INGENIERA BIOQUMICA

Mario Arias Zabala

Facultad de Ciencias
Universidad Nacional de Colombia
Sede Medelln
2007
PROGRAMA RESUMIDO
1. Breve resea histrica
2. Generalidades de los Procesos Bioqumicos
3. Procesos Fermentativos
3.1. Estequiometra de procesos fermentativos
3.2. Cintica de procesos fermentativos
3.3. Aspectos termodinmicos
4. Tcnicas del cultivo celular
4.1. Cultivo discontinuo (batch)
4.2. Cultivo alimentado (fed batch)
4.3. Cultivo continuo
5. Agitacin de Medios de Cultivo
6. Aireacin de Medios de Cultivo
7. Esterilizacin
8. Escalado
BIBLIOGRAFA (Libros)
1. Doran, P. : Bioprocess Engineering Principles. Academic Press. 1995.
2. Blanch, H. and Clark, D.: Biochemical Engineering. Marcel Dekker. 1997.
3. Casablancas, F. y Lpez, J. (Editores): Ingeniera Bioqumica. Editorial
Sntesis.1998.
4. Bailey, J. and Ollis, D.: Biochemical Engineering Fundamentals.
McGraw-Hill. 1986.
5. Quintero, R.: Ingeniera Bioqumica. Editorial Alhambra. 1981.
6. BuLock, J. y Kristiansen, B.: Biotecnologa Bsica. Edit. Acribia. 1991.
7. Stanbury, P., Whitaker, A. and Hall, S.: Principles of Fermentation Technolo-
gy. Edit. Butterworth Heinemann. 1995.
8. Nielsen, J. and Villadsen, J.: Bioreaction Engineering Principles. Plenum
Press. 1994.
9. Wang, D. y otros: Fermentation and Enzyme Techonology. John Wiley and
Sons. 1979.
10. Aiba, S., Humphrey, A. and Millis, N.: Biochemical Engineering. Academic
Press. 1973.
11. Shuler, M. and Kargi, F.: Bioprocess Engineering: Basic Concepts. Prentice
Hall. 1992.
BIBLIOGRAFA (Revistas)
1. Biotechnology and Bioengineering
2. Biotechnology Progress
3. Journal of Fermentation and Bioengineering
4. Biochemical Engineering Journal
5. Chemical and Biochemical Engineering Quarterly
6. The Chemical Engineering Journal and the Biochemical Engineering Journal
7. Process Biochemistry
8. Applied Biochemistry and Microbiology
9. Applied Microbiology and Biotechnology
10. Journal of Applied Microbiology
11. Letters in Applied Microbiology
12. American Journal of Biochemistry and Biotechnology
13. Biotechnology Advances
14. Critical Reviews in Biotechnology
15. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology
AREAS DE INVESTIGACIN EN INGENIERA BIOQUMICA
Optimizacin de procesos existentes.
Desarrollo de nuevos procesos con base en clulas microbianas modificadas
. genticamente, clulas vegetales y clulas animales.
Procesos con clulas y enzimas inmovilizadas.
Nuevos diseos de biorreactores.
Desarrollo de biosensores y sensores virtuales.
Monitoreo y control asistido por computador de bioprocesos.
BREVE RESEA HISTRICA DE LA MICROBIOLOGA
1665 Hook describe la estructura celular del corcho.
1675 Leeuwenhoek mejora los lentes del microscopio y descubre formas de
vida unicelular.
1750 Spallanzani aporta evidencias de que los m.o. no surgen espontnea-
mente.
1828 Wohler sintetiza la urea, desmintiendo que los compuestos orgnicos
slo pueden ser sintetizados por organismos vivos.
1837 Cagniar, Schwann y Kutzing proponen, independientemente, que las
levaduras son plantas y causan la fermentacin.
1862 Pasteur postula que todos los procesos fermentativos resultan de activi-
dad microbiana y descubre los m.o. anaerobios.
1876 Tyndall desarrolla el mtodo de esterilizacin discontinua por calenta-
miento.
1883 Koch introduce las tcnicas del cultivo puro, incluyendo la caja de petri,
inventadas por Ricardo Petri.
BREVE CRONOLOGA DE LA BIOTECNOLOGA
1865 Era pre-Pasteur: Bebidas alcohlicas (cerveza, vino); productos lcteos
. (quesos, yogurt); otros alimentos fermentados.
1865 1940 Era Pasteur: Solventes orgnicos (etanol, butanol, acetona, glicerol);
. c. orgnicos (ctrico, actico, lctico); tratamiento aerobio de aguas
. residuales.
1940 1960 Era de los antibiticos: Penicilinas (tecnologa de fermentacin sumergi-
. da); gran variedad de antibiticos; vacunas contra virus, transformaciones
. microbiolgicas de esteroides; tecnologa de la estructura de la clula ani-
. mal.
1960 1975 Era post antibiticos: Aminocidos; protena unicelular (SCP); enzimas
. (detergentes); tecnologa de clulas y enzimas inmovilizadas; tratamiento
. anaerobio de aguas residuales (biogs); polisacridos bacterianos (goma
. xantana); gasohol.
1975 Era de la nueva biotecnologa: Tecnologa de los hibridomas; anticuerpos
. monoclonales; tecnologa del ADN recombinante (ingeniera gentica);
. insulina humana.
Generalidades de los procesos biolgicos
La Ingeniera Bioqumica se ocupa del estudio del
conjunto de operaciones que hacen uso de clulas
(microbianas, vegetales o animales), o de componentes
de dichas clulas (enzimas), para la obtencin de bienes
(productos tiles) o servicios (tratamiento de desechos
contaminantes o aguas residuales) en condiciones
econmicas.
Este conjunto de operaciones constituyen los llamados
Bioprocesos, Procesos Bioqumicos, Procesos Biotecno-
lgicos o Procesos Biolgicos.
Bioprocesos
Procesos Enzimticos: Utilizan enzimas o complejos
enzimticos aislados de las clulas, libres en suspensin
en un medio lquido o inmovilizadas en soportes fsicos.
Son procesos catalticos.
Procesos Fermentativos: Utilizan clulas libres en
suspensin o inmovilizadas en soportes fsicos, tejidos
celulares u rganos, como agentes de la biotransforma-
cin. Son procesos autocatalticos.
Biocatalizador: Clulas, enzimas o complejos enzimti-
cos.
Proceso Enzimtico:
S + E P + E (Proceso Cataltico)
(Sustrato) (Enzima) (Producto) (Enzima)
S E P
(Sustrato) (Enzima) (Producto)
Proceso Fermentativo:
S + X
o
X + P (Proceso Auto-
(Sustratos o (Biomasa o (Biomasa) (Productos o cataltico)
Nutrientes) Inculo) Metabolitos)
Nutrientes:
Fuente de carbono y energa: carbohidratos (glucosa, sacarosa, lac-
tosa, celulosa, almidn, etc.), hidrocarburos, etc.
Fuente de nitrgeno: nitrgeno elemental (N
2
), amoniaco, sales de
amonio, rea, caldo peptonado (hidrolizado de protenas), extracto
de levadura, harinas de soya o pescado, etc.
Micronutrientes: sulfatos (S) y fosfatos (P) de Na, K u otros metales;
precursores, vitaminas, hormonas, etc.
Oxgeno (procesos aerobios): aire, aire enriquecido con O
2
, oxge-
no puro.
Sustrato limitante: nutriente presente en menor proporcin estequio-
mtrica. Normalmente es la fuente de C y energa, aunque en algu-
nos casos puede ser la fuente de N o el O
2
.
Inculo: volumen, Vi, de suspensin de clulas viables, de concen-
tracin adecuada capaz de garantizar, en condiciones econmicas,
la fermentacin de un volumen, V, dado de medio.
Comnmente: Vi = 0.05-0.1 V
Medio de cultivo: solucin, normalmente acuosa, que contiene los
nutrientes necesarios para las clulas.
Medios sintticos o definidos: composicin exactamente definida;
normalmente son medios selectivos (medios de laboratorio).
Medios complejos: composicin no conocida con exactitud (medios
industriales). Ej.: melazas, suero de leche, licor de coccin de maz.
Preparacin de medios
Tipo y cantidad de nutrientes a emplear (formulacin)
Esterilizacin
Ajuste de condiciones ambientales (T, pH, fuerza inica,
homogenizacin, etc.)
Control del proceso: T, pH, agitacin, nivel de espuma,
concentraciones de O
2
y CO
2
.
Fermentacin: conversin de los componentes del me-
dio en biomasa y productos o metabolitos, por la accin
del biocatalizador (clulas o biomasa).
Optimizacin del proceso
Tipo de fermentador
Modo de operacin
Tipo de clulas
Medio de cultivo
Condiciones de operacin ms adecuadas (T, pH, agitacin, etc.)
Control de variables ms importantes
Separacin y purificacin del producto (Down stream processing)
Conjunto de operaciones de separacin y purificacin de la biomasa
o de los metabolitos de inters (centrifugacin, filtracin, disrupcin
celular, intercambio inico, cromatografas, separacin con mem-
branas, destilacin, cristalizacin, precipitacin, extraccin, adsor-
cin, secado, etc.).
Aspectos a estudiar en un bioproceso
Estequiometra
Cintica
Termodinmica
Fenmenos de Transporte
Dinmica y Control
Economa
ESTEQUIOMETRA DE PROCESOS
FERMENTATIVOS
Objetivo
Establecimiento de relaciones cuantitativas entre los distintos
componentes del proceso, a saber:
Sustratos o nutrientes (S)
Biocatalizador, clulas o biomasa (X)
Productos o metabolitos (P)
Aplicaciones
Formulacin de medios de cultivo
Requerimientos de enfriamiento de biorreactores
Control por computador de biorreactores
Enfoques:
Molecular o microscpico: supone el conocimiento del conjunto de
reacciones qumicas que constituyen el metabolismo celular (mode-
los de caja blanca) Ingeniera Metablica.
Diseo de Medios de Cultivo
a. Requerimientos Nutricionales y Ambientales
Necesidades elementales
Necesidades de nutrientes especficos
Requerimientos energticos
Necesidades ambientales del cultivo
b. Objetivos del proceso
Obtencin de productos
Produccin de biomasa (protena unicelular, SCP)
Mantenimiento celular
c. Restricciones tcnico-econmicas
Disponibilidad y costos de las materias primas
Facilidad de recuperacin de productos
Control de contaminacin
Enfoque Macroscpico
No considera los procesos que a nivel molecular ocurren en las clulas
(modelos de caja negra). Se basa en balances elementales de materia,
relaciones estequiomtricas empricas y en el conocimiento de la compo-
sicin elemental de la biomasa.
Caractersticas del enfoque macroscpico
Se deben cumplir los balances de masa y energa.
No se tienen en cuenta los mecanismos o rutas de reacciones que el
sistema emplea.
Es aplicable para propsitos ingenieriles como formulacin de medios y
control de biorreactores.
Se requiere conocer el contenido celular de todos los elementos para los
cuales se deban hacer los clculos (composicin elemental de la biomasa).
El nmero de nutrientes en el medio usualmente es muy grande y no todos
pueden ser incluidos en los clculos.
Algunos nutrientes pueden ser limitantes o algunos productos pueden ser
inhibitorios.
Ecuacin genrica del proceso:
Fuente C + Fuente N + O
2
Clulas + Productos + CO
2
+ H
2
O
C
a
H
b
O
c
+ N
l
O
m
H
n
+ O
2
C

+ C
j
H
v
O
z
+ CO
2
+ H
2
O
Donde:
C
a
H
b
O
c
: frmula genrica para carbohidratos o hidrocarburos.
C

: frmula emprica de la biomasa.

N
l
O
m
H
n
: frmula genrica para la fuente de nitrgeno.
C
j
H
v
O
z
: frmula genrica para el producto extracelular.
Conocida la composicin elemental de la biomasa, es posible
asociarle una frmula emprica.
Composicin elemental de microorganismos
Slo 22 elementos qumicos, son componentes esenciales de los
organismos vivos.
Elementos de la materia orgnica: C, O, H, N, P
Iones monoatmicos: Na
+
, K
+
, Mg
2+
, Ca
2+
, Cl
-
Elementos traza: Mn, Fe, Co, Cu, Zn, B, Al, V, Mo, I, Si
X: Elementos presentes slo en algunas especies.
La composicin elemental de las clulas vara con la especie, el
sustrato limitante, la rata de crecimiento celular, factores ambien-
tales, etc.
Ejemplo: Composicin elemental de la bacteria Escherichia coli.
Ejemplo: Determine la frmula emprica de un microorganismo que tiene la
siguiente composicin porcentual en peso seco:
*10
-3
Frmula emprica: CH
1.936
O
0.295
N
0.251
Ejemplo: Considere la siguiente ecuacin qumica genrica, correspon-
diente al crecimiento celular sin formacin de productos extracelulares
(metabolitos externos):
a CH
x
O
y
+ b O
2
+ c H
l
O
m
N
n
CH

+ d H
2
O + e CO
2
x: Coeficientes estequiomtricos (5 incgnitas)
Establezca las ecuaciones de balance elemental del proceso.
Solucin:
Balance de C: a = 1 + e (Ec. 1)
Balance de H: ax + cl = + 2d (Ec. 2)
Balance de O: ay + 2b + cm = + d + 2e (Ec. 3)
Balance de N: cn = (Ec. 4)
Conocidas las frmulas empricas de las fuentes de carbono y nitrgeno y
de la biomasa, el sistema tendra 4 ecuaciones y 5 incgnitas (los 5 coe-
ficientes estequiomtricos), requiriendo otra ecuacin para su solucin.
La otra ecuacin generalmente es una relacin em-
pricamente obtenida entre algn par de coeficientes es-
tequiomtricos. Estas relaciones se conocen genrica-
mente como Factores de Rendimiento.
Ejercicio: Determine los coeficientes estequiomtricos
del proceso anterior, si la fuente de carbono es el
hexadecano, la fuente de nitrgeno es amoniaco y la
biomasa tiene la frmula emprica CH
1.66
O
0.27
N
0.20
. Se
sabe adems, por determinacin experimental, que el
factor de rendimiento Moles CO
2
formadas/Moles O
2
consumidas, tambin conocido como Cociente
Respiratorio (RQ), es 0.43 moles CO
2
/mol O
2
.
Otros factores de rendimiento ampliamente usados
Y
x/s
: Rendimiento de biomasa a partir del sustrato.
(moles biomasa/mol sustrato, g biomasa/g sustrato).
Y
p/s
: Rendimiento del producto a partir del sustrato.
(moles producto/mol sustrato, g producto/g sustrato).
Y
p/x
: Rendimiento de producto con respecto a la biomasa.
(moles producto/mol biomasa, g producto/g biomasa).
Y
x/o
: Rendimiento de biomasa con respecto al oxgeno.
(moles biomasa/mol oxgeno, g biomasa/g oxgeno).
Y
c/o
: Rendimiento de CO
2
con respecto al oxgeno (RQ).
(moles CO
2
/mol O
2
, g CO
2
/g O
2
).
Rendimiento Global y Rendimiento Instantneo
Y
F/G
= F/G (Rendimiento Global)
F, G: Variaciones en las cantidades de F y G en un intervalo finito de
tiempo.
Para un reactor discontinuo (batch), de volumen constante, en el cual la
reaccin qumica entre F y G es la nica fuente de variacin de sus can-
tidades, podemos definir:
Lim (F/G) = dF/dG = (dF/dt)/(dG/dt) = r
F
/r
G
= Y
F/G
(Rendimiento
G0 Instantneo)
r
F
, r
G
: Ratas volumtricas de reaccin de F y G.
Notas
Por definicin, los factores de rendimiento son siempre positivos.
Y
F/G
Y
FG
Rendimiento Terico y Rendimiento Observado
Rendimiento Terico: Dado por la relacin estequiomtrica existente entre
las sustancias relacionadas en el factor de rendimiento. Representa el
mximo rendimiento posible.
Rendimiento Observado: Dado por la relacin F/G, donde los s son los
cambios medidos u observados en las cantidades de F y G en un intervalo
dado de tiempo.
Ejemplo: Considere el proceso fermentativo de produccin de biomasa
dado por la ecuacin:
S X
X: Variacin medida u observada en la cantidad de biomasa.
S
T
: Variacin total medida u observada en la cantidad de sustrato.
Y
XS
= X/-S
T
(Rendimiento observado de biomasa con respecto al
. sustrato).
En realidad:
S
T
= S
C
+ S
M
S
C
: Sustrato realmente utilizado para crecimiento celular.
S
M
: Sustrato utilizado para mantenimiento celular (movimiento, transporte
. activo de sustancias a travs de membranas, recambio de componentes
. celulares, etc.).
Por tanto:
Y
XS
= X/-S
C
(Rendimiento Verdadero o Terico de biomasa con respecto al
. sustrato).
Como S
C
< S
T
, entonces, Y
XS
> Y
XS
Cuando, adems de la biomasa, hay formacin de productos extracelulares:
S
T
= S
C
+ S
M
+ S
P
Donde:
S
P
: Sustrato consumido para la formacin de productos extracelulares.
Estequiometra del crecimiento celular con formacin de
productos extracelulares
Casos
El producto principal aparece como resultado del metabolismo ener-
gtico primario. Ej.: Produccin de etanol por S. cerevisiae.
El producto es un metabolito secundario. Ej.: Produccin de antibi-
ticos por mohos.
El producto surge del metabolismo energtico. Ej.: Produccin de -
cido ctrico por A. niger.
Slo para procesos de la primera clase se puede expresar la este-
quiometra del proceso por una nica ecuacin qumica que relacio-
na la biomasa acumulada con el sustrato consumido y el producto
formado.
Ecuacin genrica:
aC
w
H
x
O
y
+ bO
2
+ cN
l
O
m
H
n
CH

N

+ dH
2
O + eCO
2
+ fCH
v
O
z
Conocidas las frmulas empricas de las fuentes de car-
bono y nitrgeno, de la biomasa y el producto, se tendr-
an 6 incgnitas (los 6 coeficientes estequiomtricos).
Los balances elementales de C, O, H y N suministraran
4 ecuaciones, faltando dos ecuaciones para poder resol-
ver el sistema.
Las dos ecuaciones faltantes se pueden obtener a partir
de factores de rendimiento, experimentalmente hallados,
o a partir de un balance de electrones.
Otra ecuacin entre los coeficientes estequiomtricos puede obtenerse de
un balance de electrones.
Electrones Disponibles: nmero de electrones disponibles en un com-
puesto para transferir al oxgeno en la oxidacin del compuesto hasta CO
2
,
H
2
O y compuestos que contienen N. Se calcula a partir de la valencia de
los distintos elementos que constituyen el compuesto.
C: 4; H: 1; O: -2; S: 6; P: 5; N: -3 (NH
3
), 0 (N
2
), 5 (NO
3
-
).
Grado de Reduccin (): nmero equivalentes de electrones disponibles en
aquella cantidad del material que contiene 1 at-gr de C.
Ejemplo: Considere el sustrato C
w
H
x
O
y
N
z
. Calcule el nmero de electrones
disponibles y el grado de reduccin.
Solucin
No. de electrones disponibles: 4w + x - 2y 3z
Grado de reduccin (
s
): (4w + x - 2y 3z)/w
Balance de electrones
Los electrones disponibles para transferir al oxgeno son conservados du-
rante el metabolismo. As, para la reaccin qumica genrica de produccin
de biomasa con formacin de producto extracelular:
aC
w
H
x
O
y
+ bO
2
+ cN
l
O
m
H
n
CH

+ dH
2
O + eCO
2
+ fC
j
H
v
O
z
el balance de electrones disponibles, con N
2
como fuente de nitrgeno,
es:
aw
S
4b =
X
+ fj
P
Donde:

S
: Grado de reduccin del sustrato.

X
: Grado de reduccin de la biomasa.

P
: Grado de reduccin del producto.
La ecuacin de balance de electrones anterior, provee otra ecuacin que
relaciona los coeficientes estequiomtricos (incgnitas) la cual, sumada a
las ecuaciones de balance elemental y a los factores de rendimiento cono-
cidos, permitir determinar los coeficientes estequiomtricos.
Demanda terica de oxgeno
El requerimiento de oxgeno de un proceso fermentativo, est directamente
relacionado con los electrones disponibles en el sustrato para transferir al
oxgeno, pudiendo estimarse su demanda terica a partir de un balance de
electrones.
As, para la fermentacin representada por la ecuacin genrica:
C
w
H
x
O
y
+ aO
2
+ bN
l
O
m
H
n
cCH

+ dH
2
O + eCO
2
+ fC
j
H
v
O
z
Balance de electrones: w
S
4a = c
X
+ f j
P
La demanda terica de oxgeno (dada por el coeficiente estequiomtrico a)
ser:
a = (w
S
c
X
f j
P
)/4
De la ecuacin: a = (w
S
c
X
f j
P
)/4
obtenemos: 1 = ( 4a/w
S
) + (c
x
/w
S
) + (f j
P
/w
S
)
Donde:
4a/w
S
: Fraccin de los electrones disponibles del sustrato que salen con el
. oxgeno.
c
x
/w
S
: Fraccin de los electrones disponibles del sustrato que salen con la
. biomasa.
fj
P
/w
S
: Fraccin de los electrones disponibles del sustrato que salen con el
. metabolito extracelular.
En un proceso anaerobio en ausencia de formacin de producto:
c
x
/w
S
= 1
Por tanto:
c = c
max
= w
S
/
x
Donde:
c
max
: Mximo rendimiento terico o termodinmico posible de biomasa.
Adems:
Y
XS
= cM
X
/M
S
Donde:
Y
XS
: Rendimiento de biomasa a partir del sustrato.
M
X
, M
S
: Masas moleculares de la biomasa y del sustrato respectivamente.
Por tanto: Y
xs, max
= w
S
M
X
/
x
M
S
Admitiendo como frmula genrica para la biomasa la frmula emprica:
CH
1.8
O
0.5
N
0.2
, el grado de reduccin de la biomasa (
x
) sera:

x
= 4 + 1.8 + 0.5 (-2) + 0.2 (-3) = 4.2
Anlogamente: f
max
= w
S
/ j
P
f
max
: Lmite superior terico de rendimiento del producto.