UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE

GROHMANN

FACULTAD DE INGENIERIA

ESCUELA AACDEMICO PROFESIONAL DE
INGENIERIA QUIMICA

Bioqumica

Practica de laboratorio N: 04
Carbohidratos III- parte

PROFESORA: Ing. Elia Cabrera Navarrete

ALUMNO: Jhonatan Walter Flores Mamani

CODIGO: 2012-36029

GRUPO: B

FEHCA DE REALIZACION: 24 de septiembre del 2013

FECHA DE ENTREGA: 1 de octubre del 2013

TACNA-PERU

2013



A. OBJETIVOS:
- Determinar azucares reductores, mediante el mtodo de MILLER
modificado por Mandels.

B. FUNDAMENTO TEORICO:
Los carbohidratos son molculas formadas por carbono, hidrogeno y
oxgeno. Todos los carbohidratos son azucares pequeos, solubles en agua
(glucosa y fructuosa, por ejemplo) o bien cadenas, como el almidn y la
celulosa, que se elaboran enlazando subunidades de azcar. (Audesirk
Audesirk, & Byers, 2003)
En la naturaleza, los carbohidratos se presentan como monosacridos
(azucares simples), oligosacridos (contienen de dos a diez unidades
monosacridas) y polisacridos (glcidos polmeros ms grandes). Los
monosacridos se clasifican en aldosas si tienen el grupo aldehdo y
cetosas si tienen el grupo cetona. Todos los monosacridos, aldosas a
cetosas y la mayora de los disacridos son azucares reductores (excepto la
sacarosa) porque uno de sus carbonos anomricos no est formando
enlace glucosdico. (Berg, Stryer, & Tymoczko, 2008) las pruebas de Fehling
y de Benedict, por ejemplo se basan en la capacidad de los azucares
reductores de reducir los iones cpricos (CU
2+
) y aportan un ensayo
sencillo para reconocer azucares que pueden existir como aldehdo o
cetona libre. Los azucares que reaccionan se llaman azucares reductores,
que pueden unirse de forma inespecfica a otras molculas; los que no lo
hacen, azucares no reductores. (Armstrong & Bennet 1982)
El mtodo DNS es una tcnica colorimtrica que emplea 3,5-
acidodinitrosalicilico para la hidrolisis de los monosacridos presentes en
una muestra, seguido de la determinacin espectrofotomtrica a 540 nm
de los azucares reductores. Esta tcnica sirve para cuantificar los azucares
reductores producidos durante una fermentacin o para cuantificar los
productos en una reaccin enzimtica. Por lo tanto se aplicara esta tcnica
para la construccin de una curva patrn de glucosa que ser nuestra
referencia.

C. MATERIALES Y RACTIVOS:
MATERIALES:
- Cocina elctrica
- Tubos de ensayo
- Fiola de 500 ml, 25 ml, 50
ml
- Vaso de precipitado
- Bombilla de succin
- Esptula
- Pipetas
- Luna de reloj
- Probeta
- Vagueta
- Balanza analtica
- Gradilla
- espectrofotmetro
REACTIVOS:
- DNS
- Agua destilada
- Glucosa miel



D. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:
a) Pesamos 1 g de miel y lo diluimos en una Fiola de 100 ml.














b) Luego sacamos de la Fiola 1 ml y lo diluimos en una Fiola de 50 ml,
retiramos nuevamente 1 ml de la Fiola y lo diluimos en una de 25 ml.















c) Finalmente retiramos 1 ml de la ltima Fiola y la agregamos en un
tubo de ensayo y agregamos 3 ml de DNS.





100 ml
100 ml
50 ml
50 ml
25 ml
25 ml
Muestra



d) Preparamos una solucin en blanco que es DNS con agua destilada.






Preparacin de la curva estndar de la glucosa:
a) Preparamos una solucin de 0.5g de glucosa en medio litro de agua
destilada; luego medimos alcuotas de: 0.25, 0.50, 0.75 y 1 ml.














b) Luego completamos las alcuotas con agua destilada hasta 1 ml en el
tubo de ensayo, agregamos el reactivo de DNS.






c) Despus de tener los tubos los llevamos a bao mara.

0.25 ml
0.50 ml 0.75 ml 1.00 ml
DNS











d) Luego llevamos los tubos junto con el tubo del ensayo anterior al
espectrofotmetro para leer las absorbancias de cada uno a unos 550
nm.













E. RESULTADOS EXPERIMENTALES:
La lectura en el espectrofotmetro fueron los siguientes:
MUESTRA MEDIDA, nm
Solucin en blanco 0.041
Alcuota de 0.25 ml 0.101
Alcuota de 0.50 ml 0.180
Alcuota de 0.75 ml 0.211
Alcuota de 1 ml 0.246
miel 0.048


INSTRUCCIONES:
- Se escoge la opcin absorbancia en el
espectrofotmetro
- Luego se elige la longitud de onda con la que
vamos a trabajar.
- Se calibra el espectrofotmetro con una prueba
en blanco que un una celda con agua destilada.
- Se introduce la celda con la muestra que vamos
a analizar.

Muestra




a) Al homogenizar las soluciones con agua destilada se obtuvo soluciones
perfectas porque todas estas soluciones eran incoloras.
b) Tuvimos con resultados las siguientes concentraciones:
Formula:

Glucosa:

- La concentracin del tubo con solo agua, en este caso es de 0, ya que
no posea muestra alguna; siendo esta la concentracin C 2(1).

c) Al agregar el reactivo de DNS a los tubos de ensayo la solucin que
obtuvimos fue una solucin de color naranja fuerte.
d) Al calentar los tubos en bao Mara, se observ diferencias en la
coloracin por la concentracin de cada tubo; amarillo el que contiene solo
agua hasta el anaranjado intenso que contiene solo a la glucosa,
obtenindose as una gama de soluciones patrn, en el caso dela glucosa,
ya que de la miel, se obtuvieron dos muestras parecidas, que a simple vista
no podan distinguirse a pesar de llevarlas al bao Mara.









Muestra
de Miel
Agua
Muestra Patrn
(Glucosa)









Reaccin:









En esta reaccin podemos observar que el reactivo DNS (cido 3,5-
dinitrosaliclico) se redujo por la presencia de la glucosa al cido 3-amino-
5-nitro saliclico, de color anaranjado, y dando como sub-producto al cido
D-glucnico.
e) Las absorbancias medidas con el espectrofotmetro de los diferentes tubos
fueron:
a. Tubo con H2O: 0.041
b. Tubo con 0.25 ml de glucosa: 0.101
c. Tubo con 0.5 ml de glucosa: 0.180
d. Tubo con 0.75 ml de glucosa: 0.211
e. Tubo con 1 ml de glucosa: 0.246
f. Tubo M2 : 0.038
g. Tubo M3 : 0.048
f) Con los datos de absorbancia obtenidos podemos determinar la
concentracin de la muestra (Miel):
Hallamos la regresin, con ayuda de la calculadora cientfica.
Y= a X + b
Dnde:
a = 20.92
b = -2.57x10
-4

Calculamos X (concentracin) usando y (como la absorbancia medida),
con la ecuacin anterior:

M
2
:

X= 1.82x10
-3

M
3
:

X= 2.30x10
-3

g) Tabulamos y graficamos los datos obtenidos:


Muestras 1 ml Agua M
2
(miel) M
3
(miel) 0.25ml glucosa 0.50ml glucosa 0.75ml glucosa 1 ml glucosa
X 0 1.82x10
-3
2.30x10
-3
0.0025 0.0050 0.0075 0.01
Y 0.041 0.038 0.048 0.101 0.180 0.211 0.246

X = concentracin de los azucares reductores.
Y = absorbancia de los azucares reductores.
Grfica:













F. CUESTIONARIO
a. Investigue la preparacin del reactivo que se emple para
cuantificar los azcares reductores y qu se debe de considerar
antes de efectuar el anlisis.
M
2(miel)

M
3(miel)

0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
-0.001 0.001 0.003 0.005 0.007 0.009 0.011
A
b
s
o
r
v
a
n
c
i
a
s

concentraciones de los azucares



DNS
Se disuelven los reactivos Hidrxido de sodio, Tartrato de sodio y potasio
(KNaC4H4O6*4H2O), Fenol, Metabisulfito de sodio (Na2S2O5) en
aproximadamente 600ml de agua destilada.2.
Se adiciona el cido 3,5 dinitrosaliclico (DNS) poco a poco hasta lograr
una completadisolucin.3.
Se afora a 1 litro de agua destilada. La solucin debe guardarse en frasco
mbar y alejado de la luz, a temperatura ambiente durando hasta dos
meses, antes de mostrar precipitacin o vestigios de descomposicin.
Lo que se debe considerar antes de efectuar el anlisis, es el orden de muestras,
como el de sus concentraciones, adems de contar siempre con un blanco y
equipo bien calibrado para obtener datos ptimos.

b. Describa otro u otros mtodos para determinar los azucares
reductores.
REACCION DEL ACIDO MUCICO
Este ensayo permite la identificacin de la galactosa o de los
azcares que la contienen. El cido ntrico oxida tanto al grupo
aldehdo como al alcohlico primario de cualquier azcar para
originar cidos dicarboxlicos que han recibido el nombre general de
cidos sacricos. El cido mcico o galactrico es el menos soluble
en agua acidificada de todos los cidos sacricos.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Colocar 700 mg de galactosa, glucosa y de la sustancia problema en
distintos tubos de ensayo, a continuacin aadir 1 ml de agua y 1
ml de HNO3 a cada tubo. Calentar los tubos en un bao de agua
hirviendo durante una hora y luego se dejan enfriar lentamente. La
reaccin debe considerarse positiva si aparece un precipitado blanco
de cristales de cido mcico.

REACCION DE MOLISCH

Este ensayo permite detectar la presencia de hidratos de carbono en
una muestra; se basa en la accin hidrolizante y deshidratante que
ejerce el cido sulfrico sobre estos compuestos. Como se sabe, los
cidos concentrados originan una deshidratacin de los azcares
para rendir furfurales, que son derivados aldehdicos del furano. Los
furfurales se condensan con los fenoles para dar productos



coloreados caractersticos, empleados frecuentemente en el anlisis
colorimtrico.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

En un tubo de ensayo se depositan 10 ml de una disolucin al 5%
de la muestra a ensayar, en un segundo tubo de ensayo se deposita
la misma cantidad de una disolucin tambin al 5% de un hidrato
de carbono conocido (glucosa). Se aaden unas gotas de reactivo de
Molisch (-naftol al 5% en etanol) y se mezcla el contenido.
Inclnense los tubos y djese resbalar cuidadosamente 1 ml de cido
SO4H2 concentrado a lo largo de la pared del tubo de manera que
se forme una capa bajo la fase acuosa. A continuacin se calientan
los tubos en un bao de agua unos minutos. La reaccin es positiva
si se forma un anillo rojo violceo en la interfase. Esta reaccin la
dan todos los azcares por lo que debe llevarse a cabo evitando la
presencia de restos de papel de filtro o materiales similares en los
tubos de ensayo. REACCION DE FEHLING

Este ensayo pone de manifiesto la presencia de azucares reductores
(aldosas: glucosa, ribosa, eritrosa, etc.). Se trata de una reaccin
redox en la que el grupo aldehdo (reductor) de los azcares es
oxidado a grupo cido por el Cu2+ que se reduce a Cu+. Tanto los
monosacridos como los disacridos reductores reaccionan con el
Cu2+ dando un precipitado rojo de xido cuproso. La reaccin tiene
lugar en medio bsico por lo que es necesario introducir en la
reaccin tartrato sdico-potsico para evitar la precipitacin del
hidrxido cprico. La prueba de Fehling no es especfica; otras
sustancias que dan reaccin positiva son los fenoles, aminofenoles,
benzona, cido rico, catecol, cido frmico, hidrazobenceno,
fenilhidrazina, pirogalol y resorcinol.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

El reactivo de Fehling consta de dos disoluciones que se mezclan a
partes iguales en el momento de su utilizacin. La solucin I est
formada por CuSO4* 5H2O al 7% en agua y la solucin II por
tartrato sdico-potsico al 35% en NaOH al 10% en agua. En un
tubo se disuelven 500 mg de la sustancia a ensayar en 5 ml de
agua. Se procede de igual manera con otros tubos que contengan
azcares reductores y no reductores conocidos. A continuacin se
aaden a todos los tubos 5 ml del reactivo de Fehling.



Finalmente se someten a ebullicin en bao de agua durante 5
minutos. La reaccin debe considerarse positiva si se forma un
precipitado rojo de xido cuproso.

REACCION DE BARFOED

Este ensayo se emplea para diferenciar a los mono de los
disacridos.
Estos ltimos reaccionan ms lentamente con el acetato cprico,
debido probablemente al tamao molecular, aunque tambin
pueden estar implicados otros factores tales como una interaccin
ms compleja con los dos anillos monosacridos.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
El reactivo de Barfoed se prepara aadiendo 2.5 ml de cido actico
al 38% en agua a 100 ml de acetato cprico al 6.6% en agua. Se
disuelven 500 mg de la sustancia a ensayar en 5 ml de agua y se
aaden 5 ml del reactivo de Barfoed. Se repite la operacin con
muestras de mono y disacridos conocidos. Posteriormente se
someten a ebullicin en bao de agua y se anotan los distintos
tiempos de formacin del precipitado.

c. Escriba la Reaccin Qumica de Hidrolisis.











G. CONCLUSIONES:
- Las concentraciones de las soluciones influye bastante en el color de
estas.
- El DNS hidroliza a la glucosa y produce acido D-glucnico.
- El espectrofotmetro mide con exactitud las absorbancias de las
concentraciones de una solucin.






H. BIBLIOGRAFIA:
- http://acasti.webs.ull.es/docencia/practicas/5.pdf
- http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-
mol/pdfs/31%20INVERTASA%20ENSAYO.pdf
- http://espanol.answers.yahoo.com/question/index?qid=20080516154
947AAQVLjk
- http://es.scribd.com/doc/17151688/1Hidrolisis-de-carbohidratos
- http://www.slideshare.net/xilberferbeltranfernandez/asistente-para-
organigrama
- http://es.scribd.com/doc/14424586/DNS-una-tecnica-para-la-
cuantificacion-de-azucares-reductores
- http://es.scribd.com/doc/56421369/DETERMINACION-DE-
AZUCARES-REDUCTORES-POR-LA-TECNICA-DE-MILLER