CROMATOGRAFIA LQUIDA (HPLC)

Scientia Chromatographica 2012; 4(3):197-207

Instituto Internacional de Cromatografia
http://dx.doi.org/10.4322/sc.2012.014
ISSN 1984-4433
UHPLC Uma abordagem atual:
desenvolvimentos e desafios recentes
Liane Maldaner, Isabel Cristina Sales Fontes Jardim*
Instituto de Qumica, Universidade Estadual de Campinas UNICAMP, Cep 13083-970, Campinas, SP, Brasil
e-mail: icsfj@iqm.unicamp.br
Resumo
A cromatografa lquida de ultra efcincia (UHPLC) desenvolveu-se com a introduo das partculas
de fases estacionrias (FE) porosas 2 m, juntamente com a busca contnua por anlises mais rpidas
e efcientes, e fundamenta-se nos mesmos princpios de separao da cromatografa lquida de alta
efcincia (HPLC). Desde a sua introduo em 2004, a UHPLC vem ganhando espao em todas as reas de
aplicao da HPLC em decorrncia de suas vantagens e, desta forma, vem sendo alvo constante de novas
pesquisas, principalmente no que diz respeito a novas FE e melhorias nos equipamentos. Os principais
desafos no emprego da UHPLC em comparao com a HPLC j foram identifcados e juntamente com
os desenvolvimentos recentes sero abordados neste artigo.
Palavras-chave
UHPLC; fases estacionrias; instrumentao; UHPLC HPLC.
UHPLC - The present situation: developments and recent challenges
Abstract
Ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) emerged with the advent of sub-2 m porous
particles catalyzed by the continuous search for faster and more efcient analyses, and retains the same
separation principles as high performance liquid chromatography (HPLC). Since its introduction in
2004, UHPLC has grown in all HPLC separation areas as a consequence of its advantages and, thus,
has been a driving force for new research, especially in terms of novel stationary phases and improved
equipment. Te main challenges for using UHPLC, in comparison with HPLC, have already been
identifed and will be discussed in this paper together with recent developments in both stationary
phases and instrumentation.
Keywords
UHPLC; stationary phases; instrumentation; UHPLC HPLC.
Maldaner L, Jardim ICSF UHPLC abordagem atual
198 Scientia Chromatographica 2012; 4(3):197-207
do meio acadmico e avaliada por usurios diver-
sos, at os dias atuais, a UHPLC vem ganhando
espao em todas as reas de aplicao da HPLC,
em decorrncia de suas principais vantagens:
diminuio considervel no tempo de anlise,
melhor resoluo e detectabilidade, economia de
fase estacionria e fase mvel, pequeno volume
de amostra, facilidade de transferncia de um
mtodo desenvolvido por HPLC para UHPLC,
grande variedade de colunas e equipamentos dis-
ponveis e menor gerao de resduos atendendo,
desta forma, Qumica Verde.
Em vista deste rpido crescimento e da
expanso do emprego da UHPLC nas anlises
de rotina, esta tcnica vem sendo alvo constante
de novas pesquisas, principalmente no que diz
respeito a novas FE e suportes cromatogrfcos
e melhorias nos equipamentos. Os principais
desafos no uso da UHPLC em comparao com
a HPLC j foram identifcados e, juntamente
com os desenvolvimentos recentes, sero abor-
dados neste artigo.
2 Desenvolvimentos recentes
O desenvolvimento da UHPLC se deu em
virtude da introduo das partculas de FE poro-
sas 2 m que, associadas s colunas cromato-
grfcas com dimenses reduzidas e s altas velo-
cidades lineares de FM, permitiram que anlises
mais rpidas fossem possveis, sem o comprome-
timento da efcincia e da resoluo cromatogr-
fca. Entretanto, a grande aceitao da UHPLC
nos mais diversos campos de aplicao impulsio-
nou as pesquisas em busca de novos materiais,
suportes e/ou FE e novas estratgias de uso das
colunas e dos equipamentos para ancorar o cres-
cimento e tambm para oferecer novas alterna-
tivas aos desafos decorrentes da expanso e da
ampla variedade de reas de aplicao.
1 Introduo
A cromatografa lquida de alta efcincia
(HPLC) uma tcnica de separao bem esta-
belecida e empregada nas mais diversas reas,
entre elas, qumica, forense, toxicolgica, clnica
e ambiental, para solucionar inmeros proble-
mas analticos. Durante os ltimos anos, mui-
tas melhorias vm sendo incorporadas a esta
tcnica, como desenvolvimentos de novas fases
estacionrias (FE) e suportes cromatogrfcos,
avanos na instrumentao, entre outros, permi-
tindo que anlises mais rpidas e mais efcientes
sejam alcanadas, corroborando com a necessi-
dade atual de aumentar o nmero de anlises e o
rendimento e reduzir os custos.
A cromatografa lquida de ultra efcincia
(UHPLC)
[1-7]
(UHPLCultra-high pressure liquid
chromatography ou ultra-high performance liquid
chromatography) desenvolveu-se a partir da
introduo das partculas de FE porosas 2 m,
em resposta busca contnua por anlises mais
rpidas e efcientes. A UHPLC fundamenta-se
nos mesmos princpios de separao da HPLC,
tendo como principais diferenas as colunas cro-
matogrfcas empregadas que so de dimenses
reduzidas (5-10 cm de comprimento e dimetros
internos de 1-2,1 mm), recheadas com partculas
de FE 2 m, as quais, juntamente com as altas
velocidades lineares de fase mvel (FM) aumen-
tam a resoluo e a detectabilidade, diminuem o
tempo das anlises, porm geram um aumento
signifcativo na presso cromatogrfca. Em vista
disso, um equipamento adequado, capaz de ope-
rar a altas presses, acima de 1000 bar (15000
psi), empregado para extrair um desempenho
cromatogrfco mximo dessa tcnica.
Desde a introduo do primeiro equipa-
mento de UHPLC pela Waters Corporation em
2004, denominado de ACQUITY UPLC System,
que permitiu que a tcnica fosse empregada alm
UHPLC abordagem atual Maldaner L, Jardim ICSF
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ses de at 1034 bar (15000 psi). Encontram-se
disponveis comercialmente colunas HSS C18,
ciano e fuorfenil.
Mais recentemente, a Waters Corporation
lanou as partculas de slica hbrida de terceira
gerao, que consistem de partculas de slica
hbrida (partculas BEH de 1,7 m) incorporadas
com uma pequena quantidade de carga na super-
fcie
[11]
. As principais vantagens que estas part-
culas apresentam so a melhora na capacidade
de amostra e na simetria de pico de compostos
bsicos quando so empregadas FM com baixa
fora inica (meio cido). Essas partculas so
comercializadas pela Waters com a denominao
de CSH e encontram-se disponveis comercial-
mente colunas C18, fenil-hexil e fuorfenil.
As FE denominadas de HILIC so empre-
gadas em cromatografa de interao hidrof-
lica (HILIC - hydrophilic interaction chromato-
graphy), que uma modalidade de separao
na qual empregada uma FE polar e uma FM
menos polar, sendo, desta forma, muito propcia
para anlise de compostos polares e inicos
[5,12]
.
As principais vantagens da HILIC em relao
s separaes por fase reversa, que fzeram com
que elas tambm fossem redimensionadas para
serem empregadas em UHPLC so: a ordem
de eluio dos compostos em HILIC mais ou
menos oposta ordem de eluio em FR, o que
indica que a HILIC retm melhor os compostos
que so problemticos de serem analisados em
FR; alta detectabilidade nas anlises com detec-
o por espectrometria de massas (EM) devido
alta porcentagem de solvente orgni co polar
empregada nas FM para HILIC e separaes
mais rpidas, devido a menor viscosidade da FM.
Uma alternativa para aumentar a seleti-
vidade das separaes por FR a modifcao
ou introduo de novos grupos qumicos nas
cadeias da FE
[5,12]
. Dentro deste contexto, as FE
que vm ganhando destaque so as FE fuoradas,
2.1 Colunas de UHPLC: novos suportes
e fases estacionrias
2.1.1 Colunas recheadas com
partculas porosas 2 m
As primeiras colunas recheadas com par-
tculas de FE 2 m disponveis comercial-
mente foram as denominadas ACQUITY BEH
(BEH - ethylene bridged hybrid) (baseadas em
slica hbrida de segunda gerao de 1,7 m,
a qual possui pontes de etano inseridas na sua
estrutura), introduzidas em 2004 pela Waters
Corporation. Hoje, 8 anos aps o surgimento da
tcnica, mais de 30 fabricantes esto comercia-
lizando colunas de UHPLC recheadas com FE
de tamanhos de partculas que variam de 1,5 a
2,0 m, preparadas a partir de suportes de slica
ou de slica hbrida e modifcadas com diferentes
grupos qumicos como: C18, C8, fenil, ciano e
grupos polares embutidos
[2,4,5,8,9]
.
Alm destas FE, muitas outras esto sendo
desenvolvidas e empregadas em condies de
UHPLC, como as FE baseadas em suporte de
slica de elevada resistncia (HSS) (HSS - high
strenght silica) e suportes hbridos com a super-
fcie carregada (CSH) (CSH - charged surface
hybrid), HILIC (HILIC - hydrophilic interaction
chromato graphy), fuoradas, de modo misto,
entre outras, como alternativas para as separa-
es cromatogrfcas mais complexas no alcan-
adas com as FE tradicionais de fase reversa (FR).
O suporte cromatogrfco designado de
HSS foi desenvolvido pela Waters Corporation
como alternativa s partculas de slica hbrida
de segunda gerao (BEH) de 1,7 m
[10]
. Este
suporte cromatogrfco constitudo de 100%
de slica, de tamanho de partcula de 1,8 m e,
segundo o fabricante, possui uma morfologia que
capaz de aumentar o tempo de vida til, gerar
maiores efcincias e proporcionar alta resistn-
cia mecnica, podendo ser empregado em pres-
Maldaner L, Jardim ICSF UHPLC abordagem atual
200 Scientia Chromatographica 2012; 4(3):197-207
os sistemas convencionais de HPLC
[2,5,12,13-17]
.
Estas vantagens so decorrentes das caracters-
ticas destas partculas, que so produzidas com
uma estreita faixa de distribuio de tamanho
e, desta forma, permitem maior densidade de
recheio das colunas cromatogrfcas, e, devido
fna camada porosa, oferecem uma baixa resis-
tncia transferncia de massa, possibilitando o
emprego de maiores velocidades lineares de FM
sem perdas signifcativas na efcincia.
Estas partculas so comercializadas por
diferentes fabricantes, como: com a deno-
minao de Halo
TM
, pela Advanced Material
Technologies; Kinetex
TM
, pela Phenomenex;
Ascentis
TM
Express, pela Supelco; Poroshell 120,
pela Agilent Technologies; Nucleoshell, pela
Macherey-Nagel; Sunshell, pela Biotech (paten-
teado pela Chromanik Technologies Inc.); e
Accucore, pela Termo Scientifc, com tama-
nhos de partculas 3 m (sub-3 m) e 2 m
(sub-2 m), sendo estas ltimas apenas comer-
cializadas pela Phenomenex. Partculas superf-
cialmente porosas 2 m tambm vm sendo
desenvolvidas pela Glantreo Ltd, Ireland, com a
denominao de Eiroshell
TM
, porm ainda no
se encontram disponveis comercialmente
[13-15]
.
As partculas sub-3 m so resistentes a pres-
ses de at 600 bar (9000 psi) e comercializadas
em colunas com dimetros internos de 4,6, 3,0 e
2,1mm; e as partculas sub-2 m so resistentes
a presses de at 1000 bar (15000 psi) e comer-
cializadas em colunas com dimetros internos de
3,0 e 2,1 mm. Encontram-se disponveis FE pre-
paradas a partir das partculas superfcialmente
porosas, sub-3 m e sub-2 m, com diferentes
grupos qumicos como: C18, C8, fenil, for, gru-
pos polares embutidos, HILIC, entre outros.
Embora sejam, na maioria das vezes, vistas
como uma alternativa ao emprego da UHPLC e,
consequentemente, das partculas de FE poro-
sas 2 m, quando se trata de cromatografa
por apresentarem uma seletividade nica pro-
veniente das propriedades especfcas das liga-
es C-F que promovem um aumento no carter
dipolar da FE, o que intensifca a interao com
compostos polares, e, dessa forma, as separaes
no ocorrem por um mecanismo de interao
simples de FR. Entre as FE fuoradas, podem ser
destacados dois tipos, aquelas que possuem os
tomos de for ligados cadeia alquila e aquelas
que possuem os tomos de for ligados a grupos
fenil. Estas ltimas, alm de possurem a seletivi-
dade infuenciada pelas propriedades especfcas
das ligaes C-F, so tambm infuenciadas pelas
interaes -, provenientes dos grupos fenil. Em
vista disso, colunas recheadas com FE fuoradas
com dimenses apropriadas para UHPLC vm
sendo comercializadas por diversos fabricantes
e exploradas em diferentes campos de aplicao.
2.1.2 Colunas recheadas com
partculas superficialmente
porosas sub-3 m e sub-2 m
Conforme descrito nas sees anteriores,
tanto a introduo da UHPLC quanto a expanso
da tcnica se deu com o advento das partculas
de FE porosas 2 m. Entretanto, atualmente,
praticamente todos os novos desenvolvimentos
e/ou artifcios em torno de novas FE ou de novas
estratgias de trabalho podem tambm ser trans-
feridas/aplicadas s separaes realizadas por
UHPLC.
Um exemplo deste fato so as partcu-
las de slica superfcialmente porosas (SPP)
(SPP superfcially porous particles), que so
compostas por um ncleo slido revestido por
uma fna camada de slica porosa, que foram
desenvolvidas como uma alternativa s partcu-
las de FE porosas 2 m, por fornecerem an-
lises rpidas e com efcincias similares, porm
sem um aumento signifcativo da presso croma-
togrfca, sendo, desta forma, compatveis com
UHPLC abordagem atual Maldaner L, Jardim ICSF
Scientia Chromatographica 2012; 4(3):197-207 201
A maioria das FE baseadas em slica possui
estabilidade trmica at 60 C, independente-
mente se for indicada para uso em HPLC ou em
UHPLC. Entre as FE que vm sendo desenvolvi-
das para serem empregadas em altas temperatu-
ras ( 150 C), como as polimricas, as baseadas
em zircnia ou em carbono graftizado, apenas
se encontram disponveis comercialmente, com
dimenses de UHPLC e recheadas com partcu-
las 2 m, colunas baseadas em zircnia, comer-
cializadas pela ZirCrom
[19]
, a Zicrom-PBD e a
Zircrom-PHASE, sendo a primeira modifcada
com polibutadieno e a segunda composta por
zircnia pura. As colunas baseadas em carbono
graftizado so comercializadas pela Termo
Scientifc
[20]
com o nome de Hypercarb e pos-
suem dimenses de UHPLC, porm so rechea-
das com partculas de 3 m.
2.3 Instrumentao
Em termos de instrumentao, a UHPLC
pode ser considerada uma tcnica bem estabele-
cida, uma vez que comercializada por pratica-
mente todos os grandes fabricantes de equipamen-
tos de cromatografa lquida (Waters-ACQUITY
UPLC, Agilent - 1290 Infnity LC System,
Termo Scientifc Dionex - UltiMate
3000 RSLC, Shimadzu - Nexera UHPLC,
Termo Scientifc - Accela High Speed
LC, JASCO - X-LC, Perkin-Elmer - Flexar
UHPLC, Knauer - PLATINblue UHPLC e
Hitachi - LaChromUltra), permitindo, dessa
forma, a expanso e o emprego da UHPLC nas
anlises de rotina de um laboratrio.
As modifcaes requeridas para que um
equipamento de UHPLC possa ser empregado
com alto desempenho cromatogrfco vo alm
da capacidade de trabalhar a elevadas pres-
ses
[1,4,5,13]
. necessrio tambm possuir um
sistema de bombeamento robusto, um sistema
de injeo rpido, exato e preciso na faixa de
rpida, estas partculas superfcialmente porosas,
sub-3 m ou sub-2 m, podem ser empregadas
em conjunto com a UHPLC para que anlises
mais seletivas e/ou com melhor ou diferente
desempenho cromatogrfco sejam alcanadas.
Estudos comparativos a respeito das vantagens
do emprego das partculas superfcialmente
porosas associadas ao UHPLC em relao s par-
tculas porosas 2 m ainda no foram conclu-
dos, mas indicam que, em termos de efcincia,
as partculas superfcialmente porosas parecem
ser mais vantajosas.
2.2 Condies de operao das
colunas: emprego de temperatura
Uma alternativa para melhorar o desem-
penho cromatogrfco bem como tornar as
anlises por cromatografa lquida mais rpi-
das atravs do emprego de altas temperaturas
(60 < T < 200 C)
[2,4,5,12,18]
. O emprego de tempe-
ratura mais elevada reduz a viscosidade da FM
e, desta forma, a resistncia transferncia de
massa tambm diminui, permitindo o uso de
maiores vazes de FM sem aumento na pres-
so cromatogrfca, e, consequentemente, an-
lises mais rpidas so alcanadas. Alm disso, o
emprego da temperatura pode melhorar a efci-
ncia e a resoluo cromatogrfca.
O emprego da temperatura pode ser utili-
zado nas separaes por UHPLC, assim como
nas anlises por HPLC, possuindo as mesmas
vantagens e limitaes. Entretanto, a expan-
so do emprego da temperatura nas separaes
cromatogrfcas fora do meio acadmico ainda
lenta, devido ao nmero limitado de FE que
so estveis em temperaturas acima de 60 C,
a necessidade de modifcao do equipamento
para controlar adequadamente a temperatura da
FM e a possibilidade de degradao dos compos-
tos a serem analisados.
Maldaner L, Jardim ICSF UHPLC abordagem atual
202 Scientia Chromatographica 2012; 4(3):197-207
3 Desafios atuais para o emprego
da UHPLC x HPLC
Alm da necessidade de instrumentos espe-
cfcos (UHPLC) para o emprego efciente das
partculas 2 m e do custo dos equipamentos e
dos consumveis serem superiores aos de HPLC,
os principais desafos esto relacionados com o
uso contnuo do equipamento e esto descritos
a seguir.
3.1 Efeitos decorrentes da reduo das
tubulaes e da porosidade dos
filtros da coluna
Comparando-se um sistema de UHPLC
com um sistema de HPLC percebe-se uma redu-
o signifcativa nos dimetros internos (d.i.)
das tubulaes, que possuem tipicamente d.i.
de 0,175-0,125 mm em um sistema de HPLC
para d.i. de 0,125-0,0625 mm em um sistema de
UHPLC e, tambm uma reduo signifcativa na
porosidade dos fltros que retm as partculas da
FE dentro das colunas, que tipicamente de 2,0
ou 0,5 m para partculas de 5 ou 3 m, respecti-
vamente, para fltros com porosidade de 0,2 m
para partculas 2 m. A reduo dos d.i. das
tubulaes necessria para diminuir o volume
extracoluna e, consequentemente, evitar o alar-
gamento do pico cromatogrfco, enquanto que a
diminuio da porosidade dos fltros necessria
para reter as partculas de FE 2 m no interior
da coluna, mantendo um leito cromatogrfco
estvel. Porm, estas alteraes fazem com que
as tubulaes e os fltros da coluna de um sis-
tema de UHPLC sejam muito mais suscetveis ao
entupimento que aquelas empregadas em HPLC.
Em vista disso, para evitar a entrada de
qualquer tipo de material particulado, o uso
rotineiro do UHPLC requer cuidados com a
limpeza cromatogrfca bem mais rigorosos que
aqueles empregados em um sistema de HPLC, e
pequenos volumes, volumes internos reduzidos
(conexes, ala de amostragem, cela do detector
e bombas), detectores com alta taxa de aquisio
de dados e colunas e FE apropriadas.
Atualmente, os novos desenvolvimentos e/
ou as melhorias relacionadas aos equipamen-
tos de UHPLC esto direcionados, principal-
mente, busca pela diminuio da disperso da
banda cromatogrfca, como forma de alcanar a
mxima efcincia das colunas com dimenses de
UHPLC, sendo necessria, desta forma, a redu-
o do volume extracoluna e tambm desenvol-
ver sistemas de injeo mais rpidos. Alm disso,
vem sendo expandida a faixa de temperatura do
forno de coluna e tambm a presso mxima na
qual o equipamento capaz de operar.
Outro fator importante que impulsionou a
expanso da UHPLC foi o desenvolvimento de
detectores capazes de adquirir e processar os
dados sufcientemente rpido para serem com-
patveis com os picos estreitos resultantes destas
anlises cromatogrfcas
[1,4,5,8,21]
. Desde a introdu-
o da tcnica, detectores pticos, UV-VIS e por
arranjo de diodos, com as modifcaes necess-
rias, volume da cela do detector reduzido e longo
caminho ptico, foram disponibilizados e comer-
cializados para serem empregados nas determi-
naes por UHPLC. Atualmente, o acoplamento
da UHPLC com a espectrometria de massas tam-
bm j est consolidado, com espectrmetros de
massas com capacidade de trabalhar com baixos
tempos de residncia (dwell time), baixos tempos
de troca de canal (inter-channel delay) e baixos
tempos de troca de varredura (inter-scan delay),
de tal forma que forneam uma quantidade de
pontos sufcientes para a construo do pico cro-
matogrfco, permitindo que as mais diversas
reas de aplicao tenham acesso ao emprego da
UHPLC.
UHPLC abordagem atual Maldaner L, Jardim ICSF
Scientia Chromatographica 2012; 4(3):197-207 203
de presses elevadas pode gerar alguns inconve-
nientes durante o desenvolvimento e a aplicao
do mtodo cromatogrfco, e discutido a seguir.
3.2.1 Efeitos de alterao da presso
na coluna
Giddings
[24]
, h mais de 40 anos, apontou
que a presso poderia provocar mudanas no
volume molar das molculas. Em uma anlise
cromatogrfca, isto pode implicar em mudanas
na seletividade (alterao na ordem de eluio
dos compostos) ou na reteno cromatogrfca
(provocando o deslocamento ou a sobreposio
de picos cromatogrfcos)
[22,25,26]
.
Este fato, porm, somente comeou a des-
pertar interesse e ateno com o desenvolvi-
mento e a comercializao de equipamentos de
UHPLC que oferecem a possibilidade de operar
em presses elevadas, nos quais as mudanas de
volume molar das molculas esto mais propen-
sas a ocorrerem, sendo praticamente irrelevante
quando se trabalha com HPLC.
Desta forma, a seletividade derivada da
presso deve ser levada em considerao quando
houver a necessidade de alterar mtodos exis-
tentes, principalmente quando envolver uma
modifcao brusca na presso e/ou, quando
um mtodo desenvolvido em um UHPLC para
ser, posteriormente, transferido para um sis-
tema de HPLC. Esta prtica tem sido comum em
indstrias qumicas e farmacuticas, que, para a
reduo de custos e tempo, desenvolvem novos
mtodos em sistemas de UHPLC, porm, muitos
deles, para serem posteriormente transferidos
para sistemas de HPLC e empregados rotineira-
mente. Entretanto, a transferncia de um mtodo
desenvolvido por UHPLC para HPLC no to
simples, principalmente quando os mtodos
desenvolvidos envolvem a anlise simultnea de
vrios compostos com picos estreitos e/ou com
baixa detectabilidade, em um curto tempo de
envolvem
[22,23]
: (i) a amostra a ser injetada, deve
ser fltrada com fltros de porosidade de 0,2 m,
mesmo se ela j tiver sido centrifugada, um pro-
cedimento comumente empregado, de forma
satisfatria, para as amostras a serem injetadas
em um sistema de HPLC. Alm disso, reco-
mendado que seja empregado um fltro de linha
com porosidade de 0,2 m, como precauo;
(ii) a fase mvel, deve ser fltrada com fltros de
porosidade de 0,2 m (que so capazes de remo-
ver as bactrias presentes na soluo) e, alm
disso, as FM aquosas, incluindo as tamponadas,
devem ser substitudas diariamente, uma vez que
pode ocorrer um crescimento microbiano que
capaz de bloquear as conexes, e o reservatrio
da FM deve ser substitudo por um limpo cada
vez que a FM for reabastecida, para evitar que
a contaminao microbiana presente no frasco
se transfra para a nova FM. Cuidados tambm
devem ser tomados com o possvel desgaste dos
selos do pisto e dos rotores da vlvula de inje-
o, que podem introduzir material particu-
lado no sistema em decorrncia do aumento da
frico, principalmente quando so empregadas
presses elevadas, danifcando-os e reduzindo-
-lhes o tempo de vida til.
Em vista disso, cabe ressaltar que os cui-
dados necessrios com a higiene cromatogr-
fca em um sistema de UHPLC devem ser bem
mais rigorosos que aqueles empregados em um
sistema de HPLC, porm, se realizados correta-
mente, o emprego rotineiro do UHPLC total-
mente adequado e possvel.
3.2 Efeitos decorrentes do uso de
presses elevadas
A presso resultante do emprego de colu-
nas recheadas com partculas 2 m e das altas
velocidades lineares de FM, primeira vista,
apenas uma consequncia para que anlises mais
rpidas sejam alcanadas. Entretanto, o emprego
Maldaner L, Jardim ICSF UHPLC abordagem atual
204 Scientia Chromatographica 2012; 4(3):197-207
3.2.2 Efeito do aquecimento por atrito
Quando um lquido (FM) passa atravs de
um leito cromatogrfco formado de pequenas
partculas de FE, o atrito entre as duas fases
provoca um aquecimento
[22,27-30]
. Este aque-
cimento pouco signifcativo em se tratando
de HPLC, na qual so empregadas colunas de
15-20 cm de comprimento, recheadas com par-
tculas de FE de 3 ou 5 m e operadas a presses
de 100-200 bar (1400-3000 psi). Entretanto,
quando so empregadas colunas de 5-10 cm de
comprimento recheadas com partculas de FE
2 m e operadas a presses de 400-1000 bar
(6000-15000 psi), pode ser gerada uma quan-
tidade de aquecimento que passa a ser signifca-
tiva. Este calor dissipado ao longo e atravs da
coluna cromatogrfca, resultando em gradientes
de temperatura longitudinal e radial que podem
infuenciar na reteno e na efcincia cromato-
grfca e so dependentes do controle da tempe-
ratura da parede externa da coluna.
Quando a temperatura da parede externa
da coluna controlada (mantida constante),
um perfl de gradiente de temperatura radial se
desenvolve no interior da coluna, de tal forma
que o centro da coluna torna-se mais aquecido
que as laterais (Figura2a). Esta heterogeneidade
de temperatura pode provocar perda de efcin-
cia na separao, devido ao alargamento do pico
cromatogrfco, uma vez que o centro da coluna
estando mais aquecido faz com que as molcu-
las que esto no centro da banda cromatogrfca
se movimentem mais rapidamente que aquelas
prximas da parede da coluna, resultando em
um pico cromatogrfco com cauda. Quando a
temperatura da parede externa da coluna no
rigorosamente controlada (no mantida cons-
tante), ocorre o desenvolvimento de um gra-
diente de temperatura longitudinal no interior da
coluna, de tal forma que a temperatura na sada
da coluna superior a de entrada (Figura 2b).
O gradiente de temperatura longitudinal pode
anlise, uma vez que os problemas de coeluio
ou mudana de reteno dos compostos podem
ocorrer.
Na Figura1, pode ser visualizado um exem-
plo de como a alterao da presso na coluna
pode afetar o volume molar dos compostos e,
desta forma, alterar a seletividade e a reteno
cromatogrfca. Nos cromatogramas apresenta-
dos, pode-se verifcar que houve a inverso da
ordem de eluio dos compostos 3 e 4 e 5 e 6, e
um aumento signifcativo na reteno do com-
posto 5, com o aumento da presso cromatogr-
fca de 43 para 739 bar (620 para 11000 psi),
obtido pela introduo de um capilar restritivo
na sada da coluna, sendo que as demais con-
dies cromatogrfcas foram semelhantes nos
dois experimentos.
a
b
Figura 1 Cromatogramas ilustrando o efeito da
presso na seletividade e na reteno cromatogrca:
(a) 43 bar e (b) 739 bar (obtida com o auxlio de
um capilar restritivo de 25 cm), empregando um
equipamento de UHPLC e uma coluna XBridge C18
BEH (50 mm 2,1 mm, 5 m) e como FM: acetonitrila:
0,025 mol/L fosfato de potssio pH 2,7 (30:70, v/v).
Identicao dos picos: 1 tioureia, 2 propranolol,
3 difenidramina, 4 acetofenona, 5 protripilina e
6 nitrobenzeno. Adaptada de Fallas et al.
[25]
.
UHPLC abordagem atual Maldaner L, Jardim ICSF
Scientia Chromatographica 2012; 4(3):197-207 205
cionrias como de instrumentao. uma tc-
nica que apresenta como vantagens a diminuio
considervel no tempo de anlise, a facilidade de
transferncia de um mtodo desenvolvido por
HPLC para UHPLC, uma grande variedade de
colunas, de equipamentos e de detectores dispo-
nveis comercialmente, indicando que, possivel-
mente, num futuro prximo, ela venha a superar
a HPLC em anlises de rotina, por tambm gerar
menores quantidades de resduos, atendendo aos
apelos da Qumica Verde.
Como qualquer outra tcnica, tambm pos-
sui as suas difculdades ou limitaes, principal-
mente no que diz respeito ao uso rotineiro, como
a exigncia de maiores cuidados com a limpeza
cromatogrfca e os problemas decorrentes do
emprego de presses elevadas, que podem ser
superados a partir do entendimento e conhe-
cimento dos usurios da tcnica acerca deles.
Entretanto, estas difculdades no tm limitado
o emprego e a expanso da UHPLC.
Agradecimentos
FAPESP e ao CNPq pelo apoio fnanceiro.
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provocar alteraes nos tempos de reteno dos
compostos, devido s alteraes da temperatura
mdia ao longo da coluna.
Em vista disso, cabe ressaltar que necess-
rio considerar a possibilidade de estar ocorrendo
o aquecimento por atrito quando so desenvol-
vidos novos mtodos de separao envolvendo
presses elevadas no UHPLC, e tambm quando
um mtodo transferido do HPLC para UHPLC.
Alguns artifcios que podem ser empregados para
reduzir esses efeitos quando um mtodo desen-
volvido por HPLC for transferido para UHPLC
so: reduzir o dimetro interno da coluna, aco-
plar vrias colunas em srie, empregar uma tem-
peratura de trabalho em UHPLC menor que a
empregada em HPLC e, se necessrio, ajustar o
mtodo para que ele seja adequado para a anlise
por UHPLC.
4 Consideraes finais
Diante do contexto apresentado neste
artigo, pode-se concluir que a UHPLC j est
bem estabelecida, tanto em termos de fases esta-
a
b
Figura 2 Ilustrao dos gradientes de temperatura
que se desenvolvem no interior da coluna resultantes
do aquecimento por atrito. Adaptada de Gritti e
Guiochon
[28]
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