ESCUELA DE MEDICINA HUMANA Biologa Celular y Molecular

Facultad de Ciencias de la Salud

CICLO: 2014 I

PRCTICA N 10

Espectrofotometra



I. COMPETENCIAS.

1.1. Identifica el equipo utilizado en espectrofotometra.
1.2. Comprende la utilidad de la espectrofotometra en mediciones
cuantitativas.
1.3. Comprende el concepto de Espectrofotometra.
1.4. Valora el papel de la espectrofotometra en el anlisis de muestras
clnicas.
1.5. Aprende el correcto uso del espectrofotmetro para medir la absorbancia
de soluciones coloreadas.


II. INTRODUCCIN.

El estudio a nivel bioqumico de cualquier biomolcula requiere la utilizacin de
tcnicas analticas que permitan su determinacin cualitativa y cuantitativa, as como
su caracterizacin fsico-qumica y biolgica. Uno de los mtodos ms sencillos,
accesibles, tiles y utilizados es la espectrofotometra, en general, y la
espectrofotometra ultravioleta-visible, en particular. Se pueden identificar y cuantificar
biomolculas en solucin y en muestras biolgicas, con el empleo de reactivos
especficos que reaccionan con el compuesto a analizar y forman un producto
coloreado que permite detectarlo en muestras complejas.
El fundamento de la espectrofotometra se debe a la capacidad de las molculas para
absorber radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro del espectro UV-visible. Las
longitudes de onda de las radiaciones que una molcula puede absorber y la eficiencia
con la que se absorben dependen de la estructura atmica y de las condiciones del
medio (pH, temperatura, fuerza inica, constante dielctrica), por lo que dicha tcnica
constituye un valioso instrumento para la determinacin y caracterizacin de
biomolculas.
FUNDAMENTACIN
Las molculas pueden absorber energa luminosa y almacenarla en forma de energa
interna. Esto permite poner en funcionamiento ciclos vitales como la fotosntesis en
plantas y bacterias. Cuando la luz (considerada como energa) es absorbida por una
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molcula se origina un salto desde un estado energtico basal o fundamental, E
1
, a un
estado de mayor energa (estado excitado), E
2
. Y slo se absorber la energa que
permita el salto al estado excitado.

Cada molcula tiene una serie de estados excitados (o bandas) que la distingue del
resto de molculas. Como consecuencia, la absorcin que a distintas longitudes de
onda presenta una molcula - esto es, su espectro de absorcin - constituye una seal
de identidad de la misma. Por ltimo, la molcula en forma excitada libera la energa
absorbida hasta el estado energtico fundamental.









En espectrofotometra el trmino luz no slo se aplica a la forma visible de radiacin
electromagntica, sino tambin a las formas UV e IR, que son invisibles. En
espectrofotometra de absorbancia se utilizan las regiones del ultravioleta (UV cercano,
de 195-400 nm) y el visible (400-780 nm).













La regin UV se define como el rango de longitudes de onda de 195 a 400 nm. Es una
regin de energa muy alta. Provoca dao al ojo humano as como quemadura comn.
Los compuestos con dobles enlaces aislados, triples enlaces, enlaces peptdicos,
sistemas aromticos, grupos carbonilos y otros heterotomos tienen su mxima
absorbancia en la regin UV, por lo que sta es muy importante para la determinacin
cualitativa y cuantitativa de compuestos orgnicos. Diversos factores - como pH,
concentracin de sal y el disolvente - que alteran la carga de las molculas, provocan
desplazamientos de los espectros UV.

Figura 1. Diagrama de niveles de energa en
una molcula. La absorcin de energa
luminosa hace que la molcula pase desde un
estado fundamental (E
1
) a otro excitado (E
2
).
Posteriormente la molcula relaja su energa
mediante distintos mecanismos (vibracin,
rotacin, etc.)
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La fuente de radiacin ultravioleta es una lmpara de deuterio. En la regin visible
apreciamos el color visible de una solucin y que corresponde a las longitudes de onda
de luz que transmite, no que absorbe. El color que absorbe es el complementario del
color que transmite. Por tanto, para realizar mediciones de absorcin es necesario
utilizar la longitud de onda en la que absorbe luz la solucin coloreada. La fuente de
radiacin visible suele ser una lmpara de tungsteno y no proporciona suficiente
energa por debajo de 320 nm.

Longitud de Onda
- (nm)
Color Color Complementario
380-435 Violeta Verde-amarillo
435-480 Azul Amarillo
480-490 Azul-verdoso Anaranjado
490-500 Verde-azulado Rojo
500-560 Verde Prpura
560-580 Verde-amarillo Violeta
580-595 Amarillo Azul
595-650 Anaranjado Azul-verdoso
650-780 Rojo Verde-azulado

Transmitancia y Absorbancia: Cuando un rayo de luz de una
determinada longitud de onda de intensidad I
o

incide
perpendicularmente sobre una disolucin de un compuesto qumico
que absorbe luz o cromforo, el compuesto absorber una parte de la
radiacin incidente (I
a
) y dejar pasar el resto (I
t
), de forma que se
cumple: I
o
= I
a
+ I
t

La Transmitancia (T) de una sustancia en solucin es la relacin entre la cantidad de
luz transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la muestra, I
t

y la
cantidad de luz que incidi sobre ella, I
o
, y se representa normalmente en tanto por
ciento: % T = I
t
/I
o

x 100. La transmitancia nos da una medida fsica de la relacin de
intensidad incidente y transmitida al pasar por la muestra. La relacin entre %T y la
concentracin no es lineal, pero asume una relacin logartmica inversa.

La absorbancia (A) es un concepto ms relacionado con la muestra puesto que nos
indica la cantidad de luz absorbida por la misma, y se define como el logaritmo de 1/T,
en consecuencia: A = log 1/T = -log T = -log I
t
/I
o

Cuando la intensidad incidente y transmitida son iguales (Io = It), la transmitancia es
del 100% e indica que la muestra no absorbe a una determinada longitud de onda, y
entonces A vale log 1 = 0. La cantidad de luz absorbida depender de la distancia que
atraviesa la luz a travs de la solucin del cromforo y de la concentracin de ste.

Espectrofotmetro UV-visible: La medicin de absorbancia de la luz por las molculas
se realiza en unos aparatos llamados espectrofotmetros. Todos constan, segn se
indica en la figura, de:
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1. Una fuente de energa radiante: lmpara de deuterio y tungsteno.
2. Un monocromador para la seleccin de radiaciones de una determinada longitud
de onda: filtros, prismas, redes de difraccin.
3. Un compartimento donde se aloja un recipiente transparente (cubetas) que
contenga la muestra. Pueden ser de vidrio, cuarzo o plstico transparente. Para
medir en UV se deben usar las de cuarzo o slice fundido, porque el vidrio no
transmite la radiacin UV.
4. Un detector de luz y un amplificador convertidor de las seales luminosas en
seales elctricas.
5. Un registrador o sistema de lectura de datos.

Desde el punto de vista operativo, el primer paso es seleccionar la fuente de luz y
longitud de onda a la que se va a realizar la medida. Hay espectrofotmetros de un
solo haz (con una sola celdilla para alojar la cubeta con la muestra) y de doble haz (con
dos celdillas para dos cubetas); en nuestro caso se trabajar con los de un solo haz,
pero con cmara para cuatro cubetas.

Se mide primero la absorbancia del disolvente (conocido como blanco) y al que se le
asigna el valor de cero mediante el ajuste del mando, de forma que la intensidad
incidente y transmitida sean iguales (I
o
= I
t
), y por tanto la absorbancia es cero. A
continuacin se pone en la celdilla la cubeta con la muestra y se lee la absorbancia de
sta.
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III. MATERIAL Y MTODOS

3.1 Materiales y equipos

3.1.1. Materiales:
A. De vidrio:
10 tubos de ensayo 13x100
01 Micropipeta 100 L.
01 Micropipeta de 1000 L.

B. Reactivos:
Azul de Metileno/Safranina 0,1 mg/ml
Agua destilada 500 ml

3.1.2. Equipos e instrumentos:
01 Espectrofotmetro nico 2100 UV-VISIBLE
Micropipetas automticas de 2-20, 100-1000 L.

3.1.3. Otros:
10 cubetas para espectrofotmetro.
03 gradillas
03 Marcadores indelebles

3.2 Procedimiento.

3.2.1. Espectrofotometra.

DETERMINACIN DE ESPECTROS DE ABSORCIN: Segn la tabla
indicada lneas abajo, determinar los espectros de absorcin de cada
una de las soluciones de colorantes (azul de metileno y safranina),
leyendo las absorbancias en cada una de las longitudes de onda del
espectrofotmetro, llevando el equipo a cero con agua destilada en
cada caso. Es decir, colocar en cubetas separadas las soluciones de
colorantes y medir las absorbancias a diferente longitud de onda ().

Azul de metileno Safranina
450
500
550
600
650

Debe indicar cul es la longitud de onda de mxima absorbancia para
cada una de las soluciones. Es decir, el mayor valor de absorbancia
obtenido para cada colorante.

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PREPARACIN DE UNA CURVA DE CALIBRACIN: Preparar 5
diluciones del colorante 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 y 1:32, utilizando agua
destilada como diluyente, como sigue:


Rotular 5 tubos de ensayo: Tubo 1=1:2, Tubo 2=1:4, Tubo 3=1:8, Tubo
4=1:16 y Tubo 5=1:32

Colocar en cada tubo 2 ml de agua destilada y agregar al tubo 1, 2 ml
de la solucin de safranina (0,1mg/ml). Mezclar.

2 ml 2 ml 2 ml 2 ml








Tubos 1 a 5, contienen 2 ml de H
2
O destilada

Del tubo 1 coger 2 ml y agregarlos al tubo 2. Mezclar.
Repetir la operacin con todos los tubos y medir las absorbancias de cada
uno en la longitud de onda seleccionada en la experiencia anterior.
Graficar una curva de absorbancia x dilucin.


IV. RESULTADOS.

V. CONCLUSIONES

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS.

4.1. Docon Navaza MC, Garca-Saavedra MJ, Vicente Garca JC. Fundamentos y
Tcnicas de Anlisis Bioqumicos. Principios de anlisis instrumental. 2 ed.
Espaa: Thompson-Paraninfo; 2005.
4.2. Macarulla J y Goi F. Bioqumica humana: curso bsico. 2 ed. Barcelona.
Revert; 2003.
4.3. Vives J y Aguilar J. Manual de tcnicas de laboratorio en Hematologa. 3
a
edicin.
Barcelona. Masson, S.A.; 2006

5 4 3
2
1
5 4 3
2
1