DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA

CARRERA DE INGENIERA AGROPECUARIA

Santo Domingo
Gua de prcticas de Laboratorio

Docente: I ng. Gustavo Nez Materia: Microbiologa
Prctica No. 1
1. Tema de la prctica: Normas de bioseguridad..\MANUAL DE
BI OSEGURI DAD.OMS.pdf


2. Objetivo general:


o Conocer las normas de bioseguridad en el laboratorio que
permitan reducir el riesgo de transmisin de microorganismos
de fuentes reconocidas o no reconocidas de infeccin
vinculadas a accidentes por exposicin a sangre, fluidos
corporales de animales, personas, u otros materiales
provenientes del campo.

3. Objetivos especficos:

Cumplir las medidas de prevencin de accidentes del personal
que est expuesto a sangre, lquidos biolgicos, muestras
contaminadas.
Observar la conducta a seguir frente a un accidente con
exposicin a dichos elementos.

4. Equipos:
Estufa de incubacin
Estufa de esterilizacin
Cmara de flujo laminar
Autoclave
Cocineta elctrica







5. Materiales:
Pipetas volumetricas - automticas
Probetas
Vasos de precipitados
Erlenmeyer
Matraces
Kit de diseccin
Mechero de alcohol

6. Reactivos e insumos:
Alcohol antisptico
Metanol
Etanol
Acido actico
Formol
Jabn liquido

7. Procedimiento:
Lectura comprensiva de normas de bioseguridad y estndares de laboratorio.
Introduccin al tema:
Casi nunca es fcil prologar una obra, de cualquier naturaleza que ella sea, sinfnica, potica, cientfica
pero cuando se est comprometido con la temtica que se trata y adems cuando uno sabe la seriedad con
que los autores realizaron la tarea de bsqueda bibliogrfica, discusin y amplia consulta, la actividad se
vuelve ms sencilla y se hace agradable.
La "Bioseguridad" comienza con el pensar "qu queremos con ello?", "hacia dnde vamos?",
"terminaremos alguna vez?". Seguramente esto es algo que no se terminar nunca.
Es fundamental entonces privilegiar el conocimiento de lo que podemos llamar las "Buenas Prcticas",
que pasan por el principio esencial de la Bioseguridad: 'No me contagio y no contagio".
Estas normas nos indican cmo hacer para cometer menos errores y sufrir pocos accidentes y, si ellos
ocurren, cmo debemos minimizar sus consecuencias. Es eminentemente prctica, fcil de entender y por
sobre todo, fcil de aplicar.
Esta norma debe ser considerada como el "Guin" de una pelcula donde figura claramente la esencia, el
marco referencia, qu es lo que se quiere transmitir, cmo debemos actuar.
La transformacin de un buen guin en una pelcula magistral depender siempre de Director y de los
Actores. S que entre todos son capaces de obtener un "Oscar". Felicitaciones a los actores y a los
autores.
Tienen en sus manos una muy buena gua, no olviden que todo es mejorable, y el mejor homenaje que
podemos hacer a los autores es leerla, aplicarla y, sin duda mejorarla. ..\MANUAL DE
BIOSEGURIDAD.OMS.pdf
CUESTIONARIO


1.- Cules son las normas de proteccin personal?
2.- Que caractersticas deber reunir la zona de trabajo del laboratorio?
3.- Seale los procedimientos de manipulacin y eliminacin de material y desechos contaminantes?
4.- Clasifique en el nivel que corresponda el laboratorio de prcticas docentes de Microbiologa

Firma


























DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA
CARRERA DE INGENIERA AGROPECUARIA
Santo Domingo
Gua de prcticas de Laboratorio

Docente: I ng. Gustavo Nez Materia: Microbiologa
Prctica No. 2

1. Tema de la prctica: Esterilizacin


2. Objetivo general:


o Conocer las tcnicas y principios de esterilizacin de
materiales, instrumentos y otros insumos de laboratorio.

3. Objetivos especficos:

Cumplir las recomendaciones de utilizacin de las tcnicas de
esterilizacin especficas para cada elemento. .
Operar adecuadamente los equipos destinados a la
esterilizacin en laboratorio.

4. Equipos:
Estufa de incubacin
Estufa de esterilizacin
Cmara de flujo laminar
Autoclave
Cocineta elctrica

5. Materiales:
Pipetas volumetricas - automticas
Probetas
Vasos de precipitados
Erlenmeyer


Matraces
Kit de diseccin
Mechero de alcohol

6. Reactivos e insumos:
Alcohol antisptico
Metanol
Etanol
Acido actico
Formol
Jabn liquido

7. Procedimiento:
Lectura comprensiva de tcnicas de esterilizacin.
Demostracin del uso adecuado de instrumentos, equipos e insumos de laboratorio tiles para
los procesos de esterilizacin.
Material de estudio:

En el medio ambiente existen microorganismos que estn contaminando los objetos que se
encuentran en l; as en el aire, agua y suelo existen patgenos y/o saprofitos que aprovechan
los nutrientes a su alcance para desarrollarse o permanecer sobre ellos; debido a esto es difcil
considerar algn lugar libre de microorganismos. Esta situacin crea dificultades en los estudios
microbiolgicos, pues para estudiar los microorganismos es fundamental tenerlos en cultivos
puros.

Esterilizacin:

Es la prctica que tiene por fin destruir (matar) todos los microorganismos contenidos en una
preparacin. El material tratado se denomina estril.
Desinfeccin:
Es un proceso que elimina la mayora o todos los microorganismos sobre los objetos inanimados
con la excepcin de esporos bacterianos. Se efecta por medio de agentes qumicos,
clasificados en tres categoras: Alta, intermedia y baja, segn la intensidad de su accin.
GERMICIDA:
Agente que destruye microorganismos en especial patgenos, en tejidos vivos y objetos
inanimados. Segn germen sobre el que acta, se lo denominar fungicida, virucida,
bactericida, etc..
ANTISPTICO:
Sustancia aplicada en la piel u otro tejido vivo que previene o detiene el crecimiento o la accin
de microorganismos por inhibicin de su actividad o por su destruccin.



Desinfectante: se denomina as generalmente a un agente qumico capaz de destruir
microorganismos patgenos o perjudiciales. Normalmente se utiliza este trmino para tratar
objetos inanimados; por ello se pueden utilizar concentraciones ms elevadas y por un tiempo
ms prolongado que en organismos vivos.

Se utiliza el trmino de sptico cuando un lugar u objeto posee microorganismos patgenos y
stos pueden desarrollarse; el antnimo de este trmino es asptico.

En muchas ocasiones, como por ejemplo operaciones quirrgicas, se necesitan rigurosas
condiciones de asepsia. as en ciruga el campo operatorio debe estar exento de grmenes
patgenos y de todos aquellos que por extensin son potencialmente peligrosos.

Agentes antispticos: son sustancias qumicas capaces de destruir los microorganismos o
detener su desarrollo o accin.

Bacteriosttico o Fungisttico: son productos como por ejemplo los antibiticos y fungicidas
que dependiendo de su concentracin impiden la multiplicacin de una bacteria o de un hongo.

Bactericida o Fungicida: son productos que destruyen (matan) totalmente las bacterias u hongos.

Accin antimicrobiana. Est influenciada por diversos factores, entre ellos tenemos:

a) Tipo de microorganismo. Los agentes antimicrobianos poseen un espectro de accin
determinado, as por ejemplo los estreptococos son sensibles a numerosos antibiticos, en
particular a la penicilina, eritromicina, tetraciclina, cloranfenicol, mientras que las micobacterias
no son sensibles a algunos antibiticos como la rifampicina y estreptomicina.

b) Tipo de agente antimicrobiano. El agente puede ser fsico o qumico.

c) Medio ambiente. Ejemplo pH del medio, etc.

Agentes estabilizantes y desinfectantes:

I. Agentes Fsicos

1. Temperatura

La accin de la temperatura depender del medio ambiente, estado fsico-qumico de las clulas
y del nmero de stas.

La mayora de las formas vegetativas son destruidas rpidamente a una temperatura de 100C
cuando se encuentran en solucin acuosa, mientras que en un medio deshidratado son mucho
ms resistentes. La gran mayora de las formas vegetativas bacterianas son inactivadas cuando
son sometidas a temperatura de 50-60C por 30 minutos. Las formas esporuladas son
extremadamente resistentes y requieren temperaturas superiores a los 100C y un mayor tiempo
de exposicin. El nmero de clulas presentes en el medio a esterilizar tambin es importante.




Mtodos de aplicacin:

a) Fuego directo: consiste en exponer los objetos a la llama de un mechero (asas con hilos
de platino, boca de tubos de ensayo y matraces, pipetas Pasteur, etc.).
b) Ebullicin: el material a esterilizar se coloca en recipientes con agua a ebullicin
(generalmente por 15 minutos). Se utiliza para esterilizar agujas, pinzas, jeringas, etc.
c) Autoclave: es un aparato que esteriliza a travs de calor hmedo. Es un mtodo muy
efectivo ya que el vapor de agua difunde por smosis a travs de las membranas de las esporas
coagulando su protoplasma. Se utiliza para esterilizar medios de cultivos, agua destilada, tierra,
etc. La esterilizacin puede ser a travs de vapor a presin o sin presin (vapor fluente) y la
fuente de energa calrica puede ser gas o electricidad. Generalmente se esteriliza a
temperaturas que van entre 120 -160 C por un tiempo de 5-20 minutos con presiones que
varan entre 5 y 20 p.s.i.
d) Tindalizacin: este mtodo es muy poco utilizado en microbiologa para esterilizar
lquidos o sustancias que no resisten el tratamiento a travs del autoclave debido al riesgo de
alteracin. Consiste en calentar el medio a una temperatura de 60-70C durante 30 minutos 1
hora por tres veces consecutivas pero dejando un intervalo de 24 horas entre cada vez. A las
temperaturas antes mencionadas todas las formas vegetativas son destruidas y las esporas termo
resistentes pueden germinar entre cada paso y transformarse en formas vegetativas que son
eliminadas con los tratamientos consecutivos.
e) Pasteurizacin: se aplica a ciertos productos naturales donde se desea asegurar la
conservacin momentnea de stos, sin alterar sus caractersticas organolpticas (color, olor,
sabor). La leche por ejemplo se pasteuriza a una temperatura de 90C durante 30 segundos y
luego se enfra a 10C.
Por sus caractersticas, este mtodo no se puede considerar como esterilizacin.
f) Horno Pasteur (Pupineles): la esterilizacin se efecta por calor seco a travs de
circulacin de aire caliente a temperaturas que varan entre 120 y 180C por un lapso de tiempo
de 20 minutos a 8 horas. La fuente de energa puede ser electricidad o gas. Este mtodo se
utiliza preferentemente para esterilizar material de vidrio, ejemplo: placas de Petri, tubos de
ensayo, matraces, pipetas, etc.

Es necesario sealar que por razones de dilatacin en el proceso de esterilizacin, en el caso de
pipetas volumtricas y matraces aforados, stos no deben esterilizarse a temperaturas superiores
a los 140C.

2. Radiaciones

El efecto bactericida de las radiaciones es conocido desde hace muchsimo tiempo, as por
ejemplo se sabe que la radiacin solar, o ms precisamente las radiaciones ultravioletas, son
agentes naturales de esterilizacin. A continuacin se indican los diferentes tipos:

a) Radiaciones electromagnticas: las primeras radiaciones conocidas por su actividad son
las ultravioletas; stas son las menos eficaces debido a su gran longitud de onda (se pueden
utilizar para esterilizar bolsas de polietileno o papel, adems de otros usos); la regin ms activa
de su espectro se encuentra entre los 2.600 y 2.700 ngstrom.

Los Rayos X y rayos Gama liberan una energa ms importante y debido a ello penetran
ms profundamente. Por su poder de penetracin ms intenso estas radiaciones son ms


eficientes, pero sus instalaciones son costosas. Adems, la irradiacin tiene la desventaja que no
puede localizarse en un solo objeto.
Otra desventaja es que las radiaciones ionizantes no slo destruyen los microorganismos, sino
tambin las sustancias que los rodean.

b) Radiaciones electrnicas: se logran por el efecto termoelectrnico que permite obtener
una emisin continua de electrones, adems de la aceleracin de stos, bajo el efecto de un
campo elctrico. Estos electrones lanzados a gran velocidad tienen un poder de esterilizacin
idntico a los rayos gama. Ellos se pueden dirigir a voluntad sobre el objeto a esterilizar, pero su
efecto es ms dbil que el de los rayos gama y su principal defecto es la alteracin de las
substancias orgnicas sometidas a su accin.

c) Sonidos: stos no poseen una utilidad prctica en esterilizacin; sin embargo, es
necesario sealar que los ultrasonidos poseen el poder de matar microorganismos en una
suspensin lquida liberando su contenido endocelular; de la misma manera pueden alterar las
sustancias qumicas en solucin. En microbiologa se utilizan para extraer constituyentes
endocelulares, enzimas, o para hacer preparados de pared celular bacteriana.
El ultrasonido tambin puede emplearse para limpiar grillas que se utilizan en el
microscopio electrnico.

3. Eliminacin mecnica

a) Filtracin: se utiliza para esterilizar soluciones que posean sustancias termolbiles como
por ejemplo protenas que no soportan altas temperaturas. Consiste en filtrar las soluciones a
travs de filtros que slo dejan pasar partculas ultradiminutas. Los filtros son de diversos tipos;
los primeros que se utilizaron fueron los filtros Chamberland (de porcelana); hoy da stos han
sido reemplazados por filtros Seitz (Fig. 6), de vidrio fritado (Fig. 7), Berkefeld o filtros de
diatomeas y membranas de acetato de celulosa (Fig. 8) llamados tambin filtros moleculares de
porosidad graduada.

b) Centrifugacin: normalmente la centrifugacin se realiza a una aceleracin de 5.000g y
permite separar partculas en suspensin en un medio lquido y tiene la desventaja que no se
puede aplicar a grandes cantidades de lquido; adems, no permite una eliminacin total de los
microorganismos.

II. Agentes Qumicos

No todos los agentes qumicos sirven como desinfectantes o como antispticos; algunos como
los cianuros son venenos celulares de alta toxicidad; otros como los antibiticos y sulfamidas
poseen una accin teraputica.

Su modo de accin est relacionado con:
a) Oxidacin y desnaturalizacin de las protenas: los agentes oxidantes como el H2O2 y
sus derivados halogenados, oxidan los grupos SH libres de las enzimas y los alteran
irreversiblemente.
Los metales pesados como el mercurio y sus derivados orgnicos e inorgnicos se
combinan con estos grupos SH inactivndolos.
Los alcoholes poseen una accin similar al calor coagulando las protenas.



b) Alteracin de la membrana citoplasmtica: un gran nmero de agentes bactericidas
actan directamente sobre la membrana citoplasmtica que juega un rol importante en la
permeabilidad selectiva de los nutrientes. Debido a que esta membrana no es otra cosa que una
barrera lipoproteica, los agentes liposolubles son los ms activos; tales son los compuestos
fenlicos, jabones y sobre todo los detergentes. Estos ltimos gracias a sus grupos hidrosolubles
y liposolubles se fijan sobre la membrana lipdica de la bacteria y sobre el medio acuoso
circundante. Ellos modifican y desnaturalizan la estructura de la membrana suprimiendo as sus
funciones vitales de permeabilidad.

c) Accin sobre el metabolismo: numerosas sustancias qumicas son bactericidas o
bacteriostticas por inhibicin enzimtica, as tenemos que ciertos cianuros y los fluoruros son
verdaderos venenos respiratorios inutilizables como antispticos.

Los colorantes no presentan la toxicidad antes indicada, as por ejemplo los colorantes
bsicos (azul de metileno, violeta de genciana) reaccionan con los cidos nucleicos de la
bacteria, principalmente con los ribonucleicos que estn presentes en abundancia en el
citoplasma; estas combinaciones inactivan todas las funciones de la bacteria.

Otros agentes son los mutagnicos (acridinas y sus derivados) y los quelatricos.

1. Oxidantes

a) Agua oxigenada: sta y todos los compuestos que dan origen a ella (perboratos y
persulfatos alcalinos) son antispticos eficaces.

b) Cloro y sus derivados: el cloro bajo su forma gaseosa o diversas combinaciones
qumicas, es un antisptico muy utilizado; al respecto es necesario sealar que bajo su forma
gaseosa es un producto peligroso y delicado de manejar. Sus compuestos lquidos como los
hipocloritos y cloraminas son los ms difundidos.
Todos los compuestos clorados siguen un mecanismo semejante de accin formando el cido
hipocloroso; en esta reaccin el oxgeno es liberado dando as un intenso poder oxidante que
destruye instantneamente a la mayor parte de los microorganismos que entran en contacto con
l. Las formas esporuladas son ms resistentes y para su inactivacin se necesitan dosis 100
veces ms elevadas que las normales.
La accin de estos compuestos clorados est relacionada con el pH del medio.

c) Yodo: es uno de los primeros compuestos que se utiliz como desinfectante; siendo
principalmente de accin bactericida y fungicida. Es poco soluble en agua pero fcilmente
soluble en alcohol o en soluciones acuosas de yoduro de potasio.

2. Alcoholes: el alcohol etlico en concentraciones de 50-70% es uno de los ms utilizados;
posee un efecto bactericida pero no ejerce una accin sobre las formas esporuladas. El alcohol
metlico es menos activo pero ms nocivo.
Los alcoholes superiores como los proplicos, butlicos y amlicos tienen un poder mayor pero
su baja solubilidad al agua limita su uso.




3. Metales pesados y sus sales: ciertos metales tienen un efecto bactericida, este poder ejercido a
dosis nfimas se llama oligodinmico y se puede explicar por una pobre ionizacin del metal y
por la afinidad de estos iones con las protenas celulares.
La plata bajo su forma metlica ha sido uno de los elementos ms utilizados. Las sales de
metales pesados son ms eficaces y muy utilizadas; las ms comunes son las sales de Ag, Hg,
Cu y Zn. Todas inactivan la clula precipitando las enzimas o combinndose con sus grupos -
SH; esto explica a su vez la actividad y toxicidad que ejercen tanto sobre las clulas del
hospedante como sobre las clulas bacterianas.

4. Fenoles: gracias a su grupo fenlico poseen propiedades bacteriostticas o bactericidas.
El fenol como desinfectante ha sido reemplazado por antispticos menos custicos; a pesar
de ser bactericida y fungicida es poco activo sobre las formas esporuladas y su accin puede ser
favorecida por Na o K; atenuada por la materia orgnica e inhibida en presencia de soda.
En general los fenoles se utilizan en medicina como desinfectantes y como antispticos
pulmonares e intestinales. Algunos de ellos son: fenol, hexaclorofeno, cresol-brut, timol,
resorcina, hexilresorcina.
5. Jabones y detergentes sintticos: los jabones son sales sdicas o potsicas de cidos grasos de
pesos moleculares elevados (ac. oleico, linoleico, ricinoleico) cuyo poder antisptico vara
segn las especies microbianas. Su accin mecnica reduce la fuerza de tensin superficial y
aumenta el poder humectante del agua. Los microorganismos son aprisionados por la espuma y
luego eliminados con el enjuagado.
Junto con los jabones alcalinos se han sintetizado otros compuestos de elevado poder
mojante con una accin bactericida paralela, stos son los detergentes, que se dividen en:

a) Detergentes aninicos (el grupo activo es el aninico).
b) Detergentes catinicos (poseen un grupo activo catinico; los ms importantes son los
amonios cuaternarios) entre los cuales tenemos: cloruro de alquil-dimetil-benzil-amonio,
bromuro de cetil-trimetil-amonio, bromuro de dimetil-cetil-cicloexil-amonio).
c) Detergentes no inicos (no son de inters debido a su ausencia de actividad
antimicrobiana).


6. Colorantes: la mayor parte se utilizan como antispticos de uso local y normalmente poseen
una accin selectiva ya sea sobre bacterias Gram(+) o Gram(-), as por ejemplo el cristal violeta
inhibe el crecimiento de la mayor parte de las bacterias Gram(+).
Algunos colorantes son: azul de metileno, verde de malaquita, verde brillante, violeta de
genciana.

7. Gases: A travs de este mtodo se pueden esterilizar productos inestables al calor, objetos de
plstico, locales, etc.

Tipos de gases utilizados:
a) Formaldehido: los vapores de formaldehido se pueden obtener por calentamiento de
soluciones diluidas de formaldehido o por los productos de polimerizacin de este aldehdo.
Estos vapores poseen un poder bactericida que aumenta con la temperatura y humedad; as por
ejemplo a 22C en presencia de un 60-80% de humedad, el tiempo de esterilizacin ser de
algunas horas, siendo rpidamente destruidas las formas vegetativas y ms lentamente las


formas esporuladas. Debido a la toxicidad de los vapores, stos deben evacuarse una vez
terminada la desinfeccin.
b) Oxido de etileno: posee un amplio espectro de accin con un gran poder esporicida. Su
uso est ligado a una mezcla con anhdrido carbnico o fren, ya que en su estado puro es
prcticamente inutilizable debido a su alto poder inflamable.
El xido de etileno es gaseoso a temperatura ambiente y lquido a una temperatura inferior
a 10C. Su accin en base a la temperatura le permite entrar en contacto con los productos y
objetos ms diversos y su poder penetrante asegura la esterilizacin de telas y an de ciertos
plsticos.
La utilizacin de aparatos especialmente diseados para su aplicacin, han ampliado su
campo de accin.
c) B-propiolactona: es un compuesto lquido que a temperatura ambiente emite vapores que
son bactericidas, esporicidas y fungicidas. Es 25 veces ms activo que el formol y 400 veces
ms activo que el xido de etileno. Tiene la ventaja que no es inflamable ni explosivo, posee
una accin penetrante y es de rpida eliminacin.
Se puede utilizar para esterilizar materiales quirrgicos, hilo para suturas, desinfeccin de
locales e incluso medios de cultivos.
d) Esencias voltiles (aceites esenciales): las esencias naturales tienen un poder
bacteriosttico limitado que se debe a sus compuestos fenlicos y terpnicos y tambin en
menor medida a sus alcoholes y aldehdos.

Ejercicios

- Conozca los diferentes mtodos y equipos de esterilizacin. (Dibuje)

- Prepare material de vidrio y esterilcelo en la estufa de esterilizacin.

- Prepare un medio de cultivo y utilice el autoclave para su esterilizacin.

Cuestionario

1. Describa que materiales requieren esterilizarse con calor hmedo y cuales con calor seco.
2. A que temperatura se somete
.

Firma








DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA
CARRERA DE INGENIERA AGROPECUARIA
Santo Domingo
Gua de prcticas de Laboratorio

Docente: I ng. Gustavo Nez Materia: Microbiologa
Prctica No.3

1. Tema de la prctica: Preparacin y dispensacin de medios de cultivo para
hongos y bacterias


2. Objetivo general:


o Conocer las tcnicas de preparacin, conservacin y uso de los
medios de cultivo para el crecimiento y desarrollo de
microorganismos existentes en el ambiente suelo, aire, agua,
materiales de origen vegetal, para su estudio y clasificacin.

3. Objetivos especficos:

Adiestrar al estudiante en las tcnicas de dispensacin de
medios de cultivo en platos petri, tubos de ensayo.
Preparar medios de cultivo en estado slido y lquido.
Demostrar las bondades de los medios de cultivo con
caractersticas especficas de constitucin qumica.
4. Equipos:
Estufa de incubacin
Estufa de esterilizacin
Cmara de flujo laminar
Autoclave
Cocineta elctrica

5. Materiales:
Pipetas volumetricas - automticas
Probetas
Vasos de precipitados


Erlenmeyer
Matraces
Kit de diseccin
Mechero de alcohol
Platos petri
Tubos de ensayo

6. Reactivos e insumos:
Alcohol antisptico
Medios de cultivo

7. Procedimiento:

Preparacin de un medio de cultivo
En la preparacin de un medio de cultivo, se pueden distinguir los siguientes pasos:

Extraccin de los medios nutritivos (en caso de medios naturales o mixtos).
Adicin de sustancias nutritivas (ej. glucosa) y/o de sostn (ej. agar).
Ajuste del pH.
Reparticin.
Esterilizacin.

Medios de cultivos ms comnmente utilizados
Agar agua. Se utiliza preferentemente para aislar hongos del suelo.
Agar 10 - 18 g
Agua 1000 ml (destilada, desionizada o potable).

Se agrega al agua el agar y se calienta hasta licuarlo. Se distribuye en tubos o
matraces y se esteriliza a 15 p.s.i. durante 20 minutos.

Agar-papa-dextrosa (APD). Se usa para aislar la mayora de los hongos.
Papas peladas 200,0 g
Dextrosa 12,5 g
Agar 20,0 g
Agua destilada 1.000,0 ml

Las papas peladas se hierven en 1.000 ml de agua destilada hasta que estn
cocidas. Posteriormente el jugo se filtra mediante gasa y algodn hidrfilo, se
agrega el agar y la dextrosa y se enrasa a 1.000 ml con agua destilada. Se reparte
en matraces o tubos y se esteriliza en autoclave a 15 p.s.i. por 20 minutos.

Agar-papa-dextrosa acidificado. este medio permite inhibir el desarrollo de
bacterias, pudiendo utilizarse para aislar hongos a partir de tejidos enfermos (ej.
races).


La preparacin se realiza en forma idntica al APD; salvo, que despus de
esterilizado se agregar 50 gotas de cido lctico 50% por litro de medio de cultivo.

Agar nutritivo o agar peptona. Se utiliza para aislar la mayora de las bacterias,
pudiendo tambin servir como medio para conservar microorganismos.
Extracto de carne 3 g
Peptona 10 g
Agar 18 g
Agua destilada 1.000 ml

Los ingredientes se disuelven en 500 ml de agua destilada, se lica el agar a bao
Mara, se reparte en tubos o matraces y se esteriliza a 15 p.s.i. durante 20
minutos.

Caldo nutritivo. Se emplea para el cultivo lquido de bacterias y difiere del agar
nutritivo en que se omite el agar, pudindose tambin incluir un carbohidrato (10
g de sacarosa o dextrosa).


Suplementos antibacterianos

Cloranfenicol. Antes de esterilizar agregue 0,05 g/L de cloranfenicol suspendido en
10 ml de alcohol etlico 95%; mezcle bien y esterilice a 118C durante 10 minutos.

Penicilina. Preparar una solucin stock de agua destilada estril con 60 mg
(100.000 unidades) y guardar en refrigerador. Agregar 1 ml de la solucin a 10 ml
de medio de cultivo previo a depositarlo en las placas de Petri.

Estreptomicina. Preparar una solucin stock de agua destilada estril de 750 ml
con 1 g de estreptomicina y guardar en refrigerador. Agregar 1 ml de la solucin a
cada 10 ml de medio de cultivo previo a depositarlo en la placa de Petri; la
concentracin es de 100 unidades/ml.

Firma








DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA
CARRERA DE INGENIERA AGROPECUARIA
Santo Domingo
Gua de prcticas de Laboratorio

Docente: I ng. Gustavo Nez Materia: Microbiologa
Prctica No. 4

1. Tema de la prctica: Aislamiento de microorganismos.


2. Objetivo general:

Ejercitarse en las tcnicas de aislamiento y purificacin de
microorganismos comunes del ambiente suelo, agua, aire.

3. Objetivos especficos:

Conocer la estructura de hongos comunes.
Ejercitarse en el manejo del microscopio compuesto y de
diseccin. (Estereoscopio).

4. Equipos:
Estufa de incubacin
Estufa de esterilizacin
Cmara de flujo laminar
Autoclave
Cocineta elctrica

5. Materiales:
Pan hmedo
Fruta en descomposicin
Pipetas volumetricas - automticas
Probetas
Vasos de precipitados
Erlenmeyer
Matraces


Kit de diseccin
Mechero de alcohol
Platos petri conteniendo medio de cultivo


6. Reactivos e insumos:
Alcohol antisptico
Agua destilada

7. Procedimiento:
Aislamiento de microorganismos de material vegetal enfermo.

Con la ayuda de una aguja de diseccin raspe el sitio en donde usted
visualice la presencia de hongos, o zona afectada (podrida), y pngalo en
la placa petri conteniendo medio de cultivo, con ligeros movimientos
circulatorios.
Selle el plato petri con papel parafilm.
Etiquete el aislamiento con la informacin de procedencia del material,
fecha y medio de cultivo utilizado.
Incube de forma invertida en una estufa a 28C por 48 horas

Aislamiento de microorganismos del suelo

Tome la muestra de suelo seca y tamizada y coloque en forma de grumos
en el interior de un plato petri conteniendo medio de cultivo
Incube la muestra en el interior de una estufa a 28C por 48 horas
Observe el crecimiento y desarrollo de los microorganismos

Aislamiento de microorganismos del aire

Deposito un plato petri conteniendo medio de cultivo en el rea en la que
usted quiere obtener informacin de la presencia de microorganismos.
Abra la tapa y exponga el medio de cultivo por cinco minutos al
ambiente, en el reposaran los microorganismos existentes en el rea.

Proceda a la observacin.

.

Firma






DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA
CARRERA DE INGENIERA AGROPECUARIA
Santo Domingo
Gua de prcticas de Laboratorio

Docente: I ng. Gustavo Nez Materia: Microbiologa
Prctica No. 5

1. Tema de la prctica: Observacin e identificacin de microorganismos
Aislados el ambiente suelo, agua, aire.


2. Objetivo general:

Ejercitarse en las tcnicas de observacin macroscpica y microscpica
de microorganismos comunes del ambiente suelo, agua, aire.

3. Objetivos especficos:

Conocer la estructura de hongos comunes.
Ejercitarse en el manejo del microscopio compuesto y de
diseccin. (Estereoscopio).

4. Equipos:
Microscopio estereoscopio
Microscopio compuesto
Estufa de incubacin
Estufa de esterilizacin
Cmara de flujo laminar
Autoclave
Cocineta elctrica

5. Materiales:
Placas porta objeto
Placas cubreobjeto
Vasos de precipitados
Erlenmeyer
Matraces
Kit de diseccin
Mechero de alcohol
Platos petri conteniendo medio de cultivo




6. Reactivos e insumos:
Alcohol antisptico
Agua destilada
Lactofenol

7. Procedimiento:
Observacin macroscpica

Coloque debajo del lente objetivo del microscopio estereoscopio
(diseccin), una parte del material a observar, examine cuidadosamente
acercndolo, hasta tener una buena visualizacin (60 x). Describa y dibuje
lo que observe.

Observacin microscpica

limpie la placa portaobjetos. La placa debe estar exenta de pelusas, esto lo
consigue flamendola sobre la columna de fuego del mechero bunsen.
Con el cuenta gotas coloque una gota de agua destilada, lactofenol o
colorante sobre la placa portaobjeto.
Con la ayuda de una aguja de diseccin raspe el sitio en donde usted
visualice la presencia de hongos, o zona afectada (podrida) y pngalo en la
placa con ligeros movimientos.
Coloque el cubre objeto, haciendo coincidir una arista de la placa con el
borde del agua.
Ponga la placa sobre la platina del microscopio, asegurndola mediante las
pinzas.
Proceda a la observacin.


Resultados.

Describa y dibuje lo que observe.
Realice una descripcin detallada de la clasificacin del organismo
observado y su etiologa

Cuestionario.

Seale con que lente (aumentos) hace la observacin de hongos?
Cual es la estructura de la pared celular de los hongos

Bibliografa


.

Firma


DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA
CARRERA DE INGENIERA AGROPECUARIA
Santo Domingo
Gua de prcticas de Laboratorio

Docente: I ng. Gustavo Nez Materia: Microbiologa
Prctica No. 6

1. Tema de la prctica: Control biolgico


2. Objetivo general:

Evaluar la accin antagnica de microorganismos tiles en la
produccin agropecuaria

3. Objetivos especficos:

Estudiar las caractersticas, hbitos y comportamiento de los
microorganismos antagnicos en contra de microorganismos
patgenos

4. Equipos:
Microscopio estereoscopio
Microscopio compuesto
Estufa de incubacin
Estufa de esterilizacin
Cmara de flujo laminar
Autoclave
Cocineta elctrica

5. Materiales:
Vasos de precipitados
Kit de diseccin
Mechero de alcohol
Platos petri conteniendo medio de cultivo
Sacabocado




6. Reactivos e insumos:
Alcohol antisptico
Agua destilada

7. Procedimiento:
Con la ayuda de un sacabocado #3 coloque un disco de la cepa del
microorganismo antagnico en un extremo de la caja petri, y en el
otro un disco del patgeno.











Selle el plato petri con papel parafilm
Etiquete el plato indicando el nombre del medio de cultivo utilizado,
material de precedencia, fecha.
Incube a 28C
Registre datos de crecimiento radial a partir del segundo da de
realizada la siembra
Tabule los datos
Anlisis de datos
Exposicin de resultados



Cuestionario.
Defina que es Control biolgico
Cules son los objetivos de CB.
Qu tipo de antagonismos existen en la naturaleza?

Bibliografa


.

Firma




Pa An
P


DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA
CARRERA DE INGENIERA AGROPECUARIA
Santo Domingo
Gua de prcticas de Laboratorio

Docente: I ng. Gustavo Nez Materia: Microbiologa
Prctica No. 7

1. Tema de la prctica: Aislamiento de bacterias del ambiente suelo, agua, aire.

2. Objetivo general:
o Conocer y practicar las tcnicas de aislamiento de
bacterias provenientes de ambientes diferentes.
3. Objetivos especficos:
Estudiar las caractersticas morfolgicas de los diferentes
gneros de bacterias
Conocer hbitos y comportamiento de las bacterias en
distintos medios de cultivo

4. Equipos:
Microscopio estereoscopio
Microscopio compuesto
Estufa de incubacin
Estufa de esterilizacin
Cmara de flujo laminar
Autoclave
Cocineta elctrica

5. Materiales:
Vasos de precipitados
Kit de diseccin
Mechero de alcohol
Platos petri conteniendo medio de cultivo
Sacabocado
Material vegetal enfermo


6. Reactivos e insumos:


Alcohol antisptico
Agua destilada

7. Procedimiento:
Aislamiento de bacterias de material vegetal enfermo.

Proceda a desinfectar con etanol 90% el material vegetal en estudio
Con la ayuda de un bistur extraiga parte de material vegetal enfermo y
deposite en una vaso de precipitacin conteniendo agua destilada estril,
djelo en reposo por 5 minutos.
Deposite 1 ml en el interior de una caja petri conteniendo medio de
cultivo selectivo para el crecimiento de bacterias y distribyalo en la
superficie de agar con suaves movimientos giratorios.
Selle la caja petri con papel parafilm
Etiquete la caja petri consignando la informacin referente a procedencia
del material, fecha.
Incube por 48 horas a 32C
Realice observaciones peridicas de control de contaminacin

Aislamiento de bacterias del suelo

Tome la muestra de suelo seca y tamizada y coloque en un vaso de
precipitacin, formando una solucin homognea
Djela reposar por cinco minutos, tome 1 ml de la solucin y depostela
en el interior de una caja petri conteniendo el medio de cultivo apropiado
para el crecimiento de bacterias del suelo
Incube la muestra en el interior de una estufa a 32C por 48 horas
Observe el crecimiento y desarrollo de los microorganismos

Aislamiento de bacterias del aire

Deposito un plato petri conteniendo medio de cultivo apropiado para el
crecimiento y desarrollo de bacterias en el rea en la que usted quiere
obtener informacin de la presencia de microorganismos.
Abra la tapa y exponga el medio de cultivo por cinco minutos al
ambiente.
Incube a 32C por 48 horas
Proceda a la observacin.

Cuestionario.

1. Que agrupaciones son fcilmente encontradas?
2. Defina que es colonia bacteriana.
Bibliografa


.
Firma



DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA
CARRERA DE INGENIERA AGROPECUARIA
Santo Domingo
Gua de prcticas de Laboratorio

Docente: I ng. Gustavo Nez Materia: Microbiologa
Prctica No. 8

1. Tema de la prctica: Tincin de Gram. (Hans Christian Gram)

2. Objetivo general:
o Conocer y practicar las tcnicas de preparacin y
observacin microscpica de bacterias
3. Objetivos especficos:
Estudiar las caractersticas morfolgicas de diferentes
gneros de bacterias
Determinar la reaccin Gram negativa y positiva de
bacterias.

4. Equipos:
Microscopio estereoscopio
Microscopio compuesto
Estufa de incubacin
Estufa de esterilizacin
Cmara de flujo laminar
Autoclave
Cocineta elctrica

5. Materiales:
Cultivos bacterianos
Placas porta objeto
Laminas cubre objeto
Vasos de precipitados
Kit de diseccin
Mechero de alcohol
Platos petri conteniendo medio de cultivo
Sacabocado
Asas de inoculacin
Goteros




6. Reactivos e insumos:
Alcohol antisptico
Agua destilada
Cristal violeta
Alcohol cetona
Yoduro de potasio
Safranina
Aceite de inmersin

7. Procedimiento:

Tincin simple
- Limpie bien las placas portaobjeto, eliminando la grasa y pelusas. Las grasas sern
eliminadas con xilol y las pelusas haciendo una o dos pasadas de la placa por sobre
la columna de calor del mechero.
- Frotis. Consiste en extender o repartir la suspensin de bacterias sobre la placa
portaobjeto, una vez que ha sido depositada la gota de agua-bacteria, ste extensin
se har con la ayuda de un asa o placa portaobjeto limpia, lo que permitir realizar
una mejor observacin
- Fijacin. Fije las bacterias a la placa haciendo pasar tres veces el portaobjeto en la
llama del mechero de alcohol a una altura prudencial, para no deformar las
agrupaciones bacterianas que pudieran existir.
- Tincin. emplee un solo colorante como el azul de metileno, fuscina, rojo congo,
tie la placa completamente y deje actuar el colorante por un minuto.
- Retire el colorante, enjuague y luego squela a la columna del mechero de alcohol o
por simple exposicin al aire con movimientos horizontales
- Agregue una gota de aceite de inmersin sobre el frotis y observe las bacterias al
microscopio, utilizando el lente hmedo o de inmersin.


Procedimiento:

Tincin Compuesta (Gram)

- Coloque el colorante A (violeta de genciana) por espacio de medio minuto., elimine
el exceso.
- Agregue el colorante B (solucin de yodo) por un minuto. Elimine el exceso con
leves sacudimientos de la placa o con la pisceta.
- Aada la solucin C (safranina) por 30 segundos.
- Lave la placa con agua corriente y luego squela a la columna del mechero de
alcohol, o por simple exposicin al aires con movimientos horizontales.
- Agregue una gota de aceite de inmersin sobre el frotis y observe las bacterias al
microscopio, utilizando el lente hmedo o de inmersin.

Resultados y comentario.



Observe y dibuje la forma y agrupacin bacteriana.

Cuestionario

Qu es una tincin diferencial?
Defina cual es el rol de los colorantes utilizados en la Tincin compuesta


Bibliografa


.
Firma























DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA
CARRERA DE INGENIERA AGROPECUARIA
Santo Domingo
Gua de prcticas de Laboratorio

Docente: I ng. Gustavo Nez Materia: Microbiologa
Prctica No. 9

1. Tema de la prctica: Anlisis microbiolgico de una muestra de orina, y
residuos fecales de animales

2. Objetivo general:
o Conocer y practicar las tcnicas de preparacin y anlisis
de muestras de orina y residuos fecales en animales de
granja.
Lquido excretado por los riones a travs de las vas urinarias, con el cual se eliminan
sustancias innecesarias para el organismo. Desempea un papel importante en la regulacin
del balance de lquidos y electrolitos y del equilibrio entre cidos y bases. En las personas
sanas es clara y de color amarillo. En el animal ste color no cambia.
La cantidad de orina producida diariamente es de 1 a1,5 litros, en la especie humana
(consultar en animales) valor que aumenta si se ingieren muchos lquidos y disminuye en
caso de sudoracin intensa.
3. Objetivos especficos:
- Visualizar sustancias innecesarias para el organismos y
que son expulsadas en la orina
Observar los tipos de cristales ms comunes secretados en
la orina.
4. Equipos:
Microscopio compuesto
Estufa de incubacin
Estufa de esterilizacin


5. Materiales:
Muestra de orina
Placas porta objeto
Laminas cubre objeto
Mechero de alcohol


Goteros


6. Reactivos e insumos:
Alcohol antisptico
Agua destilada
Aceite de inmersin
Solucin salina

7. Procedimiento:
Tome 40 ml de la muestra en estudio
Sumerja la tira colorimtrica de parmetros biofsicos
Registre los datos
Centrifugue la muestra colocada en un tubo de ensayo por cinco minutos a 1500
rpm
Elimine el sobrenadante y coloque el sedimento en un porta objeto
Observe el sedimento urinario al microscopio compuesto (lente 40 x -100 x)
Dibuje lo que observa


Realice el frotis de la muestra
Cubra la preparacin con solucin de cristal violeta djela reposar por un minuto
Lave con agua destilada estril
Cubra la preparacin con yodo de gram
lave con agua destilada.
Aada alcohol cetona
Elimine el exceso
Lave con agua destilada estril
Cubre con rojo congo o safranina y djelo actuar por dos minutos
Elimine el exceso, enguaje con agua destilada esteril
Seque la muestra al calor del mechero de alcohol
Observe al microscopio

Resultados y comentario.

Dibuje lo que observa.

Cuestionario.

Que sustancias son anormales en una muestra de orina
Cual es el pH normal

Bibliografa


.
Firma



DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA
CARRERA DE INGENIERA AGROPECUARIA
Santo Domingo
Gua de prcticas de Laboratorio

Docente: I ng. Gustavo Nez Materia: Microbiologa
Prctica No. 10

1. Tema de la prctica: Anlisis microbiolgico de la leche

2. Objetivo general:
o Aplicar las tcnicas de anlisis microbiolgico de
muestras de leche para su categorizacin.

3. Objetivos especficos:
- Aplicar el recuento total en una muestra de leche para
reconocer su pureza.
- Aplicar las pruebas de anden para conocer la calidad de
una muestra de leche
-
4. Equipos:
Microscopio compuesto
Estufa de incubacin
Estufa de esterilizacin


5. Materiales:
Muestra de leche
Mechero de alcohol
Asas de inoculacin
Goteros
Vasos de precipitacin
Probetas de 500 ml
Lactodensmetro
Tubos de ensayo
Termometro
Bureta de 500 ml





6. Reactivos e insumos:
Alcohol antisptico
Agua destilada
Fenolftalena
KOH
Azul de metileno

7. Procedimiento:

Determinacin de la densidad de la leche
Verter la leche por las paredes de la bureta sin hacer espuma
Colocar suavemente el lacto densmetro dentro de la bureta y dejarlo flotar
Cuando est en reposo hacer la lectura

RESULTADOS
Por cada grado centgrado sobre 15 C aumentar 0.2
Por cada grado centgrado bajo 15C disminuir 0.2
Ejemplo: el lactodensimetro indica 28 a la temperatura 25C
Correccin: 28 + (10 x 0.2) -28 + 2 = 30

Leche pura = 1.028 1.033
Leche aguada = menos de 1.028
Leche descremada = 1.0033 1.037


PRUEBA DE REDUCTASA
REDUCCIN DEL AZUL DE METILENO

INTRODUCCIN
Se basa en la observacin del cambio de color que sufre el azul de metileno. El tiempo que
requiere este cambio depende del nmero de bacterias, del consumo de oxgeno por ellas, de
la multiplicacin de dichas bacterias.
Un tiempo de reduccin corto es indice de falta de cuidado en la produccin de esa leche, uso
de utensillos mal lavados, falta de enfriamiento de la leche a temperaturas favorables para el
crecimiento de microorganismos



OBJETIVO
Determinar la presencia de microorganismos que adulteran la calidad de la leche
MATERIALES
Tubos de ensayo de 40 ml
Recipiente para muestra de leche
Incubadora a 37 C
Pipeta de 1 ml

PROCEDIMIENTO
Poner en tubos de prueba 40 ml de leche
Agregar 1 ml de solucin de azul de metileno
Mover el tubo para mezclar la leche y el colorante
Colocar en una estufa incubadora a 37C
Realizar lecturas cada hora

RESULTADOS
Realizar los controles y tomar nota de las coloraciones. Cuando se han decolorado las
dos terceras partes del tubo se considera totalmente decolorado, comparar los
resultados con la siguiente tabla:

Ms de 5 horas = muy buena
3 a 5 horas = buena
2 a 3 horas = regular
1 hora = mala
Menos de 1 hora = psima

DETERMIANCIN DE LA ACIDEZ
INTRODUCCIN

La acidez de la leche es un dato que nos indica la carga microbiana de la leche, el
cuidado en cuanto a higiene y conservacin. La leche debe estar entre 16 y 18
Dornic. En la sierra por el transporte largo tenemos que aceptar la leche de 20
Dornic.
El fermento lctico debe estar entre 70 y 90 Dornic, de lo contrario debemos
preparar un nuevo cultivo




OBJETIVO
Determinar la cantidad de microorganismos que intervienen en los procesos de
conservacin de la leche hasta su procesamiento y consumo.
MATERIALES
- Vaso de precipitacin de 50 ml
- Gotero
- Acidmetro
Pipeta de 10 ml
Solucin 1/10 normal de NaOH(Hidrxido de sodio)
Solucin indicadora de fenoltaleina 2%
bureta

PROCEDIMIENTO
Colocar 9 ml de leche en el vaso de precipitacin
Agregar 3-4 gotas de fenoltaleina
Llenar la bureta con la solucin de NaOH 1/10 normal.
Empezar a titular la leche en el vaso.
Cuando la leche toma el color rosado, la titulacinest terminada.
Debe mantenerse el color durante 10 segundos como mnimo.

RESULTADOS
Dcimas de ml de NaOH N/ 10 utilizada = acidez en grados Dornic



Bibliografa


.
Firma