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BROMATOLOGIA

Prof. Alvaro Galdos


Espectrofotometria
Mtodos Quantitativos Instrumentais
So mais sensveis;
Requerem quantidades menores de amostras;
So mais seletivos que os mtodos clssicos (anlise volumtrica).



So caracterizados pela interao entre a matria e a
energia eletromagntica.

Energia Radiante: dividida em vrias regies e relaciona-se
com os mecanismos de transies atmicas ou moleculares
pertinentes a cada regio.


Mtodos Espectromtricos
Regio do espectro (comprimento
de onda)
Modificaes
Interao energia / matria
Raios gama 0,0001 0,01 nm Reaes nucleares
Raios x 0,01 2 nm Transies de eltrons de
camada K e L
Ultravioleta afastado 2 200 nm Transies de eltrons de
camada intermediria
Ultravioleta 200 400 nm Transies de eltrons valncia
(externos)
Visvel 400 750 nm
Infravermelho
prximo
0,75 2,5 m Vibraes moleculares
Infravermelho 2,5 25 m Rotaes moleculares e
vibraes fracas
Microondas 1 mm 30 cm Rotaes moleculares
MTODOS ESPECTROMTRICOS
ESPECTROSCOPIA DE ABSORO NO UV-VISVEL
Conceito: tcnica analtica quali-quantitativa que tem como
fundamento a interao da radiao eletromagntica com
diferentes espcies qumicas: molculas, ons, tomos isolados.

- Absoro: processo especfico relacionado com a estrutura
da espcie absorvente.

- Visvel: ( 380 780 nm)
Ultravioleta: ( 190 380 nm)


ESPECTROSCOPIA DE ABSORO NO UV-VIS
Objetivo: avaliao da qualidade de medicamentos,
alimentos, cosmticos, insumos, anlises clnicas e
toxicolgicas: IDENTIFICAO E QUANTIFICAO.


Caractersticas: facilidade de manuseio e operao, boa
sensibilidade, boa exatido, ampla aplicabilidade, porm
pouca seletividade.
LEI DE LAMBERT-BEER
Correlaciona a intensidade de energia absorvida com a concentrao
da soluo.


Io

It
b
c= concentrao da espcie qumica absorvente (soluo em anlise)
b= espessura atravessada pelo feixe luminoso
I
o
= intensidade de luz incidente
It = intensidade de luz transmitida
= cte caracterstica para cada soluo.
I
o
> It
A quantidade de luz que
absorvida por uma soluo
depende da concentrao
da substncia absorvente e
da espessura da soluo
atravs da qual a luz
passa.
Log I0 = . c . It
It
A = . c . It
Desvios da Lei de Lambert-Beer
Presena de mais de uma substncia absorvente;

Mudana de natureza do solvente ou solues muito
concentradas;

Incidncia de luz com mais de um comprimento de onda
em virtude de uma larga faixa de luz.
Ps. Espectrofotmetros de boa qualidade apresentam menor desvio
porque fornecem faixas de luz estreitas e um mnimo de luz dispersa.
Definies
Deslocamento batocrmico: deslocamento da absoro para
comprimento de onda maior devido efeitos de substituio do solvente
(deslocamento para o vermelho).
Deslocamento hipsocrmico: deslocamento da absoro para
comprimento de onda menor devido efeitos de substituio do solvente
(deslocamento para o azul).

Efeito hipercrmico: o aumento da intensidade de absoro.

Efeito hipocrmico: uma diminuio da intensidade de absoro.

Espectroscopia no UV-Vis
-Para quantificar substncias que no absorvem a luz a nenhum
comprimento de onda da regio do UV ou compostos coloridos, as leituras
devem ser efetuadas na regio do visvel (Vis) - 380 780 nm.

- Ou realizar reao da substncia com reagente especfico, de modo a
desenvolver cor cuja intensidade diretamente proporcional
concentrao.
Cor Comprimento de
onda (nm)
Violeta 390 455
Azul 455 492
Verde 492 577
Amarelo 577 597
Laranja 597 622
vermelho 622 - 780
Regio do visvel
ESPECTROFOTMETROS

- Quando se mede a absoro para fins de quantificao, o
comprimento de onda escolhido, aquele em que se observa
absoro mxima.

- A curva de absoro espectral a representao grfica da
absorbncia em relao ao comprimento de onda.
Fonte luminosa:

-Regio do UV: lmpada de descarga de hidrognio ou de deutrio
(190 370 nm).
-Regio do Visvel: lmpada de filamento de tungstnio (350 750 nm)

Monocromador: seleciona comprimento de onda da fonte luminosa.

Detector: desenvolve corrente eltrica.

Amplificador: amplia o sinal.

Galvanmetro: mede a intensidade de luz.

Cubeta: local onde transferida a amostra ou soluo. Pode ser de
vidro, quartzo ou slica transparente, com faces perfeitamente
paralelas, espessura de 1cm (padro).


Variaes nos clculos de doseamento
- Absortividade (): razo entre absorbncia (A) e o
produto da concentrao (c) em g/L e caminho ptico (b)
em cm.

= A/bc ou A = . b .c

- Absortividade Molar (E) = razo entre absorbncia (A) e
o produto da concentrao (c) em mol/L e caminho
ptico (b) em cm.

E = A/bc ou E = . PM


Aplicaes da fotometria (Exemplo prtico) Dosagem
de Protena
A principal finalidade de uma medida espectrofotomtrica, nas regies do
ultravioleta e visvel, avaliar quantidades.
Rigorosa calibrao visando obter resultados exatos.
Para obter-se uma curva de calibrao alguns aspectos devem ser considerados
como:

1. A escolha de uma soluo padro ( Ex:proteina-Albumina)
2. O estabelecimento de um branco adequado
3. A seleo da rea espectral.


Preparo de uma curva padro (ou calibrao)
O preparo da curva de calibrao de grande importncia e deve ser
bem entendido. Todo analista deve ser capaz de preparar suas prprias
curvas de calibrao e interpretar os resultados obtidos.

Para se obter o valor da concentrao de substncias cuja concentrao
se desconhece, necessrio estabelecer uma relao entre a
absorbncia desta soluo em diferentes concentraes com as suas
concentraes.

Isto se chama curva de calibrao (curva padro).

Espectro de absoro do permanganato de potssio
A amostra (1) tem 66 mg/L de
concentrao.

As demais (2),(3),(4) e (5) foram diludas
para (0,8), (0,6), (0,4) e (0,2) da
concentrao da primeira amostra,
respectivamente.
- Preparar a srie de padres de concentrao conhecida,
cobrindo-se a faixa de leitura.
Curva de Calibrao
Procedimento
1. Preparar uma srie de padres exatos, cobrindo a faixa de trabalho usada ou
indicada. Usar o padro recomendado para o mtodo a ser calibrado.
2. Dosar todos os padres de acordo com a tcnica recomendada. Efetuar as
leituras colorimtricas, usando o branco apropriado para acertar o zero-A, alm
do comprimento de onda recomendado pela literatura ou obtido pela curva de
absoro espectral previamente realizada.
3. Obter os valores de Absorbncia.
4. Plotar os resultados em papel milimetrado, relacionando Absorbncia
(ordenada) com as concentraes dos padres (abscissa). Examinar bem os
pontos e decidir se eles sero cobertos por uma linha reta. Se os pontos
aparentemente seguirem uma linha reta, traar uma curva de modo que mais se
aproxime de todos os pontos obtidos. A curva no deve ser traada de ponto a
ponto, mas interpolando atravs dos pontos.
5. Examinar a curva traada, avaliando se ela tem sensibilidade correta

Temos que preparar as diluies do padro 10 mg/ml tendo como
volume final 1,0 ml.
Recorremos a regra geral da diluio:
C
i
V
i
= C
f
V
f
onde:
C
i
= concentrao inicial (10 mg/ml)
V
i
= volume a ser retirado do padro (?)
C
f
= concentrao final (2mg/ml)
V
f
= volume final (1,0 ml)


Albumina
10 mg/ml
Albumina
2 mg/ml
Exemplo: Tubo 1 ( 2,0 mg/ml )

C
i
V
i
= C
f
V
f

10 mg/ml V
i
(?) = 2 mg/ml 1,0 mg/ml

V
i
= 0,2 ml
V
i
= 0,2 ml do padro
+ 0,8 ml de gua

1,0 ml (2 mg/ml)

Curva padro de Albumina
Na prtica, como ser a performance de vocs?
Tubo
Conc.
(mg/ml)

Albumina
10 mg/ml
(ml)

gua
(ml)
Biureto
(ml)
A
1 2,0 4,0
2 4,0 4,0
3 6,0 4,0
4 8,0 4,0
5 10,0 4,0
BR ----- ----- 1,0 4,0 -----
Preenchendo a tabela para obter a curva...
Tubo Conc.
(mg/ml)
Albumina 10
mg/ml (ml)

gua
(ml)
Biureto (ml) A
1 2,0 4,0
2 4,0 4,0
3 6,0 4,0
4 8,0 4,0
5 10,0 4,0
BR ----- ----- 1,0 4,0 -----
0,2 0,8
0,4 0,6
0,6 0,4
0,8 0,2
1,0 ---
Deixar os tubos em repouso por 15 minutos.
Ler as absorbncias de todos os tubos contra o Branco no adequado.
Traar o grfico e analisar.

A curva padro ideal deve ter ngulo aproximado de 45














2 4 6 8 10 mg/ml
0
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
A
C
Equao da reta: y = bx + a
Uma boa curva padro
1,0 ml da amostra
4,0 ml do reagente de biureto
Esperar 15 minutos
Ler contra o Branco

Amostra
Conc. ?
Determinar a
concentrao de
protenas totais na
amostra recorrendo
curva padro













2 4 6 8 10 mg/ml
0
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
A
C
Dosagem de protenas totais de uma amostra
Equao da reta:

y = bx + a


























2 4 6 8 10 mg/ml
0
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
A
C
Curva de calibrao da albumina
Y = 0,0579x + 0,001

0,438 = 0,0579x + 0,001

X = 7,56 mg/mL


Leitura da amostra
[ ] ?
7,56 mg/mL
Exemplo pela extrapolao grfica e pelo clculo da
equao da reta:
um artifcio usado rotineiramente e seu
clculo feito como:



Finalmente, para calcular a concentrao da
amostra:



concentrao padro
FC =
absorbncia padro
O uso de Fator de Calibrao (FC)
[amostra] = Absorbncia da amostra FC
Obtendo o Fator de Calibrao pela prpria curva padro
FC = cotag
0.
5













2 4 6 8 10 mg/ml
0
0
0.
1
0.
2
0.
3
0.
4
A
C
Y2
Y1
X1 X2

cateto oposto
(sen )
cateto adjacente
(cos )
Portanto:
FC = 1 / tg
Como:
tg = sen / cos
Ento:
FC = cos / sen
De onde se conclui que:
cateto adjacente X2 - X1
FC = =
cateto oposto Y2 - Y1
Finalmente, para calcular a concentrao da amostra:
[amostra] = Absorbncia da amostra FC