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DANIEL ALTINO DE JESUS

DETERMINAO DE RESDUOS DE AVERMECTINAS NO LEITE POR


CLAE-EM/EM






Dissertao apresentada ao Programa de
Ps-Graduao em Qumica, Setor de
Cincias Exatas, Universidade Federal do
Paran, como requisito parcial obteno
do grau de Mestre.

Orientador: Prof. Dr. Brs Heleno de Oliveira








CURITIBA
2007




ii





























Dedico este trabalho minha querida
e amada esposa.



iii

Agradecimentos

A minha esposa Aniele Borba Miranda pelo seu amor, carinho e compreenso;
Ao meu orientador professor Brs Heleno de Oliveira pela confiana e orientao;
A minha amiga Silvana L. Bosquiroli pelo apoio prestado no LACEN;
A minha amiga colaboradora Nanny Pereira Dias;
Ao programa de ps-graduao em Qumica da UFPR pela oportunidade da realizao deste
mestrado profissionalizante;
Ao Laboratrio Central do Estado do Paran por oferecer sua infra-estrutura e condies que
possibilitaram este trabalho;
Ao professor Patrcio G. Peralta-Zamora pelas correes e sugestes;
professora Beatriz Helena L. N. Sales Maia pelas correes e sugestes.





iv

Lista de Abreviaturas e Siglas


: Angstrom
ABA: abamectina
ABNT: Associao Brasileira de Normas Tcnicas
ANVISA: Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria
AVMs: avermectinas
C18: coluna de slica com fase reversa de octadecilsilano
CAD: gs de coliso
CEM: canal multiplicador de eltrons
CLAE: cromatografia lquida de alta eficincia
CLAE-EM: cromatografia liquida de alta eficincia com espectrmetro de massas
CLAE-EM-EM: cromatografia liquida de alta eficincia com espectrmetro de massas
triploquadrupolo
CLAE-FL : cromatografia lquida de alta eficincia com detector de fluorescncia
CLAE-UV: cromatografia lquida de alta eficincia com detector de ultra-violeta
Cps: Contagem por segundos
CUR: cortina de gs
CV: coeficiente de variao
CXP: potencial de sada da cela de coliso
Da: Daltons
DL
50
: Dose letal
DOR: Doramectina
DP: potencial de desaglomerao
DPR: desvio padro relativo
SPE: extrao em fase slida
MS1: Espectrometria de massas simples quadrupolo
MS2: Espectrometria de massas triplo quadrupolo



v

EMEA: Agncia Europia para avaliao de produtos mdicos
EP: potencial de entrada
EPR: Eprinomectina
FAO: Food and Agriculture Organization
FDA: Food and Drug Administration
FIA: injeo de fluxo
FP: potencial de focalizao
GABA: cido gama-aminobutrico
IDA: ingesto diria aceitvel
INMETRO: Instituto Nacional de Metrologia
IS: Spray de ons
IVR: ivermectina
LACEN: Laboratrio Central do Estado
LDE: Limite de deteco do equipamento
LDM: limite de deteco do mtodo
LMR: limite Mximo de Resduos
LQE: Limite de quantificao do equipamento
LQM: Limite de quantificao do mtodo
MRC: Material de Referncia Certificado
MRM: mltipla Reao Monitorada
m: mili Olms
N: Soluo normal
NEB: gs nebulizador
OMS: Organizao Mundial da Sade
PAMvet: Programa nacional de anlise de medicamentos veterinrios em alimentos
ppb: parte por bilho
PPG: polipropileno glicol
ppm : parte por milho
ppt: parte por trilho
R: recuperao
RPM: rotaes por minuto



vi

u.m.a: unidade de massa atmica
s/n: sinal/rudo
v/v: volume/volume
V: Volts
VISA-PR: Vigilncia Sanitria do Estado do Paran
WHO: World Health Organization
A: micro Amperes











vii

Sumrio

AGRADECIMENTOS.......................................................................................................III
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS........................................................................ IV
SUMRIO........................................................................................................................ VII
LISTA DE FIGURAS........................................................................................................ XI
LISTA DE TABELAS .................................................................................................... XIV
RESUMO .......................................................................................................................XVII
ABSTRACT ................................................................................................................. XVIII
1 INTRODUO.............................................................................................................. 1
1.1 AVERMECTINAS ...................................................................................................... 2
1.1.1 IVERMECTINA............................................................................................................. 4
1.1.2 ABAMECTINA.............................................................................................................. 6
1.1.3 DORAMECTINA........................................................................................................... 6
1.1.4 EPRINOMECTINA........................................................................................................ 7
1.1.5 EFICCIA DAS AVERMECTINAS ................................................................................... 8
1.1.6 TOXICOLOGIA DAS AVERMECTINAS ............................................................................ 9
1.2 MTODOS DE ANLISE........................................................................................ 12
1.2.1 ESPECTROMETRIA DE MASSAS POR IONIZAO PRESSO ATMOSFRICA .............. 13
1.2.2 SUPRESSO DE ONS E O EFEITO DA MATRIZ............................................................ 16
1.3 VALIDAO DE MTODOS ANALTICOS ......................................................... 17
1.3.1 ESPECIFICIDADE...................................................................................................... 17
1.3.2 LIMITE DE DETECO............................................................................................... 18
1.3.3 LIMITE DE QUANTIFICAO....................................................................................... 18
1.3.4 INTERVALO OU FAIXA LINEAR DE TRABALHO............................................................. 18
1.3.5 LINEARIDADE........................................................................................................... 19
1.3.6 EXATIDO................................................................................................................ 20
1.3.6.1 Veracidade ......................................................................................................... 21
1.3.7 RECUPERAO........................................................................................................ 22
1.3.8 PRECISO................................................................................................................ 22
1.3.8.1 Repetitividade .................................................................................................... 23
1.3.8.2 Preciso intermediria ...................................................................................... 23



viii

1.3.8.3 Reprodutibilidade............................................................................................... 24
1.3.9 ROBUSTEZ............................................................................................................... 25
1.3.10 ESTABILIDADE DO ANALITO.................................................................................... 26
1.3.10.1 Estabilidade do analito em soluo............................................................... 26
1.3.10.2 Estabilidade do analito na matriz................................................................... 27
2 OBJETIVOS ................................................................................................................ 28
2.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................................. 28
2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS .................................................................................. 28
3 EXPERIMENTAL....................................................................................................... 29
3.1 MATERIAIS.............................................................................................................. 29
3.1.1 REAGENTES E INSUMOS........................................................................................... 29
3.1.2 EQUIPAMENTOS....................................................................................................... 30
3.2 PREPARO DAS SOLUES DE ESTOQUE DAS AVERMECTINAS .............. 31
3.3 PREPARO DA FASE MVEL DE ACETATO DE AMNIO 5 MM...................... 31
3.4 PREPARO DAS CURVAS DE CALIBRAO..................................................... 31
3.5 MTODOS DE IONIZAO E ANLISE POR MLTIPLA REAO
MONITORADA.................................................................................................................. 32
3.5.1.1 Mtodo de ionizao com interface electrospray ........................................ 32
3.5.1.2 Mtodo de ionizao com interface de ionizao qumica............................ 33
3.5.2 PROCEDIMENTOS NO MODO EM-EM PARA ESCOLHA DO MTODO MAIS SENSVEL... 35
3.5.2.1 Desenvolvimento do mtodo MRM com aduto de sdio [M+Na]
+
por
electrospray..................................................................................................................... 35
3.5.2.2 Desenvolvimento do mtodo MRM na forma desprotonada [M-H]
-
por
electrospray..................................................................................................................... 37
3.5.2.3 Desenvolvimento do mtodo MRM na forma desprotonada [M-H]
-
por
ionizao qumica ............................................................................................................. 38
3.5.2.4 Otimizao da injeo de fluxo do mtodo MRM com aduto de sdio
[M+Na]
+
por electrospray ............................................................................................... 40
3.5.2.5 Otimizao da injeo de fluxo do mtodo MRM na forma desprotonada [M-
H]
-
por electrospray......................................................................................................... 41
3.5.2.6 Otimizao da injeo de fluxo do mtodo MRM na forma desprotonada [M-
H]
-
por ionizao qumica ................................................................................................. 42
3.5.3 COMPARAO E ESCOLHA DO MTODO MRM MAIS SENSVEL ................................. 43
3.5.4 MTODO FINAL ........................................................................................................ 43
3.6 OTIMIZAO DA LIMPEZA DAS AMOSTRAS POR EFS................................. 44
3.7 PREPARAO DAS AMOSTRAS DE LEITE...................................................... 45
3.8 PROCEDIMENTO PARA ESCOLHA DO MTODO DE EXTRAO............... 48
3.9 PROCEDIMENTO PARA DETERMINAO DA SUPRESSO DE ONS........ 49
3.10 PROCEDIMENTO PARA O TESTE DE EFEITO MATRIZ ................................ 49
3.11 PROCEDIMENTOS DE VALIDAO................................................................. 51



ix

3.11.1 METODOLOGIA ANALTICA PROPOSTA.................................................................... 51
3.11.2 ESTUDO DA ESPECIFICIDADE ................................................................................. 51
3.11.2.1 Avaliao de interferentes do leite................................................................. 51
3.11.2.2 Avaliao de interferentes do padro das avermectinas e do branco
reagente 51
3.11.2.3 Teste de degradao das avermectinas....................................................... 52
3.11.3 DETERMINAO DO LIMITE DE DETECO E QUANTIFICAO DO EQUIPAMENTO.... 52
3.11.4 DETERMINAO DO LIMITE DE DETECO E QUANTIFICAO DO MTODO ............. 53
3.11.5 FAIXA LINEAR DE TRABALHO .................................................................................. 53
3.11.6 LINEARIDADE......................................................................................................... 53
3.11.7 DETERMINAO DA ROBUSTEZ .............................................................................. 54
3.11.7.1 Otimizao dos parmetros da interface atravs de planejamento fatorial
54
3.11.7.2 Otimizao da extrao atravs de planejamento fatorial .......................... 55
3.11.8 EXATIDO.............................................................................................................. 57
3.11.9 PRECISO ............................................................................................................. 57
3.11.10 REPETITIVIDADE.................................................................................................. 57
3.11.11 PRECISO INTERMEDIRIA................................................................................... 57
3.11.12 ESTABILIDADE DOS PADRES.............................................................................. 58
3.12 ANLISE DAS AMOSTRAS DE LEITE .............................................................. 58
4 RESULTADOS E DISCUSSO.................................................................................. 59
4.1 RESULTADOS DAS INTERFACES DE IONIZAO.......................................... 59
4.1.1 RESULTADOS DA INTERFACE DE IONIZAO QUMICA.............................................. 59
4.1.2 RESULTADOS DA INTERFACE ELECTROSPRAY ....................................................... 62
4.2 RESULTADO DA ESCOLHA DO MELHOR MTODO MRM DE ANLISE...... 65
4.3 FRAGMENTAO DAS AVERMECTINAS POR EM-EM................................... 70
4.4 AVALIAO DOS CINCO MTODOS DE LIMPEZA DAS AMOSTRAS.......... 74
4.5 RESULTADO DA ESCOLHA DO MTODO FINAL PARA A ANLISE DAS
AVERMECTINAS ............................................................................................................. 83
4.6 AVALIAO DO EFEITO DA MATRIZ NAS CURVAS DE CALIBRAO...... 86
4.7 RESULTADOS DA VALIDAO DA METODOLOGIA...................................... 89
4.7.1 RESULTADOS DO TESTE DE ESPECIFICIDADE .......................................................... 89
4.7.2 RESULTADOS DA DETERMINAO DO LIMITE DE DETECO E QUANTIFICAO DO
EQUIPAMENTO E DO MTODO.............................................................................................. 91
4.7.3 FAIXA DE TRABALHO E LINEARIDADE ....................................................................... 95
Resultados do estudo de linearidade da abamectina:............................................................. 96
Resultados do estudo de linearidade da doramectina: ........................................................... 97
Resultados do estudo de linearidade da eprinomectina: ........................................................ 98
Resultados do estudo de linearidade da ivermectina: ............................................................ 99
4.7.4 ESTUDO DA ROBUSTEZ.......................................................................................... 100
4.7.4.1 Fatores que influenciam a ionizao das avermectinas na interface......... 100
4.7.4.2 Fatores que influenciam a extrao das avermectinas................................. 106



x

4.7.5 ESTUDO DA EXATIDO........................................................................................... 108
4.7.6 ESTUDO DA PRECISO .......................................................................................... 110
4.7.6.1 Estudo da repetitividade ................................................................................. 110
4.7.6.2 Estudo da preciso intermediria .................................................................. 112
4.7.7 ESTUDO DA ESTABILIDADE DO ANALITO................................................................. 114
4.7.7.1 Estabilidade do analito no solvente ................................................................ 114
4.7.7.2 Estabilidade do analito na matriz leite........................................................... 117
4.7.8 ANLISE DAS AMOSTRAS DE LEITE........................................................................ 118
5 CONCLUSES.......................................................................................................... 120
6 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ...................................................................... 121
7 ANEXOS .................................................................................................................... 126






xi

Lista de Figuras

Figura 1 Frmulas estruturais das avermectinas naturais. .................................................................. 3
Figura 2 Caractersticas estruturais das classes de avermectinas........................................................ 4
Figura 3 Frmula estrutural da ivermectina B1a. ................................................................................. 5
Figura 4 Frmula estrutural da abamectina B1a. ................................................................................. 6
Figura 5 Frmula estrutural da doramectina. ....................................................................................... 7
Figura 6 Frmula estrutural da Eprinomectina B1a. ........................................................................... 7
Figura 7 Esquema da ionizao electrospray(Fonte: Applied Biosystems do Brasil). .............. 14
Figura 8 Esquema da ionizao qumica (Fonte: Applied Biosystems do Brasil). ........................ 14
Figura 9 Esquema da anlise por EM-EM. ........................................................................................ 15
Figura 10 Esquema da determinao da supresso de ons. ............................................................ 49
Figura 11 Espectro de massas (EM1) em modo positivo da abamectina. ..................................... 59
Figura 12 Espectro de massas (EM1) em modo negativo da abamectina...................................... 60
Figura 13 Resultados dos experimentos de ionizao qumica. ....................................................... 61
Figura 14 Espectro de massas (EM1) em modo positivo da ivermectina...................................... 62
Figura 15 Espectro de massas (EM1) em modo negativo da eprinomectina. ............................... 63
Figura 16 Espectro de massas (EM1) na forma de adulto de sdio das AVMs............................ 64
Figura 17 Resultados dos experimentos de ionizao por electrospray. .................................... 65
Figura 18 Cromatograma do mtodo MRM modo positivo por electrospray. ......................... 67
Figura 19 Cromatograma do mtodo MRM modo negativo por electrospray. ........................ 68
Figura 20 Cromatograma do mtodo MRM modo negativo por ionizao qumica ................... 69
Figura 21 Espectro de massas (EM2) da Abamectina. ..................................................................... 71
Figura 22 Espectro de massas (EM2) da Ivermectina....................................................................... 71
Figura 23 Espectro de massas (EM2) da doramectina...................................................................... 72
Figura 24 Espectro de massas (EM2) da eprinomectina. ................................................................. 72
Figura 25 - Espectro de massas (MS2) da supresso de ons com a fase mvel metanol/acetato de
amnio 5 mM (98:2 isocrtico) dos mtodos 1, 2, 3, 4, 5 e fase mvel.O sinal das transies
das AVMs esto representadas pelas linhas coloridas. ................................................................ 77



xii

Figura 26 Espectro da supresso de ons com a fase mvel metanol/acetato de amnio 5 mM
(80:20 gradiente linear) dos mtodos 1, 2, 3, 4,5 e fase mvel. O sinal das transies das
AVMs esto representadas pelas linhas coloridas. ....................................................................... 80
Figura 27 Comparao das curva de calibrao da doramectina com solues preparadas com
solvente e considerando o efeito matriz. ....................................................................................... 87
Figura 28 Comparao da curva de calibrao da eprinomectina com solues preparadas com
solvente e considerando o efeito matriz. ....................................................................................... 87
Figura 29 Comparao da curva de calibrao da ivermectina com solues preparadas com
solvente e considerando o efeito matriz. ....................................................................................... 88
Figura 30 Comparao da curva de calibrao da abamectina com solues preparadas com
solvente e considerando o efeito matriz. ....................................................................................... 88
Figura 31 Cromatograma de uma amostra de leite orgnico. .......................................................... 90
Figura 32 Cromatograma do limite de deteco 0,05 g.L
-1
............................................................. 93
Figura 33 Cromatograma do limite de quantificao 0,2 g.L
-1
....................................................... 94
Figura 34 Curva de calibrao da abamectina. ................................................................................... 96
Figura 35 Grfico dos resduos padronizados da abamectina. ........................................................ 96
Figura 36 Curva de calibrao da Doramectina. ................................................................................ 97
Figura 37 Grfico dos resduos padronizados da doramectina. ...................................................... 97
Figura 38 Curva de calibrao da eprinomectina. .............................................................................. 98
Figura 39 Grfico dos resduos padronizados da Eprinomectina. .................................................. 98
Figura 40 Curva de calibrao da ivermectina.................................................................................... 99
Figura 41 Grfico dos resduos padronizados da ivermectina. ........................................................ 99
Figura 42 Efeitos padronizados da eprinomectina. ......................................................................... 101
Figura 43 Efeitos padronizados da abamectina. .............................................................................. 101
Figura 44 Efeitos padronizados da doramectina. ............................................................................ 102
Figura 45 Efeitos padronizados da ivermectina. .............................................................................. 102
Figura 46 Efeitos padronizados da eprinomectina. ......................................................................... 104
Figura 47 Efeitos padronizados da abamectina. .............................................................................. 104
Figura 48 Efeitos padronizados da doramectina. ............................................................................ 105
Figura 49 Efeitos padronizados da ivermectina. .............................................................................. 105
Figura 50 Efeitos padronizados da eprinomectina. ......................................................................... 106



xiii

Figura 51 Efeitos padronizados da abamectina. .............................................................................. 107
Figura 52 Efeitos padronizados da doramectina. ............................................................................ 107
Figura 53 Efeitos padronizados da ivermectina. .............................................................................. 108
Figura 54 Armazenamento a - 20 Celcius. ...................................................................................... 115
Figura 55 Armazenamento a + 4 Celcius. ....................................................................................... 115
Figura 56 Armazenamento a + 20 Celcius no claro. ..................................................................... 116
Figura 57 Armazenamento a + 20 Celcius no escuro. .................................................................. 116
Figura 58 Armazenamento a -20Celcius na matriz leite................................................................ 117
Figura 59 Representao da porcentagem individual de cada avermectina. ................................ 119








xiv

Lista de Tabelas

TABELA 1 Anlise de varincia para o ajuste do modelo................................................................20
TABELA 2 Veracidade mnima de mtodos quantitativos...............................................................21
TABELA 3 Exemplos de desvio padro relativo em condies de reprodutibilidade para
mtodos quantitativos (COMISSO DAS COMUNIDADES EUROPIAS, 2002)....................25
TABELA 4 Variao dos fatores do planejamento da interface (primeira etapa).........................55
TABELA 5 Variao dos fatores do planejamento da interface (segunda etapa).........................55
TABELA 6 Variao dos fatores estudados no planejamento fatorial da extrao......................55
TABELA 7 Planejamento fatorial completo 2
3
com trs variveis no ponto central...................56
TABELA 8 Resultados da porcentagem de recuperao da eluio das Avermectinas em
cartuchos de EFS slica-C18 com 22% de carbono. (n=3)..................................................................73
TABELA 9 Resultados da porcentagem de recuperao da eluio das Avermectinas em
cartuchos de EFS de carbono Envi-carb. (n=3).................................................................................74
TABELA 10 Resultado da recuperao com fase mvel metanol/acetato de amnio 5 mM
(98:2 isocrtico) com fortificao de 1,0 g.L
-1
(n=3)...........................................................................74
TABELA 11 Resultado da recuperao com fase mvel metanol/acetato de amnio 5 mM
(80:20 com gradiente linear) com fortificao de 1,0 g.L
-1
(n=3)......................................................75
TABELA 12 Resultado da recuperao do mtodo 5 com fase mvel metanol/acetato de
amnio 5 mM (80:20 com gradiente linear) com fortificao de 1,0 g.L
-1
(n=3)...........................75
TABELA 13 Resultados da recuperao do mtodo 2 fortificado com 1 ng.mL
-1
na curva de
calibrao com solvente..............................................................................................................................83
TABELA 14 Resultados da recuperao do mtodo 2 fortificado com 1 ng.mL
-1
na curva de
calibrao com extrato................................................................................................................................84
TABELA 15 Resultados da recuperao do mtodo 4 fortificado com ng.mL
-1
na curva de
calibrao com solvente.............................................................................................................................84
TABELA 16 Resultados da recuperao do mtodo 4 fortificado com ng.mL
-1
na curva de
calibrao com extrato................................................................................................................................84
TABELA 17 Resultados da recuperao do mtodo 5 fortificado com 1 ng.mL
-1
na curva de
calibrao com solvente.............................................................................................................................85



xv

TABELA 18 Resultados da recuperao do mtodo 5 fortificado com 1 ng.mL
-1
na curva de
calibrao com extrato................................................................................................................................85
TABELA 19 Resultados do teste t bilateral para avaliao estatstica do efeito matriz na
construo das curvas de calibraes das Avermectinas.......................................................................89
TABELA 20 - Resultados do teste de degradao das Avermectinas (1 g.mL
-1
) utilizando banho
Maria de gua fervente (n=1)....................................................................................................................91
TABELA 21 Resultados do teste de gradao das Avermectinas (1 g.mL
-1
) utilizando perxido
de hidrognio 30% e banho Maria de gua fervente (n=1)..................................................................91
TABELA 22 Resultados da determinao do limite de deteco e quantificao do
equipamento.................................................................................................................................................92
TABELA 23 Resultados da determinao do limite de deteco do mtodo................................92
TABELA 24 Resultados do limite de quantificao do mtodo......................................................93
TABELA 25 Resultado da determinao da falta de ajuste (lack of fit).....................................96
TABELA 26 Resultado da determinao da falta de ajuste (lack of fit).....................................97
TABELA 27 Resultado da determinao da falta de ajuste (lack of fit).....................................98
TABELA 28 Resultado da determinao da falta de ajuste (lack of fit).....................................99
TABELA 29 Resultados da determinao da Eprinomectina nos ensaios de recuperao dos
nveis de 0,2 g.L
-1
, 0,3 g.L
-1
e 0,4 g.L
-1
...............................................................................................109
TABELA 30 Resultados da determinao da Abamectina nos ensaios de recuperao dos nveis
de 0,2 g.L
-1
, 0,3 g.L
-1
e 0,4 g.L
-1
..........................................................................................................109
TABELA 31 Resultados da determinao da Doramectina nos ensaios de recuperao dos
nveis de 0,2 g.L
-1
, 0,3 g.L
-1
e 0,4 g.L
-1
...............................................................................................109
TABELA 32 Resultados da determinao da Ivermectina nos ensaios de recuperao dos nveis
de 0,2 g.L
-1
, 0,3 g.L
-1
e 0,4 g.L
-1
..........................................................................................................110
TABELA 33 Resultados da determinao da Eprinomectina nos ensaios de repetitividade dos
nveis de 0,2 g.L
-1
, 0,3 g.L
-1
e 0,4 g.L
-1
..............................................................................................111
TABELA 34 Resultados da determinao da Abamectina nos ensaios de repetitividade dos
nveis de 0,2 g.L
-1
, 0,3 g.L
-1
e 0,4 g.L
-1
..............................................................................................111
TABELA 35 Resultados da determinao da Doramectina nos ensaios de repetitividade dos
nveis de 0,2 g.L
-1
, 0,3 g.L
-1
e 0,4 g.L
-1
..............................................................................................111



xvi

TABELA 36 Resultados da determinao da Ivermectina nos ensaios de repetitividade dos
nveis de 0,2 g.L
-1
, 0,3 g.L
-1
e 0,4 g.L
-1
..............................................................................................112
TABELA 37 Resultados da determinao da Eprinomectina nos ensaios de preciso
intermediria dos nveis de 0,2 g.L
-1
, 0,3 g.L
-1
e 0,4 g.L
-1
..............................................................113
TABELA 38 Resultados da determinao da Abamectina nos ensaios de preciso intermediria
dos nveis de 0,2 g.L
-1
, 0,3 g.L
-1
e 0,4 g.L
-1
......................................................................................113
TABELA 39 Resultados da determinao da Doramectina nos ensaios de preciso
intermediria dos nveis de 0,2 g.L
-1
, 0,3 g.L
-1
e 0,4 g.L
-1
..............................................................113
TABELA 40 Resultados da determinao da Ivermectina nos ensaios de preciso intermediria
dos nveis de 0,2 g.L
-1
, 0,3 g.L
-1
e 0,4 g.L
-1
......................................................................................114























xvii

Resumo

O trabalho teve como objetivo o desenvolvimento e a validao da metodologia de
anlise de avermectinas em leite bovino. Apesar de serem muito teis para o tratamento de
parasitoses, algumas dessas substncias no so indicadas para uso em gado leiteiro e outras
devem ter seus limites de controlados. O trabalho foi motivado pela escassez de publicaes
relatando tcnicas com baixos limites de deteco e tambm pelo incentivo da ANVISA na
implantao de tais tcnicas em laboratrios oficiais. O procedimento desenvolvido, o qual ser
utilizado pelo Laboratrio Central do Estado do Paran, consta de limpeza da amostra por
extrao em fase slida, utilizando cartuchos de slica C
18
, e anlise das amostras por CLAE-
EM/EM. Os parmetros de ionizao foram otimizados de modo a produzir o mximo de
detectabilidade. O mtodo foi validado de acordo com as normas internacionais e mostrou alta
especificidade e seletividade, com limites de deteco e quantificao de 0,05 g.L
-1
e 0,2

g.L
-1
,
respectivamente, os quais so inferiores aos descritos na literatura. Foram analisadas 157
amostras de leite pasteurizado integral das quais 35 % estavam em desacordo com a legislao
Brasileira em vigor, por apresentarem abamectina e doramectina proibidas para uso em vacas
lactantes.











xviii

Abstract

The objective of this work was the development and validation of a analytical
methodology for the determination of avermectins in cows milk. Despite being very useful for
the treatment of parasitoids some of these compounds are not indicated for administration in
lactating cows, while others must have their maximum limits monitored. The work was motivated
by the relative scarcity of publications describing techniques with low detection limits and also by
the incentive ANVISA has made in the establishment of these techniques in official laboratories.
The procedure, which will be used by Laboratrio Central do Estado do Paran, comprises
sample cleaning using solid-phase extraction with C
18
silica cartridges followed by LC-MS/MS
analysis. The ionization parameters were optimized in order to produce maximum sensibility. The
method was validated according to international legislation and showed high specifity and
selectivity with detection and quantification limits of 0,05 g.L
-1
and 0,2

g.L
-1
, respectively, which
are smaller than those described in the literature. One hundred and fifty seven samples of
pasteurized milk were analyzed and 35 % of those were in disagreement with the legislation. They
should be reproved for human consumption because they contained abamectin and doramectin
prohibited for use in dairy cows.


Introduo


1
1 INTRODUO

A qualidade dos alimentos de origem animal ou vegetal de fundamental
importncia sade humana. As prticas adotadas na produo destes alimentos,
entretanto, envolvem o uso de produtos qumicos para o controle de pragas nos vegetais e
de doenas nos animais. O controle dos resduos destas substncias nos alimentos ,
portanto, importante e os valores mximos permitidos so estipulados pelos rgos
regulatrios.
O leite est entre os alimentos que podem apresentar problemas de resduos de
medicamentos veterinrios. O leite que a populao consome o resultado de prticas
adotadas nas fontes de produo atravs do manejo das vacas em lactao (LOPES, 2002).
Segundo PHILPOT (1998), o leite de alta qualidade no pode conter nenhum tipo de
resduo qumico. Dessa forma a produo leiteira deve adotar todos os cuidados
necessrios para evitar contaminantes no produto. O gado leitero, entretanto, susceptvel
a doenas que devem ser controladas com o uso de medicamentos veterinrios
apropriados.
Medicamentos veterinrios so utilizados para a profilaxia e tratamento do
rebanho leiteiro e devem ser prescritos por profissionais competentes. A utilizao
indevida, sem respeitar as indicaes do receiturio e o perodo de carncia, poder
ocasionar a presena de resduos no leite (FAGUNDES,1997; COSTA, 2002). O processo
de pasteurizao efetuado pelos laticnios, no elimina os resduos destes medicamentos
FURTADO (1999). Deste modo os esforos visando assegurar a ausncia de resduos no
leite devem ser empreendidos nas propriedades produtoras a fim de evitar problemas
sade da populao tais como hipersensibilidade, alergias (WEAVER, 1992) e resistncia a
antibioticoterapia (FONSECA , 2002). Da a importncia do controle e normatizao por
parte de rgos regulatrios.
Tendo em vista a importncia do tema a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria
ANVISA, criou, em 2001, o Programa Nacional de Controle de Resduos de
Medicamentos Veterinrios em Alimentos PAMvet. O programa tem como objetivos
avaliar o risco da exposio humana decorrente do uso de medicamentos veterinrios em
Introduo


2
animais produtores de alimentos, propor o estabelecimento dos limites mximo de resduos
(LMR) a serem adotados no Brasil e estimular prticas de controle preventivo nas
propriedades produtoras e nas indstrias de laticnios.
Existem vrias classes de medicamentos veterinrios com indicaes especficas
para as vrias doenas animais. Uma classe importante a dos antiparasitrios.
Medicamentos veterinrios antiparasitrios so amplamente utilizados na
produo animal. Eles correspondem a 28,7 % dos medicamentos vendidos no Estado do
Paran (NETTO et al., 2005) e so utilizados na preveno de ecto e endoparasitoses.
Dentre os ectoparasitas esto os carrapatos, bernes, piolhos e as moscas-do-chifre,
enquanto que os nematides gastrointestinais e pulmonares so exemplos de endoparasitas
(BRITO,1998). Para o controle dos ectoparasitas so utilizados os ectotoxidas. Eles podem
ser classificados como sistmicos e no-sistmicos e, do ponto de vista qumico, podem ser
classificados como fosforados, piretrides, diamincos, triazis, etc. Os endotoxidas so
utilizados para o controle de endoparasitas sendo, em geral, sistmicos e classificados como
benzimidazis e avermectinas (FURLANG,2000).
O grupo dos benzimidazis ainda utilizado com boa eficincia no tratamento de
nematides, porm no so eficazes contra alguns parasitas, como os carrapatos. Com a
descoberta das avermectinas, houve uma revoluo no tratamento das doenas causadas
por endo e ectoparasitas, devido grande eficcia e baixa toxicidade destes compostos.

1.1 AVERMECTINAS

As avermectinas so lactonas macrocclicas produzidas pela fermentao do fungo
actinomiceto Streptomyces avermitilis. Elas foram descobertas pelo pesquisador japons
Satoshi Omura que, em 1975, isolou o microorganismo no Instituto Kitasato a partir de
uma amostra de solo da cidade de Ito no Japo. O S. avermitilis produz uma mistura de 8
diferentes componentes: A1a, A1b, A2a, A2b, B1a, B1b, B2a e B2b (Figura 1) (BURG et
al.,1979; SCHOMBERG et al.,1981). Dentre estes a frao B1 a que possui maior
atividade antiparasitria. O produto comercial possui 80% de avermectina B1a e 20% de
avermectina B1b (ENGERTON et al.,1979).

Introduo


3




















avermectina R
1
R
2
X-Y
A1a CH
3
C
2
H
5
CH=CH
A1b CH
3
CH
3
CH=CH
A2a CH
3
C
2
H
5
CH
2
-CH(OH)
A2b CH
3
CH
3
CH
2
-CH(OH)
B1a H C
2
H
5
CH=CH
B1b H CH
3
CH=CH
B2a H C
2
H
5
CH
2
-CH(OH)
B2b H CH
3
CH
2
-CH(OH)

Figura 1 Frmulas estruturais das avermectinas naturais.

As oito avermectinas naturais so classificadas de acordo com algumas
caractersticas estruturais. Aquelas da srie A possuem um grupo metoxila em C-5 e as da
srie B possuem um grupo hidroxila naquela posio. As avermectinas da srie 1
possuem uma dupla ligao entre C-22 e C-23, enquanto que os componentes da srie 2
tm uma ligao simples com o grupo hidroxila em C-23. As avermectina da srie a tm
um grupo sec-butil em C-25 e as da srie b possuem um substituinte isopropil naquela
posio (SCHOMBERG et al., 1981). Estas caractersticas estruturais esto resumidas na
Figura 2.
Introduo


4




R
1
= CH
3
: srie A X-Y= -CH=CH-: srie 1
R
1
= H : srie B
R
2
=C
2
H
5
: srie a X-Y= -CH
2
-CHOH-: srie 2
R
2
=CH
3
: srie b

Figura 2 Caractersticas estruturais das classes de avermectinas.

A srie a e a srie b so homlogas e possuem atividades antiparasitrias
idnticas no sendo necessria sua separao durante o processo de produo. As
diferenas estruturais entre os componentes da srie 1 e os da srie 2, por outro lado,
proporciona um efeito na conformao do anel, ocasionando diferenas na bioatividade. A
avermectina B1, por exemplo, mais ativa que a B2 quando administrada via oral
(CHABALA et al., 1980).

1.1.1 Ivermectina

A 22,23-diidroavermectina B1 (figura 3) foi a primeira avermectina a ser
comercializada, em 1981, com o nome genrico de ivermectina. Ela foi obtida pela
hidrogenao seletiva da dupla ligao entre o C-22 e C-23 da avermectina B1, resultando
uma conformao em cadeira semelhante a da avermectina B2.
Introduo


5
ivermectina pode ser considerada como um hbrido das avermectinas B1 e B2
(SHOOP et al., 1995; CHABALA et al.,1980).
Na produo da ivermectina, a 22,23-diidroavermectina B1a (H2B1a) produzida
numa quantidade maior que 80% e a 22,23-diidroavermectina B1b (H2B) numa quantidade
inferior a 20%. Ambas diferem por um grupo metileno ligado ao C-25, onde a ivermectina
B1a possui um grupo sec-butila e a ivermectina B1b possui um grupo isopropila. Elas
possuem um excelente espectro de atividade contra parasitas nematides quase to
eficiente quanto a avermectina B1.














Figura 3 Frmula estrutural da ivermectina B1a.

Com o sucesso da comercializao e eficincia da ivermectina outros derivados
foram preparados a partir dela. A 22,23-diidroavermectina B1 monossacardeo, por
exemplo, obtida atravs da remoo de uma oleandrose da ivermectina por hidrlise cida,
um pouco menos potente que o seu precursor. Outros exemplo so a 22,23-
dihidroavermectina B1 aglicona, resultante da perda das duas oleandroses substitudas por
um grupo 13--hidroxi e a 22,23-dihidro-13-desoxi-avermectina B1 aglicona, produzida
pela perda das duas oleandroses substitudas por um grupo 13--desoxi (SHOOP et
al.,1995).


C H
3
C H
3
O
O
H
CH
3
CH
3
O
O
OH
H
CH
3
OH
O
CH
3
H
H
O
O
OCH
3
CH
3
O
O
C H
3
O H
O
C H
3
H
H
Introduo


6
1.1.2 Abamectina

As avermectinas B1a e a B1b so produtos naturais da fermentao do S.
avermitilis, comercializadas com o nome genrico de abamectina (figura 4). Elas so
produzidas pelo fungo numa proporo de 80 % e 20 %, respectivamente. Alm da
utilizao no controle de ecto e endoparasitoses em animais ela foi utilizada primeiramente
no controle de parasitas em vegetais.















Figura 4 Frmula estrutural da abamectina B1a.


1.1.3 Doramectina

A 25-ciclohexil-avermectina B1 produzida naturalmente pela fermentao de um
mutante do fungo S. avermitilis, comercializada com o nome genrico de doramectina
(figura 5). Ela possui um espectro de atividade antiparasitria muito prxima da
avermectina B1 e, por ser mais lipoflica melhor absorvida no tecido animal.






C H
3
C H
3
O
O
H
CH
3
CH
3
O
O
OH
H
CH
3
OH
O
H
H
O
O
OCH
3
CH
3
O
O
C H
3
O
C H
3
H
H
O H
CH
3
Introduo


7














Figura 5 Frmula estrutural da doramectina.


1.1.4 Eprinomectina

A 4-epiacetilamino-4-desoxiavermectina (figura 6) uma mistura semi-sinttica
da avermectina B1 comercializada com o nome genrico de Eprinomectina. Sintetizada
pela substituio do grupo hidroxila equatorial do C-4 por um substituinte acetamino.
composta de uma mistura de no menos de 90% de Eprinomectina B1a e no mais de 10%
de Eprinomectina B1b (MROZIK et al., 1995). A Eprinomectina conserva as mesmas
atividades antiparasitrias das avermectinas e, por ser mais hidroflica, menos provvel
seu aparecimento no leite. Isto levou permisso do uso em gado leiteiro (HOLSTE et al.,
1997).
C H
3
C H
3
C H
3
O
O
H
CH
3
CH
3
O
O
OH
H
CH
3
OH
O
H
H
O
O
OCH
3
CH
3
O
O
C H
3
O
C H
3
H
H
O NH
CH
3


Figura 6 Frmula estrutural da Eprinomectina B1a.
C H
3
C H
3
O
O
H
CH
3
O
O
OH
H
CH
3
OH
O
O
O
OCH
3
CH
3
O
O
C H
3
O H
O
C H
3
H
H
Introduo


8
1.1.5 Eficcia das avermectinas

O modo de ao das avermectinas resulta da alta afinidade delas com os
receptores de glutamato. Ao se ligarem a estes receptores elas produzem um incremento na
permeabilidade dos ons cloreto o que origina uma hiperpolarizao da membrana celular,
abrindo os canais de cloreto controlados pelo cido glutmico e pelo cido cido gama-
aminobutrico (GABA). Com o aumento do fluxo de ons cloreto para dentro das sinapses
nervosas em vermes, e no sistema neuromuscular em artrpodes, resulta na paralisia
levando morte de nematides e artrpodes (SHOOP et al.,1995; IKEDA e OMURA,
1997).
As avermectinas possuem atividade contra vermes helmnticos e artrpodes numa
dose abaixo de 10 g.Kg
-1
e ainda no se tem demonstrado atividade eficaz contra
bactrias e fungos (CHABALA et al.,1980). A avermectina B1 a que possui a mais alta
eficincia contra nematides seguida da avermectina B2. A DL
50
em ratos da avermectina
B1 e B2 de 15 mg.Kg
-1
e 50 mg.Kg
-1
respectivamente (SHOOP et al., 1995).
Egerton et al. (1979) demonstraram, em gados, a atividade antihelmintica da
avermectina B1 contra vrios parasitas nematides. Realizaram trs experimentos:
tratamento oral para vermes adultos e fase larvria, tratamento por injeo parenteral para
vermes adultos e fase larvria e atividade oral contra vermes em fase imatura. No
experimento 1, foi observado que a eficincia da avermectina B1 para eliminar as 7 espcies
de vermes utilizadas foi alta com uma dosagem abaixo de 0,05 mg.Kg
-1
. No experimento 2,
foi demonstrado que possui uma resposta um pouco abaixo a do experimento 1, sendo a
dosagem considerada pelos autores para eliminar os vermes de menor ou igual a 0,06
mg.Kg
-1
. No experimento 3, foi observado que a eficincia foi alta para todas as 8 espcies
de nematides em fase larvria com uma nica dosagem de 0,022 mg.Kg
-1
.
Chabala et al. (1980) realizaram um experimento para testar a eficincia das
avermectinas naturais e sintticas. Eles infestaram ovelhas, por via oral, com seis espcies
de vermes helmnticos e posteriormente trataram as cobaias com avermectinas. Foi
demonstrado que as avermectinas possuem um grande espectro de atividade contra os
nematides, porm existiu considervel variao na potncia conforme a droga e o parasita
utilizado no experimento. Foi observado que os compostos da srie B em geral so mais
Introduo


9
potentes que os da srie A e os dois compostos mais efetivos foram a avermectina B1 e a
22,23-dihidroavermectina B1.
A abamectina considerada a mais potente das avermectinas contra nematides,
artrpodes e insetos com um grande espectro de atividade e excelente potncia. Em gado
de corte a dose recomendada de 200 g.Kg
-1
de peso, na forma injetvel sub-cutnea ou
oral.
A ivermectina, por possuir um largo espectro de atividade e ao rpida no
tratamento de artrpodes e nematides, foi a primeira avermectina a ser comercializada no
tratamento de bois (exceto para vacas leiteiras), ovelhas, porcos, cavalos, etc (CHABALA
et al., 1980; Campbell et al., 1983). A dosagem recomendada via oral, parenteral ou tpica
para uso com alta eficincia para todos os tipos de parasitas foi de 200 g. Kg
-1
por peso.
Apesar da utilizao em larga escala nestas ultimas dcadas no foi observada resistncia
em nenhum tipo de animal. S foi detectada resistncia em um limitado nmero de
nematides em experimentos in vitro (SHOOP et al., 1993).
A doramectina possui um espectro de atividade muito prxima da abamectina,
utilizada como endo e ectotoxida na forma injetvel na dose recomendada de 200 g. Kg
-1

de peso para bovinos e 300 g.Kg
-1
de peso para sunos, no recomendado seu uso para
gados produtores de leite (FAO, 1996).
A eprinomectina possui um espectro de atividade semelhante a das outras
avermectinas e utilizada como endo e ectotoxida na forma tpica para bovinos de corte e
leiteiro na dose recomendada de 500 g. Kg
-1
por peso. Devido a sua hidrosolubilidade, e
rpida metabolizao foi permitido o uso em vacas leiteiras.

1.1.6 Toxicologia das avermectinas

As avermectinas possuem um largo espectro de atividade em doses baixas. Elas
so administradas por via oral, subcutnea ou tpica e possuem ao sistmica. A
liposolubilidade destes compostos favorece a deposio no local de aplicao por via
subcutnea, o que prolonga o tempo de permanncia deles no organismo. As
concentraes nos fluidos orgnicos so mantidas por longos perodos podendo se
Introduo


10
acumular no leite. A presena delas no leite pode colocar em risco a sade dos
consumidores.
Os resduos das avermecitnas degradam formando vrios produtos. E somente
um destes resduos, a 8,9-Z avermectina B1, de significante toxicologia, composto
neurotxico que possui um baixo DL
50
(VALENZUELA et al., 2000).
Quando no houver legislao prpria para resduos de drogas veterinrias para a
definio dos LMR deve-se observar segundo a ANVISA, a legislao Brasileira (quando
houver), Mercosul, Comunidade Europia ou o FDA, nesta ordem. Segundo o Ministrio
da Agricultura (2006), o uso da abamectina e da doramectina no autorizado para vacas
em lactao, portanto o leite no pode conter resduos delas. permitido o uso da
eprinomectina e da ivermectina e seus LMRs no leite so de 20 g.L
-1
e 10 g.L
-1
,
respectivamente.

Porm os rtulos de produtos contendo ivermectina no recomendam a
utilizao em vacas lactantes. Os resultados das anlises para estas drogas devero ser
expressos pelos seus respectivos marcadores como abamectina B1a, doramectina,
ivermectina B1a e eprinomectina B1a (MERCOSUL, 2000).
A abamectina possua em 1992, segundo a FAO/WHO (1996), uma IDA de 0 -
0,2 g. Kg
-1
de peso corpreo. Em 1995 este valor foi elevado para 0 - 1 g.Kg
-1
(60 g por
pessoa de 60 Kg). O motivo que levou a esta alterao foi devido a no comprovao da
formao do ismero 8,9-Z avermectina B1 em animais, o qual um metablito
teratognico e que produzido em vegetais pela foto degradao produzida pelos raios
ultravioleta. A abamectina recomendada apenas em gado de corte. Depois de sete dias da
administrao no gado, so encontrados 50% da droga nas fezes e at 2% na urina. Depois
de 21 dias 42% do total da droga se localiza no fgado, 25% em tecido adiposo e 50% nos
rins. O perodo de carncia recomendado para o consumo da carne de animais tratados
de 35 dias aps a aplicao. O LMR recomendado pela FAO/WHO de 10 g. Kg
-1
em
msculo e 50 g.Kg
-1
em fgado e rins. No permitido o uso deste antiparasitrio em
vacas lactantes. A DL
50
via oral em ratos de 13 a 23 mg. Kg
-1
.
A ivermectina possui, segundo a FAO/WHO (1993), uma IDA de 0 -1 g. Kg
-1

por peso corpreo (60 g por pessoa de 60 kg). Ela recomendada para tratamento em
gados na dose de 500 g. Kg
-1
de peso e tambm para outros animais como porcos,
cavalos, ovelhas, etc. A aplicao do medicamento na forma tpica na dose de 500 g.Kg
-1

de peso apresenta resduos nos msculos at 21 dias, no fgado at 42 dias, na gordura at
Introduo


11
56 dias e no stio de aplicao tambm at 56 dias. O tempo de vida no organismo alto,
principalmente no tecido adiposo e rins. Isto se deve principalmente alta lipofilicidade do
metablito formado. Alguns metablitos j identificados foram o 24-
hidroximetilivermectina em ruminantes e a 3-O-desmetilivermectina em porcos. A
ivermectina metabolizada pelo fgado e excretada pela bile e fezes. Segundo Halley et
al.(1989 ) 40 % da dose aplicada tpicamente excretada pelas fezes e 2% excretada pela
urina, na aplicao por dose oral 72 % da droga excretada pelas fezes. O LMR
recomendado pela FAO/WHO em gados de 100 g.Kg
-1
em fgado e 40 g.Kg
-1
em
gordura, o perodo de carncia 35 dias aps a aplicao do antiparasitrio. Segundo
FAO/WHO (1993), O

Niel em 1997 estudou os resduos deixados no leite de vaca,


aplicando o antiparasitrio na forma tpica em 6 vacas lactantes na dosagem de 580 g.Kg
-1

de peso, a mdia de resduos no leite foi de 811 g e a porcentagem de dose excretada no
leite foi de 0,23 % aps 222 horas do tratamento, sendo a quantidade de resduo deixado
no leite de 5 a 10 g.Kg
-1
. A FAO/WHO recomenda uma tolerncia de 10 g.L
-1
de
resduos de ivermectina no leite e segundo a EMEA ( Agncia Europia para Avaliao de
Produtos Mdicos), o consumo de leite por crianas contaminados por resduos pode
ultrapassar a IDA por consumirem mais leite em geral do que os adultos.
A doramectina possui uma IDA segundo a FAO/WHO (1996) de 0 0,5 g.Kg
-1

de peso corpreo (30 g por dia por pessoa de 60kg). recomendado o uso para o
tratamento de gados de corte, mas no em vacas lactantes. A dose recomendada para o
tratamento contra parasitas de 200 g.Kg
-1
de peso na forma injetvel e o perodo de
carncia de 35 dias aps a aplicao. Segundo a FAO/WHO (1996), em testes realizados
com a aplicao da doramectina injetvel em gados na dose de 200 g. Kg
-1
de peso, foram
encontrados resduos aps 35 dias da aplicao em msculo na quantidade de <3 g.Kg
-1
,
no fgado 26 g.Kg
-1
, nos rins <3,6 g.Kg
-1
e na gordura a quantidade encontrada foi de 37
g/Kg. A doramectina injetada intramuscular ou subcutnea 86 % eliminada pelas fezes e
menos de 1% pela urina. Produz metablitos como 3-O-desmetil doramectina e 24-
hidroximetil doramectina quando aplicada em gados. O LMR recomendado pela
FAO/WHO (1996) em gados de 10 g.Kg
-1
em msculos, 100 g.Kg
-1
em fgado, 30
g.Kg
-1
em rins e 150 g.Kg
-1
em gordura. A DL
50
para camundongos

via oral com veiculo
oleoso de 75 a 500 mg.Kg
-1
de peso, uma dose mais baixa de 200 g.Kg
-1
de peso em
camundongos causa tremores e letargia.
Introduo


12
A eprinomectina possui uma IDA segundo a FAO/WHO de 0 - 10 g. Kg
-1
de
peso corpreo (600 g por pessoa de 60 Kg). recomendado o uso para tratamento de
gado de corte e vacas leiteiras. A dosagem recomendada para uso tpico no tratamento de
parasitas de 500 g.Kg
-1
de peso, sendo que no foi adotado perodo de carncia para a
utilizao desta droga em gados de abate e para vacas em lactao, isto se deve a sua baixa
lipofilidade e alta hidrosolubilidade devido a existncia de um radical acetamido em
comparao com outras avermectinas, favorecendo a sua rpida eliminao por vias
excretoras . O LMR recomendado pela FAO/WHO em gados de 100 g. Kg
-1
em
msculo, 2000 g.Kg
-1
em fgado, 300 g.Kg
-1
em rins, 250 g.Kg
-1
em gordura e 20 g.Kg
-
1
em leite. A DL
50
para camundongos de 35 a 70 mg.Kg
-1
de peso.

1.2 MTODOS DE ANLISE

Um grande nmero de mtodos analticos para resduos de avermectinas foi
publicado. Para a matriz leite, entretanto, so poucos os relatos na literatura devido ao
pequeno nmero de equipamentos capazes de produzir resultados com alta seletividade e
detectabilidade. Com o avano da espectrometria de massas nestas ltimas dcadas foram
desenvolvidos mtodos cromatogrficos por CLAE acoplado ao detector de massas,
possuindo mais especificidade e seletividade que os detectores convencionais, bem como
possibilitando a anlise quantitativa e confirmatria. Valenzuela et al. (2001) compararam as
tcnicas de anlise por CLAE-UV, CLAE-FL e CLAE-EM na determinao da
avermectina B1 em frutas ctricas, obtiveram um limite de deteco (considerando a relao
sinal/rudo 3:1) respectivamente de 50, 0,5 e 12 pg (volume de injeo no EM 4 vezes
menor que os outros mtodos), onde os autores concluem que as tcnicas de FL e EM so
comparveis, sendo que o mtodo por FL mais econmico, segundo os autores. Wu et al.
(2001), utilizando 5 g de carne de porco e injeo de 20 L, obtiveram um limite de
deteco de 5 g.Kg
-1
(5 ppb) em seu mtodo de confirmao.
Com o aparecimento dos espectrmetros de massas Tandem, foi possvel a
anlise de resduos com nveis mais baixos de deteco e quantificao, proporcionando
ainda uma melhor confirmao dos compostos usando espectros de massas por MRM
(mltipla reao monitorada). Turnipseed et al. (2005), utilizando 5 mL de alquota de
Introduo


13
amostra de leite e injeo de 5L, analisaram resduos de avermectinas na faixa de 0,5 a 20
ng.g
-1
.
Para a anlise de drogas veterinrias, a espectrometria de massas tornou-se uma
ferramenta poderosa devido a sua alta seletividade e detectabilidade (MUOS et al., 2005).
Aliada a um modo de deteco universal, foi possvel desenvolver ao longo destes ltimos
anos, metodologias mais sensveis, confiveis e com baixos limites de deteco. Isto
propicia o desenvolvimento de mtodos mais rpidos com poucos passos de purificao da
amostra; sendo, atualmente, a tcnica mais aceita segundo a Comunidade Europia (CE-
657/2002) para a confirmao de resduos de drogas veterinrias.

1.2.1 Espectrometria de massas por ionizao presso atmosfrica

Esta tcnica de anlise, em geral, utiliza interfaces a presso atmosfrica, para que
ocorra a ionizao das molculas de uma forma mais branda, evitando a decomposio das
mesmas. Geralmente so utilizadas interfaces como a electrospray e a ionizao qumica.
Nas interfaces a presso atmosfrica as molculas dos compostos so ionizadas,
sofrem dessolvatao e passam para a fase gasosa podendo ser analisadas pelo
espectrmetro de massas. Estas interfases diferem no seu modo de ionizao, onde na
electrospray (figura 7) as molculas dos compostos so ionizadas em fase liquida com o
auxlio de uma descarga eltrica de alta voltagem e depois dessolvatadas (FENN, 1993). Na
ionizao qumica (figura 8) a ionizao ocorre em fase gasosa com transferncia de cargas,
onde os compostos primrios (N
2
, O
2
e H
2
O) presentes no ar so ionizados pela descarga
corona do capilar, estes transferem sua carga para ons secundrios formados pelas
molculas dos solventes, que por sua vez doam ou retiram prtons dos compostos
formando ons moleculares (KOLAKOWSKI et al., 2004).
Introduo


14

Figura 7 Esquema da ionizao electrospray(Fonte: Applied Biosystems do Brasil).

Figura 8 Esquema da ionizao qumica (Fonte: Applied Biosystems do Brasil).

Na tcnica por CLAE-EM-EM (sistema de cromatografia liquida de alta eficincia
acoplada a um espectrmetro de massas triploquadrupolo) com ionizao a presso
atmosfrica, o primeiro passo ionizar a molcula do analito utilizando uma das formas de
ionizao que melhor ionize o composto. O prximo passo selecionar o on molecular
chamado de precursor (on pai) no primeiro quadrupolo, depois fragmenta-lo no segundo
quadrupolo para produzir os ons produtos (ons filhos) e, finalmente, selecionar os
fragmentos obtidos (ons filhos) no terceiro quadrupolo para analise confirmatria e/ou
Introduo


15
quantitativa por mltipla reao monitorada (MRM), proporcionando alta seletividade e
detectabilidade (BALIZS e HEWITT, 2003), exemplificado no Figura 9.

Figura 9 Esquema da anlise por EM-EM.

Valenzuela et al. (2000) analisaram resduos da abamectina em laranja por CLAE-
EM, utilizando ionizao a presso atmosfrica com interface electrospray. A abamectina
foi ionizada em modo positivo, utilizando fase mvel de metanol/gua (90:10)
proporcionando uma melhor ionizao da molcula. O on molecular obtido foi na forma
de aduto de sdio [M+Na]
+
com m/z de 895.6 com caracterstico fragmento de m/z 391.9.
Wu et al. (2001) analisaram resduos de abamectina e ivermectina em fgado de
porco por CLAE-EM, utilizando interface de ionizao qumica e electrospray. Na
ionizao por electrospray em modo positivo, foi observado a formao de adutos de
sdio [M+Na]
+
, potssio [M+K]
+
e amnio [M+NH
4
]
+
e no modo negativo adutos de
cloro [M+Cl]
-
, formiato [M+HCOO]
-
e acetato [M+CH
3
COO]
-
. Na ionizao qumica no
modo positivo no foi observada a presena de ons adutos e no modo negativo as
molculas de interesse foram ionizadas na forma desprotonada [M-H]
-
, onde tambm no
foi observada a presena de ons adutos. A forma de ionizao escolhida pelos autores para
a anlise das avermectinas foi a ionizao qumica em modo negativo [M-H]
-
. Devido
proximidade de massa entre o on molecular da abamectina 871 m/z e da ivermectina 873
m/z, utilizou-se para anlise quantitativa os istopos dos respectivos compostos.
Introduo


16
Turnipseed et al. (2005) analisaram resduos de avermectinas (ivermectina,
doramectina e eprinomectina) e de milbemicina (Moxidectina) em leite por CLAE-
EM/EM, utilizando interfaces de ionizao qumica, electrospray e fotoelectrospray.
Testaram varias formas de ionizao com estas trs interfaces, tanto em modo positivo
como no modo negativo, e a forma de melhor ionizao segundo os autores foi a ionizao
qumica em modo positivo (sem voltagem na agulha do spray) na forma de aduto de
sdio [M+Na]
+
para todos os princpios ativos analisados.

1.2.2 Supresso de ons e o efeito da matriz


De um modo geral, a supresso de ons um fenmeno proporcionado por co-
extrativos da matriz que afetam a formao de ons moleculares dos analitos de interesse.
Ocorre tanto na interface de electrospray como na ionizao qumica, sendo que a
electrospray mais afetada (ANNESLEY, 2003). Recentes experimentos envolvendo a
interface electrospray demonstram que a supresso devido presena de substncias
no volteis ou menos volteis, causando mudanas nas propriedades de formao das
gotas, na evaporao do spray e na competio pela ionizao, em conseqncia uma
menor formao de ons moleculares (King, R et all., 2000). Estas substncias podem ser
glicoprotenas, cidos orgnicos, aminocidos e diversos outros componentes presentes na
matriz. Diferentes procedimentos de extrao e limpeza da amostra tm-se estudado para
evitar a supresso dos ons de interesse, como ela ocorre principalmente no inicio da
corrida cromatogrfica, causada por componentes polares e no retidos, a utilizao de um
gradiente cromatogrfico para tirar a substncia de interesse desta regio de forte
supresso, em geral eficiente (MLLER, C et al., 2002).
O efeito matriz causado por substncias co-extrativas, que alm de produzir a
supresso de ons na interface de ionizao, causa tambm a perda ou acrscimo do sinal
cromatogrfico, influenciando a quantificao dos compostos de interesse. Este efeito
ocorre ao longo de todo o tempo da regio cromatogrfica. A preparao da amostra, com
utilizao de procedimentos de limpeza e gradiente de eluio, minimiza o efeito da matriz,
porm no o elimina totalmente (DAMS, R. et al., 2003; KLOEPFER, A. et al., 2005;
BENIJTS, T. et al., 2004).
Introduo


17
1.3 VALIDAO DE MTODOS ANALTICOS

A validao de metodologia analtica consiste na comprovao, atravs de
evidncias objetivas, de que so respeitados os requisitos especficos para uma determinada
utilizao pretendida (NBR ISO/IEC 17025). Segundo a ANVISA (2003) a validao deve
garantir, atravs de estudos experimentais, que o mtodo atenda s exigncias das
aplicaes pretendidas, assegurando a confiabilidade dos resultados. de fundamental
importncia, que os laboratrios, ao desenvolver um mtodo analtico, implantem mtodos
normalizados ou no normalizados, verifiquem se os parmetros de validao esto de
acordo com os requisitos estabelecidos pelo (s) protocolo (s) utilizado (s) na validao da
metodologia (NBR ISO/IEC 17025).
Com relao aos parmetros de desempenho e critrios de aceitao, os
laboratrios, ao reproduzir mtodos oficiais este considerado validado quando forem
avaliados parmetros como preciso, especificidade e linearidade. No caso de metodologias
no-oficiais, a metodologia s ser considerada validada se forem avaliados os seguintes
requisitos, quando aplicvel: especificidade, linearidade, intervalo, preciso, limite de
deteco, limite de quantificao, exatido e robustez (ANVISA, 2003).

1.3.1 Especificidade

Entende-se por especificidade, a capacidade que o mtodo analtico possui em
discriminar a substncia a analisar de outras substncias presentes na matriz (ismeros,
metablitos, produtos de degradao, componentes da matriz, etc.). Este parmetro de
desempenho do mtodo, aps as investigaes necessrias, utilizado para a avaliao de
possveis falsos negativos, falsos positivos e se a quantificao apreciavelmente
influenciada (COMISSO DAS COMUNIDADES EUROPIAS, 2002; ANVISA, 2003).
A matriz utilizada na anlise poder conter co-extrativos que devero ser avaliados
na validao, pois afetam o desempenho das medies do equipamento, causando o
incremento ou a diminuio da resposta e, conseqente, erro na quantificao. A este erro
proporcional, d-se o nome de efeito matriz (INMETRO, 2003; KLOEPFER et al., 2005;
BENIJTS et al., 2004).
Introduo


18
1.3.2 Limite de deteco

Limite de deteco a menor quantidade do analito presente em uma amostra que
pode ser detectado, no necessariamente quantificada sob condies experimentais
estabelecidas (ANVISA, 2003). Limite de deteco do equipamento (LDE) definido
como uma concentrao do analito que produza um sinal trs vezes superior relao
sinal/rudo (INMETRO, 2003; ANVISA, 2003). Limite de deteco do mtodo (LDM) a
menor concentrao de uma substncia que pode ser detectado com 95% ou 99% de
confiana de que a concentrao do analito maior que zero. Determinado atravs de uma
anlise completa de uma determinada matriz (INMETRO, 2003).
O limite de deteco pode ser determinado de diversas formas como a relao
sinal/rudo, desvio padro da resposta, do coeficiente angular, mtodo visual e modelos
estatsticos. Desde que sejam estabelecidos critrios de aceitabilidade e comprovado com
certo limite de confiana aceitvel (INMETRO, 2003; ANVISA, 2003).

1.3.3 Limite de quantificao

Limite de quantificao (LQ) a menor concentrao do analito presente em uma
amostra que pode ser determinado, com preciso e exatido aceitveis, sob condies
experimentais aceitveis (ANVISA, 2003). Ele pode ser determinado de diversas formas
como relao sinal/rudo superior a 10:1 da linha base, desvio padro da mdia do branco,
estimativa do desvio padro da resposta prximo ao LQ e mtodo visual. Desde que sejam
respeitados os critrios de aceitabilidade e comprovado atravs de testes de preciso e
exatido (ANVISA, 2003).

1.3.4 Intervalo ou faixa linear de trabalho

Para um determinado mtodo quantitativo, existe um determinado intervalo de
concentrao em que o analito pode ser quantificado com exatido, preciso e linearidade
adequadas. Este intervalo especificado compreende a faixa superior e inferior do limite de
quantificao, sendo definido pela resposta do analito no equipamento em que foi efetuada
Introduo


19
a anlise. Normalmente este procedimento derivado do estudo da linearidade (ANVISA,
2003; INMETRO, 2003).

1.3.5 Linearidade

A curva de calibrao pode ser obtida por padronizao interna ou externa. Deve
ser formulada atravs da equao da reta, atravs do mtodo dos mnimos quadrados
ordinrios, para a obteno do resultado da concentrao do analito. Caso a curva de
calibrao no apresente linearidade, poder ser realizada uma transformao matemtica
(INMETRO, 2003).
Linearidade a capacidade de um mtodo analtico em produzir resultados que
sejam diretamente proporcionais concentrao do analito na amostra, dentro de uma
faixa especificada (ANVISA, 2003). A verificao da linearidade na curva de calibrao
um importante passo no desempenho do mtodo analtico durante a validao da
metodologia (SOUZA e JUNQUEIRA, 2005). Pois ela afeta a aplicabilidade, a preciso e a
exatido de um mtodo analtico.
O coeficiente de correlao (r) frequentemente utilizado para indicar o quanto
um modelo linear. O INMETRO (2003) estipula um valor aceitvel de 0,90 e a ANVISA
(2003) estipula um valor de 0,99. Porm, apesar de ser amplamente empregado como
indicao de linearidade interpretada equivocadamente como parmetro de linearidade,
portanto no deve ser utilizado isoladamente.
Um mtodo seguro para avaliar a linearidade atravs da anlise de varincia
(Tabela 1), onde a anlise do modelo e a significncia estatstica da curva ajustada podem
ser testadas. Pode-se determinar se a regresso da curva de calibrao satisfatria,
dividindo a mdia quadrtica da regresso pela mdia quadrtica dos resduos (estimativas
da varincia populacional); quanto maior for esta razo melhor ser a regresso. A
linearidade determinada dividindo a mdia quadrtica do erro puro (erros aleatrios) pela
mdia quadrtica da falta de ajuste (erros aleatrios), ao utilizar a distribuio F, se o F
calculado for menor que F tabelado, podemos considerar que existe linearidade no modelo
(PIMENTEL e NETO, 1996; SOUZA e JUNQUEIRA, 2005).
Introduo


20
Atravs da construo do grfico dos resduos padronizados em funo da
concentrao, poderemos observar visualmente se h indcios de linearidade ou no. Se um
modelo bem ajustado, os resduos so distribudos aleatoriamente. Se existir falta de
ajuste, os resduos tero a tendncia de formar um aspecto curvilneo, indicando que os
resduos so menores nas extremidades da faixa de calibrao e maiores na regio
intermediria. Caso a curva de calibrao no seja linear, pode-se adotar um modelo
quadrtico para a determinao da concentrao do analito (PIMENTEL e NETO, 1996;
SOUZA e JUNQUEIRA, 2005).

TABELA 1 Anlise de varincia para o ajuste do modelo.

Fonte Soma dos quadrados G.L. Mdia quadrtica Teste F
Regresso SQ
R
=n
i
[(ye)i- ym]
2
p - 1 MQreg= SQ
R
/ p - 1 MQreg/ MQr
Resduo SQr= [yij - (ye)i]
2
n - p MQr= SQr / n - p
Falta ajuste SQfaj=n
i
[(ye)i- yim]
2
m - p MQfaj= SQfaj / m - p MQfa/ MQep
Erro puro SQep=[yij - yim]
2
n - m MQep= SQep / n - m
Total SQt=[yij - ym]
2
n - 1
G.L.: graus de liberdade; p: nmero de parmetros do modelo; n: nmero total de medidas; m:
nveis da varivel x; (ye)i: y previsto; ym: mdia global das respostas; yij: resposta; yim: mdia das
respostas de cada nvel;SQR: soma dos quadrados da regresso; SQr: soma dos quadrados dos
resduos; SQfaj: soma dos quadrados da falta de ajuste; SQep: soma dos quadrados do erro puro;
SQt: soma dos quaddrados totais; MQreg: mdia quadrtica de regresso; MQr: mdia quadrtica
dos resduos; MQfaj: mdia quadrtica da falta de ajuste; MQep: mdia quadrtica do erro puro.

1.3.6 Exatido

Exatido o grau de concordncia entre os resultados obtidos pelo mtodo em
relao ao valor verdadeiro (ANVISA, 2003). Os processos normalmente utilizados para
avaliar a exatido so a utilizao de materiais de referncia certificados (MRC),
comparaes interlaboratoriais e testes de recuperao (INMETRO, 2003).

Introduo


21
1.3.6.1 Veracidade

Os MRC devem ser utilizados na determinao da veracidade, um dos
componentes da exatido do mtodo analtico. Este material possui um valor de
concentrao certificado com uma incerteza associada e um nvel de confiana
estabelecido, sendo indispensvel que ele seja fornecido por rgos reconhecidos e
confiveis (COMISSO DAS COMUNIDADES EUROPIAS, 2002).
A veracidade determinada como a seguir:
Analisar seis amostras idnticas do MRC em conformidade com as
instrues do mtodo;
Determinar a concentrao da substncia em cada uma das amostras;
Calcular a mdia, o desvio padro e o desvio padro relativo (CV%);
Calcular a veracidade dividindo a concentrao mdia detectada pelo valor
certificado e multiplicar o valor obtido p 100, para obter a porcentagem.
Veracidade (%) = (concentrao mdia detectada * 100) / valor certificado.
Os intervalos indicados para os desvios entre o valor mdio da concentrao
determinada experimentalmente (corrigida pela recuperao ou sem correo se os clculos
so baseados na curva de calibrao obtida com a matriz) e o valor certificado so
apresentados na Tabela 2 (COMISSO DAS COMUNIDADES EUROPIAS, 2002).

TABELA 2 Veracidade mnima de mtodos quantitativos.

Concentrao Intervalo
1 g/Kg - 50% a + 20%
> 1 g/Kg 10 g/Kg -30% a + 10%
> 10 g/Kg -20% a + 10%


Introduo


22
1.3.7 Recuperao

Quando no estiver disponvel um MRC, a exatido dever ser calculada atravs
da recuperao da substncia de interesse adicionada a uma matriz em branco
(COMISSO DAS COMUNIDADES EUROPIAS, 2002).
A recuperao realizada com a seguir:
Selecionar 18 alquotas de um material em branco e fortificar trs grupos de
seis alquotas nas concentraes de 1, 1,5 e 2 vezes o limite mnimo de
desempenho requerido ou prximas ao limite de deteco do mtodo. Para
substncias com LMR estipulado 0,5, 1, 1,5 vezes o limite permitido;
Determinar a concentrao da substncia em cada uma das amostras;
Calcular a mdia, o desvio padro e o desvio padro relativo (CV%);
Calcular a recuperao dividindo a concentrao mdia detectada pelo valor
fortificado e multiplicando o valor obtido por 100, para obter a
porcentagem.
Recuperao (%) = (concentrao mdia detectada * 100) / nvel de fortificao.
Os intervalos indicativos para os valores mdios das concentraes determinadas
experimentalmente (corrigidas pela recuperao ou sem correo se os clculos so
realizados baseados na curva obtida com a matriz) so os mesmos descritos na tabela 2.

1.3.8 Preciso

Representa a disperso de resultados entre ensaios independentes, repetidos de
amostras semelhantes ou padres, utilizando certas condies definidas. As duas formas
mais comuns de represent-la so por meio de repetitividade e reprodutibilidade, sendo
usualmente expressa pelo desvio padro ou desvio padro relativo (CV%). Ambas so
dependentes da concentrao do analito e devem ser determinadas por um diferente
nmero de concentraes (INMETRO, 2003). A preciso em validaes de mtodos
analticos considerada em trs nveis diferentes: repetitividade, preciso intermediria e
Introduo


23
reprodutibilidade (COMISSO DAS COMUNIDADES EUROPIAS, 2002; IMETRO,
2003; ANVISA, 2003).

1.3.8.1 Repetitividade

Representa o grau de concordncia entre os resultados de medies sucessivas de
um mesmo mensurando, sob as mesmas condies analticas, chamadas de condies de
repetitividade. Deve ser usado os mesmos procedimentos de medio, analista, local e
repeties em um curto espao de tempo.
A repetitividade do mtodo verificada como a seguir:
Selecionar 18 alquotas de um material em branco e fortificar trs grupos de
seis alquotas nas concentraes de 1, 1,5 e 2 vezes o limite mnimo de
desempenho requerido ou prximo ao limite de deteco do mtodo. Para
substncias com LMR estipulado 0,5, 1, 1,5 vezes o limite permitido;
Determinar a concentrao da substncia em cada uma das amostras;
Calcular a mdia, o desvio padro e o desvio padro relativo (CV%);
Repetir estes passos pelo menos mais uma vez;
Calcular a concentrao global mdia e o desvio padro relativo (CV%) para
as amostras fortificadas.

1.3.8.2 Preciso intermediria

a concordncia entre os resultados do mesmo laboratrio, mas obtidos em dias
diferentes, com analistas diferentes ou equipamentos diferentes. Recomenda-se pelo menos
um mnimo de dois dias diferentes com analistas diferentes.
A preciso intermediria verificada como a seguir:
Selecionar 18 alquotas de um material em branco e fortificar trs grupos de
seis alquotas nas concentraes de 1, 1,5 e 2 vezes o limite mnimo de
Introduo


24
desempenho requerido ou prximas ao limite de deteco do mtodo. Para
substncias com LMR estipulado 0,5, 1, 1,5 vezes o limite permitido;
Repetir estes passos pelo menos mais duas vezes com operadores diferentes
e condies ambientais diferentes Por exemplo, lotes diferentes de
reagentes e solventes, temperatura ambiente diferente, instrumentao
diferente se possvel;
Analisar e calcular a concentrao para cada amostra;
Calcular a concentrao global mdia e o desvio padro relativo (CV%) para
as amostras fortificadas.

1.3.8.3 Reprodutibilidade

a concordncia entre os resultados das medies de um mesmo mensurando,
efetuado em condies variadas de medio. O estudo da reprodutibilidade realizado
atravs de estudos colaborativos entre laboratrios. Geralmente utilizada para a
padronizao de metodologias ou para incluso de mtodos analticos, por exemplo, em
farmacopias, procedimentos do CODEX ALIMENTARIUS, etc.
Os laboratrios devem, sempre que possvel, participar de estudos colaborativos
para a verificao da reprodutibilidade dos seus mtodos analticos (COMISSO DAS
COMUNIDADES EUROPIAS, 2002; INMETRO, 2003; ANVISA, 2003). Na tabela 3,
h alguns exemplos dos desvios padres relativos para condies de reprodutibilidade
segundo as orientaes da comisso Europia.






Introduo


25
TABELA 3 Exemplos de desvio padro relativo em condies de
reprodutibilidade para mtodos quantitativos (COMISSO DAS COMUNIDADES
EUROPIAS, 2002).

Concentrao Desvio padro relativo
1 g/Kg (*)
10 g/Kg (*)
100 g/Kg
100 g/Kg
23 %
16 %
(*) Para concentraes inferiores a 100 g/Kg, a aplicao da equao de Horwitz resulta em
valores inaceitavelmente elevados, por conseguinte, os desvios padres relativos abaixo de 100
g/Kg devem ser os mais baixos possveis.

1.3.9 Robustez

A robustez estuda a introduo deliberada pelo laboratrio de pequenas variaes
razoveis e a observao de suas conseqncias. Devem ser efetuados estudos prvios para
a seleo de fatores do pr-tratamento, da limpeza e da anlise da amostra, susceptveis de
influenciarem os resultados da medio. Estes fatores podem incluir o analista, a fonte e a
idade do reagente, solventes, padres e extratos da amostra, a taxa de aquecimento, a
temperatura, o pH, assim como muito outros fatores que podem ser verificados no
laboratrio. Estes fatores devem ser alertados numa ordem de grandeza coerente com os
desvios geralmente encontrados entre laboratrios (COMISSO DAS COMUNIDADES
EUROPIAS, 2002).
A robustez deve ser conduzida da seguinte forma:
Identificar possveis fatores que possam influenciar os resultados;
Variar levemente cada fator;
Realizar um teste de Youden, que uma concepo fatorial fracionria, ou
outros mtodos aprovados;
Introduo


26
Quando for verificado que um fator influencia significantemente os
resultados das medies, devem realizar mais experimentos para decidir
quanto ao limite de aceitabilidade deste fator.
Os fatores que influenciam significativamente os resultados devem ser
claramente identificados no protocolo do mtodo.
Quando alguns fatores apresentam diferenas significativas, isto no significa que
o mtodo no considerado robusto ou que no foi otimizado. Quando os aspectos
quantitativos do mtodo no forem influenciados pelos fatores examinados, o mtodo
pode ser considerado robusto (HEYDEM et al., 2006).

1.3.10 Estabilidade do analito

A estabilidade insuficiente da substncia a analisar, ou dos constituintes da matriz
durante o armazenamento, podem dar origem a desvios significativos no resultado
analtico. Quando a estabilidade do composto a analisar no for definida, devero ser
realizados testes de estabilidade na matriz e no solvente de preparo dos padres em
condio de estocagem (COMISSO DAS COMUNIDADES EUROPIAS, 2002).

1.3.10.1 Estabilidade do analito em soluo

Para os casos em que a estabilidade da substncia a analisar em soluo no for
conhecida, devero ser preparadas solues em concentraes prximas do limite de
desempenho requerido, ou do LMR, e o seu teor medido conforme o mtodo analtico. As
solues, em volumes adequados, devero ser colocadas em recipientes apropriados,
rotuladas e armazenadas de acordo com o seguinte plano: armazenar alquotas a -20C, a +
4C e a + 20C no escuro; armazenar alquotas a + 20C no claro. O tempo de
armazenamento dever ser estipulado quando forem observados os primeiros sinais de
degradao (COMISSO DAS COMUNIDADES EUROPIAS, 2002).

Introduo


27
1.3.10.2 Estabilidade do analito na matriz

Para os casos em que a estabilidade da substncia a analisar na matriz no for
conhecida, havendo a disponibilidade de amostras reais ou amostras fortificadas (prximas
ao LMR ou do limite de desempenho requerido), determinar a concentrao da substncia
enquanto o material ainda estiver fresco. Fracionar o material em diversas alquotas em
recipientes apropriados, rotular e armazenar de acordo com o seguinte plano: armazenar
alquotas a -70 ou -80 C e a -20 C no escuro. O tempo de armazenamento dever ser
estipulado at que sejam observados os primeiros fenmenos de degradao (COMISSO
DAS COMUNIDADES EUROPIAS, 2002).





Objetivos


28
2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Desenvolvimento e implantao no Laboratrio Central do Estado do Paran -
LACEN da metodologia para anlise de avermectinas e a realizao de anlises em
amostras de leite de vaca.

2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

Escolha da melhor interface de ionizao;
Escolha da melhor forma de ionizao;
Otimizar o mtodo de anlise no espectrmetro de massas;
Desenvolvimento do mtodo de extrao e purificao;
Implantao do protocolo de validao para anlise de drogas veterinrias
no LACEN-PR;
Validao da metodologia analtica;
Anlise de avermectinas em leite pasteurizado integral, produzidos na Bacia
leiteira do Estado do Paran.





Experimental


29
3 Experimental

3.1 MATERIAIS

3.1.1 Reagentes e insumos

Padro de abamectina, pureza 99,4%, marca Dr Accustandart;
Padro de ivermectina, pureza 90%, marca USP;
Padro de doramectina, pureza 83,0 %, marca Ehrenstorfe;
Padro de eprinomectina, pureza 96%, marca Ehrenstorfe
Polipropileno glicol (PPG), marca Applied Biosystems;
Coluna cromatogrfica C18 110 de 150 mmX4.6mmX5m, marca Phenomenex;
Coluna cromatogrfica C18 110 de 100 mmX2.1mmX3m, marca ACE;
Cartucho de extrao em fase slida slica-C18 com 22% de carbono (500mg/6mL),
marca Aplied;
Cartucho de extrao em fase slida de Carbono (500mg/6mL), Envi-carb, marca
Supelco;
Cartucho de extrao em fase slida slica-C18 com 19% de carbono (500mg/3mL),
Accu Bond, marca Agilent technologies;
Sulfato de sdio anidro p.a., pureza 99,9%, marca Merck;
gua ultra- pura 18 m;
Acetonitrila grau CLAE, pureza 99,9 %, marca EM Science/Merck;
Diclorometano grau resduo, pureza 99,9%, marca Mallinckrodt;
Acetona grau resduo,pureza 99,4 %, marca J T Backer;
Experimental


30
Acetato de etila grau resduo,pureza 99,8%, marca Carlo Erba;
N-Hexano grau resduo, pureza 99,0%, marca Carlo Erba;
Metanol grau HPLC, pureza 99,9 %, marca Mallinckrodt;
Cloreto de sdio p.a., pureza 99,0%, marca Merck;
Trietilamina p.a., pureza 99,0%, marca Merck;
Acido frmico p.a, pureza 98,0%, marca Merck;
Acetato de amnio p.a., pureza 98,0%, marca Riedel;
Filtros de seringa PTFE 0,22 m, 13mm, marca Millipore;

Microseringa de 1mL, marca Hamilton;


Cilindro de nitrognio comum tipo K de 6 m


3
, marca White Martins.


3.1.2 Equipamentos

Cromatgrafo em fase lquida contendo mdulo desgaseificador, bomba quaternria,
forno de coluna e amostrador automtico. Modelo 1100 da marca Agilent Tecnologies;
Espectrmetro de massas triploquadrupolo modelo API 3000, com interfaces
electrospray e de ionizao qumica, Marca Applied Biosystems/MSD/Sciex;
Gerador de ar e nitrognio de alta pureza 99,999%, marca Peak scientific;
Bomba infusora para microseringa, marca Havard;
Concentrador de amostras turboVap, marca Zimark;
Centrfuga refrigerada de alta rotao (14000 rpm), marca Juan;
Manifold pra 10 posies com torneiras de Teflon, marca Agilent Tecnogies;
Balana analtica de 0,1 mg, modelo Dr202, marca AND;
Balana de preciso de 0,01g, modelo AC2000C, marca Marte;
Experimental


31
Banho de ultra-som com capacidade de 20L, marca Unic.

3.2 PREPARO DAS SOLUES DE ESTOQUE DAS AVERMECTINAS

Uma soluo de estoque de 1000 g.mL
-1
foi preparada individualmente para cada
avermectina, pesando cerca de 10 mg do padro. Em seguida transferido quantitativamente
para um balo volumtrico de 10 mL e completado o volume com metanol. As solues
foram devidamente identificadas e estocadas em freezer a -20 C.

3.3 PREPARO DA FASE MVEL DE ACETATO DE AMNIO 5 mM

Foi preparada inicialmente uma soluo de 1 M, pesando 7,71 g de acetato de
amnio em um becker, dissolvendo em gua ultra-pura e em seguida, transferido
quantitativamente para um balo de 100 mL e finalmente, completado o volume com gua-
ultra pura. Foi preparado 1 L da fase mvel de acetato de amnio 5 mM, transferindo 5 mL
da soluo de acetato de amnio 1 M para um balo volumtrico de 1L e em seguida,
completado o volume com gua pura e finalmente, foi filtrado atravs de membrana 0,45
m.

3.4 PREPARO DAS CURVAS DE CALIBRAO

Elas foram preparadas a partir das solues-estoque de cada avermectina (1000
g.mL
-1
). Foi preparada uma soluo intermediria (de 10 g.mL
-1
) contendo a mistura das
avermectinas, e a partir desta, diluies foram feitas a fim de obtermos cinco concentraes
(0,2 ng.mL
-1
, 0,4 ng.mL
-1
, 0,6 ng.mL
-1
, 1,2 ng.mL
-1
e 2,0 ng.mL
-1
). As diluies foram feitas
com soluo de metanol/ acetato de amnio 5 mM 1:1 v/v. As curvas de calibrao das
avermectinas foram construdas, utilizando-se a resposta (rea) de cada uma das transies
mais abundantes e as concentraes respectivas.



Experimental


32
3.5 MTODOS DE IONIZAO E ANLISE POR MLTIPLA REAO
MONITORADA

Para a escolha do melhor mtodo de ionizao das avermectinas foram avaliados
diversos parmetros de ionizao por electrospray e ionizao qumica. Variando os
modos de ionizao positivo e negativo, utilizando aditivos diferentes como acetato de
amnio e cido frmico, utilizando duas composies de solvente metanol/gua (9:1 v/v) e
acetonitrila/gua (9:1 v/v) e variando a voltagem da descarga de ionizao no caso da
ionizao qumica.

3.5.1.1 Mtodo de ionizao com interface electrospray

Os parmetros selecionados para o espectrmetro de massas e a fonte de
ionizao foram otimizados para possibilitar uma melhor ionizao das avermectinas. Os
seguintes parmetros foram otimizados:
Temperatura do turbo secador: sem ativar;
Gs nebulizador (NEB): Ar, com 8 psi;
Cortina de gs (CUR): Nitrognio, com 9 psi;
Gs secante: Ar sinttico a 8 L / minuto;
Voltagem do spray de ons (IS): 4500 V (modo positivo) e -4500 V (modo
negativo);
Potencial de desaglomerao (DP): 185 V (modo positivo) e -185 V (modo
negativo);
Potencial de Focalizao (FP): 380 V (modo positivo) e -380 V (modo
negativo);
Potencial de Entrada (EP): 10 V (modo positivo) e -10 V (modo negativo).
Parmetros selecionados para o espectrmetro de massas foram os seguintes:
Perodos por scam: 8 ciclos ou 0.4 minutos;
Experimental


33
Tipo de scam: MS1;
Polaridade: positiva e negativa, conforme modo selecionado;
Interface: electrospray;
Acumulo de espectros: sim;
Resoluo: unitria;
Defletor: -100 V (modo positivo) e 100 V (modo negativo);
Canal multiplicador de eltrons do detector (CEM): 2300 V;
Aps a otimizao dos parmetros, foram testadas seis formas de ionizao em
modo EM1 para determinar o melhor tipo de ionizao ocorrida nos modos positivo e
negativo para cada avermectina. Os seis procedimentos de ionizaes foram realizados
utilizando solues padro contendo 1 g.mL
-1
das avermectinas. Os analitos foram
injetados continuamente na interface electrospray utilizando uma bomba infusora com
vazo de 25 L.min
-1
. Foram variadas as seguintes composies de solues padro:
metanol/gua (9:1 v/v), metanol/gua (9:1 v/v) com cido frmico 0,1%, metanol/gua
(9:1 v/v) com acetato de amnio 5 mM, acetonitrila/gua (9:1 v/v), acetonitrila/gua (9:1
v/v) com cido frmico 0,1% e acetonitrila/gua (9:1 v/v) com acetato de amnio 5 mM.
Os espectros de MS1 gerados no modo positivo e negativo foram armazenados para
posterior anlise e discusso.

3.5.1.2 Mtodo de ionizao com interface de ionizao qumica

Os parmetros selecionados para o espectrmetro de massas e a fonte de
ionizao foram otimizados para possibilitar uma melhor ionizao das avermectinas. Os
seguintes parmetros foram otimizados:
Os parmetros otimizados para a fonte foram os seguintes:
Temperatura do turbo secador: 250C;
Gs nebulizador (NEB): Ar, com 6 psi;
Experimental


34
Cortina de gs (CUR): Nitrognio, com 9 psi;
Gs secante: Ar sinttico a 8 L / minuto;
Voltagem da corrente do nebulizador (CN): zero, 2 A (modo positivo) e
zero, -2 A (modo negativo);
Potencial de Desaglomerao (DP): 40 V (modo positivo) e -40 V (modo
negativo);
Potencial de Focalizao (FP): 212 V (modo positivo) e -212 V (modo
negativo);
Potencial de Entrada (EP): 10 V (modo positivo) e -10 V (modo negativo).
Parmetros selecionados para o espectrmetro de massas foram os seguintes:
Perodos por scam: 8 ciclos ou 0.4 minutos;
Tipo de scam: MS1;
Polaridade: positiva e negativa, conforme modo selecionado;
Interface: Ionizao qumica;
Acumulo de espectros: sim;
Resoluo: unitria;
Defletor: -100 V (modo positivo) e 100 V (modo negativo);
Canal multiplicador de eltrons do detector (CEM): 2300 V.
Aps a otimizao dos parmetros, foram realizados seis experimentos em EM1
para determinar o tipo de ionizao ocorrida nos modos positivo e negativo para cada
avermectina. Os seis procedimentos de ionizaes foram realizados utilizando solues
padro contendo 1 g.mL
-1
das avermectinas. Os analitos foram injetados continuamente
na interface de ionizao qumica, utilizando uma bomba infusora com vazo de 25
L.min
-1
. Foram variadas as seguintes composies de solues padro: metanol/gua (9:1
v/v), metanol/gua (9:1 v/v) com cido frmico 0,1%, metanol/gua (9:1 v/v) com
acetato de amnio 5 mM, acetonitrila/gua (9:1 v/v), acetonitrila/gua (9:1 v/v) com cido
Experimental


35
frmico 0,1% e acetonitrila/gua (9:1 v/v) com acetato de amnio 5 mM. Os espectros de
EM1 gerados no modo positivo e negativo, com ou sem descarga corona no nebulizador,
foram armazenados para posterior anlise e discusso.

3.5.2 Procedimentos no modo EM-EM para escolha do mtodo mais sensvel

Dois mtodos selecionados foram por ionizao em electrospray, no modo
positivo na forma de aduto de sdio [M+Na]
+
e negativo na forma desprotonada [M-H]
-
.
O terceiro mtodo selecionado foi por ionizao qumica no modo negativo na forma
desprotonada [M-H]
-
. Com estes trs mtodos de ionizao, foram criados mtodos de
anlise por mltipla reao monitorada, para saber qual possui a maior sensibilidade para
anlise de resduos das avermectinas.

3.5.2.1 Desenvolvimento do mtodo MRM com aduto de sdio [M+Na]
+
por
electrospray

Nesta etapa, foi injetado no modo EM-EM por infuso continua um mix das
avermectinas na concentrao de 100 ng.mL
-1
em metanol/gua (9:1 v/v) com acetato de
amnio 5 mM. Com os seguintes parmetros de fonte:
Temperatura do turbo secador: sem ativar;
Gs nebulizador: Ar, com 8 psi;
Cortina de gs (CUR): Nitrognio, com 9 psi;
Gs secante: Ar sinttico a 8 L / minuto;
Gs de coliso (CAD): Nitrognio, 6 psi;
Voltagem do spray de ons(IS): 4500 V (modo positivo);
Potencial de Desaglomerao (DP): 185 V (modo positivo);
Potencial de Focalizao (FP): 380 V (modo positivo);
Experimental


36
Potencial de Entrada (EP): 10 V (modo positivo);
Parmetros selecionados para o espectrmetro de massas foram os seguintes:
Energia de coliso (CE): 75 V;
Potencial de sada da clula de coliso (CXP):10 V;
Perodos por scam: 20 ciclos;
Tipo de scam: EM-EM;
Polaridade: positiva.
Interface: electrospray;
Resoluo: unitria;
Defletor: -100 V (modo positivo);
Canal multiplicador de eltrons do detector (CEM): 2300 V.
Nesta etapa de otimizao automtica do mtodo os parmetros testados pelo
equipamento foi a fragmentao do on precursor (pai), escolha dos 2 ons produtos mais
intensos (filhos). Foi tambm selecionada automaticamente para cada on fragmentado, a
melhor energia de coliso, potencial de sada da clula de coliso, potencial de
desaglomerao e potencial de focalizao. Ao final da otimizao automtica o software
criou um mtodo MRM com todas as transies otimizadas.
Transies do mtodo MRM:
eprinomectina: 936.6 / 490.5 e 936.6 / 352.4;
abamectina: 895.5 / 751.5 e 895.5 / 607.3;
doramectina: 921.6 / 777.5 e 921.6 / 449.4;
ivermectina: 897.6 / 753.5 e 897.6 / 609.4.


Experimental


37
3.5.2.2 Desenvolvimento do mtodo MRM na forma desprotonada [M-H]
-
por
electrospray

Nesta etapa, foi injetado no modo EM-EM por infuso continua um mix das
avermectinas na concentrao de 100 ng.mL
-1
em metanol/gua (9:1 v/v) com acetato de
amnio 5 mM. Com os seguintes parmetros de fonte:
Temperatura do turbo secador: sem ativar;
Gs nebulizador (NEB): Ar, com 8 os;
Cortina de gs (CUR): Nitrognio, com 9 psi;
Gs secante: Ar sinttico a 8 L / minuto;
Gs de coliso (CAD): Nitrognio, 6 psi;
Voltagem do spray de ons (IS): -4500 V (modo positivo);
Potencial de Desaglomerao (DP): -185 V (modo positivo);
Potencial de Focalizao (FP): -380 V (modo positivo);
Potencial de Entrada (EP): -10 V (modo positivo).
Parmetros selecionados para o espectrmetro de massas foram os seguintes:
Energia de coliso (CE): especifica para cada transio;
Potencial de sada da clula de coliso (CXP): especifica para cada transio;
Perodos por scam: 20 ciclos;
Tipo de scam: EM-EM;
Polaridade: negativa.
Interface: electrospray;
Resoluo: unitria;
Defletor: +100 V;
Canal multiplicador de eltrons do detector (CEM): 2300 V.
Experimental


38
Nesta etapa de otimizao automtica do mtodo os parmetros testados pelo
equipamento foi a fragmentao do on precursor (pai), escolha dos 4 ons produtos mais
intensos (filhos). Selecionou-se tambm automaticamente para cada on fragmentado, a
melhor energia de coliso, potencial de sada da clula de coliso, potencial de
desaglomerao e potencial de focalizao. Ao final da otimizao automtica o software
criou um mtodo MRM com todas as transies otimizadas.
Transies do mtodo MRM:
eprinomectina: 912.6 / 270.3, 912.6 / 565.4, 912.6 / 876.8 e 912.6 / 802.2;
abamectina: 871.6 / 229.3, 871.6 / 565.5, 871.6 / 835.6 e 871.6 / 759.7;
doramectina: 897.6 / 228.8, 897.6 / 591.3, 897.6 / 861.6 e 897.6 / 443.6;
ivermectina: 873.6 / 229.3, 873.6 / 567.6, 873.6 / 837.7 e 873.6 / 763.6.

3.5.2.3 Desenvolvimento do mtodo MRM na forma desprotonada [M-H]
-
por
ionizao qumica

Nesta etapa, foi injetado no modo EM-EM por infuso continua mix das
avermectinas na concentrao de 100 ng.mL
-1
em metanol/gua (9:1 v/v) com acetato de
amnio 5 mM. Com os seguintes parmetros de fonte:
Temperatura do turbo secador: 300C;
Gs nebulizador (NEB): Ar, com 8 psi;
Cortina de gs (CUR): Ar, com 9 psi;
Gs secante: Ar sinttico a 8 L / minuto;
Gs de coliso (CAD): Nitrognio, 6 psi;
Voltagem do spray de ons (IS): -4500 V (modo negativo);
Potencial de Desaglomerao (DP): -55 V (modo negativo);
Potencial de Focalizao (FP): -300 V (modo negativo);
Potencial de Entrada (EP): -10 V (modo negativo).
Experimental


39


Parmetros selecionados para o espectrmetro de massas foram os seguintes:
Energia de coliso (CE): especifica para cada transio;
Potencial de sada da clula de coliso (CXP): especifica para cada transio;
Perodos por scam: 20 ciclos;
Tipo de scam: EM-EM;
Polaridade: negativa;
Interface: ionizao qumica;
Resoluo: unitria;
Defletor: +100 V;
Canal multiplicador de eltrons do detector (CEM): 2300 V.

Nesta etapa de otimizao automtica do mtodo os parmetros testados pelo
equipamento foi a fragmentao do on precursor (pai), escolha dos 3 ons produtos mais
intensos (filhos). Selecionou-se automaticamente para cada on fragmentado, a melhor
energia de coliso, potencial de sada da clula de coliso, potencial de desaglomerao e
potencial de focalizao. Ao final da otimizao automtica o software criou um mtodo
MRM com todas as transies otimizadas.
Transies do mtodo MRM:

eprinomectina: 912.6 / 270.5, 912.6 / 565.7e 912.6 / 876.2;
abamectina: 871.6 / 229.2, 871.6 / 565.2 e 871.6 / 759.7;
doramectina: 897.6 / 229.4, 897.6 / 591.4 e 897.6 / 861.5;
ivermectina: 873.6 / 229.2, 873.6 / 567.7 e 873.6 / 837.5.

Experimental


40
3.5.2.4 Otimizao da injeo de fluxo do mtodo MRM com aduto de sdio
[M+Na]
+
por electrospray

Na injeo de fluxo (FIA) foi acoplado ao espectrmetro de massas o
cromatgrafo em fase liquida, para a otimizao dos parmetros da fonte de ons,
utilizando uma soluo padro do mix das avermectinas de 200 ng.mL
-1
. Foram otimizados
nesta etapa a cortina de gs, o gs de coliso, o gs nebulizador e a voltagem do spray de
ons.
Primeiramente foi editado um mtodo de aquisio CLAE-EM-EM com os
seguintes parmetros:
Volume de injeo do injetor automtico: 20 L;
Fluxo da fase mvel: 350 L.min
-1
;
Composio da fase mvel: 98% metanol e 2% acetato de amnio 5 mM
(isocrtico);
Tempo de analise: 0,7 min;
Dwell time: 250 milsimos de segundos.
Transies do mtodo MRM:
eprinomectina: 936.6 / 490.5 e 936.6 / 352.4;
abamectina: 895.5 / 751.5 e 895.5 / 607.3;
doramectina: 921.6 / 777.5 e 921.6 / 449.4;
ivermectina: 897.6 / 753.5 e 897.6 / 609.4.
Foram otimizados nesta etapa a cortina de gs, o gs de coliso, o gs nebulizador e
a voltagem do spray de ons. Utilizando a melhor mdia de intensidade das transies para
cada um destes parmetros.
Ao final deste procedimento o software do espectrmetro criou um mtodo final
de anlise por MRM.

Experimental


41
3.5.2.5 Otimizao da injeo de fluxo do mtodo MRM na forma
desprotonada [M-H]
-
por electrospray

Na injeo de fluxo (FIA) foi acoplado ao espectrmetro de massas o
cromatgrafo em fase liquida, para a otimizao dos parmetros da fonte de ons,
utilizando uma soluo padro do mix das avermectinas de 200 ng.mL
-1
. Foram otimizados
nesta etapa a cortina de gs, o gs de coliso, o gs nebulizador e a voltagem do spray de
ons.
Primeiramente foi editado um mtodo de aquisio CLAE-EM-EM com os
seguintes parmetros:
Volume de injeo do injetor automtico: 20 L;
Fluxo da fase mvel: 350 L.min
-1
;
Composio da fase mvel: 98% metanol e 2% acetato de amnio 5 mM
(isocrtico);
Tempo de analise: 0,7 min;
Dwell time: 250 milsimos de segundos.
Transies do mtodo MRM:
eprinomectina: 912.6 / 270.3, 912.6 / 565.4, 912.6 / 876.8 e 912.6 / 802.2;
abamectina: 871.6 / 229.3, 871.6 / 565.5, 871.6 / 835.6 e 871.6 / 759.7;
doramectina: 897.6 / 228.8, 897.6 / 591.3, 897.6 / 861.6 e 897.6 / 443.6;
ivermectina: 873.6 / 229.3, 873.6 / 567.6, 873.6 / 837.7 e 873.6 / 763.6.
Foram otimizados nesta etapa a cortina de gs, o gs de coliso, o gs nebulizador
e a voltagem do spray de ons. Utilizando a melhor mdia de intensidade das transies
para cada um destes parmetros.
Ao final deste procedimento o software do espectrmetro criou um mtodo final
de anlise por MRM.

Experimental


42
3.5.2.6 Otimizao da injeo de fluxo do mtodo MRM na forma
desprotonada [M-H]
-
por ionizao qumica

Na injeo de fluxo (FIA) foi acoplado ao espectrmetro de massas o
cromatgrafo em fase liquida sem coluna, para a otimizao dos parmetros da fonte de
ons, utilizando uma soluo padro do mix das avermectinas de 200 ng.mL
-1
. Foram
otimizados nesta etapa a cortina de gs, o gs de coliso, o gs nebulizador e a voltagem do
spray de ons.
Primeiramente foi editado um mtodo de aquisio CLAE-EM-EM com os
seguintes parmetros:
Volume de injeo do injetor automtico: 20 L;
Fluxo da fase mvel: 350 L.min
-1
;
Composio da fase mvel: 98% metanol e 2% acetato de amnio 5 mM
(isocrtico);
Tempo de analise: 0,7 min;
Dwell time: 250 milsimos de segundos.
Transies do mtodo MRM:
eprinomectina: 912.6 / 270.5, 912.6 / 565.7e 912.6 / 876.2;
abamectina: 871.6 / 229.2, 871.6 / 565.2 e 871.6 / 759.7;
doramectina: 897.6 / 229.4, 897.6 / 591.4 e 897.6 / 861.5;
ivermectina: 873.6 / 229.2, 873.6 / 567.7 e 873.6 / 837.5.
Foram otimizados nesta etapa a cortina de gs, o gs de coliso, o gs nebulizador
e a voltagem do spray de ons. Utilizando a melhor mdia de intensidade das transies
para cada um destes parmetros. Ao final deste procedimento o software do espectrmetro
criou um mtodo final de anlise por MRM.


Experimental


43
3.5.3 Comparao e escolha do mtodo MRM mais sensvel

Os trs mtodos criados por MRM, foram comparados entre si por anlise de
uma soluo padro do mix das avermectinas na concentrao de 1 ng.mL
-1
(1 ppb).
Injetados em triplicata para cada mtodo.
As avermectinas foram analisadas com os seguintes parmetros cromatogrficos
para os trs mtodos:
Coluna cromatogrfica: C18 de fase reversa com dimenses de 4.6 mm X
150 mm X 5m da marca Phenomenex;
Volume de injeo do injetor automtico: 20 L;
Fluxo da fase mvel: 800 L.min
-1
;
Composio da fase mvel: 98% metanol e 2% acetato de amnio 5 mM
(isocrtico);
Tempo de analise: 8,0 min.

3.5.4 Mtodo final

O mtodo final para a anlise das avermectinas foi o mtodo de MRM com aduto
de sdio [M+Na]
+
, utilizando a interface electrospray. Este foi ajustado para melhorar a
sua sensibilidade, modificado em alguns parmetros de MRM e FIA. O mtodo final ficou
otimizado com os seguintes parmetros:
Transies do mtodo MRM:
eprinomectina: 936.6/490.5 e 936.6/352.4;
abamectina: 895.5/751.5 e 895.5/607.3;
doramectina: 921.6/777.5 e 921.6/449.4;
ivermectina: 897.6/753.5 e 897.6/609.4;
Parmetros da interface:
Voltagem do spray de ons: 4000 V;
Experimental


44
Temperatura da interface: 500C;
Gs de coliso: 8.00 psi;
Potencial de entrada:10.0 V;
Gs nebulizador: 14 psi;
Cortina de gs: 10 psi;
Gs secante: Ar sinttico a 8 L/minuto.
Parmetros Cromatogrficos:
Volume de injeo: 20 L;
Fluxo da fase mvel: 250 L.min
-1
;
Composio da fase mvel: Solvente A (acetato de amnio 5mM) e
solvente B (metanol).
Gradiente de eluio cromatogrfica: Inicial 80% de solvente B e 20% de
A por 0,5 minutos, com rampa linear para 95% de solvente B e 5% de
A em 2 minutos, permanecendo nesta condio por 5 minutos. O
gradiente volta a sua condio inicial em 0,01 minutos, permanecendo nesta
condio at 14 minutos.
Tempo de anlise: 14 minutos;
Coluna cromatogrfica: C18 de 100 mm comprimento X 2.1 mm de
dimetro interno X 3 m de tamanho de partcula (marca ACE).
3.6 OTIMIZAO DA LIMPEZA DAS AMOSTRAS POR EFS

Foram testados cartuchos de extrao em fase slida slica-C18 com 22% de
carbono (500 mg.6mL
-1
) e cartucho de carbono envi-carb (500 mg.6mL
-1
). Foram
realizados testes em triplicata da recuperao das avermectinas com cinco solventes de
eluio (diclorometano, acetonitrila, metanol, n-hexano e acetona) conforme experimentos
descritos abaixo. Os resultados foram armazenados para posterior anlise e discusso.
Experimental


45
Para o teste de eluio com o primeiro dos cinco solventes, foi utilizado o
seguinte procedimento: Com o auxlio de um suporte acoplado bomba de vcuo, trs
cartuchos de EFS C
18
e trs de carbono Envi-carb foram condicionados com
diclorometano (5 mL), a uma vazo de 4 mL.min
-1
. Uma soluo de 2 ng.mL
-1
da mistura
das avermectinas foi aplicada nos cartuchos, eludas com duas fraes de diclorometano (5
mL) e coletados em tubos separados. As duas fraes coletadas de cada triplicata foram
levadas secura em um turbo evaporador (45C sob fluxo de nitrognio), reconstitudas
com soluo de metanol/acetato de amnio 5 mM 9:1 v/v (1 mL) e filtradas com filtro de
seringa de 0, 22 m para um frasco de 2 mL. Posteriormente foram injetadas no sistema
CLAE-EM/EM para quantificao, com uma curva de calibrao de cinco nveis (0,2
ng.mL
-1
, 0,4 ng.mL
-1
, 0,6 ng.mL
-1
, 1,2 ng.mL
-1
e 2,0 ng.mL
-1
).
O mesmo procedimento acima foi realizado com os solventes de eluio
acetonitrila, metanol, n-hexano e acetona.

3.7 PREPARAO DAS AMOSTRAS DE LEITE

Fundamentados em mtodos da referncia bibliogrfica (TURNIPSEED, S. B. et
al., 2005; POLLMEIER, M. et al., 2002; DISERENS, H. e HENZELIN, M. 1999;
FUNED, 2005; HORMAZABAL, M., 2001) foram desenvolvidos cinco mtodos para
comparao. Foi utilizada uma amostra de leite fortificada com a mistura das avermectinas
levando a concentrao final de 1, 0 g.L
1
, em triplicata.

Mtodo 1:
Uma aliquota de leite (2mL) foi transferida para um frasco de polipropileno, foi
adicionada acetonitrila (20 ML) e a mistura agitada vigorosamente por 5 minutos para
obteno do extrato. O sobrenadante foi transferido para um erlenmayer, ao qual foram
adicionados trietilamina (0,05 mL) e cloreto de sdio a 1% (60 mL). Com o auxlio de um
manifold acoplado bomba de vcuo, um cartucho de EFS slica-C18 22% de carbono
(500 mg.6mL
-1
) foi condicionado com acetona (5mL), seguido de uma soluo de
acetonitrila 40%/NaCl 1% (5mL). Todo extrato foi adicionado coluna e o vcuo foi
Experimental


46
aplicado de modo a obter uma vazo de 4 a 5 mL.min
-1
. Aps eluio do extrato, a coluna
foi lavada com gua pura (10 mL) e todo vcuo foi aplicado por 1 minuto. As avermectinas
foram eludas com acetona (5mL), coletadas em um frasco e levadas secura em um turbo
evaporador (45C sob fluxo de nitrognio). A amostra foi ento reconstituda com uma
mistura de metanol /acetato de amnio 5 mM 1:1 v/v (1 mL) e filtrada com filtro de
seringa de 0, 22 m para um frasco de 2 mL. Posteriormente foram injetadas no sistema
CLAE-EM-EM para quantificao, com uma curva de calibrao de cinco nveis (0,2
ng.mL
-1
, 0,4 ng.mL
-1
, 0,6 ng.mL
-1
, 1,2 ng.mL
-1
e 2,0 ng.mL
-1
).

Mtodo 2:
Uma aliquota de leite (2mL) foi transferida para um tubo de polipropileno
juntamente com 8 mL de uma soluo de extrao contendo gua, acetonitrila, trietilamina
(69,9/30/0,1 v/v) e a mistura foi ento agitada vigorosamente por 5 minutos para
obteno do extrato. Com o auxlio de um manifold acoplado bomba de vcuo, um
cartucho de EFS slica-C18 22% de carbono (500 mg.6mL
-1
) foi condicionado com acetona
(5mL), seguido da soluo de extrao (5mL). Todo extrato foi adicionado coluna e o
vcuo foi aplicado de modo a obter uma vazo de 4 a 5 mL.min
-1
. Aps eluio do extrato,
a coluna foi lavada com o reagente de Extrao (5mL), ento todo vcuo foi aplicado por 5
minutos. A coluna foi lavada novamente com hexano (2 mL) e todo vcuo foi aplicado por
mais 1 minuto. As avermectinas foram eludas com acetona (3mL), coletadas em um frasco
e levadas secura em um turbo evaporador (45C sob fluxo de nitrognio). A amostra foi
ento reconstituda com uma mistura de metanol /acetato de amnio 5 mM 1:1 v/v (1 mL)
e filtrada com filtro de seringa de 0, 22 m para um frasco de 2 mL. Posteriormente, foram
injetadas no sistema CLAE-EM-EM para quantificao, com uma curva de calibrao de
cinco nveis (0,2 ng.mL
-1
, 0,4 ng.mL
-1
, 0,6 ng.mL
-1
, 1,2 ng.mL
-1
e 2,0 ng.mL
-1
).

Mtodo 3:
Uma aliquota leite (2mL) foi transferida para um tubo de polipropileno,
acetonitrila (5mL) foi adicionada e a mistura agitada vigorosamente por 5 minutos e
centrifugada a 4000 rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi transferido para um tubo de
Experimental


47
ensaio, clorofrmio (5mL) foi acrescentado e a mistura agitada vigorosamente por um
minuto e centrifugado a 4000 rpm por um minuto. A fase aquosa superior foi descartada e
o extrato orgnico obtido foi evaporado em um turbo evaporador (45C sob fluxo de
nitrognio) at a secura. A amostra foi reconstituda com uma soluo de metanol /acetato
de amnio 5 mM 1:1 v/v (1 mL) e filtrada com filtro de seringa de 0, 22 m para um
frasco de 2 mL. Posteriormente, foram injetadas no sistema CLAE-EM-EM para
quantificao, com uma curva de calibrao de cinco nveis (0,2 ng.mL
-1
, 0,4 ng.mL
-1
, 0,6
ng.mL
-1
, 1,2 ng.mL
-1
e 2,0 ng.mL
-1
).

Mtodo 4:
Aps obteno do extrato seco clorofrmico descrito no item anterior. Este foi
reconstitudo com metanol 30% (1 mL). Com o auxlio de um manifold acoplado a bomba
de vcuo, um cartucho de EFS slica-C18 19% de carbono (500 mg.3mL
-1
) foi
condicionado com acetona (3 mL), seguido de metanol 30% (3mL). Todo extrato foi
adicionado coluna e o vcuo foi aplicado de modo a obter uma vazo de 4 a 5 mL.min
-1
.
Aps eluio do extrato, a coluna foi lavada com metanol 30% (9mL) e todo vcuo foi
aplicado por 5 minutos. As avermectinas foram eludas com acetona (3mL), coletadas em
um frasco e levadas secura em um turbo evaporador (45C sob fluxo de nitrognio). A
amostra foi ento reconstituda com uma mistura de metanol /acetato de amnio 5 mM 1:1
v/v (1 mL) e filtrada com filtro de seringa de 0, 22 m para um frasco de 2 mL.
Posteriormente, foram injetadas no sistema CLAE-EM-EM para quantificao, com uma
curva de calibrao de cinco nveis (0,2 ng.mL
-1
, 0,4 ng.mL
-1
, 0,6 ng.mL
-1
, 1,2 ng.mL
-1
e 2,0
ng.mL
-1
).

Mtodo 5:
Uma aliquota de leite (2mL) foi transferida para um tubo de polipropileno,
acetonitrila 30% (4mL) foi adicionada e a mistura agitada vigorosamente por 5 segundos
para obteno do extrato. Utilizando um manifold acoplado a bomba de vcuo, um
cartucho de EFS slica-C18 19% de carbono (500 mg.3mL
-1
) foi condicionado com acetona
(3mL), seguido de acetonitrila 30% (3 mL). Todo extrato foi adicionado coluna e o vcuo
Experimental


48
foi aplicado de modo a obter uma vazo de 4 a 5 mL.min
-1
. Aps eluio do extrato, a
coluna foi lavada com acetonitrila 30% (9mL) e todo vcuo foi aplicado por 5 minutos. A
coluna foi lavada novamente com hexano (6mL) e todo vcuo foi aplicado novamente por
1 minuto. As avermectinas foram eludas com acetona (3mL), coletadas em um frasco e
levadas secura em um turbo evaporador (45C sob fluxo de nitrognio). A amostra foi
ento reconstituda com uma mistura de metanol /acetato de amnio 5 mM 1:1 v/v (1 mL)
e filtrada com filtro de seringa de 0, 22 m para um frasco de 2 mL. Posteriormente, foram
injetadas no sistema CLAE-EM-EM para quantificao, com uma curva de calibrao de
cinco nveis (0,2 ng.mL
-1
, 0,4 ng.mL
-1
, 0,6 ng.mL
-1
, 1,2 ng.mL
-1
e 2,0 ng.mL
-1
).

3.8 PROCEDIMENTO PARA ESCOLHA DO MTODO DE EXTRAO

Para a escolha do mtodo mais vivel foi levada em considerao a rapidez no
preparo das amostras, menos etapas nos procedimentos de extrao e purificao, com
menos co-extrativos e, principalmente, que possua a melhor preciso e exatido.
Trs dos cinco mtodos escolhidos foram selecionados para serem comparados
entre si. A verificao do desempenho dos mtodos foi realizada com um teste de
recuperao, fortificando uma amostra de leite com 1,0 g.L
-1
(1ppb) do mix das
avermectinas em quintuplicata, onde foram determinadas a mdia das recuperaes, o
desvio padro e a preciso.
Este procedimento foi realizado confeccionando duas curvas de calibrao, uma
preparada no solvente e outra no extrato. As amostras foram quantificadas utilizando as
duas curvas de calibrao para a comparao dos resultados.
Para a obteno da curva de calibrao no solvente, o mix das avermectinas foi
diludo com uma soluo de metanol 50% / acetato de amnio 5mM 1:1 v/v, nas
concentraes de 0,2 ng.mL
-1
, 0,4 ng.mL
-1
, 0,6 ng.mL
-1
, 1,2 ng.mL
-1
e 2,0 ng.mL
-1
. A curva
de calibrao no extrato foi obtida atravs do procedimento de extrao e purificao de
uma amostra de leite sem resduos de avermectinas, onde foram obtidos cinco extratos
secos, sendo estes reconstitudos com 1 mL de volume final das diluies preparadas
conforme curva no solvente.

Experimental


49
3.9 PROCEDIMENTO PARA DETERMINAO DA SUPRESSO DE ONS

Utilizando uma bomba infusora (Figura 10), uma soluo contendo 2 ng.mL
-1
do
mix das avermectinas foi introduzida no efluente cromatogrfico ps-coluna com vazo de
20 L. minutos
-1
, produzindo uma elevada e constante linha de base. Aps procedimento
de extrao e purificao do leite sem avermectinas, a amostra foi injetada no sistema
CLAE-EM-EM para verificao de qualquer alterao na linha de base. Este procedimento
foi realizado com todos os mtodos testados neste estudo.








Figura 10 Esquema da determinao da supresso de ons.

3.10 PROCEDIMENTO PARA O TESTE DE EFEITO MATRIZ

Este procedimento foi realizado confeccionando-se duas curvas de calibrao,
uma preparada a partir de solues no solvente e outra, no extrato. As curvas foram
preparadas conforme descrito no item 3.8. Foi realizado tambm um teste t (Student)
estatstico de significncia, para verificar se os coeficientes angulares das duas curvas so
significativamente diferentes (INCQS, 2003). Inicialmente, foram calculadas as varincias
individuais das duas curvas, atravs do teste F (F1), conforme frmula abaixo:




Onde (Sy/x1)
2
a estimativa do desvio padro residual da curva 1 e (Sy/x2)
2
a da
curva 2. Se o valor F calculado for menor que o tabelado com 95% de confiana
CLAE
Bomba
infusora
Interface
Analisador de massas
Coluna
Experimental


50
(p=0,05) e (n1-1) e (n2-1) graus de liberdade para o numerador e denominados, no existe
diferena significativa entre as duas curvas, ento uma estimativa do desvio padro
agregado pode ser calculada pela formula a seguir:




Onde Sy/xa a estimativa do desvio padro residual agregado das curvas 1 e 2,
Sy/x1

e Sy/x2

so respectivamente a estimativa do desvio padro residual da curva 1 e 2,
n1+n2-4 so os nmeros totais de medidas das curvas menos 4 graus de liberdade. Caso o
valor de F calculado (primeira formula acima) seja maior que o valor F tabelado
bilateral, com 95% de confiana (p=0,05) e (n1-1) e (n2-1) graus de liberdade para o
numerador e denominados respectivamente, considerou-se que as duas varincias residuais
foram significantemente diferentes, portanto foi realizada uma abordagem semelhante ao
teste de comparao de duas mdias com varincias diferentes, conforme formula a seguir:



Onde b1 e b2 so os coeficientes angulares das curvas 1 e 2 respectivamente,
Sy/xa a estimativa do desvio padro agregado das curvas 1 e 2, xi
1
a concentrao da
soluo padro do analito no solvente e xi
2
na amostra, e a mdia dos valores de
xi
1 e
xi
2
respectivamente, e n1 e n2 so o nmero total de medidas das curvas 1 e 2. Se o
valor obtido por uma das duas frmulas acima for maior que o valor t, a diferena
significativa, portanto considera-se que h um erro sistemtico proporcional devido ao
efeito matriz.
Aps obteno das respostas das reas, atravs de uma planilha do Excel foi
plotado um grfico com as curvas e realizado o clculo do efeito matriz para cada
avermectina.
Experimental


51
3.11 PROCEDIMENTOS DE VALIDAO

3.11.1 Metodologia analtica proposta

Os parmetros analticos do espectrmetro de massas para anlise das
avermectinas encontram-se descrito no item 3.5.4. O mtodo de extrao e purificao das
avermectinas encontra-se descrito no item 3.7 do mtodo 5.

3.11.2 Estudo da especificidade

Para a avaliao da especificidade e/ou a seletividade do mtodo, realizaram-se os
seguintes experimentos: avaliao de possveis interferentes nas amostras de leite; avaliao
de possveis interferentes do padro das avermectinas e do branco reagente e realizao do
teste de degradao das avermectinas.

3.11.2.1 Avaliao de interferentes do leite

Para a avaliao de possveis interferentes foi realizada a anlise de dez diferentes
amostras de leite orgnico e dez amostras de leite integral pasteurizado. As amostras foram
analisadas conforme procedimento do item 3.7 do mtodo 5.

3.11.2.2 Avaliao de interferentes do padro das avermectinas e do branco
reagente

Para a avaliao de possveis interferentes, como produtos de degradao e
metablitos provenientes da substncia padro, foi injetado individualmente no sistema
CLAE-EM-EM em triplicata uma soluo padro de 10 g.L
-1
da eprinomectina,
abamectina, Doramectina e ivermectina.
Para a avaliao do branco reagente, a alquota de 2 mL da amostra de leite foi
substituda por 2 mL de gua pura, ento foi realizado o procedimento de extrao e
purificao da amostra, conforme mtodo analtico descrito no item 3.7 do mtodo 5.
Experimental


52
3.11.2.3 Teste de degradao das avermectinas

Amostras individuais da eprinomectina, abamectina, doramectina e ivermectina,
foram submetidas a condies de estresse como: exposio temperatura de 100 C;
hidrlise cida, hidrlise alcalina e oxidao com perxido de hidrognio 30%. Para a
verificao da presena de possveis metablitos, derivados ou produtos de degradao que
interfiram na anlise das avermectinas.
Na exposio temperatura de 100 C, 1 mL da soluo padro de 1 g.mL
-1
(diluda em gua) de cada avermectina foi adicionada em tubos de ensaio individuais e
colocada em banho Maria a 100 C por uma hora. Posteriormente, foi realizado o
procedimento de extrao e purificao da amostra conforme descrito item 3.7 do mtodo
5 e injetadas no sistema CLA-EM-EM para anlise.
Na oxidao, o procedimento foi semelhante ao pargrafo anterior, acrescentando
apenas perxido de hidrognio a 30% (1 mL) nos tubos de ensaio.
Na hidrlise cida, 1 mL da soluo padro de 1 g.mL
-1
(diluda em gua) de cada
avermectina foi adicionada em tubos de ensaio individuais onde foi acrescentado cido
clordrico 1 N (1 mL) e colocada em banho Maria a 100 C por uma hora. Posteriormente,
a soluo hidrolisada foi neutralizada com 1 mL hidrxido de sdio 1 N e realizado o
procedimento de extrao e purificao da amostra, conforme descrito item 3.7 do mtodo
5 e injetadas no sistema CLA-EM-EM para anlise.
Na hidrlise alcalina, o procedimento foi semelhante ao pargrafo anterior,
utilizando hidrxido de sdio 1 N para a hidrlise e cido clordrico para a neutralizao.

3.11.3 Determinao do limite de deteco e quantificao do equipamento

Os limites de deteco e quantificao foram determinados considerando o efeito
matriz. As diluies do mix das avermectinas foram preparadas no extrato seco do leite,
conforme item 3.7 do mtodo 5.
O limite de deteco do equipamento (LDE) foi determinado injetando solues
do mix das avermectinas nas concentraes de 50, 100, 200, 400 e 500 pg.mL
-1
, at obter
uma razo sinal/rudo de 3:1 das transies.
Experimental


53
O limite de quantificao do equipamento (LQE) foi determinado conforme
pargrafo anterior, at obter uma razo sinal/rudo de 10:1 das transaes.

3.11.4 Determinao do limite de deteco e quantificao do mtodo

Os limites de deteco e quantificao do mtodo foram determinados
fortificando, em triplicata, uma amostra de leite testemunha sem resduos de avermectinas
com os limites de deteco e quantificao do equipamento. Ao realizar os procedimentos
de extrao e purificao do mtodo, foram injetados no sistema CLAE-EM-EM para
avaliao do sinal / rudo do limite de deteco e quantificao e a recuperao obtida no
nvel de quantificao.

3.11.5 Faixa linear de trabalho

A faixa linear de trabalho foi confeccionada a partir do limite de quantificao,
utilizando cinco pontos previamente selecionados nas concentraes de 0,2 ng.mL
-1
, 0,4
ng.mL
-1
, 0,6 ng.mL
-1
, 1,2 ng.mL
-1
e 2,0 ng.mL
-1
. A confirmao da faixa linear foi realizada
atravs do estudo da linearidade.

3.11.6 Linearidade

Para o estudo da linearidade, foi preparada a partir da soluo de estoque de cada
avermectina (1000 g.mL
-1
) uma soluo intermediria de 10 g.mL
-1
contendo o mix das
avermectinas e, a partir desta, diluies foram feitas a fim de obtermos cinco nveis de
concentrao. Os nveis foram preparados utilizando uma soluo de metanol/ acetato de
amnio 5 mM 1:1 v/v considerando o efeito matriz. Os nveis definidos pelo estudo foram
de 0,2 ng.mL
-1
, 0,4 ng.mL
-1
, 0,6 ng.mL
-1
, 1,2 ng.mL
-1
e 2,0 ng.mL
-1
.
A anlise foi conduzida injetando os cinco nveis em triplicata no sistema CLAE-
EM-EM. A partir dos resultados obtidos pelas respectivas reas das avermectinas, foi
executado o tratamento estatstico dos dados, utilizando um programa desenvolvido em
planilha do Excel. Foram obtidos pelas planilhas, o grfico da curva de calibrao, o
Experimental


54
grfico dos resduos padronizados, a equao da reta obtida pelo mtodo dos mnimos
quadrados, os coeficientes linear e angular, o coeficiente de correlao, os valores
aberrantes das triplicatas calculadas pelo teste de Grubbs e a anlise de varincia para o
clculo da falta de ajuste da curva de calibrao.

3.11.7 Determinao da robustez


Os parmetros estudados na anlise da robustez foram os da interface e da
extrao. Para este estudo foi realizado um planejamento fatorial completo no ponto
central com dois nveis, trs fatores e trs rplicas (NETO et al., 1996). Perfazendo um
total de 27 experimentos por modelo.
Os dados obtidos foram tratados estatisticamente, utilizando o software estatstico
Minitab. Com o uso do software foi possvel realizar interaes com os fatores
estudados, bem como utilizar recursos para gerar o grfico de Pareto. Onde foi possvel
visualizar estatisticamente, com um nvel de significncia = 0,05, os efeitos significativos
que ultrapassaram da linha de referncia do diagrama.

3.11.7.1 Otimizao dos parmetros da interface atravs de planejamento
fatorial

Os fatores estudados da interface para cada avermectina foram realizados em duas
etapas. Na primeira, foram estudados os parmetros da temperatura da interface, a
voltagem da sonda (energia de ionizao) e a presso do gs nebulizador (tabela 4). Na
segunda etapa, foram estudados os parmetros que podero afetar a ionizao das
avermectinas na interface, sendo eles o fluxo da fase mvel, a concentrao do acetato de
amnio e a porcentagem de metanol no gradiente (tabela 5). O planejamento fatorial
encontra-se representado na tabela 7, sendo que este foi montado de forma aleatria pelo
software Minitab e executado nesta ordem.
Para cada experimento do planejamento fatorial, foi injetado em triplicata no
sistema CLAE-EM-EM um mix do padro das avermectinas na concentrao de 1 g.L
-1
,
preparado na matriz de interesse.
Experimental


55
TABELA 4 Variao dos fatores do planejamento da interface (primeira etapa).

Fator Ponto central Nvel inferior - Nvel superior +
Temperatura 475 C 450 C 500 C
Voltagem 3750 V 35000 V 4000 V
Presso 13 psi 12 psi 14 psi

TABELA 5 Variao dos fatores do planejamento da interface (segunda etapa).

Fator Ponto central Nvel inferior - Nvel superior +
Fluxo 230 L. minuto
-1
200 L. minuto
-1
250 L. minuto
-1

Acetato amnio 3 mM 4 mM 5 mM
% metanol 19% inicial 18% inicial 20% inicial

3.11.7.2 Otimizao da extrao atravs de planejamento fatorial

Os fatores estudados do procedimento de extrao das avermectinas foram a
alquota da amostra, a carga de carbono do cartucho de extrao em fase slida e a
porcentagem de acetonitrila utilizada para a extrao e eluio (tabela 6). O planejamento
fatorial encontra-se representado na tabela 7, sendo que este foi montado de forma
aleatria pelo software Minitab e executado nesta ordem. Para cada experimento do
planejamento fatorial, foi injetado em triplicata no sistema CLAE-EM-EM uma amostra
fortificada das avermectinas na concentrao de 1 g.L
-1
, preparada na matriz de interesse.

TABELA 6 Variao dos fatores estudados no planejamento fatorial da extrao.

Fator Ponto central Nvel inferior - Nvel superior +
Alquota 1,5 mL 1 mL 2 mL
% carbono 19 %* 19 % 22 %
% acetonitrila 27 % 25 % 30 %
* Foi utilizado este valor por no possuir um cartucho EFS com carga de carbono intermediria aos
valoras estudados.

Experimental


56
TABELA 7 Planejamento fatorial completo 2
3
com trs variveis e ponto central.

Experimento Fator 1 Fator 2 Fator 3
3 -1 1 -1
24 1 1 1
5 1 -1 -1
4 -1 1 1
1 -1 -1 -1
26 0 0 0
20 -1 1 1
11 -1 1 -1
9 -1 -1 -1
12 -1 1 1
7 1 1 -1
17 -1 -1 -1
21 1 -1 -1
19 -1 1 -1
25 0 0 0
22 1 -1 1
6 1 -1 1
14 1 -1 1
10 -1 -1 1
23 1 1 -1
27 0 0 0
15 1 1 -1
16 1 1 1
2 -1 -1 1
13 1 -1 -1
18 -1 -1 1
8 1 1 1
Experimental


57
3.11.8 Exatido

A exatido do mtodo foi determinada atravs do estudo da recuperao das
avermectinas, fortificando 3 nveis de seis alquotas de leite sem resduos. Os nveis de
fortificao foram de 0,2 g.L
-1
, 0,3 g.L
-1
e 0,4 g.L
-1
. As amostras fortificadas foram
extradas e purificadas, conforme item 3.7 do mtodo 5. Posteriormente, foram injetadas
no sistema CLAE-EM-EM para quantificao, com uma curva de calibrao de cinco
nveis (0,2 ng.mL
-1
, 0,4 ng.mL
-1
, 0,6 ng.mL
-1
, 1,2 ng.mL
-1
e 2,0 ng.mL
-1
). Aps a obteno
dos dados de recuperao, estes foram tratados estatisticamente utilizando uma planilha
Excel, onde foram calculadas para cada uma das avermectinas a recuperao mdia, o
desvio padro e o desvio padro relativo.

3.11.9 Preciso

A preciso do mtodo analtico foi determinada atravs de dois estudos:
repetitividade e preciso intermediria.

3.11.10 Repetitividade

A repetitividade do mtodo foi determinada atravs do estudo da recuperao das
avermectinas, conforme descrito no procedimento do item 3.11.8. Este procedimento foi
realizado por mais duas vezes em dias diferentes. Aps obteno dos dados de
recuperao, estes foram tratados estatisticamente utilizando uma planilha Excel, onde
foram calculadas para cada uma das avermectinas a recuperao mdia global, o desvio
padro e o desvio padro relativo.

3.11.11 Preciso intermediria

A preciso intermediria intralaboratorial do mtodo foi determinada atravs do
estudo da recuperao das avermectinas, conforme descrito no procedimento do item
3.11.8. Este procedimento foi realizado por trs vezes, em diferentes dias e alterando o
Experimental


58
analista. Aps obteno dos dados de recuperao, estes foram tratados estatisticamente
utilizando uma planilha Excel, onde foi calculado para cada uma das avermectinas a
recuperao mdia global, o desvio padro e o desvio padro relativo.

3.11.12 Estabilidade dos padres

No procedimento do teste de estabilidade em solvente, foram preparadas quatro
solues de 10 mL de um mix das avermectinas na concentrao de 1,0 ng.mL
-1
em
metanol

e a soluo fresca analisada. Posteriormente, foi acondicionada uma soluo a
temperatura ambiente (20 C) exposta claridade e outra no escuro, outra soluo foi
acondicionada em geladeira (+4 C) e uma quarta soluo foi acondicionada em freezer (-
20 C). Estas solues foram analisadas a cada 30 dias, quando possvel, para verificao da
estabilidade nestas condies, durante um perodo de quatro meses ou menos. As
concentraes destas solues foram calculadas em forma de porcentagem e comparadas
com a soluo de zero dias para avaliao da degradao.
Para procedimento de estabilidade na matriz leite, foram realizadas cinco
fortificaes de 1,0 ng.mL
-1
em uma amostra de leite, ento a soluo fresca foi analisada.
Posteriormente, as solues preparadas foram acondicionadas em freezer (-20 C) e foram
analisadas a cada 30 dias para a verificao da estabilidade na matriz. As concentraes
destas solues foram calculadas em forma de porcentagem e comparadas com a soluo
de zero dias para avaliao da degradao.

3.12 ANLISE DAS AMOSTRAS DE LEITE

Foram analisadas 157 amostras de leite pasteurizado integral, provenientes da
Bacia leiteira do Estado do Paran. As amostras foram coletadas em 2006 pela Vigilncia
Sanitria do Estado do Paran VISA/PR e encaminhadas para o Laboratrio Central do
Estado do Paran LACEN/PR para anlise.


Resultados e Discusso


59
4 RESULTADOS E DISCUSSO

4.1 RESULTADOS DAS INTERFACES DE IONIZAO

Todos os resultados das interfaces de ionizao qumica e electrospray esto
relacionados em tabela no anexo I e II.
4.1.1 Resultados da Interface de Ionizao Qumica

Na ionizao qumica, no modo positivo, foi observada a formao de molculas
ionizadas nas formas protonada [M+H]
+
e aduto de amnio [M+ NH
4
]
+
. E no modo
negativo as molculas foram ionizadas nas formas desprotonada [M-H]
-
, como aduto de
acetato [M+CH
3
COO]
-
e formiato [M+HCOO]
-
, conforme observado nas Figuras 11 e 12.
Figura 11 Espectro de massas (EM1) em modo positivo da abamectina.

Resultados e Discusso


60

Figura 12 Espectro de massas (EM1) em modo negativo da abamectina.

Utilizando de duas solues: uma contendo metanol e outra acetonitrila na sua
composio, com o modo positivo e o negativo de ionizao qumica, sem voltagem na
fonte de ons, no se observou ionizao dos compostos. Foram observados resultados
diferentes do encontrado em literatura, onde Turnipseed e colaboradores (2005) obtiveram
a melhor forma de ionizao no usando voltagem na corrente de ons. Isto pode ser
explicado devido utilizao de diferentes marcas de equipamentos e de fontes.
Em modo positivo, com as solues de metanol ou acetonitrila (com ou sem
aditivos), foi observado a formao de molculas ionizadas nas formas de aduto de amnio
[M+ NH
4
]
+
e protonada [M+H]
+
,

sendo que a eprinomectina e eventualmente a
doramectina se ionizam na forma protonada e as demais avermectinas pesquisadas se
ionizam na forma de aduto de amnio, conforme observado na tabela do anexo I. Com
esta diferena entre a forma de ionizao das avermectinas no modo positivo torna-se
Resultados e Discusso


61
invivel desenvolver um mtodo de MRM (mltipla reao monitorada) para a anlise
quantitativa e confirmatria.
Em modo negativo, com solues de metanol ou acetonitrila (com ou sem
aditivos) observou-se a formao de molculas ionizadas nas formas desprotonada [M-H]
-
,
com aduto de acetato [M+CH
3
COO]
-
e formiato [M+HCOO]
-
, conforme observado na
tabela do anexo I. Verificou-se a presena de um nmero maior de adutos formados neste
modo de ionizao, o que no impediu a formao de ons moleculares na forma
desprotonada [M-H]
-
, em quase todas as solues utilizadas neste experimento com boa
abundncia.
De maneira geral as avermectinas ionizam bem no modo negativo na forma
desprotonada produzindo ons com boa abundncia. As melhores ionizaes na forma
desprotonada foram com as fases mveis 2, 6, 8 e 12, conforme demonstrado na figura 13
abaixo.
1.Metanol/gua (9:1)_ Modo +; 2.Metanol/gua (9:1)_ Modo -; 3.Metanol/gua (9:1) 0,1% acido
frmico_Modo +; 4.Metanol gua (9:1) 0,1% acido frmico_Modo -; 5.Metanol/gua (9:1) 5mM
acetato de amnio_Modo +; 6.Metanol/gua (9:1) 5mM acetato de amnio_Modo -;
7.Acetonitrila/gua (9:1)_ Modo +; 8.Acetonitrila/gua (9:1)_ Modo -; 9.Acetonitrila/gua (9:1)
0,1% acido frmico_Modo +;10.Acetonitrila/gua (9:1) 0,1% acido frmico_Modo -;
11.Acetonitril/gua (9:1) 5mM acetato de amnio_Modo +; 12.Acetonitrila/gua (9:1) 5mM acetato
de amnio_Modo .


Figura 13 Resultados dos experimentos de ionizao qumica.
Resultados e Discusso


62
4.1.2 Resultados da interface electrospray

Na ionizao por electrospray, no modo positivo, foi observada a formao de
molculas ionizadas na forma protonada [M+H]
+
, aduto de sdio [M+Na]
+
, potssio
[M+K]
+
e amnio [M+ NH
4
]
+
. Em modo negativo as molculas foram ionizadas na forma
desprotonada [M-H]
-
, com adutos de acetato [M+CH
3
COO]
-
e formiato [M+HCOO]
-
,
conforme Fig. s 14 e 15.

Figura 14 Espectro de massas (EM1) em modo positivo da ivermectina.

Resultados e Discusso


63
Figura 15 Espectro de massas (EM1) em modo negativo da eprinomectina.

Em modo negativo na forma desprotonada [M-H]
-
(figura 15), apenas no
experimento 6 (figura 17), utilizando metanol com acetato de amnio, as avermectinas
ionizaram bem e com boa abundncia para desenvolver um mtodo de MRM para a anlise
quantitativa e confirmatria. Nos demais experimentos do modo negativo por
electrospray, no se obtiveram boas ionizaes para desenvolver mtodos de anlise,
conforme observado no anexo II.
Em modo positivo as avermectinas ionizaram bem e com boa abundncia nos
experimentos 5 e 11 na forma de aduto de sdio [M+Na]
+
(figura 16), sendo que no
experimento 5 (figura 17) utilizando metanol e acetato de amnio, a abundncia foi mais
intensa do que em todos os outros experimentos realizados.
Resultados e Discusso


64














ABA: abamectina; IVR: ivermectina; DOR: doramectina e EPR: eprinomectina

Figura 16 Espectro de massas (EM1) na forma de adulto de sdio das AVMs.





Resultados e Discusso


65

1.Metanol/gua (9:1)_ Modo +; 2.Metanol/gua (9:1)_ Modo -; 3.Metanol/gua (9:1) 0,1% acido
frmico_Modo +; 4.Metanol/gua (9:1) 0,1% acido frmico_Modo -; 5.Metanol/gua (9:1) 5mM
acetato de amnio_Modo +; 6.Metanol/gua (9:1) 5mM acetato de amnio_Modo -;
7.Acetonitrila/gua (9:1)_ Modo +; 8.Acetonitrila/gua (9:1)_ Modo -; 9.Acetonitrila/gua (9:1)
0,1% cido frmico_Modo +;10.Acetonitrila/gua (9:1) 0,1% acido frmico_Modo -;
11.Acetonitrila/gua (9:1) 5mM acetato de amnio_Modo +; 12.Acetonitrila/gua (9:1) 5mM acetato
de amnio_Modo .


Figura 17 Resultados dos experimentos de ionizao por electrospray.


4.2 RESULTADO DA ESCOLHA DO MELHOR MTODO MRM DE ANLISE

Os modos de ionizaes, selecionados para desenvolver um mtodo final de
MRM para anlise quantitativa e confirmatria, foram os de ionizao por electrospray
na forma de aduto de sdio [M+Na]
+
e desprotonada [M-H]
-
utilizando metanol/acetato de
amnio 5mM (90:10) e de ionizao qumica na forma desprotonada [M-H]
-
, usando
metanol/acetato de amnio 5mM (90:10). Justifica-se a escolha da ionizao na forma de
aduto de sdio por ter produzido uma maior abundncia de ons de todos os experimentos
testados, outros autores como VALENZUELA (2000) e TURNIPSEED (2005) utilizaram
a forma ionizada de aduto de sdio para analisar resduos de avermectinas. A ionizao na
forma desprotonada por eletroespray foi selecionada por ter produzido a segunda maior
Resultados e Discusso


66
abundncia de ons de todos os experimentos testados. E a terceira forma de ionizao
escolhida foi a de ionizao qumica, tambm por produzir uma boa abundncia de ons e
por utilizar o mesmo solvente e aditivo utilizados na eletroespray, podendo assim, realizar
uma melhor comparao entre as interfaces.
Na avaliao do mtodo com maior detectabilidade para a quantificao de
resduos de avermectinas, foi verificado que no mtodo MRM em modo positivo por
electrospray com uma soluo de 1 ng.mL
-1
do mix das avermectinas produziu uma
amplitude mdia de sinal de 635; 990; 450 e 500 cps respectivamente para a eprinomectina,
abamectina, doramectina e ivermectina (Figura 18). O mtodo MRM, em modo negativo
por electrospray com uma soluo de 1 ng.mL
-1
do mix das avermectinas produziu uma
amplitude mdia de sinal de 100; 210; 130 e 130 cps respectivamente para a eprinomectina,
abamectina, doramectina e ivermectina (Figura 19). E, o mtodo MRM, em modo negativo
por ionizao qumica com uma soluo de 1 ng.mL
-1
do mix das avermectinas, produziu
uma amplitude mdia de sinal de 73; 70; 45; e 80 cps respectivamente para a eprinomectina,
abamectina, doramectina e ivermectina (Figura 20). Portanto, o mtodo final com maior
detectabilidade para a anlise das avermectinas foi o mtodo de MRM com aduto de sdio
[M+Na]
+
, com a interface electrospray em modo positivo. Estes resultados
demonstraram que os experimentos utilizados para a escolha da melhor fonte e forma de
ionizao, podem ser realizados com segurana utilizando o mtodo empregado nesta
dissertao.

Resultados e Discusso


67

EPR(azul) 3,43min; ABA(verde azulado) 3,7 min; DOR(azul claro) 4,2 min;IVR(verde) 4,75.


Figura 18 Cromatograma do mtodo MRM modo positivo por electrospray.






Resultados e Discusso


68
EPR(vermelho) 3,43min; ABA(verde claro) 3,7 min; DOR(magenta) 4,2 min;IVR(azul claro) 4,75 min.

Figura 19 Cromatograma do mtodo MRM modo negativo por electrospray.







Resultados e Discusso


69
EPR(vede) 3,43min; ABA(azul) 3,7 min; DOR(amarelo palha) 4,2 min;IVR(vermelho) 4,75 min.


Figura 20 Cromatograma do mtodo MRM modo negativo por ionizao qumica






Resultados e Discusso


70
4.3 FRAGMENTAO DAS AVERMECTINAS POR EM-EM

As molculas de avermectinas ionizadas na forma de aduto de sdio [M+Na]
+
na
interface electrospray, ao chegarem na cmara de coliso do espectrmetro, so
fragmentadas em ons menores (ons filhos ou produtos) na forma de aduto de sdio.
Observados nas figuras 21, 22, 23 e 24. Os fragmentos (produtos) estampados nas figuras
abaixo, so uma tentativa de identificao da forma molecular de cada fragmento, que
tambm foram descritas por VALENZUELA et al. (2000).
Como exemplo temos a abamectina (872,6 u.m.a.) que aps ionizao, por
electrospray modo positivo, transforma-se em um on aduto de sdio [M+Na
+
+H]
+
com
895,6 u.m.a. (VALENZUELA et al., 2000). Aps sofrer fragmentao, um dos fragmentos
produzidos possui 751 u.m.a (figura 21), o que equivale a perda de um glicosideo da
molcula (144 u.m.a.). Esta concluso foi comprovada pela checagem da anlise do on
precursor do fragmento, efetuada pelo software Analist do espectrmetro. Com exceo
da eprinomectina, todas as avermectinas estudadas produziram uma fragmentao
semelhante na formao dos ons produto, diferenciando apenas na massa do radical ligado
ao anel macrociclico. Com relao a eprinomectina, os produtos do espectro na forma de
aduto de sdio foi mais complexo que as demais, sendo que a estrutura molecular dos seus
produtos devem ser melhor estudadas, concluso que tambm foi verificada por
TURNIPSEED et al. (2005).








Resultados e Discusso


71

Figura 21 Espectro de massas (EM2) da Abamectina.

Figura 22 Espectro de massas (EM2) da Ivermectina.


Resultados e Discusso


72

Figura 23 Espectro de massas (EM2) da doramectina.
Figura 24 Espectro de massas (EM2) da eprinomectina.

Resultados e Discusso


73
4.4 OTIMIZAO DA LIMPEZA DAS AMOSTRAS POR EFS


Os resultados, resumidos na tabela 8, demonstram que solventes apolares como o
hexano no possuem fora suficiente para eluir as avermectinas do cartucho de EFS slica-
C
18
, devido formao de ligaes de hidrognio entre as hidroxilas das avermectinas e os
grupos silanis livres da slica. Este resultado de grande significncia, pois este solvente
pode ser utilizado para eliminar os lpides do leite e outros co-extrativos apolares
indesejveis. Solventes mais polares como a acetona possuem fora suficiente para romper
essa adsoro fazendo com que as avermectinas eluam com mais facilidade.
A adsoro que o carbono do cartucho de EFS Envi-carb exerce pelas
molculas de avermectinas muito forte, ao ponto em que os solventes hexano,
acetonitrila, metanol e acetona no conseguiram eluir as avermectinas nas duas eluies
realizadas no procedimento (tabela 9). Apenas o diclorometano conseguiu romper esta
adsoro parcialmente. Este resultado no satisfatrio, pois poder acarretar perda de
exatido nos testes de recuperao.

TABELA 8 - Porcentagem de recuperao da eluio das avermectinas em
cartuchos de EFS slica-C
18
com 22% de carbono. (n=3)

AVM

Hexano
Eluio 1 e 2
Diclorometano
Eluio 1 e 2
acetonitrila
Eluio 1 e 2
Metanol
Eluio 1 e 2
Acetona
Eluio 1 e 2
EPR
ABA
DOR
IVR
0%
0%
0%
0%
34% e 7%
53% e 12%
53% e 9%
52% e 9%
76% e 2%
65% e 7%
67% e 5%
82% e 4%
46% e 0%
25% e 8%
48% e 0%
43% e 0%
95%e 0%
82% e 0%
81% e 0%
85% e 0%
AVM: avermectinas; EPR: eprinomectina; ABA: abamectina; DOR: doramectina e IVR: ivermectina








Resultados e Discusso


74
TABELA 9 - Resultados da porcentagem de recuperao da eluio das
avermectinas em cartuchos de EFS de carbono Envi-carb. (n=3)

AVM

Hexano
Eluio 1 e 2
Diclorometano
Eluio 1 e 2
acetonitrila
Eluio 1 e 2
Metanol
Eluio 1 e 2
Acetona
Eluio 1 e 2
EPR
ABA
DOR
IVR
0%
0%
0%
0%
38% e 0%
50% e 12%
46% e 0%
47% e 0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
AVM: avermectinas; EPR: eprinomectina; ABA: abamectina; DOR: doramectina e IVR: ivermectina


4.4 AVALIAO DOS CINCO MTODOS DE LIMPEZA DAS AMOSTRAS

Inicialmente foram avaliados os mtodos 1, 2, 3, e 4 utilizando uma fase mvel de
metanol/acetato de amnio 5 mM (98:2), o resultado das recuperaes inicialmente foi
baixo (tabela 10). Com a realizao do teste de supresso de ons (Figura 25), foi verificado
que, no gradiente isocrtico de eluio da fase mvel, o tempo de reteno das
avermectinas ficou dentro ou prximo da zona de supresso; o que explicaria a baixa
recuperao.

TABELA 10 - Resultado da recuperao com fase mvel metanol/acetato de
amnio 5 mM (98:2 isocrtico) com fortificao de 1,0 g.L
-1
(n=3).

Como tentativa de retirar as avermectinas fora da zona de supresso, optou-se em
trabalhar com gradiente de eluio com rampa linear de 80 % de metanol para 95 %
(descrito no mtodo final), o que possibilitou tirar as molculas fora da zona de supresso.
Foram ento avaliados novamente os mtodos 1, 2, 3 e 4 com o novo gradiente de eluio,
Resultados e Discusso


75
resultando no geral em uma melhora significativa nas porcentagens de recuperao (tabela
11). Com a realizao do teste de supresso de ons (Figura 25), foi verificado que, neste
gradiente de eluio da fase mvel, o tempo de reteno das avermectinas ficou fora da
zona de supresso. Porm, as recuperaes das avermectinas no ficaram satisfatrias, o
que deve ser explicado pelo efeito matriz produzido pelos co-extrativos presentes no
extrato final que competem com a ionizao das avermectinas na interface.

TABELA 11 - Resultado da recuperao com fase mvel metanol/acetato de
amnio 5 mM (80:20 com gradiente linear) com fortificao de 1,0 g.L
-1
(n=3).

Foi realizada a avaliao da recuperao do mtodo cinco com o novo gradiente
de eluio e considerando o efeito matriz na curva de calibrao. Os resultados obtidos
foram satisfatrios, onde as recuperaes para todas as avermectinas ficaram acima de 80%
(tabela 12). HOLSTEGE et al. (2002) tambm utilizaram a curva de calibrao no extrato
da amostra para a anlise de penicilinas na amostra de leite.

TABELA 12 - Resultado da recuperao do mtodo 5 com fase mvel
metanol/acetato de amnio 5 mM (80:20 com gradiente linear) com fortificao de 1,0
g.L
-1
(n=3).

Resultados e Discusso


76
Atravs da avaliao feita com os cinco mtodos, conclui-se que alm do efeito
matriz ocasionar uma forte supresso de ons no incio da corrida cromatogrfica, este se
estende, ao longo do tempo da anlise cromatogrfica, sem ocasionar uma forte supresso,
mas o suficiente para competir com a ionizao das avermectinas.
Atravs dos resultados acima obtidos, os mtodos escolhidos para serem
comparados foram os mtodos 2, 4 e 5. Apesar dos mtodos 2 e 4 no terem obtido uma
boa recuperao para a abamectina e a doramectina, foi levado em considerao que no
estudo da recuperao destes dois mtodos no foi considerado o efeito matriz na
construo da curva de calibrao.
Justifica-se a no utilizao dos mtodos 1 e 3, devido ao menor percentual de
recuperao nos testes realizados em comparao com os mtodos selecionados e por
serem dois dos mtodos mais extensos no procedimento de extrao e purificao da
amostra. Inclusive, no mtodo 3, foi observado atravs dos testes de supresso de ons
realizados, que apesar das etapas de precipitao das protenas e partio lquido-lquido,
apresentou uma grande quantidade de co-extrativos inviabilizando a sua utilizao (Figuras
25 e 26).
Ao observar o teste de supresso de ons da fase mvel 80:20 com gradiente linear
(Figura 25), foi verificado que a linha base comeou a aumentar seu sinal, medida em que
o gradiente muda sua composio de 80% para 95 % de metanol ao longo da corrida
cromatogrfica. Este incremento de sinal devido ao aumento da concentrao do
metanol, aumentando a quantidade de Sdio disponvel na composio da fase mvel e,
conseqentemente, favorecendo mais a ionizao das molculas de avermectina na forma
de aduto de sdio na cmara de ionizao, proporcionando um aumento da abundncia
dos ons pelo aumento da quantidade de avermectinas ionizadas. COLE (1977) descreve
que existem impurezas nos solventes, como no metanol, que so principalmente sais de
amnio e sdio numa concentrao de 10
-5
mol.L
-1
e que esta quantidade de impurezas
auxiliam na formao de pequenas gotas no processo de dessolvatao para gerar uma
quantidade maior de ons na fase gasosa.



Resultados e Discusso


77
Figura 25 - Espectro de massas (MS2) da supresso de ons com a fase mvel metanol/acetato de
amnio 5 mM (98:2 isocrtico) dos mtodos 1, 2, 3, 4, 5 e fase mvel.O sinal das transies das
AVMs esto representadas pelas linhas coloridas.

Mtodo 1: Precipitao com acetonitrila e cartucho de EFS slica-C18 22% carbono.



Mtodo 2: Extrao com acetonitrila 30% e cartucho de EFS slica-C 18 22% carbono.





Mtodo 1:
Mtodo 1:




XIC of +MRM (8 pair s): 936.6/490.5 amu fr om Sample 6 (sup ions_met 1_20ulfluxo) of SET 12.wiff (Tur bo Spray) Max. 2. 8e4 cps.
0.5 1.0 1. 5 2.0 2.5 3. 0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5
Time, min
0.0
2000.0
4000.0
6000.0
8000.0
1.0e4
1.2e4
1.4e4
1.6e4
1.8e4
2.0e4
2.2e4
2.4e4
2.6e4
2.8e4
0.33
0.59
5.80
1.00
5.35
3.13
4.23
2.85
2.23
1.99
2.53
XIC of +MRM (8 pair s): 936.6/490.5 amu fr om Sample 3 (sup ions_met 2_20ulfluxo) of SET 12.wiff (T ur bo Spray) Max. 2.5e4 cps.
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5
T ime, min
0.0
2000.0
4000.0
6000.0
8000.0
1.0e4
1.2e4
1.4e4
1.6e4
1.8e4
2.0e4
2.2e4
2.4e4
2.6e4
2.8e4
3.0e4
3.2e4
0.30
5.69
4.99
3.92
1. 35 4.34
3.35
3.18
2.79
1.91
2.48
2.20
Resultados e Discusso


78
Mtodo 3: Precipitao com acetonitrila e partio liquido-liquido com clorofrmio.


Mtodo 4: Precipitao com acetonitrila, partio liquido-liquido com clorofrmio e
coluna de EFS slica-C18 19% carbono.

XIC of +MRM (8 pairs): 936.6/490.5 amu from Sample 7 (sup ions_met 9 sem SPE_20ulfluxo) of SET 12.wiff (Turbo Spray) Max. 2.7e4 cps.
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5
Time, min
0.0
2000.0
4000.0
6000.0
8000.0
1.0e4
1.2e4
1.4e4
1.6e4
1.8e4
2.0e4
2.2e4
2.4e4
2.6e4
2.7e4
0.52
5.74
1.21
5.04
4.63
4.48
2.31
4.15
3.74 1.94
XIC of +MRM (8 pairs): 936.6/490.5 amu from Sample 2 (sup ions_met F1_20ulfl uxo) of SET 12.wiff (Turbo Spray) Max. 2.9e4 cps.
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5
Time, min
0.0
2000.0
4000.0
6000.0
8000.0
1.0e4
1.2e4
1.4e4
1.6e4
1.8e4
2.0e4
2.2e4
2.4e4
2.6e4
2.8e4
3.0e4
1.10
0.39
0.11
5.79
5.48
5.03 5.33
3.83
4.01 4.33
3.24
3.41
3.02
2.76
1.83
2.33 2.14
1.59
Resultados e Discusso


79
Mtodo 5: Cartucho de EFS slica-C18 19% carbono.












Fase Mvel: 98% metanol / 2% acetato de amnio 5mM (isocrtico).
XIC of +MRM (8 pairs): 936.6/490.5 amu from Sample 2 (spr ion_FM 98 02) of SET 21.wiff (Turbo Spray) Max. 2.1e4 cps.
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5
Time, min
0.0
1000.0
2000.0
3000.0
4000.0
5000.0
6000.0
7000.0
8000.0
9000.0
1.0e4
1.1e4
1.2e4
1.3e4
1.4e4
1.5e4
1.6e4
1.7e4
1.8e4
1.9e4
2.0e4
2.1e4
0.33
1.49
3.28
5.34
1.86 4.84
3.96 2.98
1.29
0.08
4.27
XIC of +MRM (8 pairs): 936.6/490.5 amu from Sample 4 (sup ions_met 9_20ulfluxo) of SET 12.wiff (Turbo Spray) Max. 2.9e4 cps.
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5
Time, min
0.0
2000.0
4000.0
6000.0
8000.0
1.0e4
1.2e4
1.4e4
1.6e4
1.8e4
2.0e4
2.2e4
2.4e4
2.6e4
2.8e4
1.20
0.38
5.56
5.12
3.90
3.31
4.79 5.86
0.69
3.00
2.67
2.85
1.87
2.27
2.44
1.56
Resultados e Discusso


80
Figura 26 Espectro da supresso de ons com a fase mvel metanol/acetato de amnio 5 mM
(80:20 gradiente linear) dos mtodos 1, 2, 3, 4,5 e fase mvel. O sinal das transies das AVMs
esto representadas pelas linhas coloridas.

Mtodo 1: Precipitao com acetonitrila e cartucho de EFS slica-C18 22% carbono.

XIC of +MRM (8 pair s): 936.6/490.5 amu fr om Sample 1 (sup ions_met 1_20ulfluxo) of SET 12a.wiff (Turbo Spray) Max. 2.0e4 cps.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Time, min
0.0
1000.0
2000.0
3000.0
4000.0
5000.0
6000.0
7000.0
8000.0
9000.0
1.0e4
1.1e4
1.2e4
1.3e4
1.4e4
1.5e4
1.6e4
1.7e4
1.8e4
1.9e4
2.0e4
2.1e4
11. 21
10.45
10.03
9.00 8.17
8.03
9.72
7.15
7.01
0.72
5. 15 0.25
7.59
6.67
2.34
4.10
3.17
2. 09
1.66
1.33

Mtodo 2: Extrao com acetonitrila 30% e cartucho de EFS slica-C 18 22% carbono.


XIC of +MRM (8 pair s): 936.6/ 490.5 amu fr om Sample 80 ( sup ions_met 2_20ulfluxo) of SET 06.wiff ( Turbo Spray) Max. 2.1e4 cps.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Time, min
0.0
1000.0
2000.0
3000.0
4000.0
5000.0
6000.0
7000.0
8000.0
9000.0
1.0e4
1.1e4
1.2e4
1.3e4
1.4e4
1.5e4
1.6e4
1.7e4
1.8e4
1.9e4
2.0e4
2.1e4
2.2e4
10.78 10. 96
11.75
10.12
9. 70
7.55
8.64
6. 36
6. 99
6.14
5.60
5.33
4.43 3. 30
3. 51 4. 59
2.19
2.47
1.83
1.59
1.30



Resultados e Discusso


81
Mtodo 3: Precipitao com acetonitrila e partio liquido-liquido com clorofrmio.


XIC of +MRM (8 pairs): 936.6/490.5 amu from Sample 2 (sup ions_met 9 sem SPE_20ulfluxo) of SET 12a.wiff (Turbo Spray) Max. 2.0e4 cps.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Time, min
0.0
1000.0
2000.0
3000.0
4000.0
5000.0
6000.0
7000.0
8000.0
9000.0
1.0e4
1.1e4
1.2e4
1.3e4
1.4e4
1.5e4
1.6e4
1.7e4
1.8e4
1.9e4
2.0e4
10.96
11.39
10.55
10.00
9.71
8.11 9.31
6.26
5.73
6.72
7.05
5.39
7.60
5.19
4.78 2.88
4.50
4.21
3.46
3.13
2.16
1.70



Mtodo 4: Precipitao com acetonitrila, partio liquido-liquido com clorofrmio e coluna
de EFS slica-C18 19% carbono.


XIC of +MRM (8 pairs): 936.6/490.5 amu from Sample 85 (sup ions_met 9_20ulfluxo) of SET 05.wiff (Turbo Spray) Max. 2.3e4 cps.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Time, min
0.0
1000.0
2000.0
3000.0
4000.0
5000.0
6000.0
7000.0
8000.0
9000.0
1.0e4
1.1e4
1.2e4
1.3e4
1.4e4
1.5e4
1.6e4
1.7e4
1.8e4
1.9e4
2.0e4
2.1e4
2.2e4
2.3e4
10.58
10.96
11.17 10.31
7.84
7.29
9.34
9.15
8.81
6.35
8.22 7.64
6.21
5.72
0.77
5.23
4.24 4.56
3.38
2.02
1.78
1.17


Resultados e Discusso


82
Mtodo 5: Cartucho de EFS slica-C18 19% carbono.


XIC of +MRM (8 pair s): 936.6/490.5 amu fr om Sample 53 ( sup ions_met F1_20ulfluxo) of SET 07.wiff (Turbo Spray) Max. 2.2e4 cps.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Time, min
0.0
1000.0
2000.0
3000.0
4000.0
5000.0
6000.0
7000.0
8000.0
9000.0
1.0e4
1.1e4
1.2e4
1.3e4
1.4e4
1.5e4
1.6e4
1.7e4
1.8e4
1.9e4
2.0e4
2.1e4
2.2e4
2.3e4
7.88
9.60 9.74 8.18 11.31 7.30
10.23
8.35 8.90
6.29
6.84
0.76
0.18
4.25 2.96
4.89
1.65



Fase Mvel: 98% metanol / 2% acetato de amnio 5mM (gradiente).

XIC of +MRM (8 pair s): 936.6/490.5 amu fr om Sample 52 ( sup ions_FM_20ulfluxo) of SET 07.wiff (Turbo Spray) Max. 2.2e4 cps.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Time, min
0.0
1000.0
2000.0
3000.0
4000.0
5000.0
6000.0
7000.0
8000.0
9000.0
1.0e4
1.1e4
1.2e4
1.3e4
1.4e4
1.5e4
1.6e4
1.7e4
1.8e4
1.9e4
2.0e4
2.1e4
2.2e4
2.3e4
10.25 10.54
9.69
9.23 8.15
11.86
7.70
7.51
7.03
6.69
6.37
5.92
5.72
0.17
3.54 2.95 1.02 1.61 5.31
0.88


Resultados e Discusso


83
4.5 RESULTADO DA ESCOLHA DO MTODO FINAL PARA A ANLISE
DAS AVERMECTINAS

Nos trs mtodos testados, o teste de recuperao foi calculado com uma curva
de calibrao externa preparada no solvente e outra preparada no extrato de uma matriz
testemunha sem o resduo das avermectinas, considerando o efeito matriz da amostra de
leite. Os resultados dos testes de recuperao esto representados abaixo nas tabelas 13,
14, 15, 16, 17 e 18.
A calibrao interna no foi utilizada por no estar disponvel no laboratrio, um
padro interno deuterado das avermectinas ou compatvel com a estrutura da molcula
delas. Com os resultados obtidos nesta pesquisa, pode-se afirmar que a utilizao de um
padro interno no seria favorvel devido variao de sinal particular de cada
avermectina, proporcionado pelo efeito matriz ao longo da corrida cromatogrfica. Esta
concluso tambm foi verificada por HOLSTEGE et al., (2002) ao constatarem que a
utilizao de padro interno no foi consistente, para corrigir a variabilidade do efeito
matriz, proporcionada pelos co-extrativos da amostra de leite na anlise de antibiticos.


TABELA 13 Resultados da recuperao do mtodo 2 fortificado com 1 ng.mL
-1

na curva de calibrao com solvente.


EPR: eprinomectina; ABA: abamectina; DOR: doramectina; IVR:ivermectina; R: recuperao; Rec:
recuperao; DP: desvio padro; CV: coeficiente de variao.






Resultados e Discusso


84
TABELA 14 Resultados da recuperao do mtodo 2 fortificado com 1
ng.mL
-1
na curva de calibrao com extrato.






EPR: eprinomectina; ABA: abamectina; DOR: doramectina; IVR:ivermectina; R: recuperao; Rec:
recuperao; DP: desvio padro; CV: coeficiente de variao.

TABELA 15 Resultados da recuperao do mtodo 4 fortificado com ng.mL
-1

na curva de calibrao com solvente.

EPR: eprinomectina; ABA: abamectina; DOR: doramectina; IVR:ivermectina; R: recuperao; Rec:
recuperao; DP: desvio padro; CV: coeficiente de variao.

TABELA 16 Resultados da recuperao do mtodo 4 fortificado com ng.mL
-1

na curva de calibrao com extrato.


EPR: eprinomectina; ABA: abamectina; DOR: doramectina; IVR:ivermectina; R: recuperao; Rec:
recuperao; DP: desvio padro; CV: coeficiente de variao.


Resultados e Discusso


85
TABELA 17 Resultados da recuperao do mtodo 5 fortificado com 1
ng.mL
-1
na curva de calibrao com solvente.

EPR: eprinomectina; ABA: abamectina; DOR: doramectina; IVR:ivermectina; R: recuperao; Rec:
recuperao; DP: desvio padro; CV: coeficiente de variao.


TABELA 18 Resultados da recuperao do mtodo 5 fortificado com 1 ng.mL
-1

na curva de calibrao com extrato.

EPR: eprinomectina; ABA: abamectina; DOR: doramectina; IVR:ivermectina; R: recuperao; Rec:
recuperao; DP: desvio padro; CV: coeficiente de variao.

Atravs dos resultados acima obtidos, foi verificado que o mtodo 4 no possui
no geral uma boa recuperao, proporcionada possivelmente por perdas na partio
lquido-lquido do procedimento de purificao e, tambm, pelo efeito matriz ao longo da
corrida cromatogrfica.
O mtodo 5 apresentou no geral uma boa recuperao e preciso. Observando o
teste de supresso de ons (Figura 26), o mtodo 5 purificou melhor a amostra em relao
ao mtodo 2, por este motivo foi o escolhido para ser o mtodo de quantificao e
confirmao para anlise de resduos de avermectinas em amostras de leite. Neste mtodo
5 optou-se pela no utilizao da trietilamina, que utilizada em geral pelos mtodos das
referncias (DISERENS et al., 1999) para reduzir a absoro das Avermectinas dos grupos
silanis da slica-C18, sendo que foi preferido a no utilizao da trietilamina, para reter
Resultados e Discusso


86
mais as Avermectinas no cartucho de extrao para uma limpeza mais eficiente do extrato,
o que foi demonstrado neste mtodo 5 em comparao com o mtodo 1 e 2 que utilizaram
a trietilamina.
Pode-se concluir, atravs dos resultados obtidos nas recuperaes com a curva de
calibrao na matriz e no solvente, como o efeito matriz afeta a quantificao das
avermectinas, por isso a necessidade de construir a curva de calibrao considerando o
efeito matriz.
Em comparao com os mtodos analticos da referncia bibliogrfica que
utilizaram a espectrometria de massas para anlise de resduo de avermectinas, o mtodo 5
selecionado obteve excelente performance na exatido e preciso, sem a utilizao de
extensivos mtodos no preparo e purificao da amostra. TURNIPSEED et al., (2005)
obteve recuperaes em amostras de leite entre 32% a 85 % com desvio padro relativo
variando entre 14% e 30% para a eprinomectina, 45% a 121% de recuperao com 4% a
38% de desvio padro relativo para a doramectina, e 45% a 121 % de recuperao com 4%
a 38% de desvio padro relativo para a ivermectina. WU et al., (2001) obteve recuperaes
em tecido de porco entre 65% a 87% para ivermectina e 74% a 94 % para abamectina.
VALENZUELA et al., (2000) obteve uma recuperao mdia de 96 % e desvio padro
relativo mdio de 4% em amostras de laranja.

4.6 AVALIAO DO EFEITO DA MATRIZ NAS CURVAS DE CALIBRAO

Os resultados dos efeitos da matriz podem ser observados visualmente nas curvas
de calibrao respectivas (Figuras 27, 28, 29 e 30). Observou-se que as anlises da
doramectina, eprinomectina e ivermectina no sofreram efeito significativo da matriz
enquanto que para a abamectina este efeito foi significativo (tabela 19). Por este motivo,
optou-se pela construo da curva de calibrao das avermectinas considerando o efeito
matriz, evitando problemas de preciso e exatido na quantificao da abamectina.
Resultados e Discusso


87
Curva de calibrao
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2
ng/ mL
matriz solvente

Figura 27 Comparao das curva de calibrao da doramectina com solues preparadas
com solvente e considerando o efeito matriz.




Curva de calibrao
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2
ng/ mL
matriz solvente

Figura 28 Comparao da curva de calibrao da eprinomectina com solues preparadas
com solvente e considerando o efeito matriz.




Resultados e Discusso


88
Curva de calibrao
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2
ng/ mL
matriz solvente

Figura 29 Comparao da curva de calibrao da ivermectina com solues preparadas
com solvente e considerando o efeito matriz.


Curva de calibrao
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2
ng/ mL
matriz solvente


Figura 30 Comparao da curva de calibrao da abamectina com solues preparadas
com solvente e considerando o efeito matriz.





Resultados e Discusso


89
TABELA 19 Avaliao estatstica do efeito matriz na construo das curvas de
calibrao das avermectinas preparadas com solvente e com o extrato do leite.

Teste de distribuio t bilateral
Doramectina 2,026
Eprinomectina 0,876
ivermectina 1,271
abamectina 7,353
t tab. (p= 0,05; n-1 + n-2 4 graus liberdade): 2,067


4.7 RESULTADOS DA VALIDAO DA METODOLOGIA

4.7.1 Resultados do Teste de Especificidade

O objetivo da especificidade verificar a capacidade que o mtodo analtico
possui em discriminar a substncia a analisar de outras substncias presentes na matriz.
Analisando os cromatogramas obtidos das amostras de leite orgnico e leite
comercial, branco reativo e dos padres, no foi verificada a presena de possveis
interferentes como ismeros, metablitos, produtos de degradao e componentes da
matriz, que poderiam afetar a especificidade e seletividade do mtodo analtico. Como
exemplo, temos a Figura 31 que nos mostra um cromatograma de leite orgnico apenas
com rudos.



Resultados e Discusso


90


Figura 31 Cromatograma de uma amostra de leite orgnico.


No teste de degradao das avermectinas, foi verificado que no ocorreu
degradao com gua fervente (tabela 20), os valores encontrados na tabela no
demonstram perda por degradao, mas sim valores previstos para a recuperao. Rose et
al. (1998), tambm obteve o mesmo resultado com um teste de degradao acima de 140C
para a ivermectina. Na oxidao com perxido de hidrognio temperatura de 100C as
AVMs de modo geral sofreram degradao (tabela 21), porm no foram detectadas
interferncias de produtos de degradao e/ ou metablitos no cromatograma. Na
hidrlise cida e alcalina, as avermectinas se degradaram completamente, porm no foi
detectado interferentes de produtos de degradao e/ ou metablitos nos cromatograma.
Atravs dos estudos realizados, pode-se afirmar com segurana que o mtodo
analtico utilizando o espectrmetro de massas triploquadrupolo possui alta especificidade e
seletividade. WU et al. (2001) tambm relatam a alta especificidade e seletividade da tcnica
de espectrometria de massas.


Resultados e Discusso


91
TABELA 20 - Resultados do teste de degradao das avermectinas (1 g.mL
-1
)
utilizando banho Maria de gua fervente (n=1).
Resultado (g.mL
-1
) % Recuperada
eprinomectina 1,01 101,0
abamectina 0,86 86,0
doramectina 0,90 90,0
ivermectina 0,95 95,0


TABELA 21 Resultados do teste de gradao das avermectinas (1 g.mL
-1
)
utilizando perxido de hidrognio 30% e banho Maria de gua fervente (n=1).
Resultado (g.mL
-1
) % Recuperada
eprinomectina 0,86 86,0
abamectina 0,16 16,0
doramectina 0,45 45,0
ivermectina 0,32 32,0


4.7.2 Resultados da Determinao do Limite de Deteco e Quantificao do
Equipamento e do Mtodo

Analisando os dados obtidos de sinal/rudo para todas as transies observadas
na tabela 22, considerando a relao sinal/rudo 3:1, optou-se pelo limite de deteco do
equipamento de 0,1 ng.mL
-1
(Figura 32). E o limite de quantificao do equipamento,
considerando a relao sinal/rudo de 10:1 para o primeiro par de transio, foi de 0,4
ng.mL
-1
(Figura 33).





Resultados e Discusso


92
TABELA 22 Resultados da determinao do limite de deteco e quantificao
do equipamento.


EPR: eprinomectina; ABA: abamectina; DOR: doramectina; IVR:ivermectina.

Na determinao do limite de deteco e quantificao do mtodo, foi conduzido
um teste de recuperao em triplicata nos nveis de 0,05 g.L
-1
e 0,2 g.L
-1
, referentes aos
limites de deteco e quantificao respectivamente. Analisando os dados obtidos de
sinal/rudo para todas as transies das molculas de avermectinas, o limite de deteco do
mtodo foi de 0,05 g.L
-1
(tabela 23). E o limite de quantificao aps avaliao das
recuperaes foi de 0,2 g.L
-1
(tabela 24).

TABELA 23 Resultados da determinao do limite de deteco do mtodo.

EPR: eprinomectina; ABA: abamectina; DOR: doramectina; IVR:ivermectina.
Resultados e Discusso


93
TABELA 24 Resultados do limite de quantificao do mtodo. (n=3)

R1 R2 R3 Mdia Rec.% DP CV(%)
eprinomectina 0,198 0,218 0,196 0,205 102 0,024 6,0
abamectina 0,188 0,187 0,201 0,19 97 0,015 4,0
doramectina 0,188 0,207 0,192 0,195 98 0,020 5,1
ivermectina 0,179 0,197 0,191 0,189 95 0,019 5,0
R: recuperao; Rec: recuperao; DP: desvio padro; CV: coeficiente de variao.


EPR: eprinomectina; ABA: abamectina: DOR: doramrctina; IVR: ivermectina.

Figura 32 Cromatograma do limite de deteco 0,05 g.L
-1
.
Resultados e Discusso


94
EPR: Eprinomectina; ABA: abamectina: DOR: Doramrctina; IVR: ivermectina.
Figura 33 Cromatograma do limite de quantificao 0,2 g.L
-1
.

Comparando com os mtodos analticos da referncia bibliogrfica que utilizaram
a espectrometria de massas para anlise de resduo de avermectinas, o mtodo 5,
selecionado nesta pesquisa, obteve excelentes nveis de deteco e quantificao, sendo
estes inferiores aos descritos na literatura. TUENIPSEED et al., (2005) utilizando 5 mL de
alquota de amostra de leite e com purificao com duas colunas de EFS slica-C18 e
carbono Envicarb com injeo de 5L, analisaram resduos de avermectinas na faixa de
0,5 a 20 g.Kg
-1
(0,5 a 20 ppb). WU et al., (2001) utilizando 5 g de carne de porco, com
purificao em coluna EFS de imunoafinidade com injeo de 20 L, obtiveram um limite
de deteco de 5 g.Kg
-1
(5 ppb) em seu mtodo de confirmao. VALENZUELA et al.,
Resultados e Discusso


95
(2000) utilizando 0, 5 g de amostra de laranja, com purificao utilizando coluna EFS slica-
C18 com injeo de 5L, obtiveram um limite de quantificao de 2,5 g.Kg
-1
(2,5 ppb).
4.7.3 Faixa de Trabalho e Linearidade

A faixa de trabalho compreende um determinado intervalo de concentrao em
que o analito pode ser quantificado com exatido, preciso e linearidade adequada. Este
intervalo foi definido nas concentraes de 0,2 ng.mL
-1
, 0,4 ng.mL
-1
, 0,6 ng.mL
-1
, 1,2
ng.mL
-1
e 2,0 ng.mL
-1
. A linearidade da faixa de trabalho de cada avermectina foi
determinada por anlise de varincia, atravs do clculo da falta de ajuste (lack of fit).
A partir dos resultados obtidos pelas respectivas reas das avermectinas, foi
executado o tratamento estatstico dos dados utilizando uma planilha Excel. Foram
construdas, atravs do mtodo dos mnimos quadrados (tabelas 25, 26, 27 28), as curvas de
calibraes das avermectinas (Figuras 34, 36, 38 e 40). Utilizando o clculo dos resduos
padronizados, obteve-se um grfico para dar uma estimativa da linearidade das curvas
(Figuras 35, 37, 39 e 41). Antes da determinao da linearidade, foi determinada a existncia
de valores aberrantes pelo teste de Grubbs, onde os valores determinados ficaram dentro
do limite estabelecido para um nvel de 95% de confiana (n=3) de 1,115. Utilizando o
clculo da anlise de varincia para a falta de ajuste, foi calculada a linearidade das curvas
(tabelas 27, 30, 33 e 36) e os resultados da determinao da falta de ajuste para a
eprinomectina, abamectina, doramectina e ivermectina foram respectivamente de 0,843,
0,915, 0,01 e 1,359, com F tabelado unilateral (p=0,05) de 3,708, confirmando a
linearidade das curvas de calibraes.








Resultados e Discusso


96
Resultados do estudo de linearidade da abamectina:

Curva de calibrao y=10589*x+(-746)
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2
ng/ mL

Figura 34 Curva de calibrao da abamectina.


Resduos padronizados
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2
d
e
s
v
i
o

p
a
d
r

o


Figura 35 Grfico dos resduos padronizados da abamectina.


TABELA 25 Resultado da determinao da falta de ajuste (lack of fit).
fonte var. SQ graus lib. MQ F calc. F tab.
Regresso 178954481,2 1 178954481 1494,002 4,667
Resduo 1557165,73 13 119781,98
Falta
ajuste 335355,06 3 111785,02 0,915 3,708
erro puro 1221810,67 10 122181,07
Total 180511646,93 14 12807731
% de variao explicada 99,13736
% mxima de variao explicativa 99,32314
Teste F tabelado unilateral, para um intervalo de confiana de 95%(P=0,05):
Se F cal. (regresso) > F tab., a regresso significativa.
Se F cal. (falta ajuste) < F tab., a falta de ajuste no significativa.
SQ: soma dos quadrados; MQ: mdia dos quadrados.
Resultados e Discusso


97
Resultados do estudo de linearidade da doramectina:

Curva de calibrao y=8330*x+(-276)
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2
ng/ mL

Figura 36 Curva de calibrao da Doramectina.

Resduos padronizados
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2


Figura 37 Grfico dos resduos padronizados da doramectina.


TABELA 26 Resultado da determinao da falta de ajuste (lack of fit).
fonte var. SQ graus lib. MQ F calc. F tab.
Regresso 89256151,84 1 89256152 714,623 4,667
Resduo 1623695,10 13 124899,62
Falta
ajuste 712880,43 3 237626,81 2,609 3,708
erro puro 910814,67 10 91081,467
Total 90879846,93 14 6407840
% de variao explicada 98,213361
% mxima de variao explicativa 98,997781
Teste F tabelado unilateral, para um intervalo de confiana de 95%(P=0,05):
Se F cal. (regresso) > F tab., a regresso significativa.
Se F cal. (falta ajuste) < F tab., a falta de ajuste no significativa.
SQ: soma dos quadrados; MQ: mdia dos quadrados.
Resultados e Discusso


98
Resultados do estudo de linearidade da eprinomectina:

Curva de calibrao y=13613*x(-550)
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2
ng/ mL


Figura 38 Curva de calibrao da eprinomectina.

Resduos padronizados
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2
d
e
s
v
i
o

p
a
d
r

o

Figura 39 Grfico dos resduos padronizados da Eprinomectina.



TABELA 27 Resultado da determinao da falta de ajuste (lack of fit).
fonte var. SQ graus lib. MQ F calc. F tab.
Regresso 295903238,9 1 295903239 1553,356 4,667
Resduo 2476406,83 13 190492,83
Falta
ajuste 499692,83 3 166564,28 0,843 3,708
erro puro 1976714,00 10 197671,4
Total 298379645,73 14 21175569
% de variao explicada 99,170048
% mxima de variao explicativa 99,337517
Teste F tabelado unilateral, para um intervalo de confiana de 95%(P=0,05):
Se F cal. (regresso) > F tab., a regresso significativa.
Se F cal. (falta ajuste) < F tab., a falta de ajuste no significativa.
SQ: soma dos quadrados; MQ: mdia dos quadrados.
Resultados e Discusso


99
Resultados do estudo de linearidade da ivermectina:

Curva de calibrao y=12385*x+295
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2
ng/ mL

Figura 40 Curva de calibrao da ivermectina.


Resduos padronizados
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2
d
e
s
v
i
o

p
a
d
r

o

Figura 41 Grfico dos resduos padronizados da ivermectina.


TABELA 28 Resultado da determinao da falta de ajuste (lack of fit).
fonte var. SQ graus lib. MQ F calc. F tab.
Regresso 275992200,1 1 275992200 826,815 4,667
Resduo 4339423,28 13 333801,79
Falta
ajuste 1256773,28 3 418924,43 1,359 3,708
erro puro 3082650,00 10 308265
Total 280331623,33 14 19789514
% de variao explicada 98,452039
% mxima de variao explicativa 98,900356
Teste F tabelado unilateral, para um intervalo de confiana de 95%(P=0,05):
Se F cal. (regresso) > F tab., a regresso significativa.
Se F cal. (falta ajuste) < F tab., a falta de ajuste no significativa.
SQ: soma dos quadrados; MQ: mdia dos quadrados.
Resultados e Discusso


100
4.7.4 Estudo da Robustez

No estudo da robustez os parmetros verificados foram os da interface e do
mtodo de extrao. Para averiguar quais os fatores que influenciam na resposta analtica
gerando erros significativos, foi realizado um planejamento fatorial completo no ponto
central com dois nveis, trs fatores e trs rplicas. Perfazendo um total de 27 experimentos
por modelo. Aps anlise, os erros foram padronizados e comparados com um valor t
tabelado com n graus de liberdade, para verificar se so significativos ou no.

4.7.4.1 Fatores que influenciam a ionizao das avermectinas na interface

Os fatores selecionados foram divididos em duas partes: parmetros da interface e
da cromatografia lquida.

4.7.4.1.1 Parmetros da interface

Os parmetros estudados que poderiam afetar a ionizao das avermectinas foram
a presso do gs nebulizador, a energia de ionizao e a temperatura do turbo secador.
No estudo realizado, os resultados dos efeitos padronizados, representados no
grfico de Pareto (figuras 42, 43, 44 e 45), demonstraram que a voltagem e a temperatura
influenciam a ionizao das molculas, portanto so crticos para uma boa otimizao da
interface. A temperatura auxilia na dessolvatao dos ons, portanto quanto mais ons
estiverem disponveis, melhor ser a resposta do equipamento na deteco dos compostos.
Com relao energia de ionizao, as molculas possuem uma energia que melhor as
ionizem, portanto sua variao produz um acrscimo ou decrscimo no sinal analtico.
J a presso do gs nebulizador no produziu variaes significativas, portanto
no tem muita influncia na ionizao das molculas em estudo. As interaes produzidas,
entre os parmetros estudados pelo programa Minitab, tambm no influenciaram
significativamente a ionizao.

Resultados e Discusso


101











Figura 42 Efeitos padronizados da eprinomectina.















Figura 43 Efeitos padronizados da abamectina.

Resultados e Discusso


102




















Figura 44 Efeitos padronizados da doramectina.





















Figura 45 Efeitos padronizados da ivermectina.

Resultados e Discusso


103
4.7.4.1.2 Parmetros da cromatografia lquida

Os parmetros estudados que poderiam afetar a ionizao das avermectinas foram
o fluxo da fase mvel, a concentrao do acetato de amnio na fase mvel e a porcentagem
de metanol no gradiente da fase mvel.
No estudo realizado, os resultados dos efeitos padronizados, representados no
grfico de Pareto (figuras 46, 47, 48 e 49), demonstraram que a variao dos parmetros
estudados no foi significativa para a doramectina, possivelmente pela sua caracterstica
mais lipoflica, a ionizao no foi afetada pelos parmetros estudados. Em contraste, a
eprinomectina demonstrou variao significativa em todos os trs parmetros, com exceo
das suas interaes. Para a abamectina e a ivermectina, ocorreu variao significativa nos
parmetros do fluxo da fase mvel e da concentrao de acetato de amnio, sendo que a
porcentagem do metanol no gradiente no influenciou significativamente a resposta da
anlise.
Um dos parmetros que mais influenciaram significativamente na resposta foi o
fluxo da fase mvel, que pode ser justificado pelo aumento do efluente lquido na interface,
e como a temperatura da interface manteve-se a mesma, menos molculas foram
dessolvatadas, em conseqncia menos ons ficaram disponveis, diminuindo a resposta do
equipamento na deteco dos compostos. Outro parmetro que influenciou
significativamente foi a concentrao de acetato de amnio na fase mvel, aditivos com
valores de pH mais altos segundo CROTTI et al. (2006), auxiliam na formao da
coordenao com metais alcalinos formando adutos de sdio, que a forma de ionizao
das avermectinas por electrospray em modo positivo, portanto sua variao pode
ocasionar diferenas na resposta das anlises.
Com os resultados obtidos conclui-se que na otimizao da interface, devem ser
considerados no s os parmetros de temperatura, presso do gs nebulizador e a
voltagem da energia de ionizao. Mas tambm temos que levar em considerao os
parmetros utilizados na cromatografia lquida como o fluxo da fase mvel, concentrao
do tampo e pH da soluo. Assim como outros fatores que no foram objetos de estudo
nesta pesquisa.
Resultados e Discusso


104











Figura 46 Efeitos padronizados da eprinomectina.


















Figura 47 Efeitos padronizados da abamectina.
Resultados e Discusso


105



















Figura 48 Efeitos padronizados da doramectina.




















Figura 49 Efeitos padronizados da ivermectina.

Resultados e Discusso


106
4.7.4.2 Fatores que influenciam a extrao das avermectinas

Os parmetros estudados que poderiam afetar a recuperao e a preciso das
avermectinas foram a alquota de amostra, a carga de carbono nos cartuchos de EFS e a
porcentagem de acetonitrila da soluo de extrao e eluio.
No estudo realizado, os resultados dos efeitos padronizados, representados no
grfico de Pareto (figuras 50, 51, 52 e 53), demonstraram que de modo geral os parmetros
estudados na extrao das avermectinas no afetaram a recuperao e a preciso do mtodo
analtico. Somente com a ivermectina ocorreu o nico caso isolado, que produziu um efeito
significativo no estudo e o parmetro que contribuiu para este efeito foi o da concentrao
da acetonitrila na soluo de extrao e eluio.




















Figura 50 Efeitos padronizados da eprinomectina.

Resultados e Discusso


107




















Figura 51 Efeitos padronizados da abamectina.






















Figura 52 Efeitos padronizados da doramectina.

Resultados e Discusso


108



















Figura 53 Efeitos padronizados da ivermectina.

4.7.5 Estudo da Exatido

Como no foi possvel disponibilizar um material de referncia certificado (MRC),
a exatido foi calculada atravs da recuperao das avermectinas adicionada a uma matriz
em branco.
A exatido do mtodo foi determinada atravs do estudo das recuperaes das
avermectinas, fortificando 3 nveis de seis alquotas de leite sem resduos. Os nveis de
fortificaes estipulados foram de 0,2 g.L
-1
, 0,3 g.L
-1
e 0,4 g.L
-1
, equivalentes a 1, 1,5 e 2
vezes o limite de quantificao do mtodo.
Aps obteno dos dados de recuperao, estes foram tratados estatisticamente
utilizando uma planilha Ecxel, onde foram calculadas para cada uma das avermectinas a
recuperao global mdia, o desvio padro e o desvio padro relativo (DPR).
Os resultados apresentados nas tabelas 29, 30, 31 e 32 demonstraram uma
excelente recuperao para todas as avermectinas estudadas. A recuperao mdia global
para a eprinomectina, abamectina, doramectina e ivermectina foi respectivamente de 90%,
98%, 92.5% e 90%. Os intervalos indicativos para os desvios da recuperao ficaram
Resultados e Discusso


109
dentro dos estipulados na tabela 2 (COMISSO DAS COMUNIDADES EUROPIAS,
2002; ANVISA, 2003).

TABELA 29 Resultados da determinao da eprinomectina nos ensaios de
recuperao dos nveis de 0,2 g.L
-1
, 0,3 g.L
-1
e 0,4 g.L
-1
.










TABELA 30 Resultados da determinao da abamectina nos ensaios de
recuperao dos nveis de 0,2 g.L
-1
, 0,3 g.L
-1
e 0,4 g.L
-1
.

0,2 g.L-1 0,3 g.L-1 0,4 g.L-1
Concentrao mdia 0,2052 0,3047 0,3538
Recuperao (%) 102,6 101,6 88,5
Desvio padro 0,0083 0,0204 0,0291
DPR (%) 4 6,7 8,2
Parmetros globais de recuperao
Recuperao (%) 98
Desvio padro 0,0192
DPR (%) 6,3


TABELA 31 Resultados da determinao da doramectina nos ensaios de
recuperao dos nveis de 0,2 g.L
-1
, 0,3 g.L
-1
e 0,4 g.L
-1
.







0,2 g.L
-1
0,3 g.L
-1
0,4 g.L
-1

Concentrao mdia 0,1919 0,2771 0,3273
Recuperao (%) 96 92,4 81,8
Desvio padro 0,0128 0,0136 0,026
DPR (%) 6,7 4,9 7,9
Parmetros globais de recuperao
Recuperao (%) 90
Desvio padro 0,0174
DPR (%) 6,5
0,2 g.L-1 0,3 g.L-1 0,4 g.L-1
Concentrao mdia 0,2044 0,2968 0,3054
Recuperao (%) 102,2 98,9 76,3
Desvio padro 0,0081 0,008 0,0229
DPR (%) 3,9 2,7 7,5
Parmetros globais de recuperao
Recuperao (%) 92,5
Desvio padro 0,013
DPR (%) 4,7
Resultados e Discusso


110
TABELA 32 Resultados da determinao da ivermectina nos ensaios de
recuperao dos nveis de 0,2 g.L
-1
, 0,3 g.L
-1
e 0,4 g.L
-1
.

0,2 g.L-1 0,3 g.L-1 0,4 g.L-1
Concentrao mdia 0,1826 0,2921 0,3226
Recuperao (%) 91,3 97,4 80,6
Desvio padro 0,0156 0,0117 0,0239
DPR (%) 8,6 4 7,4
Parmetros globais de recuperao
Recuperao (%) 90
Desvio padro 0,017
DPR (%) 6,6



4.7.6 Estudo da Preciso

A preciso do mtodo analtico foi determinada atravs dos estudos da
repetitividade e preciso intermediria.

4.7.6.1 Estudo da repetitividade

Foi avaliada, no estudo da repetitividade, a diferena das repeties das
recuperaes, utilizando o mesmo procedimento de medio, mesmo analista, mesmo local
e repeties em um curto espao de tempo.
A repetitividade do mtodo foi determinada atravs do estudo da recuperao das
avermectinas, conforme descrito no procedimento do item 3.11.8. Este procedimento foi
realizado por mais duas vezes em dias diferentes.
Aps obteno dos dados de recuperao, estes foram tratados estatisticamente
utilizando uma planilha Ecxel, onde foram calculadas para cada uma das avermectinas a
recuperao global mdia, o desvio padro e o desvio padro relativo (DPR).
Os resultados apresentados nas tabelas 33, 34, 35 e 36 demonstraram uma
excelente repetitividade para todas as avermectinas estudadas. A repetitividade expressa em
DPR% para a eprinomectina, abamectina, doramectina e ivermectina foram
respectivamente de 6.6%, 7.0%, 6.8% e 6.5 %. Os intervalos indicativos para os desvios da
Resultados e Discusso


111
repetitividade ficaram dentro dos estipulados pela tabela 3 (COMISSO DAS
COMUNIDADES EUROPIAS, 2002; ANVISA 2003).

TABELA 33 Resultados da determinao da eprinomectina nos ensaios de
repetitividade dos nveis de 0,2 g.L
-1
, 0,3 g.L
-1
e 0,4 g.L
-1
.

0,2 g.L-1 0,3 g.L-1 0,4 g.L-1
Concentrao mdia 0,1838 0,2663 0,342
Recuperao (%) 92 89 85,5
Desvio padro 0,0122 0,0166 0,0244
DPR (%) 6,6 6,2 7
Repetitividade

DPR (%) 6,6


TABELA 34 Resultados da determinao da abamectina nos ensaios de
repetitividade dos nveis de 0,2 g.L
-1
, 0,3 g.L
-1
e 0,4 g.L
-1
.

0,2 g.L-1 0,3 g.L-1 0,4 g.L-1
Concentrao mdia 0,1959 0,277 0,3425
Recuperao (%) 95,3 92,5 85,7
Desvio padro 0,01 0,0186 0,0315
DPR (%) 5,3 6,7 9,1
Repetitividade

DPR (%) 7



TABELA 35 Resultados da determinao da doramectina nos ensaios de
repetitividade dos nveis de 0,2 g.L
-1
, 0,3 g.L
-1
e 0,4 g.L
-1
.


0,2 g.L-1 0,3 g.L-1 0,4 g.L-1
Concentrao mdia 0,1762 0,2543 0,3286
Recuperao (%) 88,1 84,7 82,2
Desvio padro 0,0124 0,0125 0,0263
DPR (%) 7,3 5,1 8
Repetitividade

DPR (%) 6,8


Resultados e Discusso


112
TABELA 36 Resultados da determinao da ivermectina nos ensaios de
repetitividade dos nveis de 0,2 g.L
-1
, 0,3 g.L
-1
e 0,4 g.L
-1
.


0,2 g.L-1 0,3 g.L-1 0,4 g.L-1
Concentrao mdia 0,1615 0,24 0,3211
Recuperao (%) 80,7 80 80,3
Desvio padro 0,0111 0,0115 0,025
DPR (%) 6,8 4,9 7,8
Repetitividade

DPR (%) 6,5



4.7.6.2 Estudo da preciso intermediria

A preciso intermediria ou intralaboratorial uma medida de preciso
reconhecida como sendo a mais representativa da variabilidade dos resultados de um
laboratrio (INMETRO, 2003).
O estudo da preciso intermediria foi avaliado como no item anterior, com a
diferena que no caso, foi realizada com analistas diferentes e com repeties em um
espao de tempo de no mnimo 2 dias.
Aps obteno dos dados de recuperao, estes foram tratados estatisticamente
utilizando uma planilha Ecxel, onde foram calculadas para cada uma das avermectinas a
recuperao global mdia, o desvio padro e o desvio padro relativo (DPR).
Os resultados apresentados nas tabelas 37, 38, 39 e 40 demonstraram uma
excelente preciso para todas as avermectinas estudadas. A preciso intermediria expressa
em DPR% para a eprinomectina, abamectina, doramectina e ivermectina foram
respectivamente de 4.9%, 5.7%, 5.8% e 5.3%. Os intervalos indicativos para os desvios da
repetitividade ficaram dentro dos estipulados pela tabela 3 (COMISSO DAS
COMUNIDADES EUROPIAS, 2002; ANVISA 2003).



Resultados e Discusso


113
TABELA 37 Resultados da determinao da eprinomectina nos ensaios de
preciso intermediria dos nveis de 0,2 g.L
-1
, 0,3 g.L
-1
e 0,4 g.L
-1
.


0,2 g.L-1 0,3 g.L-1 0,4 g.L-1
Concentrao mdia 0,1837 0,2642 0,3332
Recuperao (%) 91,8 88,1 83,3
Desvio padro 0,0095 0,0119 0,0179
DPR (%) 5,1 4,5 5,3
Preciso intermediria

DPR (%) 4,9




TABELA 38 Resultados da determinao da abamectina nos ensaios de preciso
intermediria dos nveis de 0,2 g.L
-1
, 0,3 g.L
-1
e 0,4 g.L
-1
.


0,2 g.L-1 0,3 g.L-1 0,4 g.L-1
Concentrao mdia 0,1934 0,28 0,3517
Recuperao (%) 94,1 93,2 88
Desvio padro 0,0097 0,0162 0,0223
DPR (%) 5 5,7 6,4
Preciso intermediria

DPR (%) 5,7



TABELA 39 Resultados da determinao da doramectina nos ensaios de
preciso intermediria dos nveis de 0,2 g.L
-1
, 0,3 g.L
-1
e 0,4 g.L
-1
.


0,2 g.L-1 0,3 g.L-1 0,4 g.L-1
Concentrao mdia 0,1878 0,2653 0,3456
Recuperao (%) 94 88,4 86,4
Desvio padro 0,0112 0,0145 0,0203
DPR (%) 6 5,5 5,8
Preciso intermediria

DPR (%) 5,8


Resultados e Discusso


114
TABELA 40 Resultados da determinao da ivermectina nos ensaios de
preciso intermediria dos nveis de 0,2 g.L
-1
, 0,3 g.L
-1
e 0,4 g.L
-1
.


0,2 g.L-1 0,3 g.L-1 0,4 g.L-1
Concentrao mdia 0,1743 0,25 0,3363
Recuperao (%) 87,1 83,3 84
Desvio padro 0,0089 0,0141 0,056
DPR (%) 5,1 5,5 5,3
Preciso intermediria

DPR (%) 5,3



4.7.7 Estudo da Estabilidade do Analito

Foi estudada a degradao das avermectinas no solvente e na matriz leite.

4.7.7.1 Estabilidade do analito no solvente

A soluo para o teste de degradao foi preparada em metanol na concentrao
de 1 g.L
-1
. O estudo da degradao foi realizado em um perodo de cinco meses, sendo
que a anlise dos padres foi realizada em quatro oportunidades, em novembro/06 (zero
dias), janeiro/07 (60 dias), fevereiro/07 (90 dias) e maro/07 (120 dias). Aps as anlises, o
resultado das concentraes foi expresso em porcentagem em relao ao tempo zero. Os
resultados da degradao das avermectinas encontram-se abaixo nas figuras 54, 54, 56 e 57.
Foi considerado no estudo uma estimativa de degradao de no mximo 5%
(UNITED STATES DEPARTAMENT OF AGRICULTURE, 2000; INCQS, 2003).
Levando em conta os resultados apresentados abaixo, at 60 dias as avermectinas foram
consideradas estveis para todas as situaes de armazenamento, podendo ser utilizadas
para o preparo de solues padro.




Resultados e Discusso


115
















Figura 54 Armazenamento a - 20 Celcius.






















Figura 55 Armazenamento a + 4 Celcius.




Resultados e Discusso


116
















Figura 56 Armazenamento a + 20 Celcius no claro.























Figura 57 Armazenamento a + 20 Celcius no escuro.




Resultados e Discusso


117
4.7.7.2 Estabilidade do analito na matriz leite

Alquotas de leite foram fortificadas na concentrao de 1 g.L
-1
e acondicionadas
em freezer a -20C. O estudo da degradao foi realizado em um perodo de quatro meses,
novembro/06 (zero dias), dezembro/07 (30 dias), janeiro/07 (60 dias), fevereiro/07 (90
dias) e maro (120 dias). Aps as anlises, o resultado das concentraes foi expresso em
porcentagem em relao ao tempo zero, para anlise dos dados e comparao da
degradao das solues. Os resultados da degradao dos padres na amostra encontram-
se abaixo na figura 58.
Atravs dos resultados de degradao, podemos observar no grfico abaixo, que
nesta condio de armazenamento, as avermectinas devem ficar estocadas no mximo uma
semana antes da anlise para evitar perdas por degradao.
O armazenamento em um perodo de 30 dias gera uma perda de
aproximadamente 10%, perodos longos de 60 a 90 dias geram uma perda de
aproximadamente 20% do analito e de at 120 dias uma perda de aproximadamente 40%
ou mais.


Figura 58 Armazenamento a -20Celcius na matriz leite.


Estabilidade no leite -20 graus Celcius
40
50
60
70
80
90
100
110
120
0 30 60 90 120
Dias
P
o
r
c
e
n
t
a
g
e
m
EPR
ABA
DOR
IVR
Resultados e Discusso


118
4.7.8 Anlise das Amostras de Leite

Foram analisadas 157 amostras de leite integral pasteurizado, coletadas na Bacia
leiteira do Estado do Paran. O resultado foi expresso como: abamectina B1a, doramectina,
ivermectina B1a e eprinomectina B1a.
Aps as anlises foi verificado que 39 (25 %) amostras de leite no continham
nenhum resduo de avermectinas, 76 (48,4 %) amostras com apenas um tipo de
avermectina, 35 (22,2 %) amostras com dois tipos e 7 (4,4 %) amostras com 3 tipos. A
incidncia de avermectinas nas amostra de leite foi de 2 amostras para a eprinomectina, 27
amostras para abamectina, 31 amostras para doramectina e 107 amostras para ivermectina.
A porcentagem individual de cada avermectina em relao ao total de amostras est
representada na figura 59.
Das amostras analisadas, 65 % estavam de acordo com a legislao e 35 %
estavam em desacordo (Ministrio da Agricultura 2006). Sendo que, das amostras em
desacordo, 100 % foram reprovadas por apresentarem avermectinas proibidas (abamectina
e doramectina) para vacas lactantes. Das avermectinas com limite mximo de resduo
estipulado (eprinomectina: 20 g.L
-1
e ivermectina: 10

g.L
-1
)

nenhuma ultrapassou o
limite permitido.
A ANVISA nos anos de 2004 e 2005 analisou 301 amostras de leite, onde foram
encontrados 11 % de abamectina, 0,7 % de doramectina e 56 % de ivermectina e a
eprinomectina no foi analisada (ANVISA, 2006). Os limites de deteco e quantificao
para as avermectinas analisadas pelo laboratrio responsvel foram respectivamente de 0,6
g.L
-1
e 1 g.L
-1
, provavelmente, por este motivo a porcentagem de avermectinas
encontradas no foi maior.
A ivermectina recomendada pelo Cdex Alimentarius at o limite 10 g.L
-1
(limite estabelecido no Brasil),

porm o uso do medicamento no recomendado pelos
fabricantes para vacas em lactao, sendo sua presena no leite indicativo de falta de boas
prticas veterinrias. Partindo dessa premissa a ivermectina assim como na Comunidade
Europia, deveria ser proibida para uso em vacas leiteiras. Portanto a porcentagem de
amostras em desacordo aumentaria de 35 % para 75 %.


Resultados e Discusso


119



IVR: ivermectina; DOR: doramectina; ABA: abamectina; EPR: eprinomectina.

Figura 59 Representao da porcentagem individual de cada avermectina.











Concluses


120
5 Concluses


A metodologia analtica, desenvolvida neste trabalho, para a identificao e
quantificao de avermectinas no leite, demonstrou ser de fcil aplicao e rpida execuo
na extrao dos analitos de interesse. Foram utilizados baixos limites de deteco e
quantificao, principalmente com relao queles descritos na literatura, possibilitando um
monitoramento mais efetivo na deteco da presena de resduos.
O mtodo analtico foi validado, utilizando-se de normas especficas para o uso
pretendido. Os parmetros validados demonstraram que o mtodo encontra-se dentro de
uma variao permitida para a aplicao pretendida, assegurando assim a confiabilidade dos
resultados. Dentro da performance da validao, levando em considerao os resultados
obtidos com a tcnica da espectrometria de massas em Tandem, o mtodo desenvolvido
mostrou-se superior aos descritos em literaturas pesquisadas.
Atravs dos resultados alcanados, conclui-se que deve ser adotada pelos rgos
responsveis uma poltica de orientao aos produtores, comunicando a necessidade de
utilizar boas prticas agropecurias, para minimizar a quantidade de resduos, e a no
utilizao de medicamentos proibidos.






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Anexos


126
7 Anexos

ANEXO I

Resultados do teste de ionizao da fonte de ionizao qumica (grfico1)


Metanol/gua (9:1) com voltagem modo positivo

EPR: [M+H]
+
5.0e5
IVR: [M+ NH
4
]
+
5.0e5
DOR: [M+ NH
4
]
+
9.0e4
ABA: [M+ NH
4
]
+
5.0e5


Metanol/gua (9:1) com voltagem modo negativo

EPR: [M-H]
-
1.3e6
IVR: [M-H]
-
2.7e6
DOR: [M-H]
-
8.8e5
ABA: [M-H]
-
2.3e6


Metanol/gua (9:1) sem voltagem modo positivo

EPR: sem resposta significativa
IVR: sem resposta significativa
DOR: sem resposta significativa
ABA: sem resposta significativa


Metanol/gua (9:1) sem voltagem modo negativo

EPR: sem resposta significativa
IVR: sem resposta significativa
DOR: sem resposta significativa
ABA: sem resposta significativa


Metanol/gua (9:1) com voltagem/ modo positivo/ acido frmico 0,1%

EPR: [M+H]
+
2.7e6
IVR: [M+ NH
4
]
+
1.3e6
DOR: [M+ NH
4
]
+
5.3e5 [M+H]
+
5.1e5
ABA: [M+ NH
4
]
+
7.0e5 [M+H]
+
3.0e5





Anexos


127




Metanol/gua (9:1) com voltagem/ modo negativo/ acido frmico 0,1%

EPR: [M+HCOO]
-
4.4e6 [M-H]
-
1.7e6
IVR: [M+HCOO]
-
3.7e6 [M-H]
-
1.3e6
DOR: [M+HCOO]
-
3.2e6 [M+CH
3
COO]
-
1.4e6
ABA: [M+HCOO]
-
1.5e6 [M-H]
-
5.0e5

Metanol/gua (9:1) sem voltagem/ modo positivo/acido frmico 0,1%

EPR: sem resposta significativa
IVR: sem resposta significativa
DOR: sem resposta significativa
ABA: sem resposta significativa


Metanol/gua (9:1) sem voltagem/ modo negativo/acido frmico 0,1 %

EPR: sem resposta significativa
IVR: sem resposta significativa
DOR: sem resposta significativa
ABA: sem resposta significativa


Metanol/gua (9:1) com voltagem/ modo positivo/ acetato de amnio 5 mM

EPR: [M+H]
+
1.7e6
IVR: [M+ NH
4
]
+
1.7e6
DOR: [M+ NH
4
]
+


8.0e5 [M+H]
+
4.0e5
ABA: [M+ NH
4
]
+


1.6e6 [M+H]
+-
4.0e5


Metanol/gua (9:1) com voltagem/ modo negativo/ acetato de amnio 5 mM

EPR: [M-H]
-
1.6e6 [M+CH
3
COO]
-
1.4e6 [M+HCOO]
-
5.8e5
IVR: [M-H]
-
1.5e6 [M+CH
3
COO]
-
1.4e6 [M+HCOO]
-
5.0e5
DOR: [M+CH
3
COO]
-


1.1e6 [M-H]
-
9.5e5 [M+HCOO]
-
2.5e5
ABA: [M-H]
-


1.8e6 [M+CH
3
COO]
-
1.5e6 [M+HCOO]
-
4.0e5


Metanol/gua (9:1) sem voltagem/ modo positivo/acetato de amnio 5mM

EPR: sem resposta significativa
IVR: sem resposta significativa
DOR: sem resposta significativa
ABA: sem resposta significativa
Anexos


128



Metanol/gua (9:1) sem voltagem/ modo negativo/ acetato de amnio 5mM

EPR: sem resposta significativa
IVR: sem resposta significativa
DOR: sem resposta significativa
ABA: sem resposta significativa

acetonitrilal/gua (9:1) com voltagem/modo positivo

EPR: [M+H]
+
1.1e6
IVR: [M+ NH
4
]
+
2.0e5
DOR: [M+H]
+
1.1e5 [M+ NH
4
]
+
1.0e5
ABA: [M+ NH
4
]
+
1.7e5


acetonitrila/gua (9:1) com voltagem modo negativo

EPR: [M-H]
-
2.0e6
IVR: [M-H]
-
2.1e6
DOR: [M-H]
-
1.4e6
ABA: [M-H]
-
2.6e6


acetonitrila/gua (9:1) sem voltagem modo positivo

EPR: sem resposta significativa
IVR: sem resposta significativa
DOR: sem resposta significativa
ABA: sem resposta significativa


acetonitrila/gua (9:1) sem voltagem modo negativo

EPR: sem resposta significativa
IVR: sem resposta significativa
DOR: sem resposta significativa
ABA: sem resposta significativa


acetonitrila/gua (9:1) com voltagem/ modo positivo/ acido frmico 0,1%

EPR: [M+H]
+
5.3e5
IVR: [M+ NH
4
]
+
2.0e5
DOR: [M+H]
+
5.0e4
ABA: [M+ NH
4
]
+
2.0e5 [M+H]
+
1.0e5
Anexos


129









acetonitrilal/gua (9:1) com voltagem/ modo negativo/ acido frmico 0,1%

EPR: [M+HCOO]
-
5.4e5 [M-H]
-
2.0e5
IVR: [M+HCOO]
-
8.4e5 [M-H]
-
3.5e5
DOR: [M+HCOO]
-
5.2e5 [M-H]
-
1.9e5 [M+CH
3
COO]
-
1.5e5
ABA: [M+HCOO]
-
1.0e6 [M-H]
-
3.5e5


acetonitrila/gua (9:1) sem voltagem/ modo positivo/acido frmico 0,1%

EPR: sem resposta significativa
IVR: sem resposta significativa
DOR: sem resposta significativa
ABA: sem resposta significativa


acetonitrilal/gua (9:1) sem voltagem/ modo negativo/acido frmico 0,1 %

EPR: sem resposta significativa
IVR: sem resposta significativa
DOR: sem resposta significativa
ABA: sem resposta significativa


acetonitrila/gua (9:1) com voltagem/ modo positivo/ acetato de amnio 5 mM

EPR: [M+H]
+
1.0e6
IVR: [M+ NH
4
]
+
1.4e6
DOR: [M+ NH
4
]
+


6.5e5 [M+H]
+
2.5e5
ABA: [M+ NH
4
]
+


1.8e6 [M+H]
+
4.0e5


acetonitrila/gua (9:1) com voltagem/ modo negativo/ acetato de amnio 5 mM

EPR: [M-H]
-
1.3e6 [M+CH
3
COO]
-
7.0e5 [M+HCOO]
-
4.5e5
IVR: [M-H]
-
2.0e6 [M+CH
3
COO]
-
1.5e6 [M+HCOO]
-
8.0e5
DOR: [M+CH
3
COO]
-


9.1e5 [M-H]
-
8.5e5 [M+HCOO]
-
4.5e5
ABA: [M-H]
-


2.5e6 [M+CH
3
COO]
-
1.9e6 [M+HCOO]
-
5.6e5
Anexos


130
ANEXO II

Resultados do teste de ionizao da fonte de electrospray (grfico 2)


Metanol/gua (9:1) modo positivo

EPR: [M+Na]
+
3.3e5 [M+K]
+
3.0e4
IVR: [M+ Na]
+
2.5e5 [M+K]
+
4.0e4
DOR: [M+Na]
+
1.6e5 [M+K]
+
7.0e4
ABA: [M+Na]
+
3.9e6

Metanol/gua (9:1) modo negativo

EPR: [M-H]
-
1.1e4
IVR: [M-H]
-
1.5e4
DOR: [M-H]
-
3.2e4
ABA: [M-H]
-
7.0e4 [M+CH
3
COO]
-
8.8e4


Metanol/gua (9:1) modo positivo/ acido frmico 0,1%

EPR: [M+Na]
+
2.7e6 [M+H]
+
2.0e5 [M+K]
+
1.5e5
IVR: [M+ Na]
+
1.3e6
DOR: [M+Na]
+
5.3e5
ABA: [M+Na]
+
7.0e5

Metanol/gua (9:1)modo negativo/ acido frmico 0,1%

EPR: [M+HCOO]
-
1.3e5 [M-H]
-
6.0e4
IVR: [M+HCOO]
-
1.9e5 [M-H]
-
1.3e5
DOR: [M+HCOO]
-
5.5e5 [M+H]
-
1.0e5
ABA: [M+HCOO]
-
2.2e4


Metanol/gua (9:1) modo positivo/ acetato de amnio 5 mM

EPR: [M+Na]
+
1.3e7 [M+H]
+
4.0e6 [M+K]
+
1.0e6
IVR: [M+ Na]
+
9.2e6 [M+K]
+
5.5e6 [M+ NH
4
]
+
3.0e6
DOR: [M+ Na]
+


1.0e7 [M+ NH
4
]
+
1.0e6
ABA: [M+ Na]
+


1.4e7 [M+ NH
4
]
+
4.0e6


Metanol/gua (9:1) modo negativo/ acetato de amnio 5 mM

EPR: [M+CH
3
COO]
-
2.9e6 [M-H]
-
2.8e6 [M+HCOO]
-
5.4e5
IVR: [M-H]
-
3.8e6 [M+CH
3
COO]
-
3.0e6
DOR: [M-H]
-


1.8e6 [M+CH
3
COO]
-
1.6e6
ABA: [M-H]
-


3.8e6 [M+CH
3
COO]
-
4.0e6 [M+HCOO]
-
5.5e5





Anexos


131


acetonitrilal/gua (9:1) modo positivo

EPR: [M+Na]
+
2.9e5 [M+K]
+
4.5e4
IVR: [M+Na]
+
2.4e5 [M+K]
+
4.0e4
DOR: [M+Na]
+
1.1e5 [M+K]
+
2.5e4
ABA: [M+Na]
+
2.4e5 [M+K]
+
4.0e4


cetonitrila/gua (9:1) modo negativo

EPR: [M-H]
-
sem resposta significativa
IVR: [M-H]
-
sem resposta significativa
DOR: [M-H]
-
sem resposta significativa
ABA: [M-H]
-
sem resposta significativa


acetonitrila/gua (9:1) acido frmico 0,1%

EPR: [M+Na]
+
2.8e5 [M+K]
+
4.5e4
IVR: [M+Na]
+
2.9e5 [M+K]
+
4.5e4
DOR: [M+Na]
+
1.2e5 [M+K]
+
3.0e4
ABA: [M+Na]
+
7.2e5 [M+K]
+
5.0e4


acetonitrila/gua (9:1) acido frmico 0,1%

EPR: [M-H]
-
sem resposta significativa
IVR: [M-H]
-
sem resposta significativa
DOR: [M-H]
-
sem resposta significativa
ABA: [M-H]
-
sem resposta significativa


acetonitrila/gua (9:1) acetato amnio 5mM

EPR: [M+Na]
+
4.0e6 [M+K]
+
1.8e6
IVR: [M+Na]
+
3.1e6 [M+K]
+
1.0e6
DOR: [M+Na]
+
1.9e6 [M+K]
+
1.1e6
ABA: [M+Na]
+
5.2e6 [M+K]
+
1.0e6


acetonitrila/gua (9:1) acetato de amnio 5 mM

EPR: [M-H]
-
3.4e5 [M+CH
3
COO]
-
1.5e5
IVR: [M-H]
-
3.6e5 [M+CH
3
COO]
-
2.4e5 [M+HCOO]
-
1.4e5
DOR: [M+CH
3
COO]
-


2.6e5 [M+CH
3
COO ]
-
1.5e5 [M+HCOO]
-
1.3e5
ABA: [M-H]
-


5.2e6 [M+CH
3
COO]
-
1.7e5 [M+HCOO]
-
1.4e5