Fundamentos y tcnicas de anlisis microbiolgico 2009/10 UD 2

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UD 2: ESTERILIZACIN. DESINFECCIN

En los laboratorios de microbiologa hay que trabajar en un ambiente libre de
microorganismos, hay que impedir la propagacin de microorganismos, hay que evitar la
contaminacin de:
Las muestras que se estn analizando con microorganismos que enmascaren los
resultados.
Los cultivos puros una vez aislado un tipo de microorganismo.
Los materiales, puesto de trabajo y personas con microorganismos patgenos
procedentes de las muestras.

La desinfeccin y esterilizacin son tcnicas destinadas a tal fin.
1. Esterilizacin.
La esterilizacin es el mecanismo con el que se consigue la destruccin de todos los
microorganismos vivos: bacterias, hongos, protistas, virus y sus formas de resistencia. No se
puede usar en personas. No hay que confundir con desinfeccin que si se puede emplear en
personas.

1.1. Tipos de esterilizacin en el laboratorio de microbiologa
En el laboratorio de microbiologa se consideran dos tipos de esterilizacin:
1.1.1. Esterilizacin preparativa
La esterilizacin preparativa es la que se realiza antes o durante el trabajo en el laboratorio su
finalidad es mantener libre de microorganismos el material que vamos a utilizar (placas Petri,
pipetas, medios de cultivo, asas de siembra, hisopos, etc.). En este caso, la eleccin del proceso de
esterilizacin se debe adecuar para preservar las caractersticas de los diversos materiales o medios a
esterilizar, pues algunos pueden ser susceptibles de ser destruidos o alterados, durante los
mecanismos de esterilizacin.
1.1.2. Esterilizacin final
La esterilizacin final se realiza al terminar el trabajo en el laboratorio, su finalidad es destruir
los microorganismos con los que se ha trabajado y descontaminar el material utilizado antes de que
sea desechado. En este caso no es necesario considerar ni el tipo de medio de cultivo, ni la posible
alteracin de materiales, nicamente interesa la muerte de todos los microorganismos antes de
desechar los materiales y o muestras.

1.2. Mtodos de esterilizacin
Los mtodos de esterilizacin son diversos y se pueden clasificar como: mtodos fsicos y
mtodos qumicos.

1.2.1. FSICOS

- Incineracin: consiste en la destruccin por combustin del
material contaminado. Se suelen utilizar contenedores apropiados
de un solo uso que tienen cierre hermtico una vez llenos. En
estos se recolecta el material contaminado (puntas, agujas, gasas,
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etc) y sern posteriormente incinerados con su contenido. Este tipo de esterilizacin slo se
realiza como esterilizacin final.


- Flameado: se realiza poniendo el objeto a esterilizar en
contacto con la llama de un mechero. Este mtodo se usa,
sobre todo, para la esterilizacin de agujas y asas de
siembra, o para la boca de los tubos y matraces, ya estriles
o con cultivos, durante los procedimientos habituales de
manipulacin de microorganismos y medios estriles.











- Horno Pasteur (calor seco). Estos hornos tienen un sistema de resistencias elctricas y
termostatos que una vez alcanzada la
temperatura adecuada la mantiene durante el
tiempo programado. El material se introduce en
el horno debidamente protegidos con papel o
contenedores especiales para evitar la
contaminacin desde que se esteriliza hasta su
utilizacin. Se suele utilizar para esterilizar
material de vidrio, porcelana o metal. Este
sistema es de bajo coste y bastante sencillo, pero
lento.


Material Temperatura (C) Tiempo exposicin (min)
Envuelto 170 60
160 120
150 150
140 180
121 12hrs
Sin envoltorio 190 6


- Radiaciones gamma, se usan poco en el laboratorio, su uso es ms frecuente en la industria
para esterilizar materiales desechables (agujas, pipetas de plstico, etc.)


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- Autoclave (calor hmedo): con el autoclave el agente esterilizante es el vapor de agua. Es el
que ms se utiliza en el laboratorio de microbiologa El funcionamiento de este aparato se
basa en la utilizacin de vapor de agua a presin, por lo que, en la esterilizacin intervienen
dos elementos: la temperatura de ese vapor y la presin del mismo. Como la esterilizacin se
lleva a cabo con vapor, no se produce la desecacin de los productos esterilizados. Por este
motivo, la principal indicacin del uso del autoclave en el laboratorio de microbiologa es la
esterilizacin de los medios de cultivo. Actualmente, los autoclaves controlan
automticamente la temperatura, la presin y el tiempo de exposicin, para esto estn
provistos de un manmetro que permite regular la presin y por lo tanto la temperatura, y un
temporizador que permite ajustar el tiempo de exposicin automticamente. El equipo suele
incluir adems una vlvula de seguridad.

El autoclave se suele utilizar para la esterilizacin de medios de cultivo, soluciones,
material de vidrio, gomas o ciertos tipos de plsticos (policarbonato o polipropileno), acero
inoxidable y tambin material de trabajo como ropas, algodn, gasas, etc. Tambin es un
mecanismo que se utiliza para esterilizacin final de medios de cultivo.

- Tindalizacin (Calor hmedo) consiste en aplicar 80-100C durante 10-30 minutos varios das
consecutivos sin abrir el autoclave y con la llave de purga abiertadurante todo el proceso. Con
este mtodo se consigue eliminar las esporas ya que al germinar se hacen ms vulnerables a
la temperatura. Se suele utilizar cuando existe un problema de contaminacin en algn
material o en el propio autoclave as como para materiales y medios de cultivo
termosensibles, que no pueden someterse a temperaturas superiores a los 100C (se puede
utilizar en medios de cultivo con azcares, gelatina, sueros o huevo que se descomponen a
temperaturas elevadas).

- Filtracin
Con la filtracin los microorganismos no son destruidos sino que son retenidos fsicamente o
adsorbidos por los filtros con un tamao de poro adecuado. El tamao de poro
que se considera en la actualidad esterilizante es el de 0,22 m aunque
ltimamente se tiende a la utilizacin de poros de 0.1 m. Existen de varios
tipos:
Filtros de membrana. Se utilizan para esterilizar soluciones
termolbiles como son antibiticos, vitaminas, medios de
cultivo lquidos que contienen azcares a concentraciones
elevadas que pueden caramelizar, o protenas que pueden
desnaturalizarse por el calor, de tal forma que los
microorganismos quedan retenidos en el filtro, y el lquido
filtrado se encuentra estril.

Filtros HEPA (high-efficiency particulate air). Buena parte de las manipulaciones propias
de la microbiologa deben realizarse en condiciones de esterilidad total para evitar la
contaminacin de los medios o cultivos y la seguridad de los trabajadores, para ello se
usan las cabinas de seguridad biolgica con flujo de aire ( campanas o cmaras de flujo
laminar), se trata de equipos que crean un rea de trabajo libre de partculas
contaminantes, pasando el aire ambiente a travs de filtros y produciendo un flujo
laminar sobre la zona de trabajo que provoca una presin positiva constante que
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previene la infiltracin de aire contaminado y se mantiene as la zona en esterilidad. Los
filtros retienen partculas de hasta 0,3-0,12 m de dimetro y pueden estar montados en
cmaras de flujo laminar de distinto tipos: campanas de flujo vertical donde la corriente
de aire crea una cortina vertical de aire estril que protege a la persona que est y a los
cultivos o medios de contaminacin externa o campanas de flujo horizontal, en ellas la
proteccin es efectiva para los medios, se usa en la manipulacin de microorganismos
que no reporten riesgos para el operador.
Las cmaras suelen estar provistas adems de lmparas UV que mantienen el
interior estril, mientras no se utilizan, o inmediatamente antes de su uso.
Externamente suelen presentar unos indicadores con las horas de utilizacin (para el
control de la vida til del filtro HEPA), luz ultravioleta, luz visible, etc.


1.2.2. QUMICOS:

- xido de etileno: se emplea en forma de gas mezclado con CO
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ya que el xido de etileno
puro presenta problemas de explosin. Se usa en la industria para utensilios u objetos
envasados en plstico. Es necesario un largo periodo de aireacin de los materiales
esterilizados antes de su uso.

- Glutaraldehdo: es un producto lquido que se utiliza diluido y a pH alcalino. En esta solucin
se introduce el material limpio y se deja actuar unas 3 horas. No se usa demasiado.

- Otros, poco o nada usados actualmente.


1.3. Precauciones para la esterilizacin:

1.3.1. Limpieza: Los materiales una vez utilizados deben limpiarse para eliminar los restos de
materia orgnica en los que pudieran sobrevivir microorganismos, despus de la
esterilizacin, haciendo ineficaz el proceso.
-Limpieza manual: enjuagar con agua fra, con el fin de arrastrar los restos orgnicos.
Se lava y se frota con agua caliente, se aclara con agua tambin caliente y se deja
secar.
-Ultrasonido: consiste en introducir los objetos en una cubeta llena de un lquido
apropiado emitindole un sonido que provoca el desprendimiento de los restos
adheridos a los objetos.

1.3.2. Preparacin: Se introduce el material en cestillos, cajas metlicas, bombonas, tubos
de ensayo, etc. Se cierran adecuadamente, no de forma hermtica ya que el vapor o el
gas debe de llegar al material a esterilizar, por ejemplo en caso de frascos con tapn de
rosca no se cierran del todo, esto se har al sacarlos del autoclave, el material de
envoltura debe dejar pasar el vapor o el gas aunque no los microorganismos.

1.3.3. Controles de esterilizacin: Sirven para comprobar la eficacia del sistema empleado y
para darnos la seguridad de que podemos confiar en la asepsia del objeto.
Los controles de esterilizacin pueden ser: fsicos, qumicos y biolgicos.
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Controles fsicos de esterilizacin
Los controles fsicos son los que forman parte del aparato de esterilizacin:
indicadores de temperatura, indicadores de presin, registros grficos de la temperatura
y/o presin durante todo el proceso, etc.

Controles qumicos
Suelen ser compuestos qumicos termosensibles, sensibles a las radiacciones o
al xido de etileno que cambian de color si el proceso de esterilizacin se ha desarrollado
de forma correcta. Ests tiras se adhieren al material a esterilizar de forma que el cambio
de color supone una garanta de la temperatura alcanzada. Se utiliza de forma rutinaria en
los laboratorios de microbiologa.
Tambin pueden ser, aunque es menos frecuente, sustancias cuyo punto de
fusin sea el mismo que la temperatura que se debe alcanzar en el proceso de
esterilizacin. Tienen la desventaja de que no se controla el tiempo que se ha mantenido
esa temperatura.

Controles biolgicos
Los controles biolgicos son bacterias o esporas que se someten al proceso de
esterilizacin. Estas vienen impregnadas en tiras o en suspensin en ampollas cerradas.
Se exponen al proceso de esterilizacin, junto al el material que se va a esterilizar. Una
vez finalizado el proceso, se cultiva el microorganismo en las condiciones habituales en
microbiologa. La ausencia de crecimiento despus de la incubacin en las condiciones
adecuadas significa que el proceso de esterilizacin es correcto. El crecimiento indicara la
no esterilizacin.

Controles del producto esterilizado propiamente dicho
El control del producto esterilizado se realiza para:
Controlar la esterilizacin de medios de cultivo: se cultiva una serie de
muestras aleatorias del lote esterilizado y se observa si hay crecimiento de
microorganismos.
Controlar la eficacia de los filtros. En este caso, se somete una suspensin de
microorganismos patrn o sus formas de resistencia a la accin del filtro,
posteriormente se siembra el lquido filtrado en un medio adecuado al
microorganismo patrn. Si hay crecimiento, el filtro no ha funcionado como
mecanismo de esterilizacin.


1.3.4. Validacin en los procesos de esterilizacin
La validacin de calidad en los procesos de esterilizacin, sigue una normativa
publicada y consensuada en las normas ISO (International Organization for
Standardization) que est especficamente creada para productos utilizados en salud, y
material mdico, aunque realmente muchos de ellos sirven para cualquier proceso de
esterilizacin.
En estas normativas se detallan los procesos y mecanismos adecuados y
consensuados de calidad en la utilizacin de esterilizacin, y que deben seguir todos
aquellos laboratorios de microbiologa que pretendan obtener una certificacin de
calidad.
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2. Desinfeccin:
La desinfeccin es el mecanismo por el que se destruyen los microorganismos que causan
enfermedad o efectos nocivos sobre productos como alimentos, cosmticos, etc. Con la desinfeccin
pueden que incluso los microorganismos patgenos no sean totalmente eliminados pero al menos se
reduce su nmero, crecimiento y actividad.
La antisepsia es el mecanismo, aplicado en piel, mucosas u otros tejidos vivos, por el que se
destruyen los microorganismos que causan enfermedad

2.1. Mtodos de desinfeccin

2.1.1. Mtodos FSICOS de desinfeccin
Hervido o ebullicin: consiste en sumergir en agua hirviendo los objetos que se quieran
desinfectar, al menos durante 20 minutos. Con este mtodo se consigue destruir la mayor
parte de los grmenes patgenos pero no todos.
Radiacin ultravioleta: tipo de radiaciones con poder germicida. Se utiliza mediante
lmparas ultravioleta. Se usan en cabinas de flujo laminar, vitrinas, quirfanos, salas de
infecciosos, industria alimentaria, etc.



2.1.2. Mtodos QUMICOS de desinfeccin:
Estos mtodos consisten en la utilizacin de compuestos qumicos con poder germicida que
se aplican sobre objetos, o en la superficie corporal; las sustancias qumicas destinadas a la
desinfeccin de objetos se denominan desinfectantes, y las destinadas a la desinfeccin de la
superficie corporal se denominan antispticos.


2.1.2.1. Caractersticas que debe reunir los desinfectantes y los antispticos :
- Alto poder germicida (eficaz a diluciones altas y en presencia de materia orgnica)
- Amplio espectro.
- No ser txico para las personas, ni animales
- No corrosivo para materiales.
- Soluble en agua.
- Facilidad de aplicacin.
Norma Protocolo Esterilizacin
ISO 17665-1:2006 Calor (Hmedo)
ISO/TS 17665-2:2009 Calor (Hmedo)
ISO 25424:2009 Esterilizacin con vapor a baja temperatura y formaldehdo.
ISO 11137:2006 Radiaccin
ISO 11135:2007 xido de etileno
ISO/TS 11135-2:2008 xido de etileno
ISO 14161:2009 Indicadores Biolgicos
ISO 11138:2006 Indicadores Biolgicos
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- Estable como compuesto qumico.
- Inodoro o de olor agradable.
- Econmico.

2.1.2.2. Formas de aplicar los desinfectantes:
- Locin: el desinfectante se utiliza en esponjas o bayetas empapadas con la solucin
desinfectante frotando el suelo, paredes, objetos, piel, etc.
- Inmersin: accin de sumergir los objetos en solucin desinfectantes mantenindolas
en ellas durante un tiempo determinado.
- Pulverizacin: produccin de gotitas pequeas mediante aparatos que contienen el
desinfectante. Actan sobre la superficie de forma uniforme.
- Aerosoles y brumas (o micronieblas): la produccin de una finsima niebla que flota
en el aire mediante microdifusores que contengan el desinfectante.


2.1.2.3. Desinfectantes y antispticos:
Derivados del cloro: leja, etc. Se usan como desinfectantes de superficies y objetos.
Alcoholes: etanol (alcohol de 70) e isopropanol: para la antisepsia de las manos y otras zonas
del cuerpo.
Detergentes inicos: jabones con poder germicida que limpian y desengrasan, se utilizan
como antispticos en piel y heridas, y como desinfectante sobre material mdico quirrgico.
Biguanidinas (clorhexidina). Se usa como antisptico en piel y mucosas.
Metales pesados (Ag2+, Zn2+, Cu2+), como desinfectante de heridas.
Derivados del yodo (povidona yodada): se usan como antispticos. Tienen la ventaja que
mantienen parcialmente su accin antisptica en presencia de pus, sangre, exudados, etc.
Agua oxigenada: se usa como antisptico para heridas, siempre y cuando antes se haya
lavado la herida con agua.