Espcies Ativas de Oxignio na Resposta de Defesa de Plantas

a Patgenos
Mrio Lcio V. Resende, Snia M. L. Salgado & Zuleide M. Chaves
Departamento de Fitopatologia, Universidade Federal de Lavras, Cx. Postal 37, Lavras, MG,
CEP 37200-000, e-mail: mlucio@ufla.br
(Aceito para publicao em 31/01/2003)
Autor para correspondncia: Mrio Lcio V. Resende
RESENDE, M.L.V., SALGADO, S.M.L. & CHAVES, Z.M. Espcies ativas de oxignio na resposta de defesa de plantas a patgenos.
Fitopatologia Brasileira 28:123-130. 2003.
RESUMO
A exploso oxidativa uma resposta de defesa da planta
aps o reconhecimento do patgeno, conduzindo reao de hipersen-
sibilidade (HR). Esta resposta devido gerao de espcies ativas
de oxignio (ROS ou EAOs), tais como H
2
O
2
, O
2
-
, e OH
-
As espcies
ativas de oxignio possuem vrias funes na resposta de defesa da
planta. Perxido de higrognio (H
2
O
2
) pode ser diretamente txico
ao patgeno e est envolvido com o fortalecimento da parede celular,
uma vez que o H
2
O
2
necessrio para a biossntese de lignina. Per-
xido de hidrognio

atua tambm como mensageiro secundrio, sendo
responsvel pela ativao da hidrolase do cido benzico, enzima
responsvel pela converso do cido benzico em cido saliclico. A
exploso oxidativa no est confinada somente HR macroscpica,
uma vez que exploses oxidativas secundrias podero ocorrer nos
tecidos distantes, causando micro-HRs e conduzindo resistncia
sistmica adquirida (SAR), a qual mediada pelo cido saliclico como
um sinal. Portanto, a ocorrncia de HR e SAR dependente da cascata
de sinalizao derivada da exploso oxidativa, que por sua vez um
evento inicial na resposta da planta contra a invaso do patgeno.
Palavras-chave adicionais: resistncia, exploso oxidativa,
HR, SAR.
ABSTRACT
Reactive oxygen species on plant defense responses to pathogens
Oxidative burst is a very quick plant defense response
after pathogen recognition, leading to hypersensitive reaction
(HR). This response is due to generation of reactive oxygen
species (ROS), such as H
2
O
2
, O
2
-
, and OH
-
. Several roles in
plant defense have been proposed for ROS. Hidrogen peroxide
(H
2
O
2
)
,
apart from being directly toxic to pathogens, is also involved
in cell wall strengthening, since it is necessary for lignin
biosynthesis. Hidrogen peroxide acts as a second messenger, being
responsible for the activation of the benzoic acid 2-hydrolase,
enzyme responsible for benzoic acid conversion to salycilic acid.
Oxidative burst is not only confined to the macroscopic site of
HR, since secondary bursts can occur in distant tissues, causing
micro-HRs and leading to systemic acquired resistance (SAR),
which is mediated by salycilic acid as a signal. Therefore,
occurrence of both HR and SAR are dependent on signaling
cascades derived from oxidative burst, as an early event in plant
response against pathogen invasion.
REVISO / REVIEW
INTRODUO
As interaes planta-patgeno so classificadas em
compatveis (patgeno virulento e hospedeiro suscetvel) e
incompatveis (patgeno avirulento e hospedeiro resistente).
Nas interaes incompatveis, o sistema de defesa da planta
eficientemente ativado, conduzindo resistncia, mas
tardiamente ativado ou no ativado em interaes compatveis,
condicionando a doena. A presena de um gene de resis-
tncia, dominante na planta (R) e um gene de avirulncia
dominante no patgeno (Avr) condiciona a incompatibilidade
em interaes gene-a-gene.
A infeco por patgenos avirulentos induz uma srie
de respostas de defesa freqentemente resultando no colapso
localizado de clulas vegetais conhecido como reao de
hipersensibilidade (HR) (Stakawicz et al., 1995). Nessa
reao, h a produo de intermedirios reativos de oxignio,
conhecidos como Reactive Oxygen Intermediates (ROI) ou
Reactive Oxygen Species (ROS), ou ainda Espcies Ativas
de Oxignio (EAOs), incluindo o O
2
.-
, H
2
O
2
e OH
.
(Hegedus
et al., 2001).
A exploso oxidativa participa de um sistema integrado
e amplificado de sinalizao, que envolve o cido saliclico e
clcio (Ca
2+
) citoslico no disparo dos mecanismos de defesa
(Lamb & Dixon, 1997). O desenvolvimento da HR, inicial-
mente desencadeado pela presena de espcies ativas de
oxignio, promove o estabelecimento gradual da resistncia
sistmica adquirida (SAR) (Alvarez et al., 1998).
123 Fitopatol. bras. 28(2), mar - abr 2003
124
M.L.V. Resende et al.
Fitopatol. bras. 28(2), mar -abr 2003

FIG. 1 - Fluxo de eltrons durante a exploso oxidativa: espcies
ativas de oxignio (EAOs) derivadas de O
2
, vias de detoxificao
(limpeza) e interconverses em plantas (adaptado de Baker &
Orlandi, 1999).
Equivalentes redutores (e
-
)
E
n
e
r
g
i
a

r
e
l
a
t
i
v
a

Oxignio molecular
O2

Perxido de hidrognio
HO
2 2


nion superxido
O2
-
Radicais hidroxila
livres OH
-


Na presente reviso, procurou-se abordar aspectos da
exploso oxidativa como a qumica da produo de espcies
ativas de oxignio, EAOs e a patognese em plantas,
mecanismos envolvidos na exploso oxidativa, funes das
EAOs na planta e sua quantificao durante a interao
planta-patgeno.
QUMICA DA PRODUO DE ESPCIES ATIVAS
DE OXIGNIO
Simplificadamente, a partir do O
2
, os agentes de
exploso oxidativa so:
O oxignio molecular (O
2
) relativamente no reativo
e no txico, devido a estrutura estvel dos eltrons na sua
camada externa. Entretanto, alteraes na distribuio dos
eltrons podem provocar a sua ativao e influenciar os
sistemas biolgicos. As EAOs podem ser geradas dentro das
plantas como resultado da excitao ou um leve toque no
eltron externo, formando oxignio simples (
1
O
2
) ou de uma
sucessiva adio de eltrons ao oxignio molecular produzindo
O
2
.-
, H
2
O
2
e OH
.
(Figura 1). Essas molculas, descritas a
seguir, so consideradas ativas porque no necessitam da
entrada de energia para reagir com outras molculas.
Superxido (O
2
.-
): pode ser produzido na planta por
meio de vrios mecanismos, inclusive pela ativao de
NADPH-oxidases/sintases ligadas membrana, peroxidases
(POX) da parede celular, lipoxigenases (LOX) e como
resultado da transferncia de eltrons da mitocndria ou do
cloroplasto. Normalmente, oxida vrias molculas orgnicas,
como o ascorbato, ou como redutor de metais como Fe
3+
, nas
reaes de Haber-Weiss ou Fenton (Breusegem et al., 2001).
Reao de Fenton ou Haber Weiss
I) Fe
3+
+ O
2
..-
Fe
2+
+ O
2
II) Fe
2+
+ H
2
O
2
Fe
3+
+ OH
-
+ OH
Reao geral: O
2
.-
+ H
2
O
2
OH
-
+ OH
.
+ O
2
Perxido de hidrognio (H
2
O
2
): a maioria do H
2
O
2
celular surge da dismutao do O
2
.-
catalisada pela SOD (Tabela
1). Perxido de hidrognio

um oxidante relativamente estvel
e ausente de carga, o que pode facilitar a passagem atravs da
camada bilipdica da membrana celular. Essa capacidade de
difundir-se rapidamente atravs da membrana celular favorece
a rpida elicitao da resposta vegetal (Apostol et al., 1989).
Radical hidroxila (OH): embora os radicais hidroxila
tenham meia-vida curta (< 1 s), so radicais potencialmente
fortes e com alta afinidade biomolculas no seu stio de
produo (Halliwell & Gutteridge, 1989), o que dificulta o
estudo desses radicais.
Oxignio simples (
1
O
2
): semelhante aos radicais hidro-
xila, os
1
O
2
tm aproximadamente 2 s de vida e so altamente
destrutivos, reagindo com a maioria das molculas biolgicas
(Foyer et al., 1994), porm a maioria dos danos so prximos
aos stios onde so produzidos. So predominantemente
gerados nos cloroplastos, atravs da transferncia de energia
de uma clorofila foto-excitada para o eltron do oxignio
molecular.
1
Oxignio simples reage facilmente com ligaes
duplas e tm alta afinidade com dienos na membrana e
aminocidos especficos como histidina, metionina, triptofano
e cistena.
O acmulo de H
2
O
2
pode depender de duas etapas
consecutivas: reduo do O
2
molecular a O
2
-
seguida pela
dismutao espontnea ou catalisada de O
2
-
a H
2
O
2
. A enzima
SOD catalisa uma converso altamente eficiente de O
2
-
/
.
HO
2
a H
2
O
2
, numa velocidade 10
10
vezes maior que na reao
espontnea.
EAOs E A PATOGNESE EM PLANTAS
Os primeiros estudos enfocando as EAOs na defesa
vegetal, foram realizados por Doke (1983), na dcada de 80,
muito embora a produo de radicais de oxignio j tivesse
sido constatada em clulas do sistema imunolgico humano
(Baldridge & Gerard, 1933). Doke (1983) e Doke & Ohashi
(1988) publicaram os primeiros relatos da produo de O
2
-
nas interaes incompatveis nos patossistemas batata
(Solanum tuberosum L.)-Phytophthora infestans (Mont.) de
Bary e fumo (Nicotiana tabacum L.) -vrus do mosaico do
Espcies ativas de oxignio na resposta de defesa de plantas...
125 Fitopatol. bras. 28(2), mar - abr 2003
FIG. 2 - Fases da produo de EAOs na interao planta-bactria
(adaptado de Baker & Orlandi, 1995).
O
x
i
g

n
i
o

a
t
i
v
o
Tempo aps a inoculao (h)
Superxido dismutase (SOD) H
2
O
2
+ O
2
.-
+ H
+
H
2
O
2
+ O
2

O
2
.-
+ O
2
-
+ 2H+ H
2
O
2
+ O
2

Ascorbato Peroxidase (APX) APX + H
2
O
2
Composto I + H
2
O
Composto I + Ascorbato

Composto II + MDA
. (*)
Composto II + Ascorbato APX + MDA
.
+ H
2
O
Catalase H
2
O
2
+ H
2
O
2
2H
2
O + O
2

TABELA 1 - Equaes qumicas ilustrando as principais enzimas
chaves catalisando a formao e degradao de espcies ativas de
oxignio (EAOs) em plantas
MDA
. (*)
: Radical monodehidroascorbato
fumo (Tobacco mosaic virus, TMV).
As EAOs ocorrem durante o contato inicial entre o
patgeno e a clula vegetal mas podem tambm ser produzidas
e apresentar um papel sutil nos estdios posteriores da
patognese. Durante a interao planta-patgeno a produo
de EAOs acontece em trs fases: na fase I ocorre o reconhe-
cimento dos elicitores provenientes do patgeno, que podem
ser carboidratos, protenas ou pores de glicoprotenas. Esse
reconhecimento dispara os eventos de transduo de sinais.
Durante a fase II so iniciados vrios processos relacionados
defesa, mas no identificados por sintomas visveis. Os
processos ou vias metablicas dessa fase so resultantes do
reconhecimento durante a fase I, e nesses processos de defesa
incluem-se aumento de antioxidantes, ao de lipoxigenases,
a HR, produo de fitoalexinas, lignificao e SAR. A fase
III compreende o processo de evoluo da patognese levando
ao desenvolvimento de sintomas visveis. A diferenciao da
patognese em trs fases distintas apenas um artifcio para
compreenso de como ocorrem tais processos. Na natureza,
dependendo das interaes, ocorrer uma sobreposio dos
eventos fisiolgicos (Baker & Orlandi, 1999).
MECANISMOS ENVOLVIDOS NA EXPLOSO
OXIDATIVA
Mecanismos indutores da produo de EAOs
Injrias no tecido vegetal e processos oxidativos
normais da clula so provavelmente responsveis pela
gerao de O
2
-
. Durante o transporte de eltrons (e
-
)nos
cloroplastos e mitocndrias, muitos desses e
-
so perdidos, e
ento captados pelo O
2
formando O
2
-
(Leshem, 1988, citado
por Goodman & Novacky, 1994).
Fatores abiticos tais como UV B (280 a 320 nm),
extremos de temperatura, poluentes, estresse osmtico e
mecnico, podem aumentar a produo de EAOs. Contudo,
os elicitores mais efetivos so macromolculas derivadas do
patgeno que se ligam a receptores na superfcie da clula
vegetal (Allan & Fluhr, 1997).
Segundo Hammond-Kosack & Jones (1996), prova-
velmente, o oznio (O
3
) ou UV-B, sinalizadores no espec-
ficos, induzem o acmulo de EAOs. Isso foi confirmado
recentemente por Wohlgemuth et al. (2002) ao verificarem
que o O
3
induziu a produo e acmulo de H
2
O
2
em plantas
de fumo e tomate (Lycopersicon esculentum Mill.), e H
2
O
2
e
O
2
-
em Arabidopsis sp. Neste estudo, a gerao e acmulo de
H
2
O
2
e/ou O
2
-
foi dependente da espcie e cultivar da planta,
apesar de ambas EAOs estarem envolvidas na induo da
morte celular.
Duas fases de induo de EAOs por elicitores fngicos
e bacterianos tem sido avaliadas em culturas de clulas
vegetais. A fase I corresponde a aquela de resposta muito
rpida (poucos minutos) (Baker & Orlandi, 1995). Embora a
produo de EAOs na fase I, possivelmente envolva uma
interao elicitor-receptor, as respostas nem sempre so
correlacionadas com resistncia a fitodoenas, podendo
tambm ocorrer em interaes compatveis. Na 2 fase de
produo de espcies ativas de oxignio ocorre uma exploso
mais forte e prolongada, que est diretamente correlacionada
com a resistncia da planta ao patgeno, provocando a morte
localizada de clulas (HR) e, portanto, essa fase caracterstica
das interaes incompatveis (Dangl et al., 2000).
Elicitores derivados do patgeno provocam uma
biossntese muito rpida de EAOs (menos de 5 min), que
requer Ca
++
externo e a ativao de canais de ons. Contra-
riamente, bactrias avirulentas provocam uma pequena
exploso oxidativa inicial rpida e, aps 2 a 4 h, uma exploso
oxidativa massiva. Este atraso reflete o tempo requerido para
o sinal da bactria avirulenta ser liberado para as clulas da
planta e processado para uma forma que possa elicitar o
mecanismo de reconhecimento (Figura 2) (Keppler & Baker,
1989; Keppler et al. 1989; Baker et al, 1991).
Na interao entre uma raa incompatvel de
Phytophthora nicotianae Breda de Hann e clulas de fumo, a
produo de H
2
O
2
ocorreu em sucessivas exploses oxidativas,
verificadas entre 0 e 2 h aps a inoculao. Entretanto, uma
exploso oxidativa mais intensa ocorreu no perodo de 8 a 10
h aps a inoculao (Able et al., 2000).
A exploso oxidativa envolve a ativao de compo-
nentes de oxidases pr-existentes mais do que a sntese de
novo do maquinrio de exploso oxidativa. O mecanismo que
as plantas possuem para gerar O
2
-
a partir do oxignio mole-
cular, possivelmente envolve uma NADPH oxidase associada
membrana. H indicaes de que plantas e mamferos geram
126
M.L.V. Resende et al.
Fitopatol. bras. 28(2), mar -abr 2003
EAOs de maneira similar durante as respostas de defesa.
Entretanto, a presena de um motivo citoplasmtico no qual
o clcio se liga a NADPH oxidase vegetal, sugere a
possibilidade de regulao direta da atividade dessa oxidase,
atravs da percepo de trocas em concentraes subcelulares
de clcio, em vez da montagem de oxidases citoplasmticas
adicionais, como ocorre em sistemas de defesa de mamferos
(Hammond-Kosack & Jones, 2000). Exemplificando, com-
ponentes citoslicos pr-formados como o Ca
++
, ATP e uma
etapa de fosforilao, contriburam para aumentar a atividade
in vitro da NADPH oxidase associada membrana plasmtica
de clulas de tubrculos de batata infetados por P. infestans
(Allan & Fluhr,1997) .
Culturas de clulas de feijoeiro (Phaseolus vulgaris
L.), testadas com dois diferentes tipos de elicitores, mostraram
um rpido aumento na absoro de oxignio, seguido pela
produo transitria de H
2
O
2
e aumento na atividade cataltica
da peroxidase. Uma alcalinizao transitria do apoplasto,
pH 7,0-7,2, foi necessria para a gerao de H
2
O
2
nesse
sistema. Nenhuma dessas rotas alternativas foram inibidas
por difenilenoiodonium, levando a crer que a produo de
EAOs durante as interaes incompatveis poderia ocorrer
por mecanismos divergentes em diferentes espcies vegetais
e a contribuio de cada mecanismo para a exploso oxidativa
poderia variar de acordo com a espcie em questo
(Hammond-Kosack & Jones, 1996).
Mecanismos celulares para inibio das EAO
As EAOs ocorrem normalmente no metabolismo
celular, porm, quando acumuladas tornam-se txicas clula.
O H
2
O
2
sobrevive no citoplasma da clula em concentraes
suficientes para alcanar o ncleo da clula vegetal ou do
patgeno, podendo reagir com ons metlicos intracelulares.
Dessa forma, embora moderadamente reativas por elas
prprias, muito do prejuzo celular causado por H
2
O
2
e O
2
-
resulta da converso dessas molculas para espcies ainda
mais reativas. Exemplo disso a converso do H
2
O
2
, na pre-
sena de Fe
2+
, para OH
-
, extremamente txico. Esses radicais
podem reagir com protenas e assim reduzir a atividade de
enzimas, reagir com lipdios e aumentar a permeabilidade
de membranas e ainda reagir com o DNA causando mutaes
(Moller, 2001). Portanto, como o acmulo de EAOs pode
resultar em prejuzos considerveis, a clula dispe de vrios
mecanismos para detoxificar eficientemente essas espcies
ativas de oxignio. Esses mecanismos de proteo, foram
desenvolvidos pelas plantas durante o processo de evoluo,
para controlar os nveis dessas molculas e anular essa
toxicidade. Molculas antioxidantes, enzimas simples, e um
sistema mais complexo de detoxificao, podem estar
envolvidos na proteo celular contra EAOs acumuladas.
Conhecidos como scavengers, vrias enzimas reguladoras
(Tabela 1) impedem a ao txica das EAOs clula vegetal.
Superxido dismutases: as SODs so enzimas
catalisadoras da dismutao do O
2
.-
e HO
2
+
a H
2
O
2
, e podem
estar ligadas a um metal (Cu/Zn, Mn e Fe). As plantas,
normalmente, tm Cu/Zn-SOD no citosol, Cu/Zn e/ou Fe-
SOD no cloroplasto e Mn-SOD na mitocndria. As SODs
so consideradas importantes agentes antioxidantes porm,
em elevadas concentraes nas clulas animais e bacterianas,
podem induzir disfunes e morte celular (Baker & Orlandi,
1995).
Ciclo do ascorbato/glutationa: principal sistema de
remoo das EAOs nos cloroplastos. Nesse ciclo so
empregadas quatro enzimas: ascorbato peroxidase (APX),
dehidroascorbato redutase (DHA), monodehidroascorbato
redutase (MDA
.
) e glutationa redutase. O H
2
O
2
pode ser
reduzido e removido pela APX atravs do ascorbato como
redutor, formando o radical monodehidroascorbato (MDA
.
)
(Yoshimura et al., 2000). Esse por sua vez, ir dismutar para
dehidroascorbato (DHA) e ascorbato.
Catalase: so enzimas que convertem o H
2
O
2
em H
2
O
e O
2
. As plantas possuem vrias isoformas de catalase, as
quais esto presentes nos peroxissomas e glioxissomas. So
as principais enzimas de detoxificao do H
2
O
2
em plantas e
podem dismutar diretamente o H
2
O
2
ou oxidar substratos, tais
como metanol, etanol, formaldedo e cido frmico. As cata-
lases podem ser dividas em trs classes: catalases da classe 1
removem o H
2
O
2
produzido durante a fotorespirao em
tecidos fotossintticos; catalases da classe 2 so produzidas
em tecidos vasculares e podem exercer uma funo de
lignificao mas, sua exata funo biolgica permanece desco-
nhecida; e na classe 3 esto as catalases presentes abun-
dantemente em sementes e plantas jovens, e cuja atividade
est relacionada remoo do H
2
O
2
produzido durante a
degradao dos cidos graxos no glioxissoma. As catalases
funcionam ento como canal de limpeza do H
2
O
2
celular
(Breusegem et al. 2001). Em soja [Glycine max (L.) Merril],
Dixon et al. (1994) verificaram que a adio da catalase ou
cido ascrbico, potentes antioxidantes, bloqueou o acmulo
da fitoalexina gliceolina elicitada por Verticillium dahliae
Kleb. Pelo lado do patgeno, possivelmente a catalase seja
uma forma de defesa enzimtica de alguns patgenos contra
as EAOs do hospedeiro (Garre et al., 1998), isso porque essas
enzimas localizadas nos peroxissomos de muitos organismos,
incluindo os fungos, quando aplicadas na clula vegetal,
impedem a influncia positiva do gene da glucose oxidase na
resistncia do hospedeiro e efetivamente inibem a exploso
oxidativa, a produo de fitoalexinas e a ao de H
2
O
2
na
morte celular programada durante a HR.
-caroteno: um eficiente agente de detoxificao de
1
O
2
. Os carotenides participam do sistema de antenas dos
cloroplastos, na absoro de luz e transferncia de energia
para os centros das reaes. Entretanto, os carotenides
tambm podem dissipar energia durante o estresse fotoxidativo
(Baker & Orlandi, 1999).
As EAOs induzidas por elicitores fngicos e bacte-
rianos durante a fase inicial da exploso oxidativa, tm sido
especificamente inibidas por difenilenoiodonium (DPI),
Espcies ativas de oxignio na resposta de defesa de plantas...
127 Fitopatol. bras. 28(2), mar - abr 2003
inibidores do influxo de clcio e inibidores de quinases (Baker
& Orlandi, 1995; Hammond-Kosack & Jones, 1996).
Nas mitocndrias, principal stio de produo de
EAOs na clula vegetal, existem vrias enzimas para detoxi-
ficao de EAOs. Recentemente a thioredoxina, pequena
protena (12 - 14 kDa) com duas cistenas no stio ativo, tem
sido apontada como possvel agente de detoxificao de
EAOs (Moller, 2001). No entanto, esse autor considera que
o sistema celular de detoxificao de EAOs est pouco
esclarecido.
FUNES DAS EAOs NA PLANTA
A rpida gerao e acmulo de espcies ativas de
oxignio, desencadeadas pela exploso oxidativa aps a
percepo dos sinais de avirulncia do patgeno, atuam com
diferentes funes de defesa. Dentre as vrias funes das
EAOs na defesa vegetal, podemos citar o efeito txico direto
de H
2
O
2
ao patgeno, agindo como um agente antifngico e
antibacteriano (Sutherland, 1991; Allan & Fluhr, 1997). O
efeito antimicrobiano direto das EAOs numa dada interao
planta-patgeno, depende das concentraes das EAOs e da
sensibilidade do patgeno a essas concentraes (Medhy et
al. 1996). Para atuar como antibitico efetivo na resposta de
defesa vegetal, a concentrao de H
2
O
2
no stio de infeco
deve ser alta o bastante para servir como agente microbicida
(Medhy et al. 1996). Concentraes micromolares de H
2
O
2
inibiram a germinao de esporo de vrios fungos patognicos
(Peng & Kc, 1992). O H
2
O
2
a

0,1 mM inibiu completamente
o crescimento de Erwinia carotovora ssp. carotovora (Jones)
Bergey, Harrison, Breed, Hammer & Huntoon e mais de 95%
do crescimento de P. infestans (Wu et al. 1995). Entretanto,
os estudos da atuao do H
2
O
2
como agente redutor da
viabilidade do patgeno, so dificultados pelas vrias funes
exercidas pelo H
2
O
2
na clula vegetal (Medhy et al. 1996).
Alm da atuao no complexo e integrado sistema de
sinalizao celular que culminar na ativao da expresso
dos genes de defesa (Figura 3), o H
2
O
2
participa do cruzamento
oxidativo (cross-linking) de protenas da parede celular
formando, com a matriz de polissacardeos, um grande
polmero de vrias glicoprotenas ricas em hidroxiprolina,
reforando estruturalmente a parede celular. O H
2
O
2
tambm
atua como importante substrato das peroxidases e por
conseguinte dispara a qumica de lignificao, com formao
de precursores de polmeros de lignina, via atividade da POX
(Alvarez et al., 1998).
Na sinalizao para respostas de defesa da planta ao
patgeno, o H
2
O
2
o candidato mais atrativo dentre as EAOs,
por causa da sua vida relativamente longa e alta permea-
bilidade atravs das membranas. Como o H
2
O
2
no possui
eltron pareado, pode atravessar membranas biolgicas, nas
quais as espcies O
2
-
atravessam lentamente. Desse modo,
aps o reconhecimento do patgeno avirulento seguido da
exploso oxidativa e seus intermedirios reativos, ocorre
induo de genes de defesa e morte celular, onde o H
2
O
2
age
como um sinal para induo de genes de proteo celular nas
clulas vizinhas para restringir o desenvolvimento da leso
(HR), que , ento, acompanhada pelo desenvolvimento de
uma resistncia sistmica adquirida (SAR). Essa reao
sistmica de defesa induzida pela exploso oxidativa no
stio de inoculao (local primrio), e pelas subsequentes
microexploses secundrias em folhas distantes, que por sua
vez so necessrias para o estabelecimento da SAR. Isso foi
comprovado por Alvarez et al. (1998), aps a inoculao da
bactria Pseudomonas syringae pv. tomato (Okabe) Young,
Dye & Wilkie (Pst), contendo o gene de avirulncia avrRpt
2,
em folhas de Arabidopsis thaliana (L.) Heynh ecotipo Col-0,
possuidora do gene de resistncia Rps
2
. A bactria causou
uma HR macroscpica no stio de inoculao, e o
desenvolvimento de resistncia em folhas no inoculadas
(secundrias). Assim como ocorre com os genes das protenas
relacionadas patognese (PRPs) em outros sistemas SAR, a
transcrio e acmulo de PR-2 ocorreu em folhas secundrias,
aproximadamente dois dias aps a inoculao da raa
avirulenta de Pst nas folhas primrias. Nveis mximos de
PR-2 ocorreram aps cerca de quatro dias da inoculao
(Alvarez et al., 1998).
Na SAR, o H
2
O
2
aumenta a atividade da enzima cido
benzico 2-hidrolase, requerida para a biossntese do cido
saliclico, potente sinalizador para a ocorrncia desse tipo de
resistncia induzida. Martinez et al. (2000) verificaram que
a acumulao sistmica de cido saliclico, emitido
aproximadamente 3 h aps inoculao de Xanthomonas
campestris pv. malvacearum (Smith) Dye em cotildones de
algodo (Gossypium hirsutum L.) cv. Reba B50, estava
associado com a exploso oxidativa. Existe uma forte
probabilidade de que a gerao de EAOs conduziria a uma
alterao no balano redox, e este por sua vez poderia tambm
regular a estabilidade de mRNAs especficos, o que culminaria
com a traduo de genes de defesa (Figura 3).
A exploso oxidativa necessria mas no suficiente
para disparar a morte celular (HR). Dados recentes citados
por Delledonne et al. (2001) indicam que o xido ntrico (NO)
coopera com as EAOs na ativao da HR, ento, aparen-
temente o NO possui um efeito sinergstico com o H
2
O
2
, na
induo de HR.
QUANTIFICAO DE EAOS DURANTE A
INTERAO PLANTA-PATGENO
A deteco e quantificao de EAOs em sistemas
biolgicos particularmente difcil devido rpida destruio
e detoxificao (scavenging) desses radicais. Alm disso,
as EAOs no podem ser medidas diretamente por mtodos
espectrofotomtricos ou HPLC, normalmente aplicados ao
estudo de compostos de carbono. Por isso, a maioria das
tcnicas de deteco de EAOs baseia-se na oxidao ou
reduo de certos compostos pelas EAOs. A dificuldade de
monitoramento das espcies ativas de oxignio em clulas
vegetais, deve-se ao fato de que muitas so de vida curta e
sujeitas aos mecanismos antioxidantes celulares tais como
SOD, peroxidases, ciclo do ascorbato/glutationa e catalase.
128
M.L.V. Resende et al.
Fitopatol. bras. 28(2), mar -abr 2003

FIG. 3 - Interconexes do H
2
O
2
, xido ntrico (NO) e cido saliclico (AS) para a ativao e coordenao das mltiplas reaes de defesa
das plantas (adaptado de Hammond-Kosack & Jones, 2000). SOD (superxido dismutase), SAGase (AS glicosiltransferase) e BA-2H (cido
benzico 2-hidrolase).
Ativao de
genes de
proteo
Cross-linking
das protenas da
parede celular
Toxicidade
direta a
microorganismos
Fotorespirao e
-oxidao
Ativao de
genes de
defesa
Alterao do
status redox
SAGase
AS-glicosdeo
SA BA
BA-2H
Rota de
fenilpropanodes

O
2
+ H
2
O
O
2
Catalase SOD
2 H+ 2 e
-
2 O
2
2 O
2
-
H
2
O
2
HR (morte celular)
NADPH
oxidase
Lignificao NO sintase ?
NO R + 2H
2
O
2 e
-
2 H+
O
2
Peroxidase
Ativao de genes
de proteo e de
defesa celular
RH
2
Vrios mtodos tm sido empregados para monitorar
EAOs em tecidos vegetais (Tabela 2). As aplicaes, van-
tagens e desvantagens desses mtodos, bem como os cuidados
que devem ser tomados na interpretao dos resultados, devem
ser considerados. O mtodo da quimioluminescncia facilita
os estudos que enfocam a produo e detoxificao de EAOs
durante as interaes incompatveis planta-bactria (Baker
& Orlandi, 1995). Delledonne et al. (2001) avaliaram o
acmulo de H
2
O
2
por fluorescncia em escopoletina, e de O
2
-
pelo monitoramento do citocromo C e tetrazlio atravs da
anlise de absorbncia.
O mtodo comumente usado para medir a produo
de O
2
-
a oxidao de epinefrina para formar adrenocromo.
Para se medir H
2
O
2
, o mais comum utilizar uma peroxidase
e um substrato oxidvel como escopoletina (Moller, 2001).
Pelo mtodo da espectroscopia de ressonncia magntica
de eltrons, Fodor et al. (2001) verificaram a produo de
EAOs induzida pelo TMV. A fim de localizar o H
2
O
2
na
clula, Rodriguez et al. (2002) empregaram o mtodo da
microscopia eletrnica. Diante disso, verifica-se que so
vrios os mtodos empregados para detectar e/ou monitorar
EAOs, e a escolha do mtodo vai depender principalmente
do tipo de molcula que se pretende avaliar.
CONSIDERAES FINAIS
A exploso oxidativa uma das respostas mais rpidas
de defesa da planta aps o reconhecimento do patgeno. Essa
resposta corresponde gerao de espcies ativas de oxignio
(H
2
O
2
, O
2
-
, OH
-
). So recentes os estudos de deteco e
monitoramento destas espcies de oxignio, devido a grande
variedade de formas e intermedirios, alm da alta taxa de
reatividade qumica envolvida nessas reaes, dificultando
os estudos. Existem evidncias de que H
2
O
2
est envolvido
em muitos mecanismos de resistncia da planta, atuando no
reforo da parede celular, pela ligao cruzada de protenas
estruturais ou fenlicos, formando uma barreira mecnica
efetiva. O perxido de hidrognio, no apoplasto da clula
hospedeira, pode agir diretamente como um agente antimi-
crobiano. No entanto, dificilmente esse efeito quantificado
in vivo, em virtude das vrias outras funes do H
2
O
2
, atuando,
por exemplo, como mensageiro secundrio na cascata de
transduo de sinais para ativao de genes de defesa e de
proteo celular. Assim, as EAOs em geral, so apontadas
Espcies ativas de oxignio na resposta de defesa de plantas...
129 Fitopatol. bras. 28(2), mar - abr 2003
Mtodo de deteco Sonda qumica
Macroscpico/microscpico Nitroblue tetrazlio
Amido/iodeto de potssio
Cloreto de titnio
Espectrofotomtrico Nitroblue tetrazlio
Citocromo C
Epinefrina
Fluorescente Piranina
Escopoletina
Quimioluminescente Luminol
Luciginena
Espectroscopia de Ressonncia
Magntica de Eltrons
DMPO
4-POBN
TABELA 2 - Mtodos de deteco de espcies ativas de oxignio
(EAOs) em plantas (adaptado de Baker & Orlandi, 1999)
Luminol = 5-amino-2,3-diidro-1,4-phthalazinediona
DMPO = 5,5'-dimetil-1-oxo-1-pirrolina
4-POBN = 4-piridil 1-oxo N-tertibutilnitrona
como intermedirias na complexa malha de sinalizao para
as respostas de resistncia local (HR) e sistmica (SAR).
A exploso oxidativa no est confinada reao
macroscpica de HR no stio de inoculao, pois repetidas
exploses secundrias ocorrem em stios discretos em tecidos
distantes, provocando micro-HRs e reao sistmica (SAR). O
papel do NO como molcula sinrgica ao H
2
O
2
na HR, carece
de investigao. Atualmente grande a busca por uma NO
sintase em plantas, enzima j detectada em clulas animais.
Tambm se investiga o papel do cido saliclico, cuja sntese
estimulada por H
2
O
2
, como uma dos sinais que translocam,
levando a mensagem da HR para a ativao da SAR.
Com a recente clonagem de vrios genes de resistncia
(R), que geralmente codificam os receptores do sinal de
avirulncia em interaes gene-a-gene, existe um grande
interesse na compreenso dos processos envolvidos na exploso
oxidativa, como um dos eventos iniciais aps o reconhecimento
do patgeno pelo hospedeiro. Tais estudos podero ser
aprofundados medida que as tcnicas disponveis para
deteco das EAOs tornarem-se rotineiras em laboratrios de
fisiopatologia vegetal e que novas tcnicas para deteco in
situ sejam tambm desenvolvidas, acopladas microscopia
eletrnica de transmisso.
LITERATURA CITADA
ABLE, A.J., GUEST, D.I. & SUTHERLAND, M.W. Hydrogen
peroxide yields during the incompatible interaction of tobacco
suspension cells inoculated with Phytophthora nicotianae. Plant
Physiology 124:899-910. 2000.
ALLAN, A.C. & FLUHR, R. Two distinct sources of elicited reactive
oxygen species in tobacco epidermal cells. Plant Cell 9:1559-1572.
1997.
ALVAREZ, M.E., PENNELL, R.I., MEIJER, P.J., ISHIKAWA, A.,
DIXON, R.A. & LAMB, C. Reactive oxygen intermediates mediate
a systemic signal network in the establishment of plant immunity.
Cell 92:1-20. 1998.
APOSTOL, I., HEINSTEIN, P.F. & LOW, P.S. Rapid stimulation of
an oxidative burst during elicitation of cultured plant cells. Plant
Physiology 90:109-116. 1989.
BAKER, C.J. & ORLANDI, E.W. Active oxygen and pathogenesis
in plants. In: Stacey, G. & Keen, N.T. (Eds.). Plant Microbe
Interactions, St. Paul, Minnesota. APD Press. 1999. pp.81-119.
BAKER, C.J. & ORLANDI, E.W. Active oxygen in plant
pathogenesis. Annual Review of Phytopathology 33:299-321. 1995.
BAKER, C.J., ONEILL, N.R., KEPPLER, L.D. & ORLANDI, E.W.
Early responses during plant-bacterial interactions in tobacco cell
suspensions. Phytopathology 81:1504-1507. 1991.
BALDRIDGE, C.W. & GERARD, R.W. The extra respiration of
phagocytosis. American Journal of Physiology 103:235-236. 1933.
BREUSEGEM, F.V., VRANOV, E., DAT, J.F. & INZ, D. The
role of active oxygen species in plant signal transduction. Plant
Science 161:405-414. 2001.
DANGL, J.F., DIETRICH, R.A. & THOMAS, H. Senescence and
programmed cell death. In: Buchanan, B.B., Gruissem, W. & Jones,
R.L. (Eds.). Biochemistry and Molecular Biology of Plants.
Rockville, Maryland. ASP Press. 2000. pp.1044-1101.
DIXON, R.A., HARRISON, M.J. & LAMB, C.J. Early events in
the activation of plant defense responses. Annual Review of
Phytopathology 32:479-501. 1994.
DOKE, N. & OHASHI, Y. Involvement of an O
2
-
generating system
in the induction of necrotic lesions on tobacco leaves infected with
tobacco mosaic virus. Physiological and Molecular Plant Pathology
32:163-175. 1988.
DOKE, N. Generation of superoxide anion by potato tuber
protoplasts during the hypersensitive response to hyphal wall
components of Phytophthora infestans and specific inhibition of
the reaction by suppressors of hypersensitivity. Physiological Plant
Pathology 23:359-367. 1983.
DOLLEDONNE, M., ZEIER, J., MAROCCO, A. & LAMB, C.
Signal interactins between nitric oxide and reactive oxygen
intermediates in the plant hypersensitive disease resistance
response. Proceedings of National Academic Science 98:13454-
13459. 2001.
FODOR, J., HIDEG, E., KEESKES, A. & KYRALY, Z. In vivo
detection of tobacco mosaic virus-induced local and systemic
oxidative burst by electron paramagnetic resonance spectroscopy.
Plant Cell Physiology 42:775-779. 2001.
FOYER, C.H., LELANDAIA, M. & KUNERT, K.J. Photooxidative
stress in plants. Physiologia Plantarum 92:696-717. 1994.
GARRE, V., TENBERGE, K.B. & EISING, R. Secretion of a fungal
extracellular catalase by Claviceps purpurea during infection of rye:
putative role in pathogenicity and suppression of host defense.
Phytopathology 88:744-753. 1998.
GOODMAN, R.N. & NOVACKY, A.J. The hypersensitive reaction
in plants to pathogens - a resistance phenomenon. St. Paul,
Minnesota. APS Press. 1994.
HALLIWELL, B. & GUTTERIDGE, J.M.C. Free radicals in biology
and medicine. Oxford, University Press. 1989.
HAMMOND-KOSACK, K.E. & JONES, J.D.G. Resistance gene-
dependent plant defense responses. Plant Cell 8:1773-1791. 1996.
HAMMOND-KOSACK, K.E. & JONES, J.D.G. Responses to plant
pathogens. In: Buchanan, B.B., Gruissem, W. & Jones, R.L. (Eds.)
Biochemistry and Molecular Biology of Plants., Rockville, Maryland.
130
M.L.V. Resende et al.
Fitopatol. bras. 28(2), mar -abr 2003
ASP Press. 2000. pp.1102-1156.
HEGEDUS, A., ERDEI, S. & HORVTH, G. Comparative studies
of H
2
O
2
detoxifying enzymes in green and greening barley seedlings
under cadmium stress. Plant Science 160:1085-1093. 2001.
KEPPLER, L.D. & BAKER, C.L. O
-
initiated lipid peroxidation in
a bacteria-induced hypersensitive reaction in tobacco cell
suspensions. Phytopathology 79:555-562. 1989.
KEPPLER, L.D., BAKER, C.L. & ATKINSON, M.M. .Active
oxygen production during bacteria-induced hypersensitive reaction
in tobacco suspension cells. Phytopathology 79:974-978. 1989.
LAMB, C. & DIXON, R.A. The oxidative burst in plant disease
resistance. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular
Biology 48:251-75. 1997.
MARTINEZ, C., BACCOU, J.C., BRESSON, E., BAISSAC, Y.,
DANIEL, J. F., JALLOUL, A., MONTILLET, J.L., GEIGER, J.P.,
ASSIGBETSE, K. & NICOLE, M. Salicylic acid mediated by the
oxidative burst is a key molecule in local and systemic responses of
cotton challenged by an avirulent race of Xanthomonas campestris
pv. malvacearum. Plant Physiology 122:757-766. 2000.
MEDHY, M.C., SHARMA, Y.K., SATHASIVAN, K. & BAYS, N.W.
The role of activated oxygen species in plant disease resistance.
Physiologia Plantarum 98:365-374. 1996.
MOLLER, I.M. Plant mitochondria and oxidative stress: electron
transport, NADPH turnover, and metabolism of reactive oxygen
species. Annual Review Plant Physiology and Plant Molecular
Biology 52:561-91. 2001.
PENG, M. & KUC, J. Peroxidase-generated hydrogen peroxide as a
source of antifungal activity in vitro and on tobacco leaf discs.
Phytopathology 82:696-699. 1992.
RODRGUEZ, A.A., GRUNBERG, K.A. & TALEISNIK, E.L.
Reactive oxygen species in the elongation zone of maize leaves are
necessary for leaf extension. Plant Physiology 129:1627-1632. 2002.
STASKAWICZ, B.J., AUSUBEL, F.M., BAKER, B.J., ELLIS, J.G.
& JONES, J.D.G. Molecular genetics of plant disease resistance.
Science 268:661-67. 1995.
SUTHERLAND, M.W. The generation of oxygen radicals during
host plant responses to infection. Physiological and Molecular Plant
Pathology 39:79-93. 1991.
WOHLGEMUTH, H., MITTELSTRASS, K., KSCHIESCHAN, S.,
BENDER, J., WEIGEL, H.J., OVERMYER, K., KANGASJARVI,
J., SANDERMANN, H. & LANGEBARTELS, C. Activation of an
oxidative burst is a general feature of sensitive plants exposed to
the air pollutant. Plant Cell & Environment 25:717-723. 2002.
WU, G., SHORTT, V.J., LAWRENCE, E.G., LEVINE, E.B.,
FITZSIMMONS, K.C. & SHAH, D.M. Disease resistance conferred
by expression of a gene encoding H
2
O
2
generating glucose oxidase
in transgenic potato plants. Plant Cell 7:1357-1368. 1995.
YOSHIMURA, K., YABUTA, Y., ISHIKAWA, T. & SHIGEOKA,
S. Expression of spinach ascorbate peroxidase isoenzimes in
response to oxidative stresses. Plant Physiology 123:223-233. 2000.
02054