UNIVERSIDADE CASTELO BRANCO

CENTRO DE CINCIAS AGRRIAS

CURSO DE MEDICINA VETERINRIA












TRANSFERNCIA DE EMBRIO E FERTILIZAO IN
VITRO (FIV) EM BOVINOS







Igor Nascimento Martinez
Leandro Csar de Souza












Rio de Janeiro. set. 2007
IGOR NASCIMENTO MARTINEZ
Aluno do curso de Especializao em Medicina Veterinria da UCB
Matrcula
LEANDRO CSAR DE SOUZA
Aluno do curso de Especializao em Medicina Veterinria da UCB
Matrcula








TRANSFERNCIA DE EMBRIO E FERTILIZAO IN
VITRO (FIV) EM BOVINOS




Trabalho monogrfico de concluso do curso
de Medicina Veterinria (TCC), apresentado
UCB como requisito parcial para a
obteno do ttulo Especializao em
Produo e Reproduo Bovina, sob a
orientao do Professor: Marconi Gauttieri
Abba








Rio de Janeiro. set. 2007
TRANSFERNCIA DE EMBRIO E FERTILIZAO IN
VITRO (FIV) EM BOVINOS




Elaborado por Igor Nascimento Martinez e Leandro Csar de Souza

Alunos do Curso de Especializao em Medicina Veterinria da UCB





Foi analisado e aprovado com

grau: .......................................


Rio de Janeiro_____de_________________ de___________


_________________________________________________
Membro


_________________________________________________
Membro


_________________________________________________
Professor Orientador
Presidente



Rio de Janeiro. set. 2007

RESUMO

O objetivo desse estudo o de contribuir para um melhor entendimento,
aperfeioamento e expanso da transferncia de embrio e fertilizao in vitro
(FIV). A metodologia utilizada para esse estudo denominada anlise terica, onde
foram feitas revises bibliogrficas sobre o tema, abrangendo a coleta de
informaes em livros, sites, revistas e artigos. O estudo do tema desenvolveu-se em
trs partes: Na primeira parte ser descrito sobre a transferncia de embries
compreendendo desde sua aplicao at seu rastreamento e avaliao. Na segunda
parte ser descrito sobre a fertilizao in vitro observando desde suas vantagens
at a classificao de embries. Na terceira parte ser descrito sobre a aspirao
folicular guiada por ultra-sonografia (OPU-FIV), compreendendo desde a fisiologia
ovariana at a sincronizao da onda para superovulao. Conclui-se atravs desse
estudo que so bem maiores as vantagens do que as desvantagens da transferncia
de embrio e fertilizao in vitro em bovinos. Espera-se que este trabalho possa
contribuir para um melhor entendimento, aperfeioamento e expanso da
transferncia de embrio e fertilizao in vitro (FIV), pois foram descorridos vrios
procedimentos utilizados para transferncia embrio e fertilizao in vitro em
bovinos (FIV).

Palavras-chave: transferncia embrio; fertilizao in vitro; bovinos.












ABSTRACT

The objective of this study is to contribute for one better agreement, perfectioning and
expansion of the embryo transference and fertilizao in vitro (FIV). The
methodology used for this study is called theoretical analysis, where bibliographical
revisions on the subject had been made, enclosing the collection of information in
books, sites, magazines and articles. The study of the subject it was developed in
three parts: In the first part he will be described on the transference of embryos
understanding since its application until its tracking and evaluation. In the second part
in will be described on the fertilizao in vitro observing since its advantages until
the classification of embryos. In the third part he will be described on the aspiration to
folicular guided for extreme-sonografia (OPU-FIV), understanding since the ovariana
physiology until the synchronization of the wave for superovulao. It is concluded
through this study that is well bigger the advantages of what the disadvantages of the
embryo transference and fertilizao in vitro in bovines. One expects that this work
can contribute for one better agreement, perfectioning and expansion of the embryo
transference and fertilizao in vitro (FIV), therefore had been descorridos some
procedures used for transference embryo and fertilizao in vitro in bovines (FIV).

Word-key: transference embryo; fertilizao in vitro; bovines.













SUMRIO

RESUMO................................................................................................................ iii

LISTA DE TABELAS............................................................................................. ix

LISTA DE FIGURAS............................................................................................... x

1. INTRODUO...................................................................................................11

2. TRANSFERNCIA DE EMBRIES..................................................................13
2.1 Aplicaes e Limitaes.............................................................................13
2.2 Seleo da doadora....................................................................................14
2.3 Superovulao............................................................................................14
2.4 Esquema de tratamento para a superovulao..........................................15
2.4.1 ECG (ou PMSG)...................................................................................16
2.4.2 FSH.......................................................................................................16
2.5 Fatores que interferem nos resultados da superovulao..........................17
2.5.1 Dose do hormnio.................................................................................17
2.5.2 Idade da doadora..................................................................................17
2.5.3 Pureza do hormnio..............................................................................17
2.5.4 Condies estressantes........................................................................18
2.5.5 Dia do inicio do tratamento...................................................................18
2.6 Superovulao associada a implantes de progesterona............................18
2.7 Sincronizao do estro...............................................................................19
2.7.1 Mtodos de sincronizao....................................................................19
2.7.1.1 Luteolticos......................................................................................19
2.7.1.2 Progestgenos................................................................................20
2.8 Seleo das receptoras..............................................................................20
2.9 Coleta dos embries...................................................................................22
2.9.1 Rastreamento e avaliao..................................................................24
2.9.2 Classificao quanto ao estgio de desenvolvimento........................25

3. FERTILIZAO "IN VITRO".............................................................................29
3.1 Vantagens...................................................................................................29
3.2 Coleta de Ovcitos.....................................................................................30
3.3 Recuperao Ovocitria.............................................................................31
3.3.1 Utilizando doadoras superovuladas...................................................31
3.4 Utilizando doadoras no superovuladas.....................................................31
3.5 Coleta in vitro..............................................................................................32
3.5.1 Mtodo in vitro....................................................................................32
3.6 Maturao do Ovcito.................................................................................32
3.7 Preparao Espermtica.............................................................................34
3.8 Fecundao in vitro....................................................................................35
3.8.1 Cultivo de embries in vitro................................................................36
3.8.2 Classificaes dos embries..............................................................37

4. ASPIRACO FOLICULAR GUIADA POR ULTRASONOGRAFIA (OPU-
FIV)........................................................................................................................41
4.1. Fisiologia ovariana.....................................................................................41
4.2. Aplicaes da tcnica................................................................................42
4.2.1 Produo de maior nmero de embries..............................................42
4.2.2. Menor intervalo entre geraes...........................................................43
4.2.3. Melhor aproveitamento dos animais....................................................44
4.3 Avaliao morfolgica dos ovcitos............................................................44
4.4. Pesquisas na rea da embriologia............................................................45
4.5 Produo in vitro de embries (PIV)...........................................................46
4.6. Produtos obtidos de vacas que no respondem superovulao............48
4.7 Produtos obtidos de animais com problemas reprodutivos........................48
4.8 Utilizao de animais mortos......................................................................49
4.9 Pr-Seleo de Touros...............................................................................49
4.10 Recuperao............................................................................................50
4.10.1 Ovrio de matadouro com ou sem identificao.................................50
4.10.2 Colheita de ovrios e ovidutos............................................................50
4.10.3 Colheita e seleo de ocitos.............................................................51
4.11 Vacas "acidentadas".................................................................................52
4.12 Fatores de variao em programas de OPU............................................52
4.13 Tcnica de aspirao folicular guiada por ultra-som................................55
4.13.1 Procedimentos.......................................................................................55
4.14 Superovulao..........................................................................................57
4.14.1 Vantagens...........................................................................................57
4.14.2 Desvantagens.....................................................................................58
4.15 Variaes na recuperao........................................................................59
4.15.1 Diferena entre animais......................................................................59
4.15.2 Variaes entre operadores................................................................59
4.15.3 Variaes do comportamento do animal.............................................60
4.15.4 Tipo de Animal....................................................................................60
4.15.5 Variaes com o tipo de equipamento utilizado..................................60
4.15.6 Freqncia da aspirao.....................................................................61
4.16 Amniocentese...........................................................................................62
4.16.1 Sincronizao da onda para Superovulao......................................62

CONSIDERAES FINAIS...................................................................................65

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS.....................................................................67








LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Classificao dos embries bovinos quanto ao estgio de
desenvolvimento e idade aproximada....................................................................26
Tabela 2 - Classificao dos embries bovinos quanto a sua qualidade..............27
Tabela 3 Preparao de meios...........................................................................63
Tabela 4 Meio de Transporte..............................................................................63
Tabela 5 - *TCC 199 HEPES.................................................................................64












LISTA DE FIGURAS

Figura 1-Transferncia de embries......................................................................23
Figura 2 - Esquema de montagem dos embries em palhetas.............................28
Figura 3 - Ovcito bovino imaturo, logo aps a puno.........................................33
Figura 4 - Embries bovinos produzidos in vitro, 48h aps a FIV..........................33
Figura 5 Mrula compactada..............................................................................37
Figura 6 Blastocisto inicial...................................................................................38
Figura 7 Blastocisto.............................................................................................38
Figura 8 Blastocisto expandido...........................................................................39
Figura 9- Blastocisto eclodido................................................................................39






1. INTRODUO

A tcnica de transferncia de embries (T.E.) se
desenvolve rapidamente na pecuria bovina brasileira. Com ela, o melhoramento
gentico pode ser efetuado com mais rapidez e eficincia, mesmo em pequenas
populaes de animais, com a disseminao do material gentico de uma fmea
zootecnicamente superior.
Com a finalidade de aproveitamento da capacidade
reprodutiva de animais geneticamente superiores e tendo conhecimento da fisiologia
ovariana, deu-se o desenvolvimento de protocolos hormonais possibilitando assim a
ovulao mltipla seguida da transferncia de embries.
Embora com grandes avanos nos ltimos anos, o
procedimento ainda pouco difundido, quer pelo custo relativamente elevado, quer
pela variao nos resultados (FERNANDES, 2001).
O objetivo do presente trabalho tem como finalidade
contribuir para um melhor entendimento, aperfeioamento e expanso da
transferncia de embrio e fertilizao in vitro (FIV) em bovinos.
A metodologia utilizada para esse estudo denominada
anlise terica, segundo Tachizawa (1989), esse mtodo consiste em:
Uma simples, organizao coerente de idias
originarias de bibliografia de alto nvel, em torno
de um tema especfico;
Uma anlise crtica ou comparativa de uma obra,
teoria ou modelo j existente, a partir de um
esquema conceitual bem definido;
O desenvolvimento de uma monografia
realmente inovadora, a partir de fontes
exclusivamente bibliogrficas.
Utiliza-se uma reviso bibliogrfica sobre o tema,
abrangendo a coleta de informaes em livros, sites, revistas e artigos, englobando
assim maiores informaes sobre o tema proposto.
O estudo do tema desenvolveu-se em trs partes: Na
primeira parte ser descrito sobre a transferncia de embries compreendendo
desde sua aplicao at seu rastreamento e avaliao.
Na segunda parte ser descrito sobre a fertilizao in
vitro observando desde suas vantagens at a classificao de embries.
Na terceira parte ser descrito sobre a aspirao
folicular guiada por ultra-sonografia (OPU-FIV), compreendendo desde a fisiologia
ovariana at a sincronizao da onda para superovulao.
















2. TRANSFERNCIA DE EMBRIES

2.1 Aplicaes e Limitaes

Assim como qualquer outra tcnica aplicada pecuria,
a transferncia de embries apresenta vantagens ou aplicaes e tambm algumas
restries e limitaes sua utilizao.
As principais so:
Multiplicao rpida de um gentipo superior;
Facilita transporte e estocagem de material gentico;
Permite controle de doenas;
Controle do sexo do produto;
Produo de descendentes de um animal jovem.
As principais limitaes so:
Custo operacional;
Condies mnimas.
Existem algumas condies do animal e principalmente
da propriedade, que devem ser levadas em considerao antes de se iniciar um
programa de T.E.. As principais so descritas a seguir.
Doadoras geneticamente superiores;
Aspecto sanitrio do rebanho;
Nutrio e reproduo;
Mo-de-obra (FERNANDES, 2001).

2.2 Seleo da doadora

Antes de iniciar um programa de T.E., a avaliao da
doadora pode eliminar o risco de aborrecimentos futuros. As caractersticas
principais a serem consideradas so as seguintes:
Geneticamente superior;
No apresentar anomalias congnitas e/ou hereditrias;
Histrico de boa fertilidade;
Trato genital compatvel com a tcnica e sem alteraes;
Boa condio corporal;
Livre de doenas infecto-contagiosas;
Banho em tripsina limpa os embries de patgenos;
Fora de qualquer condio de estresse;
CicIando regularmente (FERNANDES, 2001).

2.3 Superovulao

Tem como objetivo estimular, atravs de administrao
de hormnios, o desenvolvimento de um grande nmero de folculos at o estgio no
qual possa ovular. Estes folculos a mais que se tornam "ovulatrios", pertencem a
uma onda de desenvolvimento, e normalmente sofreriam atresia. Com a induo
hormonal, fornecemos a estes folculos tambm a condio de ovular. Desta forma, a
afirmao que ocorre um desgaste reprodutivo da doadora, no verdade.
Geralmente no se utiliza hormnio visando a ovulao direta dos folculos. A onda
pr-ovulatria de LH, que provocaria a ovulao de um folculo nico no caso de um
ciclo normal, geralmente suficiente para luzir a ovulao de todos que possuam
condio para tal, aps um processo induo hormonal. A utilizao de anlogos do
GnRH para melhorar a taxa ovulao apresenta resultados discordantes na literatura,
porm pode ser alternativa para melhorar os resultados de determinados animais.
a etapa menos possvel dentro da tcnica de T. E. (FERNANDES, 2001).
A variao dos resultados da superovulao o
principal fator limitante grande contribuio que a tcnica de transferncia de
embries (T .E.) pode fornecer ao melhoramento gentico necessrio um controle
rgido das variveis possveis, para que o processo de superovulao possa ser uma
etapa mais previsvel dentro do contexto da T.E.. O objetivo principal da
superovulao produzir um grande numero de ovulaes e obter um nmero
correspondente de embries viveis, que resultem em uma elevada taxa de gestao
nas receptoras (FERNANDES, 2001).

2.4 Esquema de tratamento para a superovulao

Independente do tipo de hormnio a ser utilizado,
quando se visa a estimulao de um grande numero de folculos, devem-se ter em
mente quando iniciar o tratamento, pois aqueles folculos que j entraram em atresia
no podem ser mais estimulados a desenvolverem. Assim, os protocolos de
superovulao devem iniciar numa fase da onda de desenvolvimento folicular onde o
folculo dominante ainda no tenha provocado o incio da atresia dos subordinados.
As principais bases utilizadas so as seguintes:

2.4.1 ECG (ou PMSG)

Trata-se de um hormnio denominado Gonadotrofina
Corinica Eqina. obtido do soro de guas entre a 40. e 100. dia de gestao.
Possui ao semelhante ao FSH e LH na mesma molcula.

2.4.2 FSH

a preparao hormonal mais utilizada para a
superovulao de bovinos. Em sua maioria, os produtos hoje disponveis no
mercado, tm origem suna ou ovina, sendo extrado da hipfise destas espcies.
Utilizam-se geralmente 8 aplicaes, intervaladas de 12 horas. Alguns autores
utilizam doses iguais, porm preferem dose total (100%) e divide a mesma em 8
doses menores, em regime decrescente. Este esquema pode ser usado para
qualquer produto a base de FSH. A prostaglandina aplicada simultaneamente a 7.
e/ou 8. dose de FSH, e visa a regresso do corpo lteo formado no dia 0 (cio base),
levando a reduo na taxa de progesterona, removendo o bloqueio na secreo de
GnRH, dando incio a um novo ciclo. Quando ocorrer a onda de LH, esta
teoricamente encontrar uma srie de folculos em condies de ovular, devido
induo hormonal (FERNANDES, 2001).
A aplicao de prostaglandina no terceiro dia de
superovulao, como executada por alguns profissionais, s vezes faz com que o
animal manifeste cio antes da ltima dose de FSH, que neste caso, no teria mais
efeito.

2.5 Fatores que interferem nos resultados da superovulao

2.5.1 Dose do hormnio

Infelizmente um fator que possui muita variao individual, e mesmo num
animal, entre as coletas.

2.5.2 Idade da doadora

Existe uma variao na resposta dos animais de acordo
com a idade que deve ser levada em considerao.

2.5.3 Pureza do hormnio

Para produtos a base de FSH, a pureza diz respeito
relao FSH: LH da preparao.

2.5.4 Condies estressantes

Alm de qualquer condio patolgica, como as
descritas acima, um dos principais fatores estressantes, que existe em praticamente
em todas as regies do pas, e o estresse trmico.

2.5.5 Dia do inicio do tratamento

O tratamento superovulatrio deve comear prximo ao
incio de uma onda de desenvolvimento folicular, porm os animais geralmente
possuem duas ondas por ciclo, podendo inclusive, ter 3 ou at mesmo 4, sendo isto
menos freqente (FERNANDES, 2001).

2.6 Superovulao associada a implantes de progesterona

Trata-se de uma tcnica desenvolvida recentemente,
onde possvel iniciar o tratamento superovulatrio das doadoras,
independentemente do dia do ciclo estral no qual as mesmas se encontram. um
procedimento muito interessante por facilitar a programao de coletas, em
diferentes propriedades e tambm de auxiliar no agrupamento de doadoras a serem
coletadas no mesmo perodo. Para tal procedimento necessria a sincronizao
previa da onda de crescimento folicular (GnRH ou Benzoato de Estradiol), alm do
uso de um implante de progesterona (Crestar ou CIDR), que vai funcionar como um
corpo lteo artificial, durante o processo de superovulao (FERNANDES, 2001).
2.7 Sincronizao do estro

A sincronizao do estro tem sido amplamente
utilizada, tanto em casos de monta natural ou inseminao artificial, como na tcnica
de transferncia de embries, para qual imprescindvel.
O principal aspecto fisiolgico da sincronizao de estro
entre doadoras e receptoras, que devemos retirar o embrio de um ambiente (tero
da doadora) e coloc-Io em outro ambiente (tero da receptora), com condies o
mais semelhantes possvel, daquelas de origem. A transferncia de embries para
receptoras no sincronizadas reduz drasticamente a taxa de gestao.

2.7.1 Mtodos de sincronizao

Antecipando ou atrasando a prxima manifestao de
estro. Qualquer uma destas formas necessita que os animais que vo ser
sincronizados estejam cicIando regularmente.
A relao dos mtodos e drogas mais empregadas
encontram-se nos subitens abaixo relacionados:

2.7.1.1 Luteolticos

Age provocando uma antecipao do prximo estro
(cio), pela regresso do corpo lteo antes de um perodo normal (lise do CL =
Luteolticos). Em mdia, o estro ocorre de 36 a 72 horas aps a aplicao. Quando
sincronizamos o estro atravs de PGF2a, de uma doadora (durante superovulao)
com um grupo de receptoras, estas ltimas devem receber o luteoltico de 12 a 14
horas antes da doadora, pois a doadora geralmente manifesta estro mais cedo.

2.7.1.2 Progestgenos

base de progesterona, atuam prolongando o ciclo
estral e atrasando o prximo estro. Agem basicamente bloqueando o GnRH,
funcionando como um CL artificial. Este tratamento deve ser utilizado por no mnimo
9 dias, quando ento interrompido abruptamente, removendo desta forma o
bloqueio que a progesterona exgena exercia sobre a secreo de GnRH, dando
condies para o inicio de um novo cicIo, pela manifestao de estro (FERNANDES,
2001).

2.8 Seleo das receptoras

Num programa de T.E., geralmente tem um cuidado
extremado com as doadoras, e relegam-se as receptoras a um segundo plano.
Porm um dos principais pontos de estrangulamento na difuso desta tecnologia diz
respeito taxa de gestao das receptoras. Os principais critrios a serem
observados so os seguintes:

A. Sem anomalias no trato genital

Um exame ginecolgico deve ser realizado em todas as
candidatas a futuras receptoras.

B. Boa fertilidade, ciclos regulares

As receptoras devem ser as fmeas mais frteis do
plantel.
C. Boa condio corporal

Esta associada a uma nutrio adequada.

D. Sanitariamente perfeita

No admissvel que uma receptora, depois de
gestante venha a perder a gestao devido a alguma doena infecto-contagiosa, que
poderia ser facilmente diagnosticada durante o processo de seleo.

E. Boa estatura

A importncia deste fator vem da necessidade de um
parto sem complicaes. Caso haja mais receptoras que embries, selecionar as
mesmas por grau de sincronia: caracterstica do corpo lteo: escore corporal e
fertilidade anterior (FERNANDES, 2001).

2.9 Coleta dos embries

A coleta dos embries feita pelo mtodo no cirrgico
ou transcervical, em um perodo entre 6 a 8 dias aps o estro, onde a doadora foi
inseminada. A doadora deve estar bem contida. Inicialmente faz-se uma avaliao da
resposta superovulatria, atravs da contagem por palpao via retal, do numero de
corpos lteos em cada ovrio. Uma limpeza do reto tambm facilitar outros
procedimentos. Feito isso, procede-se anestesia epidural, com 6 a 7 ml de
xilocana a 2% sem vasoconstritor. Aps a cauda estar relaxada, deve ser amarrada
lateralmente ao animal. Prender a cauda para cima favorece a entrada de ar no reto
e dificulta a manipulao. Aps isto, uma higienizao do perneo com gua e sabo
necessria. Todo o sabo deve ser removido e a regio seca. A vulva deve ser
lavada somente com gua. O cateter (FOLEY) introduzido no tero com o auxilio
de um mandril de ao. Este cateter feito de borracha e possui duas vias. Uma que
d aceso direto ao tero e a
outra utilizada para inflar o balo
existente na extremidade.









Figura 1-Transferncia de embries (FERNANDES, 2001)

Este esquema de lavagem feito de 5 a 7 vezes em
cada corno. Uma vez completado, o balonete desinflado, retira-se o cateter e
posiciona-se o mesmo no outro corno, repetindo todos os procedimentos. Em uma
coleta (PBS), e cerca de 40 a 50 minutos. Terminada a coleta, o filtro levado ao
"laboratrio", e antes de ser solta a doadora deve receber uma ou duas doses de
PGF e se for necessrio uma infuso com antibiticos para evitar a proliferao
bacteriana. Caso no apresente estro em 7 dias, deve ser novamente examinada e
se necessrio receber uma nova dose de PGF.
Existem cateteres de vrios modelos. Os mais comuns
so de uso humano. O dimetro tambm varia (tamanhos de 16 a 24), e deve ser
adequado ao tipo de crvix. Quando mais grosso o cateter mais difcil de pass-Io
pela crvix, porm mais fcil a coleta.
Uma vez transposta a crvix, o cateter deve ser
posicionado, de forma que o balo seja inflado, com o lquido de coleta em um dos
cornos. O enchimento do balo feito lentamente, com o operador monitorado. Com
o cateter posicionado, o circuito conectado, e deixa-se o liquido de coleta entrar no
tero at o enchimento do como. Este procedimento, caso possvel, deve ser feito
com o operador pressionando o limite entre o tero e tubas. O tero cheio
levemente massageado, deixando-se ento sair o lquido de coleta (FERNANDES,
2001).
Uma pessoa devera ficar responsvel por este filtro
durante toda a coleta, pois onde os embries ficaro retidos, controlando o volume
de lquido no seu interior.
Este deve ter sempre uma quantidade de lquido, e ser
protegido de variaes de temperatura e insolao direta. O lquido que sai do filtro
coletado em um frasco estril, para a avaliao posterior, quando necessrio
(FERNANDES,2001).

2.9.1 Rastreamento e avaliao

Refere-se a localizao dos embries e classificao
dos mesmos. No laboratrio o contedo do filtro de coleta passado para uma placa
de Petri, com dimetro entre 10 e 15 cm, com fundo quadriculado, para facilitar a
busca ou localizao das estruturas, que feito com microscpio estereoscpio, em
aumento de 10 a 20 vezes.
Em outra placa menor (3 cm de dimetro), coloca-se
uma das solues de manuteno existentes, que podem ser compostas de PBS
(liquido de coleta) com 10% de Soro Fetal Bovino (SFB), PBS com 0,4% de Albumina
Bovina (BSA), ou ainda solues prontas como Meio Holding. Estas solues tm a
funo de proteger o embrio e evitar que o mesmo fique grudado nos recipientes ou
instrumentos de manipulao, uma vez localizado na placa de procura, o embrio;
retirado desta por aspirao, passado para a placa menor com uma das solues
acima descrita (FERNANDES, 2001).
Completada a busca quando todas as estruturas da
placa de procura foram retiradas, procede-se ento a classificao dos embries que
se encontram na placa menor com o mesmo aparelho ptico citado acima, porm em
um aumento de 40 a 80 vezes. Esta feita de acordo com dois parmetros: estgio
de desenvolvimento e qualidade (FERNANDES, 2001).

2.9.2 Classificao quanto ao estgio de desenvolvimento

Esta classificao leva em considerao o aspecto
morfolgico do embrio e as variaes que ocorrem no mesmo durante seu
desenvolvimento iniciaI. Quando a coleta feita entre 6 a 8 dias aps o estro da
doadora geralmente so encontradas estruturas assim calcificadas:
16 clulas (16 c);
Mrula (M);
Mrula compacta (Mc);
Blastcito inicial (Bi);
Blastcito (Bl);
Blastcito expandido (Bex);
Blastcito eclodido (Bec).
As anotaes referentes classificao dos embries
utilizam inicialmente a sigla do estgio de desenvolvimento e posteriormente a
qualidade. Por exemplo, um blastcito inicial de qualidade excelente seria: Bi 1, e
assim por diante. Este um critrio usado internacionalmente em T.E.
(FERNANDES, 2001).

Tabela 1 Classificao dos embries bovinos quanto ao estgio de
desenvolvimento e idade aproximada

Estgio de desenvolvimento Idade aproximada (dias)
Mrula 5 a 6
Mrula Compacta 6
Blastcito inicial 6 a 7
Blastcito 7 a 8
Blastcito expandido 8
Blastcito eclodido 9
Fonte: (FERNANDES, 2001)

Classificao quanto a qualidade

A qualidade dos embries avaliada, tambm pelo seu
aspecto morfolgico, estando relacionada com a viabilidade dos mesmos. Os
principais parmetros considerados para avaliao da qualidade so os seguintes:
Formato;
Simetria;
Colorao;
Extruso celular;
Integridade da Zona Pelcida.
A classificao quanto qualidade feita atribuindo-se
valores de 1 a 5, conforme a tabela 2.

Tabela 2 - Classificao dos embries bovinos quanto a sua qualidade
Classificao Qualidade Comentrios
1 Excelente Praticamente nenhuma alterao
2 Bom Pequenas alteraes
3 Regular Alteraes significativas
4 Ruim Bastante alterado (difcil avaliar)
5 Degenerado Comprometimento morfolgico
Fonte: (FERNANDES, 2001)

No caso de transferncias no cirrgicas, aps a
classificao e distribuio dos embries pelas receptoras, estes devem ser
envasados. necessrio mud-Ios de soluo lavando-os pelo menos 4 vezes, para
eliminao das impurezas presentes na Zona Pelcida antes de coloc-Ios nas
palhetas. Utiliza-se uma outra soluo idntica aquela na qual estes foram
classificados (PBS com 10% de SFB, ou com 0,4% de BSA, ou outra soluo de
manuteno).


ar
____________________________________________________

____________________________________________________
lquido + embrio lquido



Figura 2 - Esquema de montagem dos embries em palhetas
Fonte: (FERNANDES, 2001)

Os embries so aspirados para o interior das palhetas
de 0,25 ml, previamente identificadas (estgio e qualidade), com o mesmo lquido
onde esto (PBS + 10% de SFB ou 0,4% de BSA). Para impedir que fiquem presos
no algodo da mesma, aspira-se, nesta ordem, uma coluna de liquido (1/4 do
comprimento da palheta), uma pequena bolha de ar, uma segunda coluna de lquido
(1/3 da palheta). Deve-se conferir na lupa se realmente o embrio se encontra dentro
da palheta aps o envase, evitando a contaminao da poro aberta da mesma
(FERNANDES, 2001).
Com os embries nas palhetas, estas so montadas
nos aplicadores, sendo ento transferidos para as respectivas receptoras. Caso se
trabalhe com inovulaes cirrgicas, o embrio aspirado para o anterior de um
pequeno cone plstico, chamado de Tom Cat, utilizado para esta finalidade,
acoplado a uma seringa de insulina.









3. FERTILIZAO "IN VITRO"

O primeiro bezerro nascido de FIV, a partir de um
ovcito, cuja maturao foi realizada in vitro, ocorreu em 1981 (BRACKETT et aI ,
1982).
A fmea bovina tem em seus ovrios ao nascimento em
tomo de 150.000 folculos primordiais. Ao chegar a puberdade este nmero diminui
para 12.000 a 86.000, e destes somente poucos chegam a ovulao durante a vida
desta fmea, enquanto o restante sofre atresia (CAMPBELL et. aI, 1995).
A tcnica de puno folicular guiado por ultra-som
permite maximizar o aproveitamento destes vulos que fisiologicamente so
produzidos nos ovrios de uma fmea, levando-os a um sistema de produo in vitro
de embries (PRETERSE et aI, 1988 ; PIVATO, et aI).

3.1 Vantagens

Alm do aumento e da maior velocidade de produo
de bezerros, e conseqentemente no ganho gentico em carne ou leite, a produo
de embries in vitro, a partir de material de vacas vivas, traz outros benefcios
pesquisa e produo, tais como:
Formao de banco de ovcitos criopreservados. O ovcito congelado
permitir, no futuro, a regenerao de raas em extino, pela fecundao in
vitro de tais ovcitos e transferncia dos embries para vacas receptoras.
Avaliao simultnea de diferentes acasalamentos em programas comerciais
de melhoramento animal.
Recuperao de material gentico de vacas que apresentam problemas
reprodutivos adquiridos.
Produo de embries a partir de fmeas imaturas, diminuindo assim o
intervalo entre geraes.

3.2 Coleta de Ovcitos

A coleta dos ovcitos pode ser realizada pelo mtodo
de Puno Folicular ou ovrios provenientes de abatedouro. (Coleta in vitro). Este
mtodo permite coletar, de forma repetida, os ovcitos por puno dos folculos
visualizados na tela de um ultra-som, podendo desta maneira otimizar a produo de
embries a partir de cultivo in vitro para vacas de elevado valor gentico.

Material necessrio para puno folicular:

Ultra-som;
Sonda transvaginal de 5 ou 7,5 MHz;
Bomba vcuo;
Sistema de agulhas (18 G e 58 cm) e cnulas;
Tubo de coleta.
3.3 Recuperao Ovocitria

3.3.1 Utilizando doadoras superovuladas

O nmero mdio de ovcitos coletados em vacas
superovuladas de 13 estruturas. Em novilhas cclicas a mdia de 9,5 ovcitos
recuperados. A utilizao deste protocolo facilita a implantao desta tcnica em um
laboratrio, visto que a recuperao ovocitria maior e a visualizao dos folculos
para a puno facilitado, quando comparado com doadoras no superovuladas.
Entretanto, a produo final de blastocistos, ao longo de um ano, significativamente
menor.

3.4 Utilizando doadoras no superovuladas

O nmero mdio de ovcitos coletados em vacas e
novilhas possui uma variao simples ou at dupla (desvio de 4,2 a 8,8 para as
mdias respectivas). Enfim, o nmero mdio de ovcitos recuperados de 6 (seis)
estruturas por sesso de puno, podendo esta ser repetida a cada trs dias, sem
causar danos maiores ao ovrio. Embora este protocolo necessite de uma dedicao
maior (nmero de sesses), o nmero de produtos nascidos de uma doadora ao ano
tambm, significativamente, maior.
3.5 Coleta in vitro

Os ovcitos podem ser coletados de ovrios de
abatedouro. Aps o abate das fmeas, os ovrios so coletados e transportados ao
laboratrio, em soluo PBS e so puncionados os folculos que medem entre 2-8
mm. de dimetro.

3.5.1 Mtodo in vitro

A maturao do ovcito realizada em meio TCM 199,
adicionado de Soro Fetal Bovino e de gonadotrofinas. Aps 24 a 26 horas de
cultivo, os ovcitos so fecundados com o smen de touro escolhido. A escolha do
touro baseada em critrios genticos, mas igualmente sobre sua habilidade
fecundante in vitro. A fecundao in vitro realizada na presena de heparina,
durante 18 horas, no meio TALP (Tyrode Albumina Lactato Piruvato). Os zigotos so
em seguida cultivados in vitro, at a obteno de embries transferveis.

3.6 Maturao do Ovcito

A maturao envolve mudanas nucleares e
citoplasmticas no ovcito. O ovcito imaturo (ovcito primrio) se encontra parado
no estgio de prfase da primeira diviso meitica.


Figura 3 - Ovcito bovino imaturo, logo aps a puno
Fonte: RHEINGANTZ (2007)
A maturao nuclear inicia-se com a retomada da
meiose pela quebra do envelope da vescula germinal (germinal vesicle break down),
atingindo o estgio de metfase I, 12 horas aps o incio do cultivo. A completa
maturao nuclear ocorre entre 20 e 24 horas e marcada pela expulso do primeiro
corpsculo polar e formao da segunda placa metafsica (ovcito maturo).


Figura 4 - Embries bovinos produzidos in vitro, 48h aps a FIV.
Fonte: RHEINGANTZ (2007)

O citoplasma passa igualmente por mudanas
significativas na sntese de protenas, na migrao e na reorganizao de organelas.
Enquanto as mitocndrias tendem a migrar para o centro do ovcito, os grnulos
corticais se deslocam em sentido contrrio.

3.8 Preparao Espermtica

Os espermatozides encontrados no epiddimo, ou
mesmo recm-ejaculados, no possuem potencial fecundante, devendo, portanto,
para adquiri-lo sofrer ordenadas alteraes funcionais e estruturais denominadas
capacitao espermtica e reao de acrossoma (ROLDAN & GOMENDIO, 1992 ;
FLORMAN & FIRST, 1988a).
Durante o processo de capacitao espermtica so
observadas profundas alteraes da composio de membrana plasmtica dos
espermatozides, levando a um aumento da difuso inica e glicoproteca,
resultando em uma mudana significativa de seus padres metablicos (LANGLAIS
& ROBERTS, 1985).
A reao de acrossoma um evento deflagrado pela
ligao do espermatozide a membrana pelcida. Sendo caracterizado por uma
extensa fuso e posterior vesiculao e destruio das membranas plasmtica e
acrossmica externa, expondo a membrana acrossmica interna e permitindo uma
ordenada liberao do contedo enzimtico presente no acrossoma. Com a reao
do acrossoma concluda, os espermatozides atingem seu padro mximo de
hiperativao, tomando-se capazes de transpor a membrana pelcida e promover a
fecundao. A heparina possui um preponderante papel no processo da fecundao,
visto que, com a sua ligao ao espermatozide, observa-se extensa formao de
stios de ligao para receptores de membrana pelcida. Com isso, alguns autores
relacionam o potencial de fertilidade de touros, in vivo, com quantidade destas HBPs
(PARRISH, 1988 ; BLEIL & WASSARMAN, 1983 ; FLORMAN & FIRST, 1988b ;
MYLES, 1993 ; KANDELL et. aI., 1992; BELLIN et. aI., 1993 ; KILLIAN et. aI., 1993).

3.8 Fecundao in vitro

A fecundao propriamente dita , na verdade uma
reao em cascata, desencadeada pela passagem do espermatozide pela
membrana pelcida, penetrao na membrana plasmtica e seu alojamento no
interior do citoplasma ovocitrio. Essa fuso envolve todo o espermatozide, de
maneira que a cauda tambm se integra ao citoplasma, fato esse fundamental para a
estruturao do cito-esqueleto do primeiro ciclo celular (LONG et aI., 1993).
A fuso do espermatozide induz a ativao do ovcito,
representada inicialmente por mudanas do potencial transmembranrio e uma
mobilizao macia do Ca++. Na seqncia, observada a exocitose dos grnulos
corticais e conseqente impermeabilizao da membrana pelcida; queda do
(MATURATION/ MITOSIS/ M-PHASE PROMOTING FACTOR) MPF; concluso da
segunda diviso meitica e expulso do segundo corpsculo polar; e modificaes
das propriedades corticais do ovo (CROZET, 1991).
Com a queda do MPF d-se incio a descondensao
da cromatina do espermatozide e dos cromossomos femininos, formando-se, assim,
ambos os pro-ncleos, masculino e feminino. Os pr-ncleos migram para o centro
do ovo, onde, aps a quebra dos envelopes nucleares, os cromossomos se pareiam
em um nico fuso, ocorrendo assim a singamia (LONG et aI., 1993).
Os ovcitos sero depositados em tubos contendo meio
definido para fecundao. Imediatamente aps efetua-se a inseminao dos ovcitos
que sero cultivados por 18 horas, nas mesmas condies da maturao.

3.8.1 Cultivo de embries in vitro

O desenvolvimento de um sistema eficiente de cultivo
de embries in vitro um dos maiores entraves no atual estgio das pesquisas. O
desafio passa pelo desenvolvimento de um sistema de co-cultivo, condies de
cultivo e desenvolvimento de meios quimicamente definidos, evitando, de certa
forma, a passagem em hospedeiros intermedirios.
Os meios mais utilizados tm sido o TCM-199 e o B2
(INRA-menzo), acrescidos de antibiticos, soro fetal bovino e/ou soro de vaca em
cio, e piruvato (GOTO et aI., 1988; PAVLOK et aI., 1989 e MENCK, 1994).
Uma gama de clulas tem sido testada no co-cultivo de
embries, sendo que as mais utilizadas so as clulas do oviduto em suspenso ou
em monocamadas, as clulas da granulosa em monocamada e clulas VERO,
igualmente em monocamada (FONTES, 1993; BERG e BREM, 1989 e MENCK,
1994).
Fontes (1993), informa o uso de um suporte extracelular
(matrigel) na co-cultura em monocamada de clulas do oviduto, mostrando algumas
tendncias da pesquisa neste segmento. Os meios condicionados por apresentarem
resultados inferiores aos sistemas de co-cultivo direto tm sido usados somente em
condies especficas. A maior limitao encontrada nos sistemas de cultivo diz
respeito a qualidade dos embries produzidos. A passagem dos embries de FIV,
temporariamente em ovidutos de ovelhas, tem melhorado a qualidade dos embries
permitindo melhores ndices de gestao ps-transferncia.

3.8.2 Classificaes dos embries

Os embries so classificados em:

Mrula compactada

Figura 5 Mrula compactada
Fonte: (CLNICA TAMBRE, 2007)

Os blastmeros esto agregados entre si, formando
uma massa compacta de clulas e ocupam cerca de 70% do espao perivitelino.
Blastocisto inicial

Nesta fase pode ser observado o incio da blastocele.
Comea a ocorrer a diferenciao entre trofoblasto e boto embrionrio.


Figura 6 Blastocisto inicial
Fonte: (CLNICA TAMBRE, 2007)

Blastocisto

Ocorre uma evidente diferenciao entre clulas do
trofoblasto e boto embrionrio.


Figura 7 Blastocisto
Fonte: (CLNICA TAMBRE, 2007)
Blastocisto expandido
O embrio ocupa todo o espao perivitelino. O lquido
da blastocele empurra o trofoblasto contra a membrana pelcida.


Figura 8 Blastocisto expandido
Fonte: (CLNICA TAMBRE, 2007)

Blastocisto eclodido






Figura 9 Blastocisto eclodido
Fonte: (CENARGEN & EMBRAPA, 2001)

O embrio est completamente livre da membrana
pelcida (CENARGEN & EMBRAPA, 2001). possvel obter um grande avano
gentico quando se utiliza est tcnica, atravs da coleta em animais pr-pberes,
pela diminuio do intervalo entre geraes (CENATTE, 2001).















4. ASPIRACO FOLICULAR GUIADA POR ULTRASONOGRAFIA
(OPU-FIV)

4.1. Fisiologia ovariana

No tero mdio da gestao, o ovrio do feto bovino j
est repleto de oognias; e estas oognias esto contidas em folculos primordiais
(pr-antrais, com uma nica camada de clulas da granulosa), e os estgios iniciais
do crescimento folicular iniciam-se antes do nascimento (ERICKSON, 1966 ;
MARION et aI., 1968).
Ao nascimento existem cerca de 0.5 milho de folculos
nos ovrios bovinos e estes, gradualmente deixam seu estado de dormncia e
iniciam um desenvolvimento para folculos antrais. Uma vez que se iniciou o
desenvolvimento, um desses eventos ir ocorrer: ovulao ou atresia. Praticamente
todos os folculos sofrem atresia. Isto pode ser demonstrado ao calcularmos que, um
animal ciclando normalmente num perodo de 15 anos vai ovular menos de 300
ocitos (ovulando a cada 21 dias ou 17.4 vezes ao ano, multiplicado por 15 = 260
ovulaes) dentre os 0.5 milhes existentes ao nascimento (ERICKSON, 1966).
Isto sem contar que os animais chegam a passar
metade de suas vidas prenhes. Fica claro, portanto, que menos de 0.1 % dos
folculos chegam a ovular. Aparentemente, so necessrios 60 dias para que um
folculo primordial ativado atinja o tamanho ovulatrio (LUSSIER et aI., 1987).
Neste perodo, seguindo um padro de ondas
foliculares, ocorrem vrias fases de crescimento e atresia folicular com subseqente
maturao ou degenerao ocitria (WILTBANK et aI., 1996).
Novas biotecnologias visam o aproveitamento destes
folculos para a recuperao dos ocitos e posterior manipulao. A seguir sero
descritas algumas delas.

4.2. Aplicaes da tcnica

4.2.1 Produo de maior nmero de embries

Uma vez que pela monta natural ou inseminao
artificial (IA), podemos obter apenas um produto por vaca ao ano, novas biotcnicas
foram desenvolvidas para acelerar os processos de melhoramento gentico. Assim
sendo, com o advento da superovulao e posterior transferncia de embries
(MOET - multi ovulation and embryo transfer), foi possvel obter-se em mdia a
produo de 25 embries ao ano, totalizando cerca de 100 embries na vida
reprodutiva de uma vaca. (SAUMANDE et aI., 1984)
Kruip et aI. (1994) estudaram a eficcia da puno
folicular transvaginal orientada por ultra-som em vacas leiteiras e de corte, obtendo
uma mdia de 8.0 ocitos colhidos por sesso, sendo que 16% desenvolveram em
embries transferveis aps MIV /FIV /CIV (maturao, fecundao e cultivo in vitro)
com uma taxa de prenhez de 40% a 50%. Baseado no nmero mdio de ocitos
colhidos por sesso, possvel transferir 2 embries/semana/vaca, resultando em 1
bezerro.

4.2.2. Menor intervalo entre geraes

O intervalo entre geraes um dos elementos chave
em qualquer abordagem sobre melhoramento gentico animal (BERRERIDGE, K. J.
et aI., 1989).
O desenvolvimento de folculos antrais em bezerras
desde 2 semanas de idade, o conhecimento das ondas foliculares e a habilidade de
superestimular o desenvolvimento folicular nesta categoria de animais, oferece a
possibilidade de se utilizar animais pr-pberes para a recuperao de ocitos
bovinos. Tais ocitos tm a mesma competncia para a FIV quando comparados aos
obtidos de animais adultos, porm o nmero de ocitos recuperados em bezerras
tende a ser 20% menor (NIBART et al.,1995).
Assim sendo, o intervalo entre geraes ficou
obviamente diminudo, permitindo uma avaliao precoce do potencial gentico
destes animais.
As grandes dificuldades da utilizao de bezerras era a
conteno dos ovrios, uma vez que apalpao retal limitada pelo pequeno
dimetro do orifcio anal. Portanto, o probe utilizado nestes animais deveria possuir
dimenses reduzidas (por exemplo, a probe humana) e, para bezerras pequenas
demais, usavam agulhas muito afiadas, pois no havia como conter os ovrios.
A superovulao (SOV) tambm pode ser utilizada em
novilhas conseguiram aumentar o nmero de ocitos recuperados, bem como o
nmero de folculos visveis (BROGLIATII & ADAMS, 1996).

4.2.3. Melhor aproveitamento dos animais

Conforme citado no item anterior, as doadoras de
ocitos podiam ser utilizadas muito precocemente, e, assim sendo, o incio de sua
vida reprodutiva era muito antecipado. Da mesma forma da aspirao folicular de
vacas senis, bem como de e vacas prenhes at o 3. ms de gestao, permitiram a
produo de embries pela aspirao guiada por ultra-som. Ento foi concludo que
as vacas podem produzir descendentes, praticamente desde o seu nascimento at
depois da perda da ciclicidade, ou seja, nos tempos atuais pode-se conseguir um
nmero muito mais elevado de prenhes, com o uso da tecnologia do que em tempos
anteriores, que s era possvel uma por ano.

4.3 Avaliao morfolgica dos ovcitos

A morfologia das clulas do cumulus oophorus e o
aspecto citoplasmtico do ovcito ao microscpio so considerados como os
parmetros mais importantes para o julgamento da qualidade ovocitria e,
conseqentemente, de sua aptido para o desenvolvimento embrionrio.
. As clulas do cumulus so ligadas ao ovcito por
intermdio de junes GAP permeveis que permitem as trocas inicas e
eletrolticas, entre o meio e o ovcito. Estas clulas so responsveis pela secreo
de certas substncias necessrias a maturao do ovcito, tais como o IGF1, fator
de crescimento importante a maturao citoplasmtica. A presena de um cumulus
intacto por pelo menos 12 horas indispensvel a esta maturao.
Konishi et aI (1996), demonstraram por adio de
clulas da granulosa ao meio de maturao dos ovcitos, que a capacidade de
desenvolvimento embrionrio era incrementada. Confirmando as concluses de
segundo as quais a taxa de desenvolvimento aumenta com o nmero de clulas em
tomo do ovcito (YANG & LU 1990 ; KING et aI 1998).
Estas clulas no possuem nenhum efeito sobre a
capacitao do espermatozide (MARQUANTLE GUIENNE, 1991).
Outras observaes relacionaram o tamanho do ovcito
e o aspecto do citoplasma a maturao e ao desenvolvimento aps a fecundao.
Os ovcitos que possuam um citoplasma denso e homogneo possuam taxas de
clivagem e de desenvolvimento ao estgio de blastocisto mais elevado que os
ovcitos que apresentavam citoplasma claro e irregular. Os ovcitos de dimetro
inferior a 3 mm, possuam uma maturao nuclear e citoplasmtica incompletas no
momento da fecundao in vitro, e, portanto, eram menos capazes de suportar um
desenvolvimento ao estado de blastocisto (KING et aI, 1998).

4.4. Pesquisas na rea da embriologia
A fecundao in vitro nos permite acompanhar passo a
passo o incio do desenvolvimento embrionrio. Desta forma, podemos estudar os
processos fisiolgicos e patolgicos correspondentes, bem como a embriotoxicidade
de certas drogas e um processo complexo como diferenciao celular.

4.5 Produo in vitro de embries (PIV)

A produo in vitro (PIV) de embries bovinos
considerada a terceira biotecnologia na rea de reproduo seguindo a IA e a TE.
Esta biotecnologia consagrou-se quando, em 1981, nasceu o primeiro bezerro
oriundo de fecundao in vitro utilizando ovcitos maturados in vivo e smen fresco
(BRACKETT et al 1982).
A partir de 1986, tomou-se possvel a fecundao in
vitro de ovcitos maturados in vitro utilizando smen congelado (CHENG et aI 1986;
CROZET et al 1987; LEBFRIED-RUTLEDGE et aI. 1987 ; PARRISH et aI, 1986).
Pieterse et aI (1988), descreveram o mtodo de puno
foIicular (OPU), do ingls "Ovulum Pick-up, para a recuperao de ovcitos a partir
de fmeas vivas.
No Brasil, os primeiros produtos de PIV foram obtidos
em 1994 utilizando ovcitos imaturos, smen descongelado e sistemas de co-cultivo.
Esta evoluo tomou-se possvel em funo de progressos realizados na definio
de condies de cultivo apropriadas (HEYMAN & MENEZO, 1987).
A PIV tomou-se uma tecnologia promissora tanto para o
estudo da embriologia bsica quanto para a produo animal representando um
importante procedimento para o estudo dos mecanismos relacionados maturao
final e interao dos gametas e o desenvolvimento embrionrio subseqente
(MENCK, 1994 ; FOOTE, 1993; LOBO et aI, 1994; LOBO, 1996). Alm disso,
permitiu o desenvolvimento de estudos sobre maturao, fecundao e cultivo in
vitro, clonagem, bipartio, microinjeo de DNA exgeno, sexagem,
congelao/descongelao de embries (AVERY & GREVE, 1993 ; AZAMBUJA,
1994 ; WATANABE, 1993 ; KEEFER, 1993).
A produo de embries in vitro viabiliza a introduo
de inovaes tecnolgicas na rea de reproduo animal assim como acelera o
progresso gentico dos bovinos submetidos a programas de melhoramento. Tambm
um maior aproveitamento das fmeas considerando a potencial viabilidade dos
milhares de ovcitos que permanecem latentes no ovrio bovino, permitindo fmea
gerar uma prognie maior que a esperada em sua vida til reprodutiva.
Comercialmente, a PIV utilizada para maximizar a produtividade do rebanho
bovino, superar a infertilidade adquirida e no transmissvel de fmeas de alto valor
econmico e de grande potencial produtivo, produzir bezerros trangnicos e prover
grande quantidade de embries sexados (BRACKETT & ZUELKE, 1993).
Uma extensiva explorao comercial e cientfica da PIV
foi obtida nos ltimos dez anos, devido a utilizao em larga escala de ovrios
provenientes de matadouros para MIV e FIV de ovcitos, que permitiu a produo de
embries a um custo baixo. No entanto, a realizao de PIV com ovcitos oriundos
de matadouros apresentam algumas desvantagens tais como:
O tempo para que o material chegue ao laboratrio;
Desconhecimento sobre as condies sanitrias ou o padro hormonal dos
animais;
A no repetibilidade da tcnica para um animal.
Neste contexto, a busca por ovcitos de melhor
qualidade conduziu a tcnicas que permitissem o aproveitamento de ovcitos de
arrimais vivos (BOLS et aI, 1995; BROGLIATTI & ADAMS, 1996 e 1998).

4.6. Produtos obtidos de vacas que no respondem superovulao

Uma vez que a OPU-FIV no requer tratamento
hormonal para o seu sucesso, pode-se aproveitar de forma muito mais eficiente
animais que no respondem superovulao, seja por anomalias adquiridas
(resistncia ao hormnio) ou por serem refratrias SOB. Assim sendo, vacas que
possuem grande potencial gentico podem ser doadoras de ocitos, no importando
mais sua resposta SOV.

4.7 Produtos obtidos de animais com problemas reprodutivos

Muitos so os casos de animais infrteis ou subfrteis
por problemas adquiridos. So freqentes os casos de aderncias de ovrio e tero,
metrites crnicas, infeces tubricas e outras patologias. A OPU-FIV permite a
produo de prognie de animais com tais enfermidades, uma vez que ela no
necessita do restante do aparelho reprodutivo, bastando o ovrio possuir folculos de
tamanho suficiente para a aspirao.
Os resultados obtidos de animais com tais patologias
no diferem dos resultados obtidos de animais saudveis.

4.8 Utilizao de animais mortos

So freqentes os casos de proprietrios que desejam
obter mais crias de uma vaca acidentada, enferma ou morta. A remoo dos ovrios
destes animais pode resultar na recuperao de ocitos viveis e posterior produo
de prognie. Assim sendo, um animal recm morto ou ante-mortem ainda pode
produzir um descendente. Temos que levar em conta que a temperatura um
aspecto muito importante. Os ocitos so extremamente sensveis s alteraes de
temperatura. A exposio dos ocitos temperatura de 25C por apenas 10 minutos
pode causar alteraes severas no seu cito-esqueleto.

4.9 Pr-Seleo de Touros

A aplicao campo dos avanos das biotcnicas da
reproduo no melhoramento gentico animal pode e deve ser utilizada como uma
ferramenta auxiliar na seleo de touros e matrizes.
A fertilidade de touros est relacionada com a
probabilidade de sucesso do espermatozide em fecundar o ocito, formar o zigoto,
seguir o desenvolvimento embrionrio e fetal at o nascimento.
Um mtodo adequado de verificar a fertilidade de touros
pode ser efetuado mediante a fecundao in vitro, onde se detecta espermatozides
de touros com baixa fertilidade. Resultados observados na fertilidade in vitro entre
touros consideram a habilidade do espermatozide em fecundar o ocito e o zigoto
continuar o desenvolvimento in vitro at chegarem ao estgio de blastocisto
(LACALANDRA et aI, 1992 ; W ATANABE & OLIVEIRA FILHO, 1994; WATANABE et
aI, 1995).

4.10 Recuperao

4.10.1 Ovrio de matadouro com ou sem identificao

Os ovrios de matadouro so uma fonte muito
acessvel para a recuperao de ocitos, porm, normalmente os ocitos no so de
animais valorosos (BROGLIAITI & ADAMS, 1996).
O protocolo de procedimentos para o envio de ovrios
de animais abatidos, mortos, ou mesmo extirpados cirurgicamente, segue-se abaixo;
tambm citada a tcnica de recuperao de ocitos destes ovrios.

4.10.2 Colheita de ovrios e ovidutos

Os ovrios so colhidos de vacas recm abatidas e
transportados em frascos contendo soluo salina 0,9% (pr-aquecida a 36C) com
antibitico (0,2 mg/ml e gentamicina).
Os frascos so mantidos em uma caixa de isopor
durante o transporte do matadouro ao laboratrio. No laboratrio os ovrios so
lavados e transferidos para nova soluo salina com antibitico e mantidos
temperatura ambiente, antes da aspirao folicular.

4.10.3 Colheita e seleo de ocitos

Os ocitos so aspirados de folculos visveis,
utilizando-se agulha de calibre 15x15 acoplada a uma seringa de 20ml, contendo 1
ml de meio de aspirao.
Aps a aspirao de 4 a 6 ovrios, o fluido folicular
transferido para tubos cnicos contendo 3 ml de meio de aspirao, imersos em
banho-maria a 30C, ou diretamente, em placas de petri sobre platina aquecedora.
Retiram-se os ocitos decantados do fundo do tubo
com auxlio de uma pipeta de Pasteur ou pipetador automtico. Toma-se cuidado
para no danificar as clulas do cumulus, transportando-os para uma placa de Petri e
posterior seleo sob estereomicroscpio (Lupa).
Somente ocitos com cumulus compacto e citoplasma
de colorao marrom e homognea so selecionados. Os ocitos atrsicos, com
citoplasma escuro e com grnulos so descartados.
4.11 Vacas "acidentadas"

Para animais acidentados ou prestes a morrer,
prefervel que se execute uma ovarectomia enquanto o animal ainda est vivo. H
indcios de que a qualidade dos ocitos seja melhor usando deste procedimento.

4.12 Fatores de variao em programas de OPU

Vrios so os fatores de variao no sistema de
produo in vitro de embries por OPU-FIV. A doadora de embries um dos
principais fatores de variao sendo responsvel por uma variao individual que
fora reportada como sendo de 0 a 26 quando se considera os resultados por puno
(HASLER et aI, 1995).
O estado da doadora tambm citada como sendo
uma fonte de variao, entretanto os resultados so contraditrios, relatou ser nula a
diferena entre o nmero de ovcitos recuperados entre vacas destinadas a
diferentes tipos de produo, o que havia sido publicado por Looney et aI. (1994) e
Wenigerkind et aI (1996) que afirmaram ser superior o rendimento de vacas em
aleitamento. A raa da doadora tambm aparenta ser um fator importante neste
contexto.
Segundo Wenigerkind et aI (1996), as vacas Charols
apresentaram resultados 3 vezes superior a vacas Holands Holstein. Diferenas
significativas tambm foram reportadas em relao a idade da doadora, comparando
doadoras de menos de 3 anos com doadoras de idade superior a 3 anos
encontraram taxas de desenvolvimento embrionrio de 42 e 46,7% respectivamente.
Ainda, comparando-se o rendimento entre doadoras
novilhas e vacas observa-se que vacas possuem um nmero mdio de ovcitos por
colheita de 6,7 e novilhas de 5,5. A diferena entre as categorias se eleva quando o
nmero de ovcitos e embries viveis por colheita estabelecido. Em mdia,
obtm-se por colheita de 4.86 e 3.84 ovcitos viveis, e 1.1 e 0.55 embries viveis,
respectivamente, para vacas e novilhas com ritmo de colheita de 2 vezes/semana
(KRUIP et aI. 1994 ; BUNGARTZ et aI. 1995 ; PElXER et aI 1995 ; DEN DAAS &
MERTON, 1994 e FRY et aI. 1994).
Segundo Pieterse et aI (1991) em relao a fase do
ciclo reprodutivo fazendo punes em 21 vacas em 3 fases diferentes do ciclo estral
(D3, DI0, DI6), no encontrou qualquer diferena significativa entre as taxas de
colheita, mas o nmero mdio de ovcitos colhidos aparentemente maior nos
primeiros dias do ciclo.
Entre novilhas pberes e no pberes grande diferena
foi evidenciada, sendo que as primeiras apresentaram maior taxa de colheita e de
desenvolvimento (LOONEY et aI. 1995).
Nenhuma diferena significativa foi encontrada entre as
taxas de colheita de animais gestantes e no gestantes; entretanto estas ltimas
apresentaram melhores taxas de desenvolvimento (KRUIP et al 1994 ; BUNGARTZ
et al, 1995).
Entre as vacas frteis e infrteis, porm ciclando, o
nmero mdio de ovcitos colhidos e de embries produzidos no foi diferente
(KRUIP et aI. 1994 ; BUNGARTZ et aI. 1995 ; HASLER et aI. 1995; NlBART et aI.
1995).
As fmeas utilizadas e classificadas como infrteis
possuam cios normais (Repeat-breeding), uma vez que possuam infeces
vaginais, cervicais ou uterinas, mal formaes da crvix e leses de oviduto, ou
ainda eram fmeas que foram submetidas a programas de transferncia de embries
clssica e no produziam mais embries viveis. Em todos os casos a funo
ovariana apresentava-se intacta.
Gibbons et al. (1994), obteve 6.82.0 e 6.31.1 para
punes efetuadas uma ou duas vezes por semana, respectivamente, demonstrando
que o ritmo de colheita de ovcitos tanto para vacas como para novilhas no
superovuladas parece no sofrer alteraes quanto a freqncia de punes. A
colheita realizada 2 vezes por semana mostrou-se mais vantajosa quanto a produo
de ovcitos classificados como grau.
As taxas de colheita para um mesmo animal tambm se
mostraram muito variveis de uma puno a outra, esta variao parece estar
relacionada ao nmero de folculos puncionados, mas tambm a habilidade do
operador. A qualidade dos ovcitos varia igualmente (SCOTT et aI. 1994).
A equipe de puno e o material utilizado so tambm
fatores muito importantes (DEN DAAS & MERTON, 1994; LANSBERGEN et aI.
1995).
A equipe de puno tem efeito direto sobre a qualidade
dos ovcitos em funo da quantidade de ocitos, o que se explica, essencialmente
pelo nvel de presso aplicada durante a aspirao folicular, assim como a escolha
das agulhas desnudos (VAN WAGTENDONK & DE LEEUW et aI. 1997).
E como ltimo fator de variao temos as condies
tcnicas de maturao, fecundao e cultivo in vitro, que variam muito entre os
diferentes laboratrios e so responsveis por diferentes taxas de desenvolvimento
dos embries in vitro (NIBART & MARQUANT - LEGUIENNE, 1995).
O smen utilizado na fecundao tambm um
elemento de variao, o que evidenciado nos programas de OPU comerciais,
quando vrios touros so utilizados com o objetivo de incrementar o progresso
gentico.

4.13 Tcnica de aspirao folicular guiada por ultra-som

4.13.1 Preparao dos animais

Sedao

O animal deve ser sedado com acepromasinal na dose
de 1,5 ml intravenoso (I. V.) quando muito nervoso. A sedao apenas facilita a
conteno, sendo desnecessrias em animais mansos.

Anestesia

Aps o animal estar devidamente contido no brete,
efetuada uma anestesia epidural baixa aplicando-se 5ml de cloridrato de lidocana a
2%2 por via I.V.

Montagem dos equipamentos

A probe montada conforme indicao do fabricante e
a agulha inserida no mandril, tomando todos os cuidados de assepsia. A extremidade
livre do tubo acoplada na bomba de vcuo e regulado a 70 mmHg.

Puno dos folculos

Primeiramente a probe introduzi da na vagina.
Atravs da palpao retal, o ovrio posicionado contra a extremidade da probe de
forma que os folculos a serem aspirados estejam no percurso da linha de puno
indicada na tela do ultra-som.
Uma vez que a agulha esteja prxima do folculo a ser
aspirado, o pedal de acionamento do vcuo pressionado e o folculo aspirado.
O material recolhido da aspirao recuperado em tubos
cnicos estreis de 50 ml de capacidade, protegidos da luz e mantidos temperatura
de 30 C, contendo 3 ml de meio de aspirao.

Destino dos ocitos
Aps a aspirao os ocitos so levados para o
laboratrio, onde so filtrados em filtro para embries e lavados trs vezes com meio
de aspirao. Em seguida so lavados uma vez em meio de transporte e
selecionados sob esterioscpio (lupa), observando-se como critrios a quantidade
das clulas do cumulus e as caractersticas dos ocitos. Rejeitam-se aqueles que
apresentavam caractersticas de degenerao.
Aps seleo os ocitos bons so colocados em
criotubos de 1 ml contendo meio de transporte para serem levados at o laboratrio
de FIV a uma temperatura mdia de 30 C.

4.14 Superovulao

A recuperao de ocitos viveis pode chegar a dobrar
com a utilizao da superestimulao com FSH (NIBART et aI, 1995).
Pieterse et aI, (1992) utilizaram um tratamento com
Gonadotrofina Srica de gua Prenhe (eCG) em 10 vacas. Obtiveram resultados
positivos quando os animais eram tratados com eCG (7.1) em comparao aos
animais no tratados (4.3). O uso de LH pode aumentar as taxas de recuperao,
por induzir in a maturao e expanso das clulas dos cmulos. (BROGLIA TTI &
VIVO ADAMS, 1996; SCHELLANDER et aI., 1989). A imunizao ativa contra a
inibina foi testada (KONISHI et aI., 1996a) resultando em aumento do nmero de
folculos de todos os tamanhos (22,2 vs 11,9) e aumentando sensivelmente o
nmero de ocitos recuperados (10,4 vs 4,2).

4.14.1 Vantagens
No ocorrem efeitos deletrios aos animais, mesmo
aps cinco meses de punes, duas vezes por semana, no que concerne aos
exames de sade e fertilidade, clnicos ou post mortem. No exame histolgico,
animais que foram aspirados por vrios meses apresentaram maior quantidade de
colgeno na tnica albugnea.
Stubbings & Walton (1995), demonstraram que em
gado de leite, aspiraes mensais de todos os folculos iguais ou maiores do que 5
mm, alteram o ciclo, promovendo apenas um aumento de 4 dias entre estros. A
produo in vitro de embries de alto mrito gentico tornava-se alternativa melhor
que a tcnica MOET por no utilizar hormnios, evitando assim os efeitos nocivos
fertilidade do animal, e aumento do nmero de embries por doadora.

4.14.2 Desvantagens

Alm das grandes variaes dos resultados
apresentados pelos diversos autores e de no haver um padro de meios de coletas
e das respostas superestimulao, a tcnica ainda tem um alto custo. Tambm
temos que levar em conta que as agulhas so um dos equipamentos descartveis
mais caros do processo de aspirao. Elas so de difcil esterilizao e aps
algumas sesses elas ficam rombas e afi-Ias no produz o mesmo efeito das
novas. Este grupo tentou com certo xito o uso de agulhas descartveis, porm
novos estudos devem ser feitos para aumentar as taxas de recuperao.
Foram encontradas massas ecognicas no interior de
25 dos 37 folculos aspirados (BROGLIATTI et aI, 1995). Estas massas ecognicas
primeiramente sugeridas como clulas da granulosa luteinizadas, foram
consideradas hematomas provocados pela aspirao, uma vez que no foi detectado
aumento na progesterona srica.

4.15 Variaes na recuperao

A aspirao folicular por ser uma tcnica bastante
recente apresenta resultados muito variveis quanto ao nmero de folculos
aspirados, o nmero de ocitos recuperados e a taxa de blastocistos produzidos. A
seguir sero expostas algumas causas das variaes nos resultados de diferentes
autores.

4.15.1 Diferena entre animais

A variabilidade entre doadoras de ocitos grande,
sendo que os animais respondem diferentemente aspirao folicular. O nmero de
ocitos recuperados do mesmo animal no variam entre cada coleta. Segundo Kruip
et aI, (1994), existe um recrutamento constante de novos folculos quando os
presentes so aspirados e a taxa de recrutamento tem uma variao individual.

4.15.2 Variaes entre operadores

O operador pode determinar grandes variaes no
nmero de folculos aspirados, bem como no nmero de ocitos recuperados. Esta
variao ocorre entre operadores, da mesma forma como, entre sesses com o
mesmo operador Nibart et al, (1995) e Lansbergen et aI, (1995), descrevem que
houve variaes significativas entre veterinrios, na taxa de recuperao.
Sua equipe era formada por 5 veterinrios operando em
duas estaes experimentais. Com sucessivas trocas de equipes foi comprovada
que a maior variao ocorre devido a doadora e, o segundo fator o operador.

4.15.3 Variaes do comportamento do animal

Animais nervosos que se debatem principalmente os
jovens, dificultavam as sees de aspirao, reduzindo assim o resultado obtido em
cada uma das mesmas.

4.15.4 Tipo de Animal

O nmero mdio de ocitos coletados pouco diferente
entre as doadoras do tipo leiteiro ou de corte. Entretanto Looney et aI. (1994),
acharam resultados um pouco superiores em vacas de corte.

4.15.5 Variaes com o tipo de equipamento utilizado
Nibart et aI. (1995), apresentam uma reviso que
demonstra que globalmente qualquer que seja o sistema de visualizao e de
puno, os resultados em termos de ocitos coletados o mesmo.
Hill et aI. (1995), realizaram aspirao folicular sem o
auxlio de ultra-som, utilizando-se apenas da palpao retal e obtiveram mdia de 6.2
ocitos recuperados por doadora.
Brogliatti & Adams, (1996), destacaram a importncia
de aspectos como espessura da agulha, fio de corte do biseI, forma do biseI e
presso de vcuo, que podem alterar a eficincia de recuperao. O aumento da
presso de aspirao em humanos demonstrou uma maior taxa de recuperao,
porm uma diminuio na qualidade dos ocitos alm de aumentar o nmero de
ocitos desnudos. Convm dizer que a presena de clulas do cumulus so
importantes para aumentar a taxa de desenvolvimento de ocitos maturados e
fecundados in vitro.
Bols et aI. (1995), obtiveram maiores taxas de
recuperao por folculos aspirados usando agulhas mais espessas (18 G),
independente da presso do vcuo. Houve um maior nmero de ocitos recuperados
com o aumento da presso de vcuo, porm diminuiu a quantidade de clulas do
cumulus, independente do calibre da agulha. Agulhas mais finas apresentaram
melhor COC (complexo cumulus-oocitrio) com clulas do cumulus mais compactas.

4.15.6 Freqncia da aspirao

A freqncia das aspiraes em mdia a cada 15 dias
nas mesmas vacas de uma mesma fazenda, e o mnimo a cada 07 dias. A taxa de
recuperao de ocitos imaturos aumenta, se a coleta for repetida no mesmo animal
por um perodo de no mnimo vrios meses (KRUIP et aI., 1994). A aspirao
repetida 2 vezes por semana produzia aumento considervel no nmero de folculos
visveis recuperados, observados nas aspiraes seguintes. Foi obtido maior nmero
de embries transferveis em aspiraes realizadas 2 vezes por semana.

4.16 Amniocentese

Outra aplicao para o equipamento de aspirao
folicular a pratica da amniocentese. Bellow et aI., (1996) utilizaram-se da tcnica
em vacas prenhes entre os dias 45 e 75 de gestao, onde observaram 4 abortos
entre 24 vacas avaliadas. O autor acredita que a amniocentese uma tcnica vivel
com o mesmo equipamento de aspirao, com risco mnimo. Os abortos ocorreram
entre 1 a 2 semanas aps a amniocentese.

4.16.1 Sincronizao da onda para Superovulao

A presena do folculo dominante nas ondas de
crescimento folicular exerce uma ao inibitria ao crescimento de outros folculos
existentes (WILTBANK et aI., 1996).
A tcnica de aspirao do folculo dominante foi testada
para iniciar um programa de superovulao em vacas leiteiras (BUNGARTZ &
NIEMANN, 1994).
Os resultados obtidos demonstraram que houve um
aumento na recuperao de embries aps a aspirao do folculo dominante, o qual
foi similar ao obtido no tratamento iniciado na ausncia do folculo dominante.
Brogliatti et aI., (1995), descrevem que a emergncia de
uma onda aps a aspirao do folculo dominante, no difere da onda folicular
normal.

Tabela 3 Preparao de meios

PBS 1 LITRO

Soluo Antibitica 1 ml

Soro Fetal Bovino (SFB) 10 ml

Liquemine 1 ml

Tabela 4 Meio de Transporte

TCM 199 (HEPES)* 18 ml

SFB (10%) 2 ml

Piruvato (0,2 mM) 4 ul

Kanamicina ou gentamicina 100 ul

Tabela 5 - *TCC 199 HEPES

NaHCO3 1,1 g

Hepes cido 1,4895 g

Hepes sdico 1,16270 g

gua desionizada 1 L









CONSIDERAES FINAIS

O desenvolvimento de biotecnologias que permitem
transferncia de embries e fertilizao in vitro em bovinos possibilita o aumento
dos ndices reprodutivos em fmeas bovinas e tambm permite o melhor
aproveitamento de fmeas com elevados padres zootcnicos, possibilitando um
manejo mais racional, garantindo assim um grande nmero de descendentes, num
curto espao de tempo.
Observou-se atravs desse estudo que muitas so as
vantagens da fertilizao in vitro dentre elas pode-se citar que ocorre uma maior
velocidade na produo de bezerros, possibilita tambm uma formao de banco de
ovcitos criopreservados, permitindo assim uma regenerao de raas em extino.
Tambm existe a possibilidade atravs dessa biotecnologia de recuperar ocitos de
vacas acidentadas, enfermas ou mortas.
As desvantagens observadas atravs desse estudo
foram os altos custos dos equipamentos da fertilizao in vitro, as agulhas
descartveis so um dos equipamentos mais caros do processo de aspirao.
Esse estudo sugere que seja feito um maior estudo para aumentar as taxas de
recuperao das agulhas que so utilizadas para a aspirao o que possibilitaria
baixar os custos gerando assim um maior lucro e posteriormente uma maior adeso
ao processo de fertilizao in vitro dos cria- dores.
Na transferncia de embries as vantagens observadas
dessa biotecnologia foram um maior controle de doenas, o controle do sexo do
produto, a multiplicao rpida de um gentipo superior e a produo de
descendentes de um animal jovem.
As desvantagens que se pode observar atravs desse
estudo foram os custos operacionais que so altos e as condies mnimas da
transferncia de embries.
Espera-se que este trabalho possa contribuir para um
melhor entendimento, aperfeioamento e expanso da transferncia de embrio e
fertilizao in vitro (FIV), pois foram descorridos vrios procedimentos utilizados
para transferncia embrio e fertilizao in vitro (FIV).






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