Tiempo ( minutos) L o g
U F C / m L 52C 55 C 57C
Curvas inactivacin trmica a 52, 55 y 57 C en salsa L. monocytogenes 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Tiempo (minutos) L o g
U F C
/ m L 52C 55C 57C
46 En cuanto a los valores D encontrados para L. monocytogenes en caldo BHI (tabla 3) se observa que hubo una disminucin de stos a medida que la temperatura aument, lo cual puede indicar que el proceso de inactivacin tuvo los resultados esperados ya que con una mayor temperatura de exposicin como lo es 57C se observa un mayor efecto sobre la viabilidad de la cepa y por lo tanto se ver inhibido su crecimiento en un menor tiempo, esto puede compararse con el anlisis estadstico que muestra una diferencia estadsticamente significativa entre los valores de la temperaturas de 55 y 57 (tablas 4 y 5). De lo anterior, se podra concluir que el tratamiento con el que ms rpido se destruye un ciclo logartmico en la poblacin de L. monocytogenes corresponde a 57C durante 3.3 minutos.
Con respecto a los valores D obtenidos en la salsa tambin se observ una disminucin para 57C, lo que indica que a mayor temperatura sea sometida la conserva menos tiempo de exposicin necesita, sin embargo se observ que el tiempo de exposicin necesario para inactivar un ciclo logartmico a las diferentes temperaturas no vara sustancialmente, lo que podra apoyarse con el anlisis estadstico, pues se observa que no hubo una diferencia estadsticamente significativa en el tratamiento con las tres temperaturas (tablas 6 y 7), por lo cual en una industria de alimentos es suficiente un tratamiento trmico que trabaje con 52C durante 60 minutos, para erradicar la contaminacin por L. monocytogenes. Esto ratifica que la transferencia de calor se da por conveccin de calor en la salsa y en el caldo sin obstculos.
Tabla 3. Valores D para L. monocytogenes en caldo BHI y conserva
D 52 (minutos) D 55 (minutos) D 57 (minutos) Cepa CALDO SALSA CALDO SALSA CALDO SALSA L.monocytogenes 15 5 6.6 5 3.3 2 47 Tablas 4 y 5. Comparacin de medias por temperaturas en caldo BHI (L. monocytogenes).
Alfa 0.05 Grados de libertad 78 Error de la media 7.543851 Valor critico de t 1.99085 Mnima diferencia significativa 1.4882
Agrupacin t Media N Tem A 7.9107 27 57 AB 7.1070 27 52 B 5.7937 27 55 Las medias con la misma letra no son significativamente diferentes.
Tablas 6 y 7. Comparacin de medias por temperaturas en salsa (L. monocytogenes).
Alfa 0.05 Grados de libertad 78 Error de la media 7.632015 Valor critico de t 1.99085 Mnima diferencia significativa 1.4969
Agrupacin t Media N Tem A 7.2811 27 57 A 7.2374 27 52 A 7.1581 27 55 Las medias con la misma letra no son significativamente diferentes.
6.4.2 Inactivacin trmica de Bacillus cereus
De acuerdo con los resultados obtenidos en las curvas de inactivacin trmica (figura 10) y los valores D (tabla 8) de B. cereus, se observ que en las curvas de inactivacin en caldo BHI y en la conserva a base de tomate no hubo una diferencia considerable en la reduccin de las unidades logartmicas, en cuanto a los valores D presentados en caldo son iguales en las tres temperaturas evaluadas (55, 60 y 70 C), lo mismo ocurri en los valores D en la conserva; claro esta que hay que tener en cuenta que al analizar los datos obtenidos estadsticamente se encontr que hubo diferencia estadsticamente significativa 48 en el caldo BHI entre 55C y las otras dos temperaturas (60 y 70C), esta diferencia se podra explicar porque los datos para los valores D son tomados manualmente lo que podra tener un mayor porcentaje de error, por lo cual en el presente estudio se tuvo en cuenta el resultado obtenido mediante el anlisis estadstico donde se confirma que es mejor un tratamiento a 60 o 70C, para una industria de alimentos es de mayor utilidad aplicar 60C porque representa menor costo. Otro punto clave para discutir estos resultados es que el tratamiento trmico para B. cereus segn reportes, tiene una mayor efectividad durante el desarrollo de las esporas porque aumenta la termorresistencia de los microorganismos. Se han avanzado una serie de teoras en torno a la diferencia entre las clulas vegetativas y las esporas. Una de esas teoras es la que implica el papel del cido dipicolnico (DPA). Se ha descrito que la termorresistencia de la espora se debe a que una gran porcin de su contenido acuoso se encuentra en forma no disponible para participar en la coagulacin de la protena celular. La termorresistencia aumenta de forma gradual a medida que la concentracin de agua del entorno disminuye (deshidratacin del protoplasto de la espora). La gran resistencia de ciertas esporas en medios acuosos exige que la cubierta esporular tenga una permeabilidad acuosa muy baja, lo que es difcil por la permeabilidad de los materiales orgnicos, se ha demostrado que existen diferencias en termorresistencia asociados al tamao de la molcula que ejerce el pH cido (Martnez, 2007). (Herson y Hulland, 1980). Adems existen factores en el medio que afectan la resistencia trmica de las esporas, como el pH, la naturaleza de los acidulantes, la temperatura y la concentracin de NaCI (Laurent et al, 1999).
En contraste, se ha encontrado que la resistencia al calor por las esporas de muchas especies incrementa cuando son sometidas al calentamiento en presencia de soluciones con altas concentraciones de azcar y sal (Mazas, et al, 1999).
Si bien se observ una mayor termorresistencia por parte de B. cereus en la conserva, esto pudo ser por la exposicin a factores diferentes al calor, como a 49 etanol o cido, lo que puede resultar en un incremento de la termotolerancia. Igualmente, se ha reportado que en una gran variedad de bacterias, la respuesta al choque trmico incluye el aumento de una serie de protenas del choque trmico (HSPs). Estudios realizados por Derr et al, 1999 con B. subtilis, concluyeron que los genes inducidos por calor son divididos en cuatro clases diferentes segn sus mecanismos regulatorios; los genes de la clase II son inducidos por estrs trmico y otras condiciones como sal o etanol. Tambin se ha visto que la repuesta al choque trmico de las clulas de B. subtilis preexpuestas a calor suave, producen esporas ms estables al calor (Periago et al, 2002), esta preexposicin al calor puede corresponder a la temperatura de incubacin utilizada en el presente estudio antes de la exposicin a las diferentes temperaturas de evaluacin. Durante el desarrollo de las esporas aumenta la termorresistencia de los microorganismos y por lo tanto puede ser mas difcil su destruccin, por esta razn se puede decir que B. cereus tuvo valores D constantes en las diferentes temperaturas evaluadas 55, 60 y 70 C, pues estas temperaturas no son suficientes para la destruccin de las esporas, se ha reportado que la temperatura ptima para inactivar las esporas es aproximadamente 90, 95 y 100 C, (Byrne et al, 2006) y que el tratamiento trmico mnimo para productos procesados (90 -95 C por 6 10 minutos) usualmente no es suficiente para inactivar a todas las esporas (Fernndez et al, 2002). En el caso de este estudio no se utilizaron estas temperaturas tan altas, porque se pensaba combinar el efecto de la temperatura con el agente antimicrobiano (aceite de M. mollis) y adems las temperaturas altas hacen que se pierdan ms fcil los componentes por volatilizacin. Asimismo se observa en la figura 7 que las concentraciones de clulas iniciales vegetativas son altas, por lo cual se ve un decrecimiento ms rpido del minuto 1 al 5, lo que explica los bajos valores D en estos primeros minutos. Por otra parte, despus del minuto 5 se observa una tendencia ms constante lo que puede hacer pensar que la cepa empieza a esporular en este momento. Adems, debido a la naturaleza logartmica de la curva de muerte trmica, cuanto mayor sea el nmero de esporas mayor ser el tiempo necesario para llevar a cabo su destruccin (Hersom y Hulland, 1980) por esta 50 razn se evaluaron tiempos largos. Por todo lo anterior era recomendable la evaluacin de la termorresistencia de B. cereus directamente sobre las esporas sin la presencia de clulas vegetativas para dar una aproximacin mas cercana a la temperatura ptima de inactivacin.
Figura 10. Curvas de inactivacin trmica de B. cereus a 55, 60 y 70 C en caldo BHI y salsa. Curvas de inactivacin trmica a 55, 60 y 70 C en caldo BHI B.cereus 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Tiempo (minutos) L o g
U F C / m L 55 C 60 C 70 C
Curvas de inactivacin trmica a 55, 60 y 70 C en SALSA B.cereus 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Tiempo (minutos) L o g
U F C / m L 55C 60C 70C 51 Tabla 8. Valores D para B. cereus en caldo BHI y conserva
Tablas 9 y 10. Comparacin de medias por temperaturas en caldo BHI (B. cereus).
Alfa 0.05 Grados de libertad 78 Error de la media 3.464374 Valor critico de t 1.99085 Mnima diferencia significativa 0.975
Agrupacin t Media N Tem A 5.3978 27 55 B 3.6600 27 60 B 3.5100 27 70 Las medias con la misma letra no son significativamente diferentes.
Tablas 11 y 12. Comparacin de medias por temperaturas en la conserva (B. cereus).
Alfa 0.05 Grados de libertad 78 Error de la media 3.464374 Valor critico de t 1.99085 Mnima diferencia significativa 1.0085
Agrupacin t Media N Tem A 3.8026 27 55 A 3.3100 27 60 A 3.2244 27 70 Las medias con la misma letra no son significativamente diferentes.
D 55 (minutos) D 60 (minutos) D 70 (minutos) Cepa CALDO SALSA CALDO SALSA CALDO SALSA B. cereus 0.98 1 0.98 1 0.98 1 52 6.6 Extraccin del aceite esencial de Minthostachys mollis y evaluacin de la actividad antimicrobiana.
En la tabla 13 se muestra la cantidad de aceite esencial obtenido a partir de las plantas de M. mollis recolectadas.
Tabla 13. Volumen de aceite esencial obtenido
Cantidad de planta sometida a hidrodestilacin Cantidad de aceite esencial obtenida 500 g 0.5 mL
Los aceites esenciales son tradicionalmente obtenidos por destilacin con vapor o por hidrodestilacin. Estos procesos son realizados a temperaturas muy altas y pueden conducir a la degradacin de los compuestos termolbiles, resultando la formacin de compuestos indeseables y desagradables. Adems que pueden tener una composicin heterognea. Aceites de superior calidad, libres de productos degradados por hidrlisis y degradacin trmica; pueden ser aislados usando dixido de carbono supercrtico (SC-CO 2 ) como solvente (Bocevska y Sovov, 2007). Debido a que la extraccin con dixido de carbono supercrtico puede ser llevado a cabo a bajas temperaturas (cerca de 313 K), se preservan las propiedades y composicin original del aceite (Zizovic et al, 2005). La extraccin del aceite esencial de M. mollis en el presente estudio, se realiz por medio de hidrodestilacin y se obtuvo una baja cantidad a partir de la planta (Tabla 13), posiblemente porque como se mencion anteriormente, esta tcnica se hace a temperaturas muy altas y la volatilizacin de los componentes del aceite se hace mucho ms fcil. Lo anterior hizo que la evaluacin de la actividad antimicrobiana fuera limitada y dependiera de la cantidad de aceite obtenida.
En las tablas 14 y 15 se muestran los datos obtenidos de la actividad antimicrobiana del aceite esencial 53
Tabla 14. Actividad antimicrobiana del aceite esencial (zona inhibicin en mm)
Tamao del halo: Dimetro halo + disco dimetro disco (0.6mm)
Tabla 15. Susceptibilidad de las cepas evaluadas con el aceite esencial de M. mollis
Disco Listeria monocytogenes Bacillus cereus Aceite esencial puro R R Control positivo S S Control negativo R R
S: Cuando la CMI del antimicrobiano para una bacteria se puede conseguir in vivo a dosis teraputicas.
R: Cuando el microorganismo no es inhibido por las concentraciones que normalmente se pueden obtener en el sito de infeccin.
I: Cuando las bacterias no se inhiben a concentraciones normales, pero pueden inhibirse a concentraciones mas altas sin resultar txicas.
Para evidenciar la actividad antimicrobiana del aceite esencial de M. mollis, fue necesario utilizar un mtodo de difusin en agar con el aceite esencial de la 54 planta, el cual se mostr inactivo y no tuvo inhibicin como se demuestra (tabla 14) pues no hubo presencia de halos en ninguna de las cepas analizadas, mostrando la resistencia de estos microorganismos al aceite con la concentracin utilizada para L. monocytogenes y B. cereus (tabla 15).
El presente estudio no tena como objetivo determinar la composicin del aceite esencial de M. mollis, por tanto se tomaron como base datos obtenidos en estudios anteriores acerca de los principales componentes presentes. Alkire et al, 1993, reportaron que el aceite contiene principalmente mentona, pulegona, -pineno, entre otros (anexo 2). Otros estudios acerca de la composicin qumica, encontraron que el aceite contiene carvona, pulegona, mentona, isomentona, -pineno and limoneno, en cantidades relativas que varan de 9.3% a 65% (Chica et al, 2006). Sin embargo Chica et al, 2006, encontr 3 compuestos adicionales en proporciones significativas: carvacrol, acetato de carvacril y trans--cariofileno. De stos, el carvacrol ha sido muy estudiado por su potencial actividad antimicrobiana y antifngica frente a distintos microorganismos. La inhibicin del crecimiento de muchos patgenos por el carvacrol, ha sido reportada en varios artculos, sin embargo no se ha definido el mecanismo de accin de ste. Usando B. cereus, un esporoformador patgeno en alimentos, como organismo modelo, se ha demostrado que la exposicin de las clulas vegetativas a concentraciones de carvacrol mayores a 1 mM, conduce a una extensin de la fase de latencia, una tasa baja de crecimiento mximo especfico y una densidad final de poblacin baja. Tambin se ha visto que a concentraciones por encima de 1 mM, la viabilidad de B. cereus decrece exponencialmente. Al mismo tiempo hay un incremento en la fluidez de la membrana y salida de protones e iones potasio, conduciendo a una disminucin en el gradiente de pH a travs de la membrana citoplasmtica, un colapso en el potencial de membrana e inhibicin de la sntesis de ATP. Finalmente estos eventos, son seguidos por la muerte celular (Ultee et al, 2002). Por otra parte, tambin se ha reportado la actividad del carvacrol frente a L. monocytogenes. Gill y Holley, 2006 encontraron que es capaz de inhibir la 55 actividad ATPasa en la membrana celular. Tambin se ha encontrado que este tipo de agentes pueden inhibir la generacin de adenosina trifosfato de dextrosa y afectar la membrana y que concentraciones de carvacrol de 5 a 10 mM tienen actividad bactericida frente a L. monocytogenes (Gill y Holley, 2006).
Por lo anterior, posiblemente la ausencia de actividad antimicrobiana pudo ser porque en el aceite esencial obtenido en el presente estudio, no contena carvacrol dentro de sus componentes, siendo este el componente con mayor actividad antimicrobiana reportado. Es probable que lo anterior se haya dado porque la composicin qumica del aceite obtenido de la planta puede variar segn las condiciones de crecimiento, geogrficas, geolgicas, climticas y estacinales de la planta, por lo tanto sus caractersticas o propiedades antimicrobianas pueden tambin variar (Chica et al, 2006). Posiblemente la composicin del aceite obtenido por Chica et al 2006 fue diferente al obtenido en el presente estudio, pues la recoleccin de la planta se llev a cabo en diferentes lugares.
Se ha reportado que las bacterias Gram negativas son menos resistentes a la accin de los aceites que las Gram positivas como resultado de las cadenas alifticas como sustituyentes en los anillos fenlicos de los componentes del aceite (Chica et al, 2006).
Adems se ha reportado que L. monocytogenes es la menos sensible entre un nmero de bacterias evaluadas (Kalemba y Kunicka 2003). La variabilidad de la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales hacia diferentes microorganismos se puede atribuir a las diferencias cualitativas y cuantitativas en componentes de aceites individuales, mientras que algunos aceites esenciales estimulan el crecimiento de algunos microorganismos, otros son capaces de inhibirlos (Demo et al, 2005). Las caractersticas letales tambin dependen de los componentes del aceite esencial, y puede depender del nmero de las clulas del inculo. Algunos productos qumicos, como por ejemplo la pulegona, han expresado una mayor inhibicin en el crecimiento de 56 Erwinia amylovora en concentraciones ms bajas (10 3 UFC/ml), otros compuestos como la -pinona en 10 7 UFC/ml. y para otros componentes no se ha encontrado. (Kalemba y Kunicka, 2004).
Otra de las posibles razones por las que no se obtuvo un efecto antimicrobiano del aceite esencial, fue porque el mtodo utilizado para evaluar la actividad no fue el mejor; pues se ha reportado que el mtodo de difusin en agar es inadecuado para aceites esenciales, sus componentes voltiles se pueden evaporar con el solvente de dispersin durante el tiempo de incubacin, mientras que sus componentes mas solubles no se difunden bien en el agar. No obstante, es la tcnica ms comn para evaluar actividad antibacteriana y antifngica de aceites esenciales porque es mas fcil llevarla a cabo y requiere solo pequeas cantidades del aceite esencial (Kalemba and Kunicka 2003).
Debido a la difcil tarea que es la recoleccin de la planta, pues es una especie que nicamente florece en verano (Ojeda, 2004), el aceite esencial no se consider rentable para su posible uso en preservacin de alimentos, ya que Colombia es un pas donde no se presentan estaciones y por lo tanto no hay periodos largos de luz para favorecer la constante floracin de la planta. Por esta razn se dificult una segunda recoleccin de sta para evaluar nuevamente la actividad antimicrobiana, debido a las siguientes razones: los cambios climticos que se presentaron en el momento de la recoleccin afectaron la floracin de la planta en Cqueza, Cundinamarca, donde se hizo una expedicin en bsqueda del material vegetal, pues es un lugar donde comnmente florece; por otro lado se intent la bsqueda en una plaza de mercado donde se conoce como organo de monte, sin embargo tampoco fue posible debido a la misma razn del clima; por ltimo, despus de conseguir la planta en un cultivo de la Universidad Nacional, se tuvo en refrigeracin durante un tiempo de 2 das, en el cual probablemente se pudieron perder algunos componentes.
57 Adicionalmente, el uso de aceites esenciales en el sector alimenticio es a menudo limitado debido a que las dosis antimicrobianas eficaces pueden exceder niveles aceptables (Kalemba y Kunicka, 2004).
Se ha reportado en literatura que los compuestos qumicos encontrados en el aceite esencial de esta planta tales como los fenoles isomricos como el carvacrol y el timol pueden tener caractersticas antimicrobianas similares, el bajo pH de estas molculas es mas disociado e hidrofbico posiblemente conduciendo a una mejor unin a las reas hidrofbicas de las protenas (Michiels et al, 2007) y la bicapa lipdica de la membrana citoplasmtica que causan la prdida de integridad y la salida del material celular tal como iones, ATP y cidos nucleicos (Nostro et al, 2007),
Por otra parte el mentol es un es un agente antifngico y antimicrobiano y ha sido encontrado para interactuar a nivel clular con el Ca 2+ citoslico, probablemente por una liberacin de calcio almacenado intracelularmente y bloqueando el canal de calcio (Mucciarelli et al, 2001).
De los compuestos encontrados se reporta que la mentona es un inhibidor del crecimiento mientras que la pulegona es metabolizada por una mono- oxigenasa microsomal heptica para una serie de hepatotoxinas que causan cncer en el hgado y esta involucrado en muchos casos reportados de intoxicacin en humanos y animales. Adems la pulegona es considerado uno de los ms poderosos aleloqumicos y ha sido demostrado que puede ser dos veces mas txico que el cianuro de hidrgeno (HCN). (Mucciarelli et al, 2001). Los efectos de los compuestos alelopticos en la respiracin mitocrondrial pueden ser importantes en el mecanismo de accin por el cual se controla el crecimiento de maleza. (Mucciarelli et al, 2001).
Por ltimo, si bien los extractos obtenidos a partir de M. mollis han resultado eficientes frente a fitopatgenos, en este caso no tienen una actividad 58 antimicrobiana que ameriten seguir con su investigacin para uso en industria de alimentos.
7. RECOMENDACIONES
En el caso de B. cereus se debe trabajar con esporas y no con formas vegetativas, para obtener datos ms homogneos.
Al trabajar con el aceite esencial de M. mollis, es necesario que todas las plantas se encuentren en el mismo estadio del ciclo de vida para asegurar resultados mas confiables en los compuestos obtenidos; igualmente se recomienda no dejar pasar ms de un da despus de la recoleccin del material vegetal para hacer la extraccin del aceite.
59 8. CONCLUSIONES
o De acuerdo con los datos obtenidos en las curvas de crecimiento, se observ que L. monocytogenes alcanz la fase estacionaria en un tiempo de 12 horas y B. cereus en un tiempo de 18 horas.
o No hubo diferencias en cuanto a la reduccin logartmica de clulas de L.monocytogenes en las temperaturas de 52, 55 y 57 C, pero si se presentaron valores D mayores en caldo que en salsa.
o B. cereus mostr valores D mayores en salsa que en caldo, pero no se obtuvieron diferencias considerables en cuanto a la reduccin logartmica en las temperaturas de 55, 60 y 70 C .
o M. mollis no present inhibicin sobre las cepas de L.monocytogenes y de alimentos.
o Estadsticamente no se encontr diferencia entre las temperaturas utilizadas para inactivar a B. cereus en la salsa, posiblemente por condiciones de pH y estructura de la espora.
60 9. REFERENCIAS
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73 ANEXO 1
Composicin del aceite esencial de M. mollis determinada por Chica, et al 2006.