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Capítulo 1. Micotoxicologia

Sumário

Neste capítulo visa-se fazer uma introdução ao estado actual de conhecimento na área da micotoxicologia, e introduzir conceitos e definições que são usados no decorrer da dissertação.

1. O que são micotoxinas

12

2. Produção de micotoxinas e sua presença em alimentos

30

3. Fungos produtores de micotoxinas

38

4. Detecção, quantificação e identificação de fungos filamentosos em comodidades agrícolas e alimentos

55

5. Métodos de determinação de micotoxinas

59

1. O que são micotoxinas

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

Os fungos são capazes de produzir em condições naturais e laboratoriais, metabolitos secundários tóxicos. Os metabolitos secundários são compostos biossintetizados e excretados através de um conjunto de vias metabólicas (que constituem o metabolismo secundário), mas que não são essenciais para o crescimento e sobrevivência do organismo (Betina, 1989). Estes compostos estão presentes no meio de cultura ou substrato onde os fungos estão a crescer. Alguns metabolitos secundários fúngicos têm propriedades antibióticas, e alguns demonstram toxicidade para animais. Os metabolitos secundários produzidos por fungos filamentosos que demonstram propriedades tóxicas em animais são designados genericamente de micotoxinas (CAST, 2003). Algumas destas micotoxinas foram detectadas em alimentos, e é destes que se ocupa a dissertação. Como tal, o termo micotoxina ao longo da dissertação é usado com o sentido de “metabolitos secundários produzidos por fungos que ocorrem naturalmente como contaminantes de produtos agrícolas, e que demonstram toxicidade quando administrados por uma via natural, essencialmente por via oral” (Abramson, 1998). As micotoxinas são um grupo diverso de substâncias químicas, que podem afectar muitos órgãos e sistemas, principalmente o fígado, rins e sistema nervoso, endócrino e imunitário. Não se sabe quantas micotoxinas e metabolitos fungicos tóxicos existem ao certo, apesar de ser possível fazer uma estimativa. Turner (1978) catalogou aproximadamente 1200 metabolitos secundários produzidos por fungos. Turner e Alderidge (1983) catalogaram mais 2000 metabolitos produzidos por aproximadamente 1100 espécies, o que, em média, dá dois metabolitos únicos por espécie. Hawksworth (1991) estimou que existem cerca de 69000 espécies fúngicas conhecidas, o que representa 5% das espécies fúngicas que se estima que existam no mundo, isto é, 1,5 milhões. Se assumirmos que existem dois metabolitos únicos por espécie, podem existir cerca de 3 milhões de metabolitos secundários produzidos por fungos. Aproximadamente 10% dos metabolitos secundários descritos por Turner e por Turner e Alderidge foram classificados como sendo tóxicos por Cole e Cox (1981). Estes investigadores listaram aproximadamente 300 compostos tóxicos, mas estima-se que possam existir entre 20000 a 300000, bem como uma grande diversidade de mecanismos de acção (CAST, 2003). Como tal, o número de metabolitos tóxicos e micotoxinas por descobrir é muito grande. No entanto, o número de micotoxinas que são detectadas com frequência em alimentos é reduzido, entre 20 a 30 (V. secção 1.3, Tabela 1.2, p. 23).

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

A principal via de exposição dos animais a micotoxinas é através da ingestão de alimentos contaminados, apesar de existirem casos esporádicos de inalação de micotoxinas e contacto dermal. As culturas agrícolas, especialmente os cereais, são susceptíveis ao ataque de fungos, no campo ou durante o armazenamento. Os níveis de micotoxinas nos alimentos podem flutuar grandemente e variar de ano para ano, consoante as condições para o crescimento de fungos. Quando presentes em níveis elevados na dieta alimentar, podem levar a problemas agudos de saúde e até à morte. A exposição prolongada a níveis baixos de micotoxinas pode levar a manifestações ocultas e insidiosas (imunidade debilitada, atrasos no crescimento, susceptibilidade a doenças), e a problemas crónicos de saúde, o que suscitou preocupação por parte de diversas organizações internacionais. Várias micotoxinas foram classificadas pela Agência Internacional para a Investigação em Cancro (IARC) como carcinogénicos humanos ou potenciais carcinogénicos humanos (IARC, 1993). Em termos de exposição e severidade de lesões crónicas, em particular cancro, estima-se que as micotoxinas apresentem um risco maior que os contaminantes antropogénicos, pesticidas e aditivos (Tabela 1.1).

Tabela 1.1. Avaliação comparativa do risco (agudo e crónico) de diversos contaminantes alimentares (adaptado

de Kuiper-Goodman, 1998)

Agudo

Crónico

Microbiológicos Ficotoxinas Algumas fitotoxinas Micotoxinas Contaminantes antropogénicos Aditivos alimentares Resíduos de pesticidas

Elevado Micotoxinas Contaminantes antropogénicos Algumas fitotoxinas Dietas desiquilibradas Ficotoxinas Microbiológicos Aditivos alimentares Resíduos de pesticidas

Baixo

Apesar de haver variações geográficas e climáticas na produção e ocorrência de micotoxinas, a exposição a estas substâncias ocorre em todo o mundo e estima-se que muitos dos alimentos mundiais estejam contaminados em alguma extensão. A contaminação dos alimentos com micotoxinas é especialmente relevante quando uma dada população baseia a sua alimentação num tipo de produto (v.g., arroz). Se essa fonte está contaminada, a população está continuamente exposta à micotoxina, e a história mostrou que essa situação pode levar ao aparecimento de micotoxicoses graves.

1.1. Perspectiva histórica

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

Foi no final do século XIX e início do século XX que o conceito de metabolismo secundário nos fungos e outros organismos ganhou aceitação. Simultaneamente, o conceito de antibiose atraía cada vez mais as atenções dos cientistas. A descoberta mais relevante para a humanidade sobre a importância dos metabolitos

secundários produzidos por fungos deu-se por Alexander Fleming em 1928-1929, ao descobrir as potencialidades antibióticas da penicilina (Fleming, 1929). A relevância da descoberta foi devida ao facto de Fleming ter verificado que a penicilina era uma substância bactericida e bacteriolítica, que não apresentava toxicidade para animais mesmo quando em doses elevadas. Foi esta característica que permitiu que mais tarde, Howard Florey e Ernst Chain explorassem o uso da penicilina como agente terapêutico na cura contra doenças bacterianas (Chain et al., 1940), dotando a medicina duma arma importantíssima na cura destas doenças, salvando incontáveis vidas desde a segunda guerra mundial até hoje.

A capacidade de certos fungos causarem doença por ingestão de alimentos contaminados

já era reconhecida desde a antiguidade. A micotoxicose mais antiga de que se tem conhecimento é o ergotismo, doença devida à ingestão de produtos elaborados a partir de cereais contaminados com esclerócios do fungo Claviceps purpurea. Vários surtos da doença ocorreram na Europa durante a Idade Média. Os esclerócios são estruturas de resistência visíveis nas espigas. A contaminação do centeio por este fungo era tão comum que estava inclusive representado nas ilustrações da espécie de centeio. As micotoxinas de Claviceps purpurea produzem uma sensação de fogo nas extremidades do corpo (mãos e pés) e alucinações, podendo levar à morte. Numa época de misticismo e religiosidade, estes

fenómenos eram interpretados como bruxaria, conduzindo à morte na fogueira de pessoas apontadas como bruxas. Na Europa, a ligação da doença aos esclerócios do fungo só foi estabelecida no século XVII por Thuillier, mas a descoberta de que a estrutura esclerocial observada pertencia a um fungo, Claviceps purpurea, só foi descoberta por Tulasne cerca de 200 anos depois (Frade & Alfonso, 2003). No entanto, os Assírios designavam o ergot de “grão louco”, o que indica que já teriam conhecimento dos seus efeitos na antiguidade.

O facto de que a ingestão de cereais contaminados com fungos podia levar a doenças foi

também reconhecido na Rússia e na Ásia. Na Rússia, desde o início do século XIX que se tem conhecimento duma doença devida à ingestão de cereais que foram deixados nos campos após

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

o Inverno, a Aleukia Tóxica Alimentar (ATA). Os grãos colhidos na primavera eram tóxicos, ao contrário dos colhidos no Outono. Mas a história conturbada de guerras da Rússia nem sempre permitiu a existência de mão-de-obra para a colheita dos campos, o que se veio a verificar mais uma vez na segunda guerra mundial e nos anos que a seguiram. Entre 1942- 1947, verificaram-se violentos surtos de ATA, levando à morte milhares de pessoas. No Japão, uma doença afligia os consumidores de arroz contaminado com fungos, conhecida desde o século XIX: o beri-beri cardíaco. Sakaki conduziu estudos pioneiros em 1891 e estabeleceu a etiologia da doença. Ao administrar arroz com bolor a coelhos, verificou que este tinha efeitos neurotóxicos. O problema continuou a ser investigado nos anos seguintes, e culminou na descoberta da presença de fungos tóxicos no arroz, Penicillium citreonigrum. O metabolito tóxico responsável pela doença foi isolado em 1947 por Hirata (Subramanian, 1983). Poucos esforços foram feitos antes dos anos 60 do século XX para reunir a informação dispersa sobre os registos de envenenamento em animais e humanos por fungos. Em 1933, Steyn faz uma introdução ao tema da implicação dos fungos na saúde humana e animal, através de experiências dos efeitos da ingestão de alimentos contaminados com bolores em animais. Em 1954, o russo Sarkisov faz uma revisão sobre as micotoxicoses na USSR, descrevendo as toxicoses e os fungos causadores, entre as quais faz várias referências à ATA (Ainsworth & Austwick, 1959). Mas o termo micotoxicose, donde deriva o termo micotoxina, foi popularizado por Forgacs e Carll (1955), sendo sinónimo de doença causada por toxinas produzidas por fungos. A associação da doença com o alimento contaminado era feita através da administração de doses orais conhecidas do alimento suspeito a animais, bem como testes dermatológicos usando extractos. Adicionalmente, era necessário isolar e identificar os bolores presentes no alimento e testar individualmente cada espécie por administração oral e testes dermatológicos usando extractos do micélio em cultura pura e no substracto em que o fungo foi detectado. Os investigadores verificaram que existiam estirpes toxigénicas e estirpes atoxigénicas. Mas salvo raras excepções, as toxinas envolvidas não foram quimicamente identificadas. Foi no início dos anos 60, com a doença X dos perús, que se atraíu a atenção para as micotoxinas e as suas implicações na saúde humana e animal, impulsionando verdadeiramente a micotoxicologia. A doença X dos perús vitimou milhares de perús na Inglaterra, e foi assim designada pois a causa da morte dos animais era desconhecida. Esforços de investigação mostraram que a morte se deveu à ingestão de rações contaminadas com um metabolito tóxico produzido por um fungo, Aspergillus flavus. O composto químico

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tóxico foi isolado e identificado: aflatoxina. Os trabalhos e a literatura científica sobre a ocorrência, toxicologia e produção de micotoxinas a partir desta data têm vindo a aumentar (Figura 1.1). Estudos subsequentes permitiram verificar que várias doenças humanas eram devidas à ingestão de micotoxinas, ou em que micotoxinas estavam aparentemente implicadas (CAST, 2003). Permitiram também identificar os metabolitos tóxicos envolvidos em micotoxicoses previamente descritas, como a ATA, cujos principais efeitos foram devidos a tricotecenos (em particular, toxina T2).

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 1956 1960 1965 1970 1975 1980
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2000
actual
Artigos científicos publicados

PatulinaToxinas de Fusarium Ocratoxinas Aflatoxinas

Toxinas dePatulina Fusarium Ocratoxinas Aflatoxinas

Fusarium

OcratoxinasPatulina Toxinas de Fusarium Aflatoxinas

AflatoxinasPatulina Toxinas de Fusarium Ocratoxinas

Figura 1.1. Número de artigos publicados entre 1956 até finais de 2004 em períodos de 4 anos sobre as micotoxinas mais investigadas devolvidos pelo motor de busca Scirus 1 : aflatoxinas, ocratoxinas, patulina e toxinas de Fusarium (deoxinivalenol, fumonisinas, zearalenona e toxina T-2)

A preocupação com a presença de micotoxinas em alimentos e suas implicações na saúde aumentou à medida que se foram descobrindo novas micotoxinas e se reunem dados sobre a sua ocorrência natural em alimentos e sobre a sua toxicidade em animais. Além dos casos de intoxicações agudas, começou-se a pensar em possíveis efeitos crónicos derivados da sua ingestão. Mas o estabelecimento da etiologia de doenças humanas com micotoxinas provou não ser tarefa fácil. Exemplo disso foi a tentativa de estabelecimento da ocratoxina A (OTA) como

1 URL: http://www.scirus.com (acedido em 12/12/2004)

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

causa etiológica da Nefropatia Endémica dos Balcãs (BEN), uma doença crónica renal de longa latência.

A OTA foi uma das primeiras micotoxinas a ser descoberta após as aflatoxinas. Foi

isolada e identificada a partir duma cultura de Aspergillus ochraceus por van der Merwe

(1965). Os principais efeitos tóxicos observados foram danos no fígado e nos rins. Em 1973, a presença de OTA e de outra micotoxina, a citrinina, foi associada com a nefropatía suína (Krogh et al. 1973). Estudos subsequentes parecem apoiar esta suposição, e ligam a OTA à etiologia da micotoxicose suína mais fortemente, quando se observa que é possível induzir a doença experimentalmente por administração de rações contaminadas com a micotoxina a porcos e outros animais (Krogh, et al., 1974; 1976). Adicionalmente, a presença de OTA foi detectada a ocorrer naturalmente em cereais e em rins de animais com nefropatia, aparentemente confirmando a OTA como substância causadora da doença (Krogh, 1977).

A micotoxina foi implicada numa nefropatia humana de etiologia desconhecida, cujos

sintomas e lesões renais observados eram semelhantes à nefropatia suína, a BEN (Elling & Krogh, 1977). A associação da micotoxina à doença foi feita devido à semelhança da patologia e ao facto de se terem encontrado níveis de OTA mais elevados nos alimentos de habitantes na área onde a doença era endémica comparativamente aos locais onde a doença era ausente (Pavlovic et al., 1979). Rastreios ao sangue de pessoas de áreas afectadas e não afectadas pareciam indicar que a OTA era mais frequentemente detectada e regra geral, em níveis mais elevados, no sangue de pacientes afectados (Petkova-Bocharova et al., 1988). Mas os resultados eram contraditórios entre investigadores, e a ligação entre as toxinas fúngicas e a BEN puramente circunstancial e inconclusiva. Mais de 20 anos depois da suposição de que a OTA poderia estar envolvida na etiologia da BEN, a etiologia da doença continuava desconhecida (Bozic et al., 1995; Tatu et al., 1998). A doença foi associada a tumores nos rins e uretra, verificando-se que o problema da BEN era não só renal, mas também oncológico.

Apesar de parecer evidente que a doença era causada por factores ambientais, outras possíveis causas para a doença foram investigadas, em particular a presença de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos na água, bem como outros compostos tóxicos derivados de minas de carvão, como as lenhites do Plioceno (Orem et al., 1999). Esta última hipótese parecia muito promissora, visto que se conseguiu estabelecer uma forte ligação entre a distribuição geográfica da BEN e a presença de compostos aromáticos tóxicos na água de poços. No entanto, a controvérsia ainda parece estar longe de terminar. Poucos anos depois, foi publicado um estudo em que se também se detectou uma associação entre a incidência de OTA em cereais e a distribuição geográfica da BEN (Puntaric et al., 2001). Para uma revisão

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

recente da problemática da BEN e micotoxinas, deve consultar-se a publicação de Pfohl- Leszkowicz e colaboradores (2002). O facto de não se conseguir estabelecer com frequência uma relação directa entre a ingestão de micotoxinas de reconhecidos efeitos tóxicos quando testadas em animais e entre doenças de ocorrência natural valeu-lhes a designação de venenos insidiosos. O número crescente de micotoxinas detectadas em alimentos levanta questões de saúde pública de resposta difícil, como quais as micotoxinas importantes para a saúde e em que doses. A co- ocorrência de micotoxinas suscita preocupação, mas ainda se sabe pouco sobre potenciais efeitos sinergísticos ou antagónicos com outras substâncias. A determinação das doses máximas de micotoxinas que se podem ingerir sem causar riscos para a saúde são difíceis de determinar, mas a avaliação do risco das micotoxinas para a saúde é necessário para a protecção do consumidor e para o estabelecimento de limites legais quanto à presença destes contaminantes nos alimentos.

1.2. Avaliação de risco das micotoxinas para a saúde

A avaliação de risco apresentada nesta dissertação está de acordo com o quadro de análise de risco proposto pela FAO/OMS (1995) (Figura 1.2). Segundo este quadro conceptual, a análise de risco é composta por 3 partes: avaliação de risco, gestão de risco e comunicação de risco. Cada uma destas grandes esferas de influência sobrepõe-se com as outras. Esta abordagem considera tanto factores de risco baseados em princípios científicos como de não risco, de cariz socio-económico englobados na gestão do risco, ou de comparação de risco englobados na comunicação do risco, para conseguir soluções práticas, como directivas quanto aos limites máximos admissíveis de contaminantes em alimentos e/ou procedimentos que visem prevenir o problema.

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

Avaliação de risco Avaliação de risco Gestão de risco Gestão de risco •Identificação do perigo
Avaliação de risco
Avaliação de risco
Gestão de risco
Gestão de risco
•Identificação do perigo
•Identificação do perigo
•Riscos aceitáveis
•Riscos aceitáveis
•Caracterização do perigo
•Caracterização do perigo
•Prevenção
•Prevenção
•Avaliação da exposição
•Avaliação da exposição
•Opções
•Opções
•Caracterização de risco
•Caracterização de risco
•Custo/Benefício
•Custo/Benefício
•Legislação
•Legislação
Comunicação de risco
Comunicação de risco
•Comparação
•Comparação
•Interacção
•Interacção
•Estabelecimento de prioridades
•Estabelecimento de prioridades
•Educação
•Educação

Figura 1.2. Quadro conceptual de análise de risco da FAO/OMS (1995)

Idealmente, a avaliação do risco duma micotoxina para as populações requer um levantamento toxicológico completo, um estudo epidemiológico, um estudo de exposição da população ao composto e a caracterização do risco. Há dois conceitos a ter em conta na avaliação de risco: perigo e risco. Por perigo entende-se a propriedade intrínseca da micotoxina que causa efeitos adversos na saúde sob dadas condições. Esta definição implica que, com algum grau de certeza, em condições semelhantes o agente causa efeitos adversos semelhantes na saúde. O risco é definido como a probabilidade estimada de um efeito adverso na saúde, ponderado pela sua severidade, ocorra em humanos como resultado da exposição à micotoxina na alimentação.

Identificação do perigo. As micotoxinas têm um vasto espectro de efeitos toxicológicos, e afectam diversos processos celulares. Esta diversidade de efeitos biológicos requer uma avaliação caso a caso e pode requerer uma variedade de técnicas de extrapolação (V. caracterização do risco). A vasta ocorrência de micotoxinas fez delas causa de micotoxicoses humanas e animais e, como tal, o estabelecimento de risco usa informação de estudos epidemiológicos de humanos expostos. Muitas micotoxinas têm propriedades carcinogéneas que afectam vários órgãos, bem como outras actividades tóxicas (v.g. demonstram actividade teratogénica, imunossupressora, neurotóxica) ou hormonais (caso da zearalenona). Além destas acções específicas, foram observados perturbações gastrointestinais, irritações de pele e efeitos hematológicos. São

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estes estudos que determinam empiricamente o “nível de efeito adverso não observado” (NOAEL), que pode ser visto como o limiar. No entanto, há processos para os quais se considera que não há limiar, como para as propriedades iniciadoras e promotoras de carcinogénese e progressão de tumores.

Caracterização do perigo. A caracterização do perigo é a fase de extrapolação do estabelecimento de risco. Tem por objectivo fazer uma caracterização preditiva do perigo para humanos, baseado em estudos animais (extrapolação a espécies) sob condições de baixa exposição (extrapolação de doses altas a baixas). O resultado final da caracterização de risco é a estimativa duma dose segura, como a ingestão diária tolerável provisória (PTDI). O termo tolerável implica a noção de que as micotoxinas não são necessárias para o nosso organismo. As doses diárias toleráveis (TDI) só são determinadas quando é provável que haja um limiar na relação dose/efeito, baseado no mecanismo e modo de acção. Para obter uma TDI para humanos, é prática comum dividir-se o NOAEL por um factor de segurança de 100, quando se extrapola para humanos e animais. Isto toma em consideração um factor 10 para diferenças entre espécies e outro factor 10 para variação intraespecífica (neste caso, intra-humano). Quando há efeitos irreversíveis para os quais estão estabelecidos limiares (caso dos carcinogénicos não genotóxicos) ou quando há dados insuficientes, podem ser adicionados factores de incerteza. Para os carcinogénicos genotóxicos ou agentes genotóxicos (patulina), como se considera que não há limiar, uma TDI não pode ser determinada. Quando a sua presença não pode ser evitada, podem-se estabelecer através de extrapolação de efeitos por modelos matemáticos doses em que se considera que o risco é negligenciável. Alternativamente, as estimativas de uma “dose segura” podem resultar de estudos epidemiológicos apropriados, sempre que estejam disponíveis. Apesar de ser difícil de determinar, a TDI pode ser vista como uma propriedade intrínseca duma dada micotoxina, que toma em consideração tanto a potência dos efeitos medidos como factores biológicos, tendo em conta a severidade, relevância e significância dos efeitos para humanos.

Avaliação da exposição. A exposição às micotoxinas depende do nível destas substâncias nos diferentes alimentos e da ingestão desses alimentos pela população. Podem existir grandes diferenças nacionais e regionais quanto à ingestão dos alimentos, devido a hábitos alimentares diferentes, o que faz com que as avaliações de exposição sejam específicas para cada país. Os rastreios aos alimentos são feitos ao longo de vários anos, para reunir dados sobre os níveis de contaminação a que as populações estão expostas. Podem-se refinar as estimativas com outros

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factores, como processamento dos alimentos tanto pela indústria como em casa. A exposição varia com a idade, com as crianças, regra geral, mais expostas a certos alimentos como o leite. Estudos da exposição podem ser conduzidos avaliando os níveis de micotoxinas presentes no sangue ou outros fluidos da população.

Caracterização do risco. A caracterização do risco é a estimativa qualitativa ou quantitativa, incluindo a incerteza, da gravidade e ocorrência provável de potenciais efeitos adversos de saúde conhecidos numa população exposta. Baseia-se na identificação e caracterização do perigo e avaliação da exposição. A caracterização do risco permite o estabelecer de níveis de exposição diários à micotoxina em que o risco seja insignificante durante o tempo de vida. Como tal, a exposição tem de ser mais baixa que a TDI ou outra medida de dose segura. Para substâncias em que não pode ser determinada a TDI, a margem de segurança entre exposição humana e efeitos adversos observados em espécies animais pode ser usado como um indicador da possibilidade de ocorrerem efeitos nefastos em humanos, e pode ser usado desta forma no estabelecimento de risco. Além de considerar a população normal, a caracterização de risco precisa de considerar aqueles grupos que são mais vulneráveis à exposição, como crianças (devido ao seu baixo peso corporal) ou outros grupos para os quais haja diferenças na bio-disponibilidade, metabolismo ou disposição genética, como os mais idosos. A este respeito, tem de se examinar se um factor de 10 é adequado para englobar estas diferenças na susceptibilidade humana devido à variabilidade humana.

1.3. Micotoxinas frequentemente detectadas

As micotoxinas mais frequentemente detectadas em alimentos bem como os seus efeitos tóxicos em animais estão indicados na Tabela 1.2. Dada a relevância da OTA para esta dissertação, fez-se uma revisão das matrizes alimentares em que foi detectada a micotoxina até ao momento da escrita desta dissertação (Tabela 1.3). Das micotoxinas listadas, as únicas para as quais existem dados suficientes que permitiram realizar a avaliação de risco pela JECFA (V. secção 1.4.1, p. 22) são as aflatoxinas, deoxinivalenol (DON), OTA, zearalenona, fumonisinas, toxina T-2 e patulina. Actualmente, as micotoxinas consideradas mais relevantes para a saúde são todas as mencionadas com a excepção da patulina, que não suscita demasiadas preocupações, devido à sua ocorrência limitada, principalmente em sumos e

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outros derivados de maçã, e à existência de medidas efectivas de controlo e legislação da micotoxina nos produtos mencionados. Outras micotoxinas, devido à sua frequente ocorrência em alimentos, co-ocorrência com micotoxinas relevantes, ou que se pensa que podem ter envolvimento em micotoxicoses ocasionais (v.g. ácido ciclopiazónico, esterigmatocistina, citrinina, micotoxinas tremorgénicas, penitrininas, citrioviridinas, ácido penicílico, toxinas de Alternaria) suscitam alguma preocupação, mas não há dados suficientes para se estabelecer o risco real destas micotoxinas para a saúde.

1.4. Controlo de micotoxinas

O reconhecimento dos potenciais perigos causados por micotoxinas em alimentos põe em cena estudos científicos e mecanismos legais, para assegurar a segurança da fonte alimentar. A necessidade de legislação que imponha limites quanto à concentração de micotoxinas nos alimentos para protecção da saúde dos consumidores é aceite por todo o mundo industrializado. Governos nacionais e organizações internacionais desempenham um papel fundamental em assegurar que os direitos dos cidadãos são defendidos.

1.4.1. Acções das organizações internacionais

Moy (1998) reviu os esforços internacionais para avaliar e reduzir os riscos humanos por consumo de micotoxinas. Em 1963, a FAO e WHO estabeleceram a Comissão Codex Alimentarius, um organismo intergovernamental cujo propósito é proteger a saúde dos consumidores e assegurar boas práticas no mercado alimentar. O Codex é composto actualmente por mais de 150 países membros, e tem desenvolvido directivas e outras recomendações cujo propósito é facilitar o comércio internacional de alimentos. Com o estabelecimento da Organização Mundial de Comércio (OMC) em 1995, os textos adoptados pelo Codex são vistos como representativos do consenso internacional quanto aos requisitos de saúde e segurança dos alimentos. Os textos adoptados pelo Codex permanecem voluntários até serem aceites ou usados pelos países, mas os acordos implementados pela OMC providenciam uma forma para a adopção colectiva de normas, directivas e recomendações do Codex por todos os países membros da OMC.

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

Tabela 1.2. Alimentos destinados à alimentação humana em que foram detectadas micotoxinas e seus efeitos

tóxicos (adaptado de CAST, 2003)

Micotoxina

Ocorrência em alimentos

Efeitos patológicos causados pela micotoxina

Aflatoxinas (B1, B2, G1, G2)

Amendoins, milho, trigo, arroz, algodão, copra, nozes, leite, ovos, queijo, figos, alimentos variados

Hepatoxidade Hiperplasia dos ductos biliares Hemorragia renal e do tracto intestinal Carcinogénese (tumores no fígado)

Aflatoxina M1

Leite

Semelhante a aflatoxina B1

Citrinina

Trigo, cevada, milho e arroz

Nefrotoxicidade (necrose tubular do rim) Nefropatia porcina

Ácido

Milho, amendoins, queijo

Necrose muscular Hemorragia intestinal e edema Lesões orais

ciclopiazónico

OTA

Cereais (trigo, cevada, aveia e milho), feijões desidratados, amendoins com bolor, queijo, tecidos porcinos, café, passas, uvas, frutos secos, vinho

Nefrotoxicidade (necrose tubular do rim) Nefropatia porcina Danos no fígado Enterite Teratogénese Carcinogénese (tumores renais e tumores do tracto urinário) Imunosupressora

Patulina

Maçãs podres, sumo de maçã

Edema cerebral e pulmões Hemorragia pulmunar Danos nos capilares do fígado, baço e rins Paralisia dos nervos motores Convulsões Carcinogénese (não confirmada) Antibiótico

Ácido penicílico

Milho armazenado, cereais, feijões desidratados, tabaco com bolor

Danos no fígado (fígado gordo, necrose celular) Danos renais Acção tipo Digitalis no coração Dilatação dos vasos sanguíneos Antidiurético Edema em pele de coelho Carcinogénese Antibiótico

Penitrininas

Queijo em creme com bolor, nozes inglesas, hamburger, cerveja

Tremores, morte, descoordenação, diarreia com sangue

Esterigmatocistina

Café verde, trigo com bolor, queijos duros, ervilhas, algodão

Carcinogénese

hepatoxicidade

Tricotecenos (toxina

T-2,

diacetoxiscirpenol, neosolaniol, nivalenol, diacetilnivalenol, DON, toxina HT-2, fusarenona X)

Milho, trigo, cevada, aveia Perturbações digestivas (emesia, diarreia, recusa de alimentos) Hemorragias (estômago, coração, intestinos, pulmões, bexiga e rins) Edema Lesões orais Dermatite Desordens sanguíneas (leucopenia)

Zearalenona

Milho

Efeitos estrogénicos (edema da vulva, prolapse da vagina, alargamento do útero) Atrofia dos testículos, atrofia dos ovários, aumento das glândulas mamárias Aborto

Fumonisinas

Milho e derivados, chá preto

Leucoencefalomalacia e edema pulmonar Carcinogénese (cancro do esófago)

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

Tabela 1.2. Alimentos destinados à alimentação humana em que foram detectadas micotoxinas e seus efeitos

tóxicos (adaptado de CAST, 2003) (continuação)

Micotoxina

Ocorrência em alimentos

Efeitos patológicos causados pela micotoxina

Alcalóides do ergot (clavinas, ácidos lisérgicos, amidas de ácido lisérgico, ergopeptinas)

Cereais

(trigo,

centeio),

milho

Ergotismo (sindrome nervoso e gangrenal)

miúdo

Ácido tenuazónico

Tomates, frutos podres

 

Nefrotóxico

 

Hepatóxico

hemorrágico

Tabela 1.2. Revisão dos alimentos onde foi detectada a presença de OTA desde 2000 até ao momento da escrita

da dissertação

 
 

Produto alimentar

Referência

Alcaçuz

Majerus et al., 2000

Azeite

Miraglia & Brera, 2002; Papachristou & Markaki,

 

2004

 

Cacau, Chocolate

Miraglia & Brera, 2002; Bonvehi, 2004; Tafuri et

 

al., 2004

 

Café

vd Stegen et al., 1997; Leoni et al., 2000; Romani et

Cereais e seus derivados

Cerveja

al., 2000; Otteneder & Majerus, 2001; Varga et al.,

2001; Fazekas et al., 2002; Lombaert et al., 2002;

Miraglia & Brera, 2002; Pardo et al., 2004

Campbell et al., 2000; Varga et al., 2001; Beretta et

al., 2002; Czerwiecki et al., 2002; Fazekas et al.,

2002; Jorgensen & Jacobsen, 2002; Miraglia &

Brera, 2002; Palermo et al., 2002; Blesa et al.,

2004a; Araguás et al., no prelo; Molinié et al., no

prelo

Visconti et al., 2000; Soleas et al., 2001; Miraglia &

Brera, 2002; Odhav & Naicker, 2002; Tangni et al.,

2002; Araguás et al. (no prelo);

Derivados de carne (fiambre, fumados)

Chiavaro et al., 2002; Miraglia & Brera, 2002

Especiarias

Vrabcheva, 2000; Miraglia & Brera, 2002

Figos e frutos secos

Miraglia & Brera, 2002; MacDonald et al., 2003

Milho

Machinski et al., 2001; Puntaric et al., 2001

Outros

Miraglia & Brera, 2002

Tecidos porcinos

Dragacci et al., 1999; Jorgensen & Petersen, 2002;

Uvas e produtos derivados

Miraglia & Brera, 2002

V. capítulo 2, Tabelas 2.2 e 2.3

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

Os propósitos do Codex quanto às micotoxinas e outros contaminantes alimentares são

conseguir uma abordagem comum que passa por soluções práticas, como o estabelecimento de recomendações quanto aos níveis máximos residuais admissíveis em alimentos, quanto aos procedimentos que visem prevenir o problema, e quanto aos métodos de análise e de

amostragem. Idealmente, estas recomendações deverão ser aceitáveis tanto para os países produtores como para os importadores. As avaliações científicas da análise de risco são a base das recomendações feitas pelo Codex no que diz respeito à regulamentação internacional de micotoxinas. O processo de controlo de contaminantes alimentares pelo Codex inicia-se geralmente com a identificação de potenciais problemas de saúde. O Programa Internacional de Segurança Química, patrocinado conjuntamente pela OMS, Programa Ambiental das Nações Unidas e Organização Internacional do Trabalho, estabeleceu em colaboração com o Instituto Internacional das Ciências da Vida da Europa, um grupo cujo objectivo era desenvolver uma lista preliminar das toxinas de plantas de ocorrência natural consideradas como constituíndo um perigo para o consumidor. Este grupo lidera a recolha de informação disponível avaliando-a de acordo com critérios uniformizados, e encoraja e apoia a pesquisa em tópicos em que seja necessária mais informação. Várias micotoxinas estão sob consideração por este comité director, incluindo muitas das mencionadas. Desde que exista informação suficiente para documentar um potencial perigo, a substância é referida ao Comité Conjunto de Peritos da FAO/OMS (JECFA) para a caracterização do perigo.

A JECFA é responsável por reunir e avaliar dados em aditivos e contaminantes

alimentares e fazer recomendações quanto aos níveis de segurança. As recomendações da JECFA servem de base científica para o codex desenvolver directivas e outras recomendações. Em termos gerais, os propósitos e funções da JECFA incluem: 1) revisão do conhecimento e informação de peritos e tornar essas informações disponíveis para a FAO, OMS e seus países membros; 2) formular recomendações técnicas; 3) fazer recomendações com o propósito de iniciar, estimular e coordenar a investigação necessária para se chegar a conclusões sobre as implicações toxicológicas ou outras sobre a presença duma dada substância na comida (Moy, ob. cit.). Para a maior parte das micotoxinas, os dados disponíveis são insuficientes para permitir uma avaliação pela JECFA. No entanto, as seguintes micotoxinas já foram avaliadas:

aflatoxina M1, DON, fumonisinas, OTA, toxina HT2 e T-2 (JECFA, 2001); patulina (OMS, 1996); zearalenona (OMS, 2000), e PTDI estabelecidas. Para as aflatoxinas, não podem ser

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

estabelecidas doses máximas, e a sua exposição deve ser reduzida ao mínimo possível (OMS,

1998).

A IARC realizou numerosos estudos para estabelecer a carcinogenicidade de várias

micotoxinas. Segundo a IARC, as micotoxinas são classificadas como carcinogénicas para

humanos (grupo 1), possíveis carcinogénicas para humanos (grupo 2B), não classificáveis quando à carcinogenicidade em humanos (grupo 3).

A nível internacional, foi criado um programa de monitorização de químicos em

alimentos, para contribuir para o estabelecimento da exposição, designado de GEMS/Food. Este programa, que engloba cerca de 70 países, tem como objectivos informar os governos, a Comissão Codex Alimentarius e outras instituições relevantes, bem como o público, quanto aos níveis de contaminantes presentes nos alimentos, a sua contribuição para a exposição humana total, e a sua significância em termos de saúde pública e mercados. As micotoxinas monitorizadas pelo GEMS/Food são aflatoxinas, OTA, DON, patulina e fumonisinas, em diversos produtos alimentares (OMS, 2001). Periodicamente a base de dados da GEMS/food é avaliada, para estabelecer níveis e tendências na contaminação dos alimentos. Quando o risco está suficientemente bem caracterizado, podem ser consideradas várias opções de controlo. No entanto, como foi referido na secção 1.2, as decisões de gestão de risco devem incluir considerações económicas, sociais e políticas (factores de não-risco). Se o contaminante for relevante no mercado internacional alimentar, as opções de gestão de risco podem ser consideradas pelo Comité do Codex em Aditivos e Contaminantes Alimentares (CCFAC) para elaboração no sistema do Codex. O CCFAC tenta desenvolver limites máximos (MLs) de micotoxinas em certos alimentos. O sucesso desta iniciativa no caso da aflatoxina foi limitado, visto que os países adoptaram diferentes níveis nos alimentos. Na ausência de dados de confiança e consenso científico, há desacordos frequentes entre os países importadores e exportadores quanto ao estabelecimento de níveis regulatórios com base

na sua percepção de que níveis são conseguidos por boas práticas agrícolas e de fabrico. Por isso, os governos nacionais estabeleceram níveis muito diferentes para as aflatoxinas. O cumprimento destas políticas acarreta custos económicos consideráveis. A rejeição de carregamentos alimentares resulta em custos económicos significativos, particularmente para os países em desenvolvimento. Além disso, os governos nacionais e organizações internacionais devotam recursos consideráveis quanto aos métodos de prevenção, redução ou eliminação das micotoxinas dos alimentos.

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

1.4.2. Acções dos governos nacionais no controlo alimentar

Cerca de 100 países possuem legislação sobre uma ou mais micotoxinas em diversos alimentos (FAO, 2004). A tomada de decisão sobre que micotoxinas regulamentar, em que produtos e em que níveis é complexa. Na maior parte dos países, as regulamentações sobre micotoxinas não foram baseadas em estabelecimentos de risco sólidos. O estabelecimento de limites por parte dum país é influenciado por diversos factores, como os métodos analíticos disponíveis para o controlo legal, os dados sobre toxicologia e ocorrência da micotoxina em alimentos usados no estabelecimento de risco, bem como a existência de legislação noutros países com que existam trocas comerciais. A falta duma abordagem unificada entre países resultou numa grande variedade de recomendações e regulamentações no que diz respeito às micotoxinas. Vários factores dificultam uma abordagem comum. Um destes factores diz respeito a conflitos entre interesses nacionais e comerciais. Os interesses dos países produtores não coincidem necessariamente com os dos importadores e a presença de micotoxinas em alimentos pode levar a barreiras comerciais a menos que todas as partes concordem em definir níveis seguros de micotoxinas e respeitar os seus próprios interesses. Em geral, os países produtores têm limites mais elevados para as micotoxinas nos produtos que os países importadores. Outros factores impeditivos dizem respeito à diferente interpretação e análise dos dados usados no estabelecimento de risco consoante os países, bem como diferenças nos padrões alimentares (Moy, 1998).

1.4.3. Posições adoptadas pela Europa e Portugal

Estão a ser feitos esforços no sentido de harmonizar os níveis máximos admissíveis de micotoxinas presentes em alimentos nos países da UE, e a Comissão Europeia emitiu regulamentações nesse sentido. Na UE, a responsabilidade do estabelecimento toxicológico do contaminante para a saúde humana e ambiente cabe ao Comité Científico dos Alimentos (SCF). De seguida, vários grupos de trabalho e comités de peritos com delegados de todos os estados membros preparam propostas. Após consultas detalhadas, é entregue uma proposta ao SCF para uma avaliação final, após a qual a Comissão Europeia estabelece uma Comissão Executiva com representantes de todos os estados membros, o que conduz à adopção da directiva ou regulamentação resultante. Visto que a UE é um parceiro importante no comércio

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

internacional, no estabelecimento de níveis máximos de micotoxinas são levadas em conta normas internacionais (v.g. Codex Alimentarius) de forma a assegurar que o comércio internacional não é impedido sem justificação. Correntemente estão regulamentados os níveis de aflatoxinas e OTA em diversos produtos alimentares (Tabela 1.4), e o estabelecimento de níveis máximos admissíveis em café e seus derivados, bem como em sumos de uva e vinhos, foi votado a favor pelo Comité da Cadeia alimentar e Saúde Animal da UE que representa os estados membros. As regulamentações podem ser encontradas nas páginas da UE na internet:

Tabela 1.3. Níveis máximos admissíveis de micotoxinas em alimentos estabelecidos na UE

Tipo de alimento

Níveis máximos admissíveis (µg/kg)

 

Patulina

 

Aflatoxinas

OTA

 

B1

B1+B2+G1+G2

M1

Nozes e frutos secos Cereais Leite Especiarias Uvas passas

 

- - - - - 10 - 50

2 – 8

4 - 15

-

- 3 - 5 - -

2

4

-

-

-

0,05

5

10

-

-

-

-

10

Sumos de frutas (excepto

-

-

-

-

uvas),

derivados Sumo de uva Vinho Café e seus derivados

maçãs

e

seus

 

50

-

-

-

2*

-

-

-

-

2*

-

-

-

-

5 - 10*

* aguarda adopção formal pela Comissão

Em Portugal, a autoridade responsável pela análise dos alimentos é a Direcção Geral de Fiscalização e Controlo de Qualidade Alimentar. Entre 1999 e Julho de 2003, mais de 1000 amostras de frutos secos, nozes, especiarias e leite foram analisadas quanto à presença de aflatoxinas. Algumas amostras de amendoins, figos secos, pistáchios, caril e noz-moscada excederam os limites máximos admissíveis para aflatoxinas. Quanto à OTA, das cerca de 400 amostras diversas analisadas, foram detectados níveis elevados em algumas amostras de uvas passas e café. A incidência de OTA nas amostras é elevada, mas em baixos níveis. Análises a

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

36 amostras recolhidas no mercado de sumos de maçã e pêra e outros produtos derivados não ultrapassaram o limite máximo proposto para a patulina (Peito & Venâncio, 2004).

1.5. Gestão de risco de micotoxinas

Sendo as micotoxinas contaminantes naturais, é impossível assegurar a sua completa eliminação dos produtos alimentares. Mas a sua presença pode e deve ser minimizada a níveis que não apresentem risco para a saúde. Em algumas situações recomenda-se a aplicação do princípio ALAR, que significa “tão baixo quanto seja razoável”. É possível reduzir os níveis de micotoxinas nos alimentos através da implementação de medidas de controlo, como a análise de perigos e pontos críticos de controlo (HACCP). O HACCP baseia-se na identificação e estabelecimento de perigos em alimentos, e na implementação de formas de os controlar. A ideia da implementação de medidas de controlo pró-activas, baseadas nos processos de fabrico, surge da percepção de que não é possível assegurar produtos seguros apenas com base em análises ao produto final, visto que é impossível testar 100% dos produtos. O HACCP assenta na suposição de que boas práticas de higiene, fabrico e armazenamento resultam na obtenção de produtos finais com perigos controlados, e assenta em 7 princípios:

Princípio 1. Identificar todos os perigos possíveis desde a entrada e aprovisionamento das matérias primas até à obtenção e despacho do produto final; Princípio 2. Identificar os pontos críticos de controlo (pontos em que se pode controlar o perigo) de cada um dos perigos identificados; Princípio 3. Definir os limites críticos para os vários perigos em cada ponto crítico; Princípio 4. Definir o procedimento de monitorização dos pontos críticos; Princípio 5. Estabelecer o plano de acção (acções correctivas) a adoptar sempre que os limites críticos sejam ultrapassados; Princípio 6. Implementar um sistema de verificação do funcionamento do plano adoptado (análises a produtos, inquéritos e monitorização das actividades do pessoal, auditorias externas); Princípio 7. Implementar um sistema efectivo de registo do resultado de todos os testes efectuados em cada ponto crítico.

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

A aplicação destes procedimentos ao controlo de micotoxinas está descrita no manual da FAO (FAO, 2001). Para que seja possível identificar os perigos micotoxigénicos que podem ocorrer, bem como os pontos críticos de controlo, é necessário ter-se conhecimento de como e quando se processa a contaminação dos alimentos com fungos micotoxigénicos e quando e em que condições se dá a síntese de micotoxinas.

2. Produção de micotoxinas e sua presença em alimentos

A contaminação dos alimentos com micotoxinas resulta da infecção da cultura/alimento

por fungos toxigénicos, frequentemente sem sintomas visíveis a olho nú.

A produção de micotoxinas pode dar-se ao longo de fases distintas da produção dos

alimentos. O esquema genérico da produção de alimentos até chegarem ao consumo humano

está elucidado na Figura 1.3.

Cultivo agrícola Cultivo agrícola Colheita Colheita Armazenamento/ Armazenamento/ Transporte Transporte
Cultivo agrícola
Cultivo agrícola
Colheita
Colheita
Armazenamento/
Armazenamento/
Transporte
Transporte
Processamento
Processamento
Consumo animal
Consumo animal
Consumo
Consumo
humano
humano

Figura 1.3. Diagrama representativo das fases de produção de alimentos até consumo humano

Os fungos toxigénicos podem estar presentes nas várias etapas da produção dos alimentos até que chegam à nossa mesa: durante o cultivo, colheita, armazenamento, transporte e processamento. Não é possível descrever um único conjunto de condições que favorecem o crescimento e produção de micotoxinas por fungos, porque os fungos micotoxigénicos diferem nas suas características ecológicas, bioquímicas e nichos ecológicos (capítulo 3). Como tal, é difícil generalizar sobre estratégias de controlo, dada a diversidade de fungos produtores de micotoxinas em diversas culturas antes e depois da colheita. Mas a

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

compreensão dos factores relevantes para a produção de micotoxinas por um dado fungo numa dada comodidade agrícola permitem a definição de estratégias para combater o problema. Os factores envolvidos na produção de micotoxinas em campo, isto é, pré-colheita, são distintos dos envolvidos no período pós-colheita, e são apresentados nas secções seguintes. Grande parte do conhecimento que se tem sobre o fenómeno da contaminação de culturas e alimentos com micotoxinas advém dos cereais. As micotoxinas mais estudadas nestas matrizes foram as aflatoxinas, e mais recentemente, as toxinas de Fusarium. Por isso, a maior parte das referências citadas dizem respeito à contaminação destas culturas com as micotoxinas referidas. Apesar de se separarem ecologicamente os fenómenos de contaminação pré e pós colheita, a produção de micotoxinas em alimentos é frequentemente um processo aditivo, que se inicia no campo e aumenta durante a colheita, armazenamento ou processamento.

2.1. Pré-colheita

O período pré-colheita inicia-se com a emergência da planta do solo e termina com a

colheita da cultura. A produção de micotoxinas nas plantas pode dar-se durante o seu crescimento e a produção de micotoxinas acumular-se em diferentes concentrações nos órgãos das plantas afectadas. Os pré-requisitos essenciais para a produção de micotoxinas antes da colheita são: i) presença de estirpes toxigénicas, ii) susceptibilidade do hospedeiro e iii) nicho agroclimático favorável (Bilgrami & Choudhary, 1998). A interacção entre estas 3 esferas está representada na Figura 1.4. Vamos falar de cada um destes conjuntos de factores em pormenor.

2.1.1. Estirpes toxigénicas

A distribuição mundial e a incidência das espécies de fungos (micogeografia) varia de

acordo com factores bioclimáticos e com o tipo de alimento (Arnolds, 1997). Comodidades agrícolas diferentes não têm a mesma micoflora, mesmo em locais próximos, e as mesmas comodidades agrícolas em variadas partes do globo exibem micofloras constituídas por espécies que apresentam perigos micotoxigénicos diferentes. Conhecer a micoflora dum dado

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

produto num local possibilita-nos prever os riscos de contaminação e restringir as nossas pesquisas às eventuais micotoxinas presentes (Frisvad & Samson, 1991).

Estirpes Estirpes Factores Factores toxigénicas toxigénicas ambientais ambientais MM MM Cultura Cultura
Estirpes
Estirpes
Factores
Factores
toxigénicas
toxigénicas
ambientais
ambientais
MM MM
Cultura
Cultura
susceptível
susceptível

Figura 1.4. As 3 componentes necessárias para haver produção de micotoxinas em alimentos: presença de estirpes toxigénicas, cultura susceptível e factores ambientais favoráveis à infecção do fungo e produção da micotoxina na cultura/alimento (M = micotoxinas)

Nem todas as estirpes duma dada espécie são capazes de produzir micotoxinas. No caso da espécie produtora de aflatoxinas, A. flavus, as estirpes não toxigénicas são mais frequentes que as toxigénicas. Em termos de genética populacional, as estirpes não toxigénicas, mais abundantemente distribuídas, podem ser vistas como o tipo selvagem (wild-type), e as

toxigénicas, mais restritas na sua distribuição, o tipo mutante. Alguns cientistas acreditam que a produção de micotoxinas traz alguma vantagem às estirpes produtoras, defendendo-se com a afirmação de Ernst Mayr de que “nature does not believe in extravagance” (Bilgrami & Sinha, 1992). Lillehoj defende que as intensivas práticas agrícolas são responsáveis pela criação de agroeconichos únicos que sob certas condições seleccionam fungos produtores de micotoxinas por mecanismos desconhecidos. O investigador pensa que as micotoxinas funcionam como sinais químicos entre as espécies num nicho ecológico e podem desempenhar uma função no estabelecimento das espécies num dado nicho (Lillehoj, 1992).

O inóculo de fungos micotoxigénicos pode advir do ar, solo, vegetação em decomposição,

plantas infectadas ou insectos, entre outros. Em condições favoráveis, estes fungos competem

com outros organismos do solo e produzem inóculos abundantes (Payne, 1998). Os níveis de inóculo variam consoante os anos e os locais.

A presença de estirpes micotoxigénicas é um dos pré-requisitos para que haja produção de

micotoxinas em comodidades agrícolas, mas não implica a sua produção. Para produzir

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

micotoxinas numa dada planta, o fungo toxigénico tem de ser capaz de colonizar e infectar a planta bem como produzir a micotoxina nos tecidos do hospedeiro. Na visão de Payne (1998), por colonização entende-se o crescimento de fungos na superfície da planta, enquanto que por infecção entende-se uma relação mais íntima com o hospedeiro, em que o fungo invade os tecidos da planta e obtém nutrientes de células vivas. No entanto, o conceito de colonização é usado ao longo desta dissertação num sentido mais abrangente: por colonização entende-se a presença de propágulos fúngicos na superfície da planta. A capacidade de infecção da cultura depende por sua vez da patogenicidade da estirpe, susceptibilidade da cultura, e de factores ambientais. Existem fungos micotoxigénicos (v.g., espécies de Fusarium) que são patogénicos para plantas, mas em geral, os fungos micotoxigénicos não são patogénios agressivos, mas sim essencialmente saprófitas ou parasitas oportunistas (v.g., espécies de Aspergillus e Penicillium), capazes de infectar as culturas através de danos e injúrias físicas. Existem nas plantas vias naturais de entrada que apresentam pouca obstrução física, que podem ser exploradas por estes fungos (Smart et al., 1990). Como estes fungos têm capacidades parasíticas limitadas, várias condições ambientais têm de ocorrer para que se dê a infecção e a síntese de micotoxinas. Após a infecção, o fungo produz a micotoxina cumulativamente, até que o substrato seja esgotado, o fungo morto ou que se estabeleçam condições permanentemente desfavoráveis para a síntese de micotoxinas. A micotoxina, se não for degradada entretanto, permanece no alimento até às fases finais da produção.

2.1.2. Susceptibilidade do hospedeiro

A planta cultivada tem de ser compatível com o fungo toxigénico presente para haver produção de micotoxinas, isto é, como foi referido na secção anterior, tem de ser possível a infecção e a produção de micotoxinas pelo fungo nos tecidos da planta. Ao longo do seu ciclo de vida, a planta apresenta susceptibilidade diferente a fungos. Por isso, factores relacionados com a colheita são essenciais no estabelecimento da infecção. Regra geral, quanto mais tarde for feita a colheita, mais tempo existe para haver formação de micotoxinas no campo e mais susceptível a cultura se torna. No momento da colheita, infligem-se danos às culturas, podendo-se abrir vias de entrada para fungos micotoxigénicos.

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

A presença de danos mecânicos e injúrias físicas na planta, devidas a ataques de pestes (v.g., insectos, pássaros, outros fungos) ou factores climáticos (v.g., granizo, seca excessiva), são um veículo de ataque por parte de fungos e outros invasores, e aumentam enormemente a susceptibilidade da planta em qualquer estado de maturação. Mas além dos danos físicos, outros aspectos, como o stresse da planta de cultivo, contribuem para a susceptibilidade a infecções. Stresse hídrico em momentos críticos do ciclo de vida da planta pode ser determinante (Bilgrami & Choudhary, 1998). Adicionalmente, existem variedades de plantas mais resistentes que outras à infecção por fungos micotoxigénicos (Widstrom, 1992). Uma vez a cultura infectada em campo, o crescimento fúngico pode continuar nos estados pós-colheita e armazenamento.

2.1.3. Nicho agroclimático favorável

Os factores ambientais são determinantes na produção de micotoxinas, porque influenciam a quantidade de inóculo, bem como a capacidade do fungo colonizar, infectar e produzir micotoxinas na planta, além de contribuírem para a susceptibilidade do hospedeiro. Os factores climatéricos mais relevantes para a produção de micotoxinas em campo são a temperatura, a precipitação e a humidade (Abramson, 1998). A chuva e vento facilitam a dispersão de inóculo. A capacidade de germinação dos esporos depende essencialmente da temperatura e da humidade ou actividade de água do substrato e, se as condições climatéricas forem favoráveis, dá-se a germinação dos esporos e a colonização das plantas, o que pode conduzir à infecção e à formação de micotoxinas. Factores biológicos, como a comunidade microbiana do solo e plantas e a competição de microrganismos, mostraram-se relevantes para a determinação da produção de micotoxinas em plantas de cultivo e seus órgãos (Bilgrami & Choudhary, 1998). Os insectos são dos factores biológicos mais relevantes na contaminação com micotoxinas, pois não só danificam as plantas, como actuam como vectores de inóculo (Dowd, 1998).

2.2. Pós-colheita

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

Durante o armazenamento e transporte, o inóculo de fungos micotoxigénicos que estava presente na comodidade agrícola, exceptuando se houve um pré-processamento que involva desinfecção, continua presente. Podem também existir outras fontes de inóculo (v.g., outros produtos armazenados, instalações de armazenamento ou transporte). Os ambientes de armazenamento são mais secos que as condições de campo, e as actividades de água do substrato mais baixas, o que favorece o crescimento de fungos com requisitos ecológicos diferentes das condições antes da colheita. Nesta fase, a produção de micotoxinas depende da presença de fungos toxigénicos capazes de crescer e produzir a micotoxina no substrato e de factores ambientais no armazenamento, dos quais a actividade de água é particularmente importante. Outros factores, como o tempo de incubação, a temperatura, a atmosfera e o potencial redox, bem como pH e comunidades microbianas são relevantes (Abramson, 1998; Smith et al., 1998).

2.3. Processamento dos alimentos

As micotoxinas podem surgir de 3 formas nos alimentos processados: i) estando presentes na matéria-prima; ii) formando-se durante o processamento; iii) ou após o processamento, devido a más condições de armazenamento ou acondicionamento. O tipo de processamento pode afectar os níveis de micotoxina presentes nas matérias-primas, podendo eliminar, reduzir ou aumentar a toxina no alimento processado. Por exemplo, sabe-se que a fermentação destrói a micotoxina patulina, que é detectada em sumos de frutas, mas não em bebidas alcoólicas (Scott et al., 1977). No processamento do café verde para café torrado e solúvel, pode ocorrer uma redução nos níveis de OTA até 90% (Viani, 2002). Kpodo e colaboradores (1996) verificaram que a cocção durante 3 horas de milho fermentado contribui para a redução de 80% nos níveis de aflatoxina B1 e G1. No processo de fabrico de vinho, verificou-se que vários passos do processo contribuem para a redução dos níveis da micotoxina OTA, essencialmente sempre que há separação de matéria sólida do vinho (Hocking et al., 2003; Fernandes et al., 2003; no prelo). Por sua vez, passos que envolvam concentração de matéria-prima podem conduzir a níveis de micotoxinas mais elevados nos alimentos processados. O aumento da concentração de

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

OTA durante o fabrico de pekmez é disso exemplo. O pekmez é uma bebida turca feita de sumo de uva concentrado e fervido. Verificou-se que a concentração de OTA no pekmez era 5 a 6 vezes maior que o detectado nas uvas (Arici et al., 2004). É possível que a produção de micotoxinas se dê durante o processamento dos alimentos. Bailly e colaboradores (2002) verificaram que durante o fabrico de queijo há potencial para a produção de micotoxinas. Mas a produção de micotoxinas durante o processamento alimentar não é referida habitualmente.

2.4. Cadeia alimentar

As micotoxinas podem entrar na cadeia alimentar ao serem consumidas em rações por animais. Os animais podem degradar as micotoxinas, acumulá-las nos seus órgãos e tecidos ou transformá-las noutros produtos e excretá-las, como é o caso da aflatoxina M1 nos produtos lácteos (Galtier, 1999; Guerre et al., 2000; Mendonça & Venâncio, no prelo), e estar presentes em alimentos destinados a consumo humano.

2.5. Presença e distribuição de micotoxinas em comodidades agrícolas

Devido à síntese de micotoxinas em alimentos ser um fenómeno complexo que depende de muitos factores, a produção de micotoxinas é tipicamente pontual e particularizada, distribuindo-se na colheita de forma não homogénea. Estudos em milho com aflatoxinas permitiram avaliar este facto. Na Figura 1.5 está representada a distribuição e o teor de aflatoxina em grãos de milho numa espiga. A contaminação é variável e nem todos os grãos infectados apresentam níveis detectáveis de aflatoxina (Cotty et al., 1994). Em muitos casos, a eliminação de componentes altamente contaminados resultaria em comodidades agrícolas com teores de aflatoxinas aceitáveis comercialmente.

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA Figura 1.5. Distribuição e teor de aflatoxina em grãos de milho numa espiga

Figura 1.5. Distribuição e teor de aflatoxina em grãos de milho numa espiga (adaptado de Cotty et al., 1994). Células brancas = não infectadas, aflatoxina não detectada; Células amarelas = infectadas, aflatoxina não detectada; células cinzentas = concentações de aflatoxina de 0,1 – 2,5 g/kg; células negras = mais de 2,5 g/kg

Devido a esta variabilidade na contaminação, a avaliação da produção de micotoxinas em campo, bem como a amostragem de lotes armazenados torna-se particularmente difícil (Whitaker, 2003a; Whitaker, 2003b). A possibilidade de co-ocorrência de micotoxinas em alimentos suscita preocupações acrescidas, visto que se desconhecem os efeitos das interacções entre estes compostos. Já foi detectada a co-ocorrência de patulina e citrinina em maçãs portuguesas (Martins et al., 2002) e de aflatoxina B1, fumonisina B1 e OTA em cereais (Park et al., 2002; Vargas et al., 2001).

2.6. Medidas micotoxinas

de

prevenção

e

controlo

na

contaminação

por

Em campo, antes da colheita, algumas estratégias de controlo de micotoxinas bem sucedidas basearam-se em boas práticas agronómicas, que maximizem o desempenho da planta e minimizem o stresse, bem como no cultivo de variedades resistentes aos fungos produtores. A maioria dos estudos diz respeito à prevenção de aflatoxinas em campo. A aposta no desenvolvimento de variedades de milho resistentes à produção de aflatoxinas por Aspergillus flavus tem mostrado resultados promissores (Brown et al., 1998). O uso de agentes biocompetitivos foi sugerido por diversas vezes. No caso das aflatoxinas, o uso de estirpes não-aflatoxigénicas para este fim parece ser o mais adequado, visto que estas estirpes são adaptáveis às condições ambientais de forma idêntica às toxigénicas, e são biologicamente activas. Em experiências de estufa e campo, obtiveram-se reduções grandes no teor de aflatoxinas em algodão com a aplicação de estirpes atoxigénicas de A. flavus em grãos de trigo. A redução no teor de aflatoxinas parece ser devida à exclusão espacial de estirpes toxigénicas e competição por recursos necessários à produção de aflatoxinas. Pensa-se que os

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

amendoins também beneficiarão da redução na contaminação com aflatoxinas com o uso de estirpes atoxigénicas como biocompetidores. Estes estudos foram realizados com estirpes atoxigénicas nativas, mas existe potencial para o desenvolvimento de estirpes de biocontrolo mais eficazes através da bioengenharia, especialmente no que diz respeito à virulência das estirpes. A prevenção da formação de micotoxinas é uma abordagem mais desejável que outras formas de controlo, como a destoxificação dos alimentos. A maioria das micotoxinas é quimicamente estável, e resistem às condições de processamento, por exemplo, temperaturas elevadas. Uma das principais críticas apresentadas à alternativa da destoxificação é que muitos dos tratamentos não são economicamente viáveis. No entanto, adicionalmente à prevenção, existem vários esforços neste sentido, que se focalizam no processamento alimentar, na remoção de micotoxinas por adsorção, filtração, moagem, solventes, altas temperaturas e destoxificação por microrganismos (Sinha, 1998). Após colheita, a ênfase é colocada em práticas adequadas de colheita e armazenamento, bem como numa decisão cuidada do momento de fazer a colheita. Regra geral, culturas tardias conduzem a maiores probabilidades de formação de micotoxinas. No caso dos cereais, grãos de café, frutos e sementes oleaginosas, após colheita, as culturas devem ser secadas imediatamente. Ênfase deve ser colocado na limpeza do material em contacto com a cultura antes do transporte para evitar fontes de inóculo posteriores. Em condições de armazenamento, o controlo de humidade é essencial para prevenir a acumulação de micotoxinas. O uso de agentes anti-fúngicos pode ser usado como um complemento, mas não substitui as boas práticas (CAST, 2003).

3. Fungos produtores de micotoxinas

Na Tabela 1.4 são apresentadas as principais espécies produtoras responsáveis pela produção de micotoxinas em alimentos. Existem outras espécies capazes de produzir as micotoxinas listadas, mas a sua ocorrência em alimentos não é relevante ou não se consideram fontes significativas da micotoxina.

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

Tabela 1.4. Principais espécies responsáveis pela produção de micotoxinas

Micotoxina

Espécies produtoras

Aflatoxinas

Aspergillus flavus; A. parasiticus Aspergillus ochraceus; A. alliaceus; A. niger; A. carbonarius Penicillium verrucosum; P. nordicum Fusarium spp. F. graminearum e outras Fusarium spp. F. moniliforme (=F. verticillioides); F. proliferatum P. citrinum; P. expansum; P. verrucosum; A. alliaceus A. ochraceus; P. aurantiogriseum; P. viridicatum P. expansum; P. griseofulvum; A. clavatus Aspergillus versicolor; Emericella nidulans Alternaria alternata Penicillium crustosum Claviceps spp. A. flavus; A. tamarii; P. commune

Ocratoxina A

Tricotecenos Zearalenona Fumonisinas Citrinina Ácido penicílico Patulina Esterigmatocistina Ácido tenuazónico Penitrem A Alcalóides do ergot Ácido ciclopiazónico

Os géneros de fungos filamentosos responsáveis pela produção de micotoxinas consideradas mais relevantes para a saúde (V. secção 1.3, p. 21) são Aspergillus, Fusarium e Penicillium. A relação entre a micotoxina e o fungo produtor não é única, i.e., uma dada micotoxina pode ser produzida por espécies diferentes (v.g., OTA), e um dado fungo pode produzir várias micotoxinas (v.g., P. expansum). A ligação entre as espécies e as micotoxinas foi frequentemente obscurecida pela má identificação das estirpes ou das micotoxinas ao longo do tempo. No entanto, esforços de vários investigadores em diferentes grupos taxonómicos, notavelmente de Frisvad e colaboradores na taxinomia e perfil de metabolitos secundários produzidos por espécies terverticiladas de Penicillium (V. secção 3.2.4), permitiram clarificar a produção de micotoxinas pelas espécies (Frisvad & Filtenborg, 1983, 1989; Frisvad, 1989; Frisvad et al., 1998; Lund & Frisvad, 1994; Svendsen & Frisvad, 1994). Apesar de nem todas as estirpes duma dada espécie serem capazes de produzir micotoxinas, a produção de micotoxinas pelas estirpes é bastante consistente em cultura pura, desde que se usem condições óptimas de produção. No entanto, a composição do meio de cultura afecta grandemente a produção de micotoxinas pelas estirpes. Daí que as micotoxinas produzidas em cultura pura podem não ser as mesmas produzidas em substratos naturais. Exemplo disso foi o trabalho desenvolvido durante a dissertação de Abrunhosa (2001a, 2001b), em que se verificou que apesar de todas as 51 estirpes de P. expansum testadas

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

produzirem citrinina em meio agarizado de extracto de levedura e sacarose (YES), apenas uma foi capaz de produzir a micotoxina num meio elaborado com base de extracto de uva. Por sua vez, estirpes que não produziram patulina em YES demonstraram essa capacidade em meio de uva. Visto que cada comodidade agrícola tem a sua micoflora própria, uma dada micotoxina pode ser produzida por espécies diferentes consoante o local ou o alimento em questão. Na Tabela 1.5 apresenta-se uma revisão das principais espécies produtoras de OTA detectadas em diversas comodidades agrícolas em diferentes pontos do globo, onde se observam as diferenças apontadas.

Tabela 1.5. Principais espécies produtoras de OTA isoladas de alimentos onde foi detectada a presença da micotoxina

Alimento

País

Espécie

Referência

 

Figos

Califórnia

A. alliaceus

Uvas

Vários países A. carbonarius, agregado A.

Bayman et al., 2002 V. capítulo 2

 

niger

Cereais

Norte da Europa, Canadá

P. verrucosum

Mills

et

al.,

1995;

 

Lund

&

Frisvad,

2003

Cereais

África do Sul

A. alliaceus

Odhav

&

Naicker,

 

2002

Derivados de produtos animais (enchidos e queijo) Derivados de milho Café

Europa

P. nordicum

Larsen et al., 2001

Nigéria

Brasil

A. ochraceus A. ochraceus, A. sulphureus, A. carbonarius A. carbonarius A. ochraceus

Adebajo et al., 1994 Batista et al., 2003; Taniwaki et al., 2003 Joosten et al., 2001 Overy et al., 2003

Café

Tailândia

Castanhas

Canadá

3.1. Fisiologia e Ecologia

Já foi referido em secções anteriores que a produção de micotoxinas pelos fungos depende de factores ambientais e da cultura em causa, particularmente do seu estado de susceptibilidade. Em campo, o estado da cultura é apontado por Pitt e Hocking (1997) como o

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

principal factor que governa a ecologia da biodeterioração dos alimentos por fungos. O estudo da produção de micotoxinas em tecidos vivos das plantas é mais um ramo da patologia vegetal que da microbiologia alimentar. No entanto, em tecidos moribundos, dormentes, ou mortos, os factores que governam a biodeterioração e a produção de micotoxinas são físicos e químicos. Segundo os autores citados, há 8 factores principais: 1) actividade de água; 2); pH; 3) temperatura; 4) tensão de O 2 e CO 2 , 5) consistência, 6) composição nutricional do substrato; 7) solutos específicos; 8) conservantes. A maioria dos fungos é pouco afectada pelo pH numa larga gama de valores, tipicamente entre 3 a 8. O pH é um factor importante em termos competitivos a elevadas actividades de água, onde a biodeterioração por bactérias é provável. Mas abaixo de pH 5, o crescimento de bactérias é menos provável. A tensão de O 2 e CO 2 é importante para os fungos visto que são organismos aeróbicos. A sensibilidade das espécies a estes parâmetros tem particular importância durante o processamento de alguns alimentos, como queijos, e no embalamento de alimentos. A consistência do alimento é importante quanto ao tipo de fungos filamentosos mais prováveis de causar estragos: duma forma geral, as leveduras causam mais estragos em produtos líquidos, visto que o ambiente é mais favorável à dispersão de organismos unicelulares, e os fungos filamentosos causam mais frequentemente estragos em substratos sólidos, onde têm acesso fácil ao oxigénio. Quanto à composição nutricional do substrato, a sua importância em termos de produção de micotoxinas já foi realçado previamente neste capítulo. A presença de certos solutos pode ser importante para o crescimento de alguns

fungos, nomeadamente glucose, glicerol, cloreto de magnésio e cloreto de sódio, mas este factor parece ter pouca importância para as espécies anamórficas de Aspergillus e Penicillium. No caso de resistência a conservantes, em particular ácidos fracos, verificou-se diferenças na resistência das espécies, mas obviamente que este aspecto só tem interesse quando se usam conservantes alimentares. Indubitavelmente, dois dos aspectos considerados mais importantes

e estudados mais frequentemente quanto aos requisitos ecofisiológicos para o crescimento de fungos filamentosos e produção de micotoxinas são a actividade de água e a temperatura. Quanto à actividade de água, os fungos produtores de micotoxinas são divididos em fungos de campo e fungos de armazenamento. Os fungos de campo só conseguem crescer

com actividades de água elevadas (acima de 0,90 a w ), e são relevantes antes da colheita, como

é o caso dos Fusarium. Os fungos de armazenamento são fungos com capacidade de crescer

com baixas actividades de água, e são relevantes em condições de armazenamento de comodidades agrícolas secas, como cereais. É nesta última categoria que se inserem tipicamente Aspergillus e Penicillium, apesar dos fungos de armazenamento também estarem

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

presentes no campo, onde podem infectar as colheitas (v.g., Aspergillus flavus) e produzir a micotoxina. As espécies do género Aspergillus são na maioria saprófitas ou patogénicos oportunistas de plantas, capazes de crescer até baixas actividades de água e com temperaturas elevadas, dominando ambientes quentes e/ou secos. O teleomorfo Eurotium consegue crescer até 0,70 de a w (Figura 1.6). Adicionalmente, algumas espécies de Aspergillus são termófilas, capazes de crescer até temperaturas máximas de 55 ºC (v.g., A. fumigatus). A distribuição de Aspergillus nos solos é mais abundante entre latitudes as 26º e 35º em ambos hemisférios, e menos abundantes entre 35º e 45º (Klich et al., 1992). São mais frequentes em climas tropicais que em climas temperados e é nos trópicos que dominam a micoflora dos alimentos e que são responsáveis pela produção de micotoxinas em diversas comodidades agrícolas, como cereais, amendoins, cacau, café. As espécies de Aspergillus regra geral crescem mais rápido que os Penicillium, apesar de tardarem mais a esporular. Os seus esporos são resistentes à radiação solar e a agentes químicos (Pitt & Hocking, 1997). O género Penicillium é dos 3 géneros indicados o mais diverso, em termos de número de espécies e diversidade de habitats. São espécies pouco exigentes nutricionalmente, capazes de crescer em qualquer ambiente com uma fonte de sais minerais e qualquer fonte de carbono excepto as mais complexas, numa gama vasta de condições físico-químicas (v.g. a w , temperatura, pH e potencial redox). A maioria das espécies descritas tem o seu habitat primordial no solo e são consideradas saprófitas ubíquos. Christensen e colaboradores (2000) verificaram numa revisão a 74 rastreios de solo publicados que os Penicillium estão entre os principais constituintes da micoflora, e que ao invés dos Aspergillus, são proeminentes numa gama de amplitudes muito alargada (entre 3º e 71º). No entanto, o género Penicillium também compreende algumas espécies patogénicas de frutos (v.g., P. digitatum, P. expansum, P. italicum). Muitas espécies são psicrófilas, capazes de crescer a temperaturas abaixo de 0 ºC, mas algumas espécies são capazes de crescer até 40 ºC (Pitt & Hocking, ob. cit.). Regra geral, crescem num regime mais estreito de actividades de água, apesar de existirem algumas espécies xerófilas, como o caso notável de P. brevicompactum, capaz de crescer abaixo de 0,80 a w . Os Penicillium dominam a micoflora micotoxigénica dos climas temperados, onde são responsáveis pela produção de micotoxinas essencialmente em cereais e derivados de carne.

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA Figura 1.6. Fungos e actinomicetes proeminentes e suas capacidades de crescer a diversas

Figura 1.6. Fungos e actinomicetes proeminentes e suas capacidades de crescer a diversas actividades de água e temperaturas. T. crust. = Thermoascus crustaceus; Sam. = Saccharomonospora; Stm. = Streptomyces (adaptado de Lacey et al., 1991 por Kozakiewicz, com permissão da autora)

Regra geral, verifica-se que os limites ecofisiológicos duma espécie para produzir micotoxinas são mais estreitos que para crescer num dado produto (Frisvad & Samson, 1991). Prova desta afirmação são os estudos recentemente publicados quanto aos requisitos de a w e temperatura para a produção de OTA por estirpes toxigénicas de Aspergillus secção Nigri em uvas (Esteban et al., 2004; Mitchell et al., 2004). Uma vez estabelecidos estes limites, é possível construir modelos preditivos de risco de produção da micotoxina.

3.2. Taxinomia micotoxinas

e

nomenclatura

dos

géneros

produtores

de

Segundo a classificação de fungos de Alexopoulos (Alexopoulos et al., 1996), o Reino dos fungos está dividido em 4 filos, definidos principalmente nos modos de reprodução sexual: Chytridiomycota, Zygomycota, Basidiomycota e Ascomycota. Os fungos produtores de micotoxinas pertencem à divisão Ascomycota. Os Ascomycota apresentam reprodução sexuada em estruturas especializadas designadas de ascos. No entanto, nem todos os fungos

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

deste filo exibem normalmente em cultura estruturas de reprodução sexuada. Os fungos cujo estado de reprodução sexual não é conhecido designam-se de fungos imperfeitos, ou deuteromycetes. Aspergillus, Fusarium e Penicillium pertencem a este grupo. Os deuteromycetes reproduzem-se assexualmente por estruturas de reprodução especializadas designadas de conidia (sing. conidium), que são esporos mitóticos que se formam em estruturas de reprodução especializadas, designadas de conidióforos. Os deuteromycetes não existem como grupo taxinómico, e não representam nenhum agrupamento natural. Este agrupamento foi abandonado a favor de alternativas menos artificiais, com base nos parceiros mais próximos que apresentam reprodução sexuada. O reconhecimento dos deuteromycetes como um grupo artificial justifica abordagens taxinómicas puramente pragmáticas. A taxinomia dos géneros deste grupo, em particular de Aspergillus, Fusarium e Penicillium, é complexa devido aos problemas apontados em seguida, apesar de se terem feito grandes esforços para a sua resolução.

3.2.1. Problemas gerais

A classificação de fungos assexuais foi tradicionalmente baseada na morfologia, isto é, no aspecto das colónias e estruturas microscópicas. O conceito biológico de espécie de Mayr, que assenta em que a espécie é um grupo de populações naturais que se cruzam entre si e estão retroactivamente isolados de outros, não é aplicável a organismos assexuais (Harrington e Rizzo, 1999). A morfologia das estruturas de reprodução especializada dos fungos foi usada na definição da espécie e na identificação. Mas a informação morfológica obtida é dependente das condições de cultura e incubação usadas, e sujeita a interpretações variadas consoante o observador. A nomenclatura das próprias estruturas morfológicas em que se baseia a classificação é complexa a tal ponto que, no primeiro encontro de Kananaskis em 1971 em que se fez a tentativa de tornar a terminologia sobre a conidiogénese dos deuteromicetes mais simples e exacta, o capítulo dedicado à terminologia começa com a frase sugestiva de Samuel Butler: “A definition is the enclosing of a wilderness of ideas within a wall of words(Kendrick, 1971). Por outro lado, a delimitação e identificação das espécies é complicada pela variabilidade morfológica inerente às estirpes. Apesar de supostamente clonais, os fungos de reprodução assexual mostram uma variação surpreendente. O pleomorfismo e dimorfismo dos fungos complicaram ainda mais o esquema taxinómico, pois a diferentes estados de

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

reprodução de fungos foram dados nomes diferentes. Dadas as dificuldades metodológicas existentes, o estabelecimento das espécies, bem como as relações e a delimitação das espécies, baseou-se na opinião dos taxinomistas. Além dos problemas metodológicos inerentes a uma classificação baseada essencialmente na morfologia de organismos tão variáveis morfologicamente como os fungos, os problemas taxinómicos dos géneros desta secção foram também nomenclaturais. Os procedimentos correctos de nomenclatura para atribuir nomes às espécies foram frequentemente ignorados, o que resultou em grande confusão, especialmente no que diz respeito às ligações entre anamorfos (designação do estado de reprodução assexual do fungo) e teleomorfos (designação do estado de reprodução sexual do fungo). Esta confusão teve origem parcial no facto do acesso à literatura sobre a taxinomia de espécies ser difícil, dado ser muito difusa e requerer enormes conhecimentos bem como acesso à bibliografia adequada (Pitt, 1991). Outro dos problemas taxinómicos nos géneros deste grupo foi uma falha tremenda na tipificação. O sistema de holótipos apresenta limitações de base evidentes: ao designar uma estirpe como tipo, representativa da espécie, não se tem em conta a variabilidade inerente à espécie. Mas sem este sistema de referência, criaram-se obviamente problemas taxinómicos, sendo por exemplo difícil verificar a sinonímia entre novas espécies criadas. Além dos problemas apontados, coloca-se uma questão de fundo a sistemas baseados principalmente em características morfológicas: pode um sistema de classificação baseado na morfologia reflectir a biologia das espécies, e ser usado para prever características? Se a pressão para a evolução das espécies for essencialmente fisiológica, não devem ser esperadas diferenças qualitativas ou quantitativas na morfologia. Como apontado por Parmasto e Parmasto (1992), as diferenças morfológicas entre espécies irmãs surgem lentamente por deriva genética, e espécies ecologicamente distintas apresentam diferenças morfológicas qualitativas e quantitativas subtis. Observa-se com frequência sobreposição nas características quantitativas mais usadas, como o tamanho dos esporos. A taxinomia dos principais géneros produtores de micotoxinas, Aspergillus, Fusarium e Penicillium, é reflexo destes problemas (Pitt, 1991). No caso dos Aspergillus, os problemas foram essencialmente nomenclaturais. O manual de referência de Aspergillus e seus teleomorfos é o de Raper e Fennell (1965). Os conceitos genéricos e de espécie estão consideravelmente bem circunscritos, apesar de vários grupos serem de identificação e classificação problemática (grupos A. niger, A. ochraceus, A. nidulans, A. flavus, A. fumigatus, A. restrictus). Os problemas nomenclaturais no género

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

Aspergillus foram devidos à recusa de Raper e Fennell aderirem ao código internacional de nomenclatura botânica (ICBN). Em primeiro lugar, Raper e Fennell não concederam nomes aos teleomorfos, prática contrária ao recomendado pelo ICBN. Em segundo lugar, a subdivisão do género foi baseada em grupos de espécies semelhantes (v.g., espécies semelhantes a A. niger eram referidas como pertencentes ao grupo A. niger). O uso do termo grupo não tem estatuto no ICBN, e foi duramente criticado (Benjamin, 1966 em Pitt & Hocking, 1997). Em terceiro lugar, não respeitaram as regras da prioridade de nomes, e recusaram alguns nomes de espécies. Por último, não tipificaram os nomes, o que levou a variações no conceito de algumas espécies (Pitt & Hocking, 1997). A taxinomia de Penicillium foi mais problemática. Raper e Thom (1949) publicaram uma monografia para a identificação de Penicillium, que foi usada durante várias décadas. Mas o seu conceito de espécie era aberto a interpretações variáveis. Novas classificações foram propostas, mas nenhuma foi aceite amplamente. A descoberta de antibióticos e de compostos tóxicos nestes géneros conduziu a um interesse enorme nos metabolitos secundários, bioquímica e biodeterioração por este género. A investigação rápida no género, juntamente com as limitações da taxinomia existentes, levou a um estado caótico de más identificações e consequente confusão sobre as espécies que estavam presentes nos alimentos. Muitas das inexactidões permaneceram até hoje, tanto em revisões de literatura como em colecções de culturas (Pitt, 1991). Esta situação prejudicou imenso o estabelecimento das micotoxinas produzidas por que espécies, bem como estudos dos requisitos ecofisiológicos para o crescimento e produção de micotoxinas das espécies. Todas estas dificuldades fizeram com que muitos investigadores questionassem o valor da taxinomia de Penicillium em particular e, mesmo ainda hoje, alguns cientistas questionam a mais valia da classificação deste género até à espécie na micotoxicologia (Paterson et al., 2004). Em Fusarium os problemas taxinómicos igualaram ou excederam os de Aspergillus e Penicillium: existem conceitos de espécies tão variados que oscilam entre o manual de Snyder e Hansen (1945), que aceitam apenas 9 espécies no género, e o de Booth (1971), que lista 146 taxa.

3.2.2. Soluções para Aspergillus, Fusarium e Penicillium

Dada a relevância de Aspergillus, Fusarium e Penicillium para a ciência, saúde e indústria, idealmente a identificação das espécies nestes géneros deve ser inequívoca, exacta,

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

simples e imutável. O conceito de espécie deve, pois, reflectir as necessidades práticas, bem como ser intelectualmente satisfatória. Novas abordagens à taxinomia destes géneros resolveram alguns dos problemas apontados. A variabilidade morfológica das estirpes foi reduzida com a concepção de meios de cultura e condições de incubação padronizados. No caso dos Fusarium, recomenda-se inclusive que as culturas sejam feitas a partir de um esporo (Nelson et al., 1983). Fizeram-se esforços para reduzir a subjectividade do taxinomista na observação das características morfológicas com programas de análise de imagem (Dorge et al., 2000) e através de ensaios interlaboratoriais entre peritos (Frisvad et al., 2000). A influência de parâmetros fisiológicos como a temperatura e a actividade de água foi incluída por Pitt na classificação e identificação de Penicillium (Pitt, 1979). Para as espécies produtoras de micotoxinas mais relevantes, foram desenvolvidos meios de cultura selectivos, como o caso do meio agarizado para Aspergillus flavus e A. parasiticus (AFPA), destinado à identificação das principais espécies produtoras de aflatoxina (Samson, 1991). Enfatizou-se a necessidade de se identificarem as estirpes quando isoladas dos alimentos, para reduzir as alterações em cultura. Desenvolveram-se e aplicaram-se novas ferramentas e métodos da quimiotaxonomia a estes grupos de fungos. Estudos de ADN, ARN, proteínas e particularmente metabolitos secundários, permitiram compreender as relações filogenéticas entre géneros, subgéneros e espécies definidas morfologicamente e clarificar a taxinomia, sendo uma ferramenta valiosa na criação de novos taxa. Os dados resultantes destas ferramentas podem ser complexos, mas técnicas estatísticas multivariadas facilitam a análise destes dados (Frisvad et al., 1998). Para Aspergillus e Penicillium, foram publicados manuais de identificação claros e concisos, que enfatizam as principais características de cada espécie e as suas afinidades com outros taxa. As espécies descritas nos manuais de referência de Aspergillus (Raper & Fennell, 1965) e Penicillium (Raper & Thom, 1949) consideradas válidas foram tipificadas (espécies de Aspergillus por Samson & Gams, 1985; espécies de Penicillium por Pitt, 1979), e a tipificação subsequente de espécies novas foi levada mais a sério pelos taxinomistas. Os problemas nomenclaturais de Aspergillus foram solucionados. Subramanian e Malloch e Cain providenciaram nomes para os teleomorfos de Aspergillus (Pitt & Hocking, ob. cit.), e Gams et al. (1985) desenvolveram uma classificação nova de Aspergillus baseada em subgéneros e secções que substituiu o termo incorrecto “grupo”, e foi elaborado um novo manual de Aspergillus onde se incorporaram os avanços desde 1965 (Klich & Pitt, 1988). A existência de novas ferramentas e a necessidade de estabilidade na taxinomia destes géneros levou à criação de comissões de peritos em sistemática de Aspergillus e Penicillium e

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

em Fusarium para estes propósitos. A Comissão Internacional em Sistemática de Penicillium

e Aspergillus (ICPAS) foi criada em 1985 e é actualmente uma comissão da Sociedade

Microbiológica Internacional (IUMS). Os trabalhos internacionais de peritos contribuíram para a estabilidade e clarificação da taxinomia (Samson & Pitt, 1986; Samson & Pitt, 1990;

Samson & Pitt, 2000).

A taxinomia de Fusarium ainda está em evolução e muitas espécies não estão

tipificadas. Os manuais de identificação mais correntemente usados são os de Nelson et al. (1983) e Burgess et al. (1988). Na Comissão Internacional em Taxinomia em Fungos foi criada uma subcomissão para a sistemática de Fusarium. Adicionalmente aos manuais de identificação, foram criadas chaves assistidas por computador para alguns grupos de Penicillium e Fusarium, destinadas a investigadores que não identificam espécies destes géneros numa base regular, nomeadamente a PENNAME e a FUSKEY (Samson, 1991). Para fungos com dois estados, teleomorfo e anamorfo, criou-se uma nomenclatura dual. Se ambos estados estão presentes numa estirpe, o nome do teleomorfo é mais apropriado. Com a clarificação dos sistemas de classificação, o refinamento dos conceitos de espécie e com o estabelecimento de meios de cultura e condições de incubação padronizadas,

a identificação morfológica tornou-se uma tarefa mais simples. Para identificações rotineiras

de grandes números de estirpes, a identificação morfológica baseada em manuais e chaves ainda é a escolha de eleição. No entanto, certas espécies de fungos não são passíveis de identificação até à espécie apenas com base na morfologia, visto que constituem agregados de diferentes espécies definidas molecularmente e/ou com base no seu perfil metabólico. Após a identificação morfológica do agregado ou espécie sensu lato, é necessário usar outras técnicas de identificação específicas para discriminar as espécies num dado agregado. Com os avanços na taxinomia, emergiu um quadro mais claro sobre o habitat de cada

espécie e os seus requisitos ecofisiológicos para crescer e produzir micotoxinas (Frisvad & Samson, 1991).

A taxinomia, especialmente de Aspergillus e Penicillium, não é de momento um

entrave à micotoxicologia e emerge cada vez mais como uma porta aberta para as características ecofisiológicas das espécies que as produzem, apesar do peso do seu passado obscuro.

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

3.2.3. Características morfológicas usadas na classificação e identificação de Aspergillus

O género Aspergillus caracteriza-se pela produção de esporos assexuais se dar numa estrutura especializada característica do género, o aspergillum (pl. aspergilla: significa em latim globo perfurado que contém uma esponja ou pincel usado para aspergir água benta). A terminologia usada para designar as estruturas varia consoante ou autores. Nesta dissertação, é usada a terminologia seguida por Klich e Pitt (1988). Na Figura 1.7 está representado o conidióforo típico do género e a designação de cada estrutura.

típico do género e a designação de cada estrutura. Figura 1.7. Conidióforo de Aspergillus bisseriado (

Figura 1.7. Conidióforo de Aspergillus bisseriado (A. ochraceus) e terminologia das estruturas usadas na classificação e identificação. O conidióforo é constituído pelo aspergillum (designação que se dá à parte superior da estrutura, ou seja, o conjunto da vesícula e das células reprodutivas especializadas que contém) e pelo estipe. São visíveis nas figuras as métulas (células estéreis), fiálides (células conidiogénicas) e conidia (esporos assexuais) (barra de escala = 10 µm)

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

O estipe é normalmente asseptado, e termina na forma de um “T”, onde se une à hifa vegetativa. Esta porção basal designa-se de célula basal, mas faz parte do estipe. Existem dois tipos de aspergillum, unisseriados e bisseriados. O aspergillum bisseriado, ao invés do unisseriado, tem uma paliçada de células designadas metulae entre a vesícula e as fiálides. Algumas espécies de Aspergillus são capazes de se reproduzir por esclerócios (Figura 1.8). Os esclerócios são massas compactas de células assexuais, observáveis frequentemente a olho nú. Algumas espécies de Aspergillus produzem células de Hulle, que são células de paredes muito espessas e refringentes, de função desconhecida. Existem espécies de Aspergillus capazes de reprodução sexuada. Estes estados teleomórficos pertencem à família Trichomataceae dos Ascomycota, e são caracterizados pela formação de ascos que contém ascósporos (Figura 1.8). Os ascos estão dentro dum ascocarpo, geralmente um cleistotécio.

estão dentro dum ascocarpo, geralmente um cleistotécio. Figura 1.8. Outras estruturas de Aspergillus . Em cima,

Figura 1.8. Outras estruturas de Aspergillus. Em cima, à esquerda: esclerócios negros de A. alliaceus; em cima, direita: células de Hulle de Emericella sp. (setas); em baixo, à esquerda: cleistotécios de Eurotium vistos ao estereomicroscópio (estruturas de cor amarela); em baixo, à direita: preparação microscópica de Eurotium, em que são visíveis um conidióforo de Aspergillus, o cleistotécio, ascos e ascósporos soltos

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

As características microscópicas de maior valor na classificação e identificação das espécies de Aspergillus são o tipo de aspergillum, a forma e ornamentação dos esporos e a cor dos esporos. Para identificação dos teleomorfos, a natureza da parede do ascocarpo, bem como o tamanho, forma, ornamentação e cor dos ascósporos são parâmetros importantes. Além das características microscópicas, também são usadas características culturais em meios e condições de incubação padronizados, como o tamanho, cor e textura da colónia.

Classificação. O texto de referência quanto às espécies de Aspergillus é “The genus Aspergillus” de Raper e Fennell (1965). Os investigadores descreveram 18 grupos de espécies, que foram reclassificados em secções pertencentes a 6 subgéneros por Gams et al.

(1985) (Tabela 1.6). Desde então, houve algumas alterações quanto à classificação e nomenclatura das espécies, em particular dos teleomorfos, e novas espécies foram descritas. Em 2000 estavam descritas 182 espécies de Aspergillus (Pitt et al., 2000). A classificação seguida nesta dissertação é essencialmente a de Klich e Pitt (1988). Existem 9 teleomorfos de Aspergillus: Chaetosartorya Subram., Petromyces Malloch

& Cain, Neopetromyces, Fennellia, Emericella Berk. & Broome, Sclerocleista Subram.,

Hemicarpentales Sarbhoy & Elphick, Neosartorya Malloch & Cain, Eurotium Link: Fr. Os anamorfos de Aspergillus estão divididos em 6 subgéneros, de acordo com o tipo de estruturas conidiogénicas, cor dos conídios e a relação de crescimento em CYA e CYA20S (Tabela 1.7).

A cor dos conidia é frequentemente um intervalo de cores. A nomenclatura da cor e o

intervalo de cores aceite é definido com base em referências de livros de cor, como o “Methuen Handbook of colour” (Kornerup & Wanscher, 1978).

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

Tabela 1.6. Classificação do género Aspergillus

Subgéneros

Secção

Conidióforo

Cor dos conidia

 

CYA20S

 

/CYA f

Aspergillus

Aspergillus

Unisseriado

Verde a cinzento

 

> 2

Restricti Gams et al

 

Unisseriado

Muito

 

lento

Fumigati Gams et al.

Fumigati Gams et al

 

Unisseriado

Verde, azul a cinzento

 

< 2

Cervini Gams et al

 

Unisseriado

Laranja a cinzento

 

Ornati Gams et al.

Unisseriado

Cinzento, amarelo-verde , castanho azeitona

 

Clavati Gams et al.

Clavati Gams et al.

 

Unisseriado a

Cinzento a verde

 

Nidulantes Gams et al.

Nidulantes Gams et al.

 

Bisseriado d

Verde

Versicolores

Gams

et

Bisseriado e

Verde a azul

 
 

al.

Usti Gams et al.

 

Bisseriado

Castanho a castanho azeitona

 

Terrei Gams et al.

 

Bisseriado

Creme a laranja acastanhado

 

Flavipedes Gams et al.

 

Bisseriado

Branco a creme

 

Circumdati Gams et al.

Wentii Gams et al.

 

Bisseriado b

Creme,

amarelo

acastanhado

ou

 

castanho azeitona

 
 

Flavi Gams et al.

 

Unisseriado/

Amarelo

esverdeado

a

castanho

 
 

Bisseriado

azeitona

 

Nigri Gams et al.

 

Unisseriado/

Negros ou quase negros

 
 

Bisseriado

 

Circumdati

Bisseriado

Creme, amarelo ou ocre

 

Candidi Gams et al.

 

Bisseriado

Branco ou quase branco

 

Cremei Gams et al.

 

Unisseriado/

Castanho-pálido, amarelo ou verde azulado

 
 

Bisseriado

 

Sparsi Gams et al.

 

Bisseriado c

Cinza claro a azeitona creme

 

a vesículas clavadas; b unisseriado em espécies raras; c estipes constrictos abaixo da vesícula; d cél. Hulle abundantes; e cél. Hulle ausentes /raras; f razão entre o crescimento da colónia em CYA20S e em CYA

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

3.2.4. Características morfológicas usadas na classificação e identificação de Penicillium

No género Penicillium, os esporos assexuais produzem numa estrutura típica do género designada de penicillus (pl. penicilli, que em latim significa pincel). Os conidia nascem em cadeias produzidas pelas fiálides. As fiálides estreitam no ápice, e o pescoço designa-se collula (pl. collulae). As fiálides estão em verticilos no estipe, e assentam nele directamente ou com a intervenção de células de suporte especializadas conhecidas por metulae e rami (Figura 1.9). Nalgumas espécies, entre as metulae e os rami, podemos ter um nível adicional, os ramuli. O penicillus é toda a estrutura suportada pelo estipe. O conjunto do penicillus e do estipe designa-se por conidióforo. Os conidia são regra geral de cor verde, as fiálides têm pescoços curtos e paredes lisas.

verde, as fiálides têm pescoços curtos e paredes lisas. Figura 1.9. Conidióforos de Penicillium com penicilli

Figura 1.9. Conidióforos de Penicillium com penicilli do tipo mais simples (penicillus monoverticilado vesiculado de P. glabrum, direita) e complexo (penicillus terverticilado de estipe liso de P. brevicompactum, esquerda) (barra de escala = 10 µm)

Os tipos de penicilli distinguem-se pelo número de verticilos (pontos de ramificação) entre a fiálide e o estipe. O tipo de penicillus mais simples designa-se monoverticilado, pois a fiálide assenta directamente no estipe. É o penicillus que está representado na Figura 1.9 à

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

direita. O penicillus diz-se biverticilado se tem apenas métulas, e terverticilado se tem métulas

e ramos. Quando existem ramulos, o penicillus designa-se quaterverticilado. A classificação e identificação das espécies baseiam-se em caracteres microscópicos e culturais. Nos caracteres microscópicos, além do tipo de penicilli, são importantes a forma e tamanho das fiálides, em particular das collulae, a forma, tamanho cor e ornamentação dos conídios, e a textura do estipe, ramos e métulas (que pode ser lisa ou rugosa). Existem dois tipos de fiálides: ampuliformes e acerosas. As ampuliformes são semelhantes a garrafas (Figura 1.9) e as acerosas são semelhantes a agulhas de pinheiro, com lados paralelos que convergem numa forma cónica para um orifício estreito. As fiálides acerosas são características do subgénero Biverticillium. As restantes espécies têm regra geral fiálides ampuliformes. Nos caracteres culturais, são importantes o tamanho das colónias, a textura, cor, presença de exudado, pigmento solúvel, e presença, tamanho e cor de esclerócios. As espécies capazes de reprodução sexuada, envolvem a formação de cleistotécios ou gimnotécios.

Classificação. Este género é de taxinomia bastante complexa. A dificuldade de taxinomia

e identificação prende-se com a variabilidade inerente do género. Admite-se que cerca de 70 a

80% das estirpes são identificáveis morfologicamente com bastante confiança. No entanto, espera-se sempre uma dada proporção de estirpes extremamente difíceis de identificar (Pitt,

1988).

A classificação de Penicillium baseia-se nos conceitos de Raper e Thom (1949). Este manual foi usado universalmente por mais de duas décadas. Em 1979, John Pitt produziu a primeira revisão taxinómica de Penicillium, após 30 anos. Introduziu a classificação sub- genérica, e tipificou as espécies incluídas no manual. Em 2000 estavam reconhecidas 225 espécies de Penicillium (Pitt et al., 2000). A classificação seguida nesta dissertação bem como

a designação de estruturas segue o esquema seguido por os manuais de 1979 e 1988. Segundo

este esquema de classificação, os teleomorfos de Penicillium pertencem a dois géneros:

Eupenicillium Ludwig, com reprodução sexuada em cleistotécios, e Talaromyces Benjamin, com reprodução sexuada em gimnotécios. As espécies estritamente anamórficas são separadas em 4 subgéneros com diversas secções, de acordo com o tipo de estruturas conidiogénicas e forma de esporos.

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

Tabela 1.7. Classificação infragenérica de Penicillium

Subgénero

Penicilli

Secção

Aspergilliodes

Monoverticilados

 

Aspergilloides

estipe vesiculado a estipe não vesiculado

Dierckx

Exicaulis

Furcatum Pitt

biverticilados

com

fiálides

Divaricatum

penicilli irregulares

ampuliformes

Furcatum

penicilli regulares

Biverticillium

biverticilados

com

fiálides

Coremigena

penicilli em corémios ou synnemata penicilli sem synnemata

Dierckx

acerosas

Simplicia

Penicillium

terverticilados

Penicillium

a quaterverticilados

 

Coronatum

penicilli multiramulados penicilli irregularmente ramulados Conídios cilíndricos

 

Inordinate

Cylindrosporum

a o estipe diz-se vesiculado se tem uma dilatação na extremidade apical junto às fiálides (Figura 1.9, direita)

A distinção entre subgéneros e secções nem sempre é fácil, visto que ocasionalmente, uma estirpe pode apresentar penicilli de tipos diversos, como mono e biverticilados, ou biverticilados e terverticilados. Por isso, a classificação apresentada na tabela diz respeito aos penicilli predominantes na secção.

4.

Detecção, quantificação e identificação de fungos filamentosos em comodidades agrícolas e alimentos

A detecção, quantificação e identificação dos fungos em alimentos e comodidades agrícolas é essencial para se compreender e prever o fenómeno da produção de micotoxinas. Os métodos para a micologia alimentar desenvolveram-se a partir dos usados na patologia vegetal e bacteriologia alimentar, adequados para organismos que requerem actividades de água elevadas para crescer. A necessidade de métodos micológicos para análise dos alimentos fez-se sentir e novas abordagens foram discutidas tendo em vista uma eventual normalização internacional, que resultaram na formação dum grupo internacional, a Comissão Internacional de Micologia Alimentar (ICFM), sob os auspícios da divisão de micologia da IUMS. Dos encontros de especialistas, resultaram duas publicações importantes, que resumem os avanços da área: King et al. (1986) e Samson et al. (1992).

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

A amostragem é sempre um aspecto relevante de qualquer método de análise a comodidades agrícolas e alimentos. Os métodos de amostragem para fungos são semelhantes aos usados para propósitos bacteriológicos (ICMSF, 1986). A escolha dos métodos de detecção, quantificação e identificação de fungos em alimentos depende dos propósitos do estudo. Os fungos filamentosos podem estar presentes nos alimentos de 3 formas: i) no estado vegetativo, isto é, sob a forma de micélio sem produção de estruturas de reprodução especializadas; ii) no estado reprodutivo, com formação de esporos; iii) sob a forma de esporos ou estruturas de resistência. Nos dois primeiros casos, o fungo está a crescer no substrato, podendo produzir e excretar enzimas de degradação e/ou metabolitos secundários, como micotoxinas; no terceiro caso, podem colonizar o substrato, mas não estão activos metabolicamente. Conhecer a micoflora total do alimento ou comodidade agrícola pode ser relevante quando se quer conhecer a micoflora que pode estar presente em fases seguintes da produção (v.g., grãos destinados ao fabrico de farinha). Doutra forma, recomenda-se métodos que avaliem a micoflora que está a crescer no alimento, visto que é uma melhor medida da qualidade micológica inerente. Quanto ao modo de detecção de fungos em alimentos, existem métodos de cultivo, que detectam os propágulos fúngicos viáveis capazes de crescer em meio de cultura, e não cultivo, em que a detecção de fungos se faz através da detecção de compostos presentes na parede das hifas e/ou esporos por técnicas imunológicas ou moleculares, ou através da detecção de produtos do metabolismo fúngico no substrato (ácido glucónico, compostos voláteis, micotoxinas).

4.1. Métodos de cultivo

Os dois métodos de referência para estimar a presença de fungos em alimentos são o plaqueamento por diluição e o plaqueamento directo. O primeiro é adequado a alimentos líquidos ou em pó, e em situações onde o conhecimento total da micoflora é relevante. O segundo é adequado à análise de alimentos particularizados. Os alimentos podem ser desinfectados superficialmente com uma solução comercial de lixívia diluída dez vezes durante alguns minutos, para remover a contaminação superficial inevitável que se origina do pó e outras fontes, de forma a recuperar só os fungos que estão realmente a crescer nas partículas. Nos métodos por diluição, os resultados são expressos em contagens viáveis por

56

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

grama de amostra. No plaqueamento directo, os resultados são expressos em nº ou percentagem de partículas colonizadas ou infectadas.

A escolha dos meios de cultura e das condições de incubação devem ser adequadas ao

tipo de fungos a pesquisar. Os meios recomendados para a detecção, enumeração e isolamento

de fungos a partir de alimentos podem ser encontrados em Pitt e Hocking (1997). Existem meios generalistas e meios específicos (v.g. AFPA mencionado na secção anterior). Dois meios generalistas são amplamente usados em alimentos: agar com diclorano e 18% de glicerol (DG18), que se destina a pesquisar fungos capazes de crescer em alimentos secos, com baixas actividades de água, e o agar com diclorano, rosa de bengal e cloranfenicol (DRBC), que se destina à análise micológica de alimentos frescos, com actividades de água elevadas. Os meios de propósitos generalistas têm de cumprir vários requisitos:

inibir o crescimento bacteriano, sem afectar o crescimento fúngico;

serem nutricionalmente adequados e suportarem fungos de crescimento lento;

suprimirem o crescimento de fungos de crescimento rápido (v.g. Mucorales), sem o suprimirem completamente, para que possam ser detectados;

abrandar o crescimento dos fungos, de forma a permitir uma contagem razoável de colónias por placa, sem inibir a germinação dos esporos.

A combinação de diclorano e rosa de bengal restringe o crescimento das colónias e o

crescimento galopante de Rhizopus e Mucor no DRBC. No DG18, a baixa actividade de água e diclorano inibem o crescimento de Mucorales, geralmente irrelevantes para alimentos secos. Os métodos de cultivo permitem o isolamento das estirpes. Através da identificação das estirpes e da avaliação dos seu potencial toxigénico, podemos restringir as buscas a eventuais micotoxinas em alimentos e prever os perigos, o que traz inegáveis mais valias em termos de futuros estudos de investigação e implementação de programas de controlo de qualidade. Contudo, estes métodos não são adequados para avaliações rápidas da qualidade micológica de alimentos, visto que demoram semanas a conseguir resultados.

57

4.2. Métodos de não-cultivo

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

A nível industrial existe a necessidade de se detectarem fungos potenciais produtores

de micotoxinas ou medidas de crescimento fúngico que estejam relacionadas com a produção de micotoxinas o mais cedo possível, de forma a avaliar a qualidade dos produtos e fazer previsões sobre o risco de contaminação com micotoxinas. Técnicas rápidas de detecção que permitem identificar espécies de relevo para a produção de micotoxinas por métodos de não

cultivos foram desenvolvidas. Estes métodos podem avaliar produtos do metabolismo fúngico que estejam correlacionados com o crescimento ou a produção de micotoxinas e que sejam de fácil avaliação, como a determinação de compostos orgânicos voláteis (VOCs) através de narizes electrónicos (Olsson et al., 2002) ou outras técnicas (Demyttenaere et al., 2003), e foram sugeridos inclusivé cães treinados para detectar estes compostos (Kauhanen et al., 2002). Pelo perfil de VOCs, é possível em alguns casos identificar-se as espécies presentes (Magan e Evans, 2000). A detecção de VOCs é aplicada principalmente em ambientes fechados, como em armazéns. Métodos genéticos e imunológicos específicos para espécies produtoras de micotoxinas foram desenvolvidos para a detecção rápida de fungos em diversos alimentos (Niessen et al., 2004; Dewey & Meyer, 2004).

A observação directa da partícula alimentar, através de técnicas de microscopia óptica

ou electrónica, pode ser de grande utilidade para ver de que forma os fungos estão no substrato. Em caso de crescimento fúngico visível, a inspecção visual ao esteromicroscópio pode fornecer elementos sobre as espécies envolvidas ou sobre o modo de infecção. Outros métodos de detecção rápida de fungos em partículas individualizadas envolvem espectroscopia de infravermelhos com transformadas de Fourier (FT-IR). Estes métodos não são destrutivos, e têm aplicações na análise de partículas sólidas secas, como por exemplo grãos de milho (Gordon et al., 1997; Kos et al., 2002).

4.3. Quantificação de fungos em alimentos

A quantificação de fungos pode levar a medidas mais exactas do risco de contaminação com micotoxinas. Devido às diferentes formas de estar nos alimentos, quantificar fungos filamentosos por contagem de células viáveis apresenta dificuldades maiores que quantificar bactérias ou leveduras, visto que quando ocorre esporulação, podem

58

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

ser produzidos esporos em grande número, que causam aumentos na contagem de células viáveis, mas não na biomassa (Pitt & Hocking, 1997). A biomassa pode ser quantificada mais exactamente com recurso a diversas técnicas, como ergosterol (Saxena et al., 2001) e PCR em tempo real (Filion et al., 2003).

5. Métodos de determinação de micotoxinas

A determinação de micotoxinas faz-se através de métodos analíticos adequados à

finalidade a que se destinam. Vão ser aqui discutidos dois aspectos distintos: a avaliação da capacidade micotoxigénica das estirpes e a determinação das micotoxinas em alimentos.

A determinação da capacidade micotoxigénica de estirpes de fungos pode ser relevante

para avaliar o potencial duma dada estirpe produzir uma dada micotoxina (rastreio) ou para propósitos taxinómicos.

A detecção e quantificação de micotoxinas em alimentos é essencial para avaliar as fontes

de exposição das populações às micotoxinas, e para gerir e controlar os níveis de micotoxinas nos produtos alimentares.

5.1. Métodos

fungos

de

determinação

da

produção

de

micotoxinas

por

Para fins de rastreio ou para propósitos taxinómicos, a produção de micotoxinas por estirpes fúngicas em cultura pura faz-se em condições padronizadas. Geralmente, os meios de cultura usados são YES ou agar de Czapek com extracto de levedura (CYA). As culturas são incubadas durante 7 dias, a 25 ºC. A preparação das culturas é muito simples, consistindo em retirar porções de diferentes zonas da colónia com um fura-rolhas de diâmetro conhecido. As análises fazem-se a cerca de 3 cilindros de cultura e os resultados, quando quantitativos, são expressos por gramas de agar. Para rastreio de produção de metabolitos secundários por fungos, os métodos cromatográficos são os mais populares, em particular a cromatografia em camada fina (TLC) e a cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) ou a cromatografia gasosa (GC).

59

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

O GC é usado principalmente para análise de tricotecenos tipo A, que não se separam

convenientemente por HPLC.

O TLC é uma técnica muito usada na quimiotaxonomia, para análise do perfil dos

metabolitos. O procedimento mais usado é pressionar os cilindros de agar contra a placa de TLC, secar e correr com fase móvel. Os compostos presentes são separados de acordo com as suas afinidades para a fase móvel e fase estacionária. A identificação dos compostos faz-se pelo seu factor de retenção (Rf), que é dado pela razão entre a distância (cm) migrada pelo composto e a distância total migrada pelo solvente, e pela cor dos metabolitos a diferentes comprimentos de onda (v.g., visível, UV). Existem bases de dados com o Rf e cor dos metabolitos, que podem ser usadas para identificações presuntivas (Paterson & Bridge, 1994), bem como padrões para algumas micotoxinas, que são usadas para fins comparativos. As

principais vantagens do TLC são o seu baixo custo e a sua rapidez. As principais limitações são o limite de detecção relativamente elevado, a falta de precisão e quantificação limitada. Estas limitações são ultrapassadas com a análise dos metabolitos por HPLC.

A cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) é um método que permite limites de

detecção muito baixos, com detecção por UV ou fluorescência, e uma quantificação mais exacta. É um método cromatográfico através do qual se separam os compostos numa amostra pela sua afinidade relativa para uma fase estacionária (coluna) e uma fase móvel. Um volume conhecido duma amostra líquida é injectado na coluna. Para obter uma amostra líquida, os cilindros de meio de cultura são extraídos com um solvente. Os compostos eluídos pela coluna passam por um detector (mais usualmente, UV ou fluorescência, dependendo das propriedades físicas do analito de interesse) e comparando a resposta do detector com quantidades conhecidas da micotoxina (curva de calibração), quantifica-se o composto presente na amostra. O resultado da análise é um cromatograma com diversos picos, identificados pelo seu tempo de retenção, isto é, pelo tempo que o composto tarda a ser

eluído.

5.2. Métodos de determinação de micotoxinas em alimentos

A detecção e a quantificação de micotoxinas em alimentos apresentam um problema

inerente, que é a distribuição não uniforme das micotoxinas no lote (secção 2.5, p. 36). A

amostragem é apontada como a principal fonte de variação dos resultados. Normalmente só uma pequena percentagem de partículas alimentares está contaminada, de distribuição não

60

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

homogénea na comodidade alimentar a analisar. No caso de produtos líquidos (leite, vinho) ou homogeneizados (v.g., farinhas), estes problemas são menos relevantes, visto que se assume que o lote está homogéneo.

A detecção e quantificação de micotoxinas em alimentos consistem geralmente em 3

passos: amostragem; preparação da amostra; análise da micotoxina.

5.2.1. Amostragem

Regra geral, o procedimento é o seguinte: a amostragem deve ser aleatória, tendo as diferentes partículas a mesma probabilidade de ser escolhidas. Como as partículas contaminadas podem não estar uniformemente distribuídas pelo lote, as amostras devem ser compostas de pequenas porções recolhidas de diferentes locais. Desta forma, constitui-se a amostra composta (Ing. bulk sample). Se a amostra composta é demasiado grande para ser analisada, deve ser homogeneizada e subdividida. A unidade mais pequena usada para estimar a concentração do lote designa-se de amostra-teste. Os métodos de colheita de amostras para análise oficial de alimentos (número de amostras analisadas e dimensão) estão fixados para diversos compostos e alimentos por directivas comunitárias (98/53/CE; 2002/26/CE).

5.2.2. Preparação da amostra

A amostra teste deve ser homogeneizada num moinho ou misturadora. Quanto menor o

tamanho das partículas, mais homogeneizada estará a amostra. No caso de alimentos sólidos, após redução do tamanho das partículas em moinhos, faz-se uma pasta semi-sólida numa misturadora, com água ou outro solvente. Depois, retira-se uma sub amostra, onde se faz a análise da micotoxina.

5.2.3. Procedimento analítico

Independentemente

do

método

analítico

usado,

a

análise

de

micotoxinas

envolve

extracção, limpeza e determinação.

 
 

61

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

Extracção. A extracção, no caso de alimentos sólidos, implica a passagem da micotoxina do sólido para uma fase líquida. Desta forma, obtém-se a micotoxina em concentrações possíveis de serem analisadas. Assume-se que a micotoxina vai estar igualmente distribuída na fase líquida e excluída da fase sólida da mistura. A validade desta assunção vai reflectir-se nas taxas de recuperação do método. Tipicamente, usam-se solventes orgânicos ou misturas de solventes orgânicos e água para extrair micotoxinas de alimentos sólidos. A forma física de misturar o solvente com o alimento influencia a eficiência de extracção. Pode-se agitar ou usar misturadoras para garantir um bom contacto entre o líquido de extracção e o alimento sólido. Tipicamente, usam-se misturadoras durante alguns minutos ou agitação durante 30 minutos a 2 horas. Procedimentos que envolvem misturadoras são mais rápidos, mas tem de

se assegurar que a totalidade da amostra está continuamente em contacto com o solvente e que não há zonas mortas ou estagnadas. Se se analisa um número considerável de amostras, a agitação é preferível (CAST, 2003).

Limpeza. A limpeza da amostra é feita após a extracção, para remover do extracto líquido impurezas antes do passo determinativo ou quantificativo. A limpeza consiste em isolar a micotoxina do extracto, e pode servir para concentrar a micotoxina. Este passo não é requerido em todos os procedimentos analíticos (v.g., ELISA), mas na maioria dos

procedimentos de rastreio e confirmatórios é necessário, para adquirir a selectividade e sensibilidade desejada. Geralmente, a limpeza de extractos faz-se recorrendo a colunas de extracção em fase sólida (SPE). O enchimento das colunas SPE é normalmente de sílica porosa, cuja superfície foi modificada para permitir uma adsorção selectiva do analito ou das impurezas. Quando se passa o extracto líquido, se o analito é retido, as impurezas são lexiviadas. Retira-se selectivamente o analito por modificação da solução de lavagem. Se a coluna retém as impurezas, o analito permanece no extracto líquido, e não é necessário um segundo solvente. As colunas de imunoafinidade (IAC) são uma forma de colunas SPE. Neste caso, estão ligados anticorpos para o analito num material inerte. Os anticorpos são altamente específicos,

e as impurezas passam. O analito é depois removido da coluna com um solvente que

desnatura o anticorpo. Existem colunas de imunoafinidade disponíveis para aflatoxinas, OTA, fumonisinas, zearelanona e DON. Por vezes, interacções não específicas entre componentes da matriz e o material de enchimento podem afectar o processo de limpeza, mas em geral, as

IACs são muito eficientes a remover impurezas. Como são os anticorpos que determinam a

62

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

especificidade do processo de limpeza, factores que influenciem a actividade dos anticorpos vão influenciar a capacidade da coluna se ligar às micotoxinas e a capacidade de recuperar a toxina dos alimentos. Por isso, é essencial que estejam anticorpos suficientes na coluna para se ligarem a concentrações elevadas de micotoxinas. Para obter resultados exactos e reprodutíveis, factores como a força do solvente aplicado na coluna, a velocidade do fluxo e o volume de extracto devem estar de acordo com as instruções dos fabricantes. Determinação. Existem diferentes métodos de determinação de micotoxinas, consoante os objectivos, que se classificam em dois tipos: métodos de rastreio e métodos confirmatórios. Os métodos de rastreio são de determinação rápida, mas são pouco rigorosos na quantificação. Como exemplo destes métodos temos os kits de ELISA, disponíveis comercialmente para várias micotoxinas. Os métodos confirmatórios permitem conhecer de forma mais exacta os níveis de micotoxina presentes, bem como confirmar a identidade do analito. Envolvem normalmente determinação da micotoxina por técnicas cromatográficas como HPLC ou GC. Confirmação da identidade de analitos. A identidade presuntiva do analito faz-se por comparação com o padrão. Em caso de dúvida ou face a uma situação não descrita, a identidade do analito pode ser confirmada por recurso a processos de derivatização do analito, que lhe alterem as propriedades (v.g. tamanho do pico e tempo de retenção em HPLC; cor da banda em TLC), ou por análise do espectro (UV, fluorescência ou espectro de massa).

5.3. Validação de métodos

Assume-se como princípio básico da validação de resultados:

Um resultado para ser dado como válido tem de satisfazer os requisitos de qualidade que lhe sejam exigidos” (Comissão Técnica RELACRE CTR03, 1996)

Um método de ensaio é um processo que envolve manipulações susceptíveis de acumular erros, podendo assim em algumas situações alterar de forma significativa o resultado final. A validação dos métodos permite através de critérios objectivos mostrar que os métodos conduzem a resultados credíveis e adequados à qualidade pretendida. Duas das medidas da avaliação da qualidade dum resultado são a exactidão e a precisão. A exactidão é a concordância entre o valor obtido e o valor convencionalmente

63

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

aceite como verdadeiro. A precisão é definida como a concordância entre os resultados obtidos por aplicação do mesmo procedimento de ensaio várias vezes em materiais idênticos, em condições definidas. A precisão está dividida em dois conceitos distintos: repetibilidade e reprodutibilidade. A repetibilidade refere-se à precisão obtida “nas mesmas condições (mesmo laboratório, mesmo operador e equipamento, durante um curto intervalo de tempo)”. A reprodutibilidade refere-se à precisão obtida fazendo variar as condições (diferentes laboratórios, operadores, equipamentos, e/ou tempos). A variabilidade dos resultados num laboratório a longo prazo é uma situação intermédia das definições anteriores. Designa-se por precisão intermédia a concordância dos resultados obtidos no próprio laboratório, em ensaios espaçados no tempo e independentes, aplicando o mesmo método de análise à mesma amostra e nas condições normais de funcionamento do laboratório com respeito aos operadores e equipamento utilizado. A medida de avaliação da precisão dum método é o desvio padrão relativo (RSD) dos resultados. O RSD é calculado dividindo o desvio padrão dos resultados pela média dos resultados. O RSD r é o desvio padrão relativo em condições de repetibilidade, e o RSD R desvio padrão relativo em condições de reprodutibilidade. A definição de valor convencionalmente aceite como verdadeiro tem originado controvérsia. Actualmente, é internacionalmente aceite como valor convencionalmente verdadeiro o valor de um Material de Referência Certificado (MRC) ou o valor médio obtido em ensaios interlaboratoriais apropriados. Os MCR, na definição da Organização Internacional de Normas (ISO), são materiais certificados para valores de uma ou mais propriedades certificadas por um procedimento técnico válido, acompanhado de um certificado emitido pela entidade certificadora. Estes materiais têm portanto níveis de micotoxinas rigorosamente definidos. Podem ser naturais ou artificialmente contaminados. Em qualquer dos casos, a amostra sofreu análises substanciais em múltiplos laboratórios para estabelecer a concentração de micotoxina. Os MRC para micotoxinas são fornecidos pelo Programa de Testes da Comissão Europeia e pelo seu predecessor, Bureau Communautaire de Référence (BCR). Estão disponíveis em diferentes níveis para matrizes legalmente e economicamente importantes. Para estabelecer procedimentos analíticos dentro dum laboratório, recomenda-se que o estudo dum procedimento analítico seja feito na matriz (ou matrizes) desejada e que se avaliem vários critérios de aceitação, como a repetibilidade e reprodutibilidade, para amostras contaminadas artificialmente e naturalmente contaminadas. A exactidão do método deve ser

64

CAPÍTULO 1. MICOTOXICOLOGIA

comparada com outro método validado ou com MRC. Recomenda-se ainda que os estudos de validação sejam feitos em níveis próximos dos regulamentados pela UE. A UE definiu critérios específicos de desempenho para os métodos de análise destinados ao controlo oficial de micotoxinas. Regra geral, os métodos devem ter uma taxa de recuperação entre 70 a 110% e valores de RSD r e RSD R menor ou igual a 20 e 30%, respectivamente (Directiva 98/53/CE da Comissão de 16 de Julho de 1998 que fixa os métodos de colheita de amostras e os métodos de análise para o controlo oficial dos teores de certos contaminantes nos géneros alimentícios 2 ; Directiva 2002/26/CE da Comissão, de 13 de Março de 2002, que fixa os métodos de colheita de amostras e de análise para o controlo oficial do teor de ocratoxina A nos géneros alimentícios 3 ; Directiva 2002/27/CE da Comissão, de 13 de Março de 2002, que altera a Directiva 98/53/CE, que fixa os métodos de colheita de amostras e os métodos de análise para o controlo oficial dos teores de certos contaminantes nos géneros alimentícios 4 ). A validação de métodos analíticos para controlo oficial dos níveis de micotoxinas em alimentos deve ser levada a cabo a um nível nacional e internacional, de acordo com protocolos internacionais harmonizados para estudos colaborativos da IUPAC/AOAC/ISO. Os métodos validados podem ser adoptados como métodos oficiais internacionais ou como normas europeias por organismos como a AOAC internacional ou CEN. Qualquer método validado e adoptado pela AOAC internacional, CEN ou ISO é reconhecido como um método oficial para os propósitos de comércio internacional.

2 Disponíveis na URL: http://europa.eu.int/eur-lex/pri/pt/oj/dat/1998/l_201/l_20119980717pt00930101.pdf

3 Disponíveis na URL: http://europa.eu.int/eur-lex/pri/pt/oj/dat/2002/l_075/l_07520020316pt00380043.pdf

4 Disponíveis na URL: http://europa.eu.int/eur-lex/pri/pt/oj/dat/2002/l_075/l_07520020316pt00440045.pdf

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