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UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS Universidad del Perú, DECANA DE AMERICA FACULTAD DE MEDICINA PROYECTO
UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN
MARCOS
Universidad del Perú, DECANA DE AMERICA
FACULTAD DE MEDICINA
PROYECTO DE
INVESTIGACIÓN
HEMATOLOGÍA
Recuento mínimo de leucocitos para realizar la Fórmula
leucocitaria en Frotis de sangre periférica
UNMSM - 2013
LIMA -PERÚ
INTEGRANTES
INTEGRANTES
1.
PONCE SÁNCHEZ, Diana
2.
ROCA BEJAR, Anel
3.
LAURENTE GÓMEZ, Roxana
4.
SOSA CORI, Manuel
5
DOCENTE
DOCENTE
Lic. Yuri Roberts Congona Rivera
LIMA – PERU 2013
UNI UNIVERSITARIA

INDICE

Página

  • 1. TÍTULO DE LA INVESTIGACIÓN

3

  • 2. AUTORES

3

  • 3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

3

  • 4. JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN

4

  • 5. OBJETIVOS DE INVESTIGACIÓN

4

  • 6. HIPÓTESIS DE LA INVESTIGACIÓN

5

  • 7. MARCO TEÓRICO

  • 7.1. ANTECEDENTES

5

BASES TEÓRICAS

  • 8. METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN

  • 8.1. Tipo de estudio

23

  • 8.2. Población

23

  • 8.3. Muestra poblacional

23

  • 8.4. Variables de Investigación

24

  • 8.5. Procedimiento

25

  • 8.6. Instrumentos de recolección de datos

31

  • 8.7. Plan de tabulación

31

  • 8.8. Análisis estadístico de datos

33

  • 9. ADMINISTRACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN

34

  • 10. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

36

  • 11. ANEXOS

39

  • 1. TITULO DE LA INVESTIGACION

2
2

Recuento mínimo de leucocitos para realizar la Fórmula leucocitaria en Frotis de sangre periférica

UNMSM - 2013

  • 2. AUTORES

PONCE SÁNCHEZ, Diana

ROCA BÉJAR, Anel

LAURENTE GÓMEZ, Roxana

SOSA CORI, Manuel

  • 3. PLANTEAMIENTO Y JUSTIFICACION DEL PROBLEMA

2
2

Según el CLSI en el documento H20A de 1992 , para formular una lámina se deben tomar en cuenta el protocolo para la examinación microscopia del frotis, en unos de sus puntos menciona: “un mínimo de 300 leucocitos deberían estar en la zona de lectura, cuando el recuento de leucocitos no es menos de 4 x 10^9/L”.

De los 300 presentes en la práctica clínica para contribución al diagnóstico sólo se realiza el recuento de 100 células en el trabajo de rutina. Sin embargo en aquellos casos que se presenten leucopenias, es decir valores menores de 4 x 10^9/L , 3 x 10^9/L , 2 x 10^9/L o menos como en las leucopenias severas en la zona de lectura debería presentar menos de 300 leucocitos, incluso existe la posibilidad de que sean menor a 100 leucocitos, que es la cantidad mínima en rutina para realizar la formula leucocitaria ( CLSI menciona que deberían ser contados 200 leucocitos)

De allí viene la inquietud de hasta que valores de leucopenia se debería realizar la formula diferencial de leucocitos con un margen de confianza confiable y válido. A partir d esto nos planteamos lo siguiente:

¿Cuál es la cantidad mínima de leucocitos con la cual se puede formular una lámina periférica para el recuento diferencial de leucocitos?

  • 4. OBJETIVOS DE INVESTIGACIÓN

    • 5.1. OBJETIVO GENERAL

2
2

Determinar el valor mínimo de leucocitos para realizar el recuento diferencial de leucocitos con un margen de confianza confiable y válido.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Determinar el conteo de leucocitos en lámina periférica en recuentos

menores de 4000 leucocitos. Determinar el C.V por estirpe leucocitaria en el recuento diferencial en los

diferentes rangos de recuentos menores de 4000 leucocitos.

  • 5. HIPÓTESIS DE LA INVESTIGACIÓN

En valores extremos menores de 1000 leucocitos no es recomendable usar la fórmula leucocitaria en una lámina periférica.

  • 6. MARCO TEÓRICO

EXAMEN DEL FROTIS DE SANGRE PERIFÉRICA EXAMEN CON OBJETIVO 10X

El examen del frotis sanguíneo es un proceso de varios pasos. Se comienza con el análisis del frotis con un barrido del portaobjeto con el objetivo 10X o de bajo aumento. Este paso es necesario para determinar la calidad general del frotis ,incluida la distribución anormal de los eritrocitos que sugiere la presencia de rouleaux(o de aglutinación) o la de un número desproporcionado de grandes células nucleadas(p.ej.,monocitos o neutrófilos) en los bordes del extendido. Si esto último sucede, debe prepararse otro frotis.Además,el examen del frotis con objetivo 10X permite la rápida detección de grandes células anormales, como blastos, linfocitos reactivos y parásitos.

EXAMEN CON OBJETIVO 40X

Con el empleo del objetivo 40X,se busca un área del frotis en la cual los eritrocitos se encuentren uniformemente distribuidos y en donde apenas se toquen unos con

2
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otros(dos o tres células pueden superponerse)(figura 1).Se examinan de 8 a 10 campos en esta área del frotis y de determina el número promedio de leucocitos por campo. Se multiplica el número promedio de leucocitos por campo de gran aumento por 2000 para obtener una aproximación del total de leucocitos contados/mm 3 .

Este estimado es una herramienta de control de calidad útil para validar el recuento de leucocitos realizado por el analizador hematológico. Debe resolverse cualquier discrepancia entre el recuento de leucocitos del instrumento y el estimado por el frotis.

otros(dos o tres células pueden superponerse)(figura 1).Se examinan de 8 a 10 campos en esta área

Figura 1 Área correcta del frotis de sangre para realizar la evaluación de la distribución celular y la estimación de leucocitos(400X).

EXAMEN CON OBJETIVO 100X

El paso siguiente en la evaluación del frotis es realizar el recuento diferencial de leucocitos.Esto se efectua en la misma área del frotis en la que se hizo el estimado del recuento de leucocitos,pero utilizando el objetivo de inmersión en aceite 100X.Cuando se analiza el área correcta de un frotis de un paciente con recuento normal de eritrocitos,se observan alrededor de 200 a 250 eritrocitos por campo de 100X.Por lo general, el recuento diferencial incluye el conteo y la clasificación de 100 leucocitos consecutivos y el informe de estas clases como porcentajes.El recuento diferencial se realiza de modo sistemático; para ello se utiliza un recorrido en patrón de guardia griega(Figura 2),que minimiza los errores de distribución de los leucocitos.Los resultados se informan como porcentajes de cada tipo de leucocitos observado durante el recuento.Un ejemplo de recuento diferencial de leucocitos es el siguiente:3% de neutrófilos en banda,55% de neutrófilos polimorfonucleares,30% de linfocitos,6% de monocitos,4% de eosinófilos y 2% de basófilos(cuadro 1).Se informa también cualquier alteración de los leucocitos que se observe;por ejemplo,cambios tóxicos,cuerpos de Dohle,linfocitos reactivos y bastones de Auer.Cuando se encuentran presentes los eritrocitos nucleados se cuentan e informan como número de eritrocitos

2
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nucleados/100 leucocitos.La

evaluación

de

la

morfología

de

los

eritrocitos,leucocitos y plaquetas y el recuento estimado de plaquetas se realiza también utilizando el objetivo de inmersión en aceite 100X.Las inclusiones de eritrocitos(p.ej.,los cuerpos de Howell-jolly) y las inclusiones de leucocitos (como los cuerpos de Dohle) pueden observarse también con este aumento.Cada laboratorio debe establecer protocolos para estandarizar el informe de estas alteraciones.

nucleados/100 leucocitos.La evaluación de la morfología de los eritrocitos,leucocitos y plaquetas y el recuento estimado de

Figura 2 Patrón en guardia griega para realizar el recuento diferencial de leucocitos.(De Rodak BF,Fritsma GA,Doig K.Hematology:clinical principles and applications,3 rd ed,philadelphia,2007,Saunders.)

Criterios

del

CLSI

para

el

recuento

diferencial

de

lámina

periférica

1.-La muestra de sangre venosa es extraída en tubos con tripotásico etilendiamina

2
2

tetra-acetato (EDTA K) 31,5 ± 0,15 mg (en forma líquida o en polvo) por ml de muestra.

2.-La condición de la muestra

Macroscópicamente cuando se observa coágulos visibles estos son causa de rechazo de la muestra para el análisis.

3.-Anotar el número total de leucocitos, anotar cualquier condición anormal del espécimen, tales como la lipemia o hemólisis en el plasma sobrenadante.

4.-Preparación de la lámina periférica

Se realiza en portaobjetos (25x 75 mm, 0,8 a 1,2 mm de espesor) que estén limpios, secos y libre de polvo. Si la sangre es leucopenia, preparar un gran número de películas de sangre (por ejemplo, seis).

Preparar el frotis de sangre dentro de las 4 h de la extracción de sangre en EDTA

K.

NOTA: No guarde la sangre en la nevera. Una mezcla adecuada (20 inversiones completas a mano) es necesario, antes de la preparación de un frotis de sangre.

Para preparar un frotis de sangre se coloca primero una gota (Aproximadamente 0,05 ml) de sangre bien mezclada cerca de un extremo del portaobjeto. Luego colocar en un ángulo de 45 ° otro portaobjeto encima con los bordes pulidos e inmediatamente extender la gota de sangre formando una película. Posteriormente se tiñe la película dentro de una hora de preparación con un Romanowsky,que contienen fijadores, o fijar en una hora con "agua libre" (es decir, <3% agua) metanol para realizar más tarde la tinción.

5.-Requerimientos para una lámina de sangre aceptable

Cualidades deseables de un frotis de sangre

Área de trabajo suficiente

Mínimo 2,5 cm de longitud de un frotis

El frotis tiene que terminar en un borde cuadrado o recto.

Hacer el recuento de los leucocitos dentro de la zona de estudio(entre

cuerpo y cola). Se producen frotices menos óptimos en los casos de anemia o policitemia o

en los casos que haya proteínas plasmáticas anormales (por ejemplo, en el mieloma, enfermedad por crioaglutininas).

2
2

6.-Tinción de Romanowsky

Los colorantes tipo Romanowsky contienen metileno y/o productos de oxidación(azur B), y un colorante de fluoresceína halogenados, por lo general eosina B o Y. Las preparaciones para un recuento diferencial requieren la tinción con Romanowsky,que es una tinción óptima de los elementos celulares ,de gran ayuda en la identificación precisa de ambos leucocitos maduros e inmaduros, así como las células anormales.

Protocolo para examinar el frotis Evaluación microscópica:

La lámina debe de ser barrida de 10X a 40X para ver células anormales y una aceptable distribución celular. Y con el objetivo de 100x para captar con mejor resolución los gránulos citoplasmáticos y filamentos de neutrólifos.

Realizar la lectura donde se aprecia una distribución lineal de los eritrocitos.

Un mínimo de 300 leucocitos debe estar dentro del área de trabajo, cuando el recuento total de leucocitos es no menos de 4 x 109 por L.

Los neutrófilos, monocitos, y linfocitos deben aparecer de manera uniforme. Cuando el recuento total de leucocitos está dentro del rango normal, el número de glóbulos blancos por campo de 100X en el área de la cola no debe exceder de 2 a 3 veces el número por campo que en el cuerpo de la película.

A excepción a ciertos estados patológicos como Leucemia linfocítica crónica.En caso de encontrar células rotas indentificables también considerarlas en el conteo.En tanto que las células rotas no identificables

anotar como otro y anotarlo como observación en el reporte de laboratorio.

Procedimiento de conteo:

Usar el patrón de almena para el barrido del frotis. (Revisar el anexo 1).Cada célula identificada debe ser colocado en una de las siguientes categorías: Neutrófilos segmentados, abastonados, linfocitos normal, linfocitos variante; monocitos, eosinófilos, basófilos; otra nucleado excepto las células rojas nucleadas.

2
2

En

cada

frotis

deben

ser

contados

200

leucocitos. Si

la

sangre

es

leucopenia, procesar diapositivas adicionales en paralelo. Expresar los conteos en porcentaje en base al total.

 

Contar las células eritroides nucleadas presentes y expresan el resultado como el número por 100 leucocitos contados.

  • 7. METODOLOGIA DE LA INVESTIGACIÓN

    • 7.1. TIPO DE ESTUDIO

El presente estudio es observacional, prospectivo y transversal.

  • 7.2. POBLACIÓN DE ESTUDIO

2
2

La población estará conformada por los alumnos de Tecnología Médica que llevan el curso de hematología 2013 en la UNMSM.

  • 7.3. MUESTRA POBLACIONAL

La muestra poblacional para el presente estudio estará constituida por los 12 integrantes del grupo de los sábados que llevan el curso de hematología 2013 en la UNMSM. Por ello no se empleará ninguna técnica de selección de la muestra ya que el muestreo será no probabilistico por conveniencia.

CRITERIOS DE SELECCIÓN

  • a) Criterios de Inclusión:

Muestras extraídas con EDTA-K2 por su mejor preservación de la

estructura. Muestras centrifugadas e inducidas a un estado leucopénico por

extracción de la capa de glóbulos blancos. Muestras que después de haber sido tratadas al realizarle el

recuento de leucocitos presenten valores menores de 4000 células por mm 3

  • b) Criterios de Exclusión

Láminas con coloración no adecuada por el ph ácido o por presencia

de precipitados.

  • 7.4. TÈCNICAS E INSTRUMENTOS

El análisis de los datos recolectados se hizo usando Microsoft Excel 2002 y el paquete estadístico SPSS 13.

  • 7.5. PLAN DE PROCEDIMIENTOS

1.-En primer lugar se debe tomar la muestra a 12 alumnos al azar que integran el grupo de los sábados que llevan el curso de hematología 2013 en la UNMSM. Para ello vamos a utilizar todos los materiales necesarios para una buena toma de muestra, y se va a utilizar tubos con anticoagulante EDTAK 2 en la cual se va a obtener 3ml de muestra.

2
2

2.-Posteriormente determinar el recuento de leucocitos de cada muestra en la cámara de neubauer y realizar la fórmula leucocitaria respectiva de cada uno analizando la zona de lectura.

3.-Deacuerdo a la cantidad de leucocitos hallados en la cámara de neubauer,se va a proceder a diluir la muestra con el objetivo de simular una muestra leucopénica. Para ello se va a diluir la muestra con NaCl al 0.9% con el objetivo de disminuir la cantidad de leucocitos a 4000 mm 3 /ul.

2.-Posteriormente determinar el recuento de leucocitos de cada muestra en la cámara de neubauer y realizar
2.-Posteriormente determinar el recuento de leucocitos de cada muestra en la cámara de neubauer y realizar

a.-Extraer:1.8ml de

la muestra.

b.-Remplazar con

NaCl hasta los 3ml

c.-Recuento de

leucocitos

3ml de 1.8m muestr 1.2m
3ml de
1.8m
muestr
1.2m
1.8 ml de NaCl 1.2m
1.8 ml
de NaCl
1.2m

10,000 mm 3 /ul---------------- 3ml

4.000 mm 3 /ul ----------------

1 2ml
1 2ml

4.-Seguir diluyendo para obtener menor cantidad de leucocitos

2.-Posteriormente determinar el recuento de leucocitos de cada muestra en la cámara de neubauer y realizar
2.-Posteriormente determinar el recuento de leucocitos de cada muestra en la cámara de neubauer y realizar
2.-Posteriormente determinar el recuento de leucocitos de cada muestra en la cámara de neubauer y realizar

4.000

mm 3 /ul

  • 3.000 mm 3

/ul

  • 2.000 mm 3

/ul

  • 1.000 mm 3

/ul

5.-Posteriormente realizar la fórmula leucocitaria de cada dilución y determinar la cantidad de leucocitos en la zona de lectura.

6.-Ingresar los resultados a una hoja de Excel,para poder analizar el coeficiente de variación y en base a ello determinar el recuento mínimo de leucocitos para realizar la Fórmula leucocitaria en Frotis de sangre periférica de manera confiable.

  • 7.6. ANALISIS DE DATOS

Supuestos para el análisis estadístico:

2
2

El método de referencia representa la verdad. (Si aceptada, a continuación,

desacuerdos representan un imprecisión del método de prueba.) Los valores de la prueba (y) se distribuyen gaussiana en cualquier valor de

referencia determinado (x). La media de los valores de y de cada muestra es una función lineal de x.

Esto puede ser probado satisfactoriamente mediante el examen de la x-y diagrama de dispersión de los medios de la referencia método (x) frente a los medios del método de ensayo i (y) para cada muestra (i). En este diagrama de dispersión, i superponer el sobre que tiene en cuenta la imprecisión de los métodos de ensayo y de referencia.Para simplificar la construcción de la envolvente, calcular la media del número de células contadas por el analizador para todas las muestras e introducir este número "n" (ver La Figura 5). Los puntos de datos que caen fuera de la límites sobre debe ser examinado.

 Para evaluar la imprecisión Clinical Sensitivity  Construir un histograma para cada tipo de célula
Para evaluar la imprecisión
Clinical Sensitivity
 Construir un histograma para cada tipo de célula a partir de
todos los valores normales inicialmente tabulados. Examine

estos histogramas de valores atípicos. Estos pueden definirse como más de> 3 SD de la media. Deducir la gama de valores de referencia a partir del histograma

de la restante valores. Definir el rango de referencia como el

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2

centro de 95% de la población. El 95% de los límites se utilizan para establecer la normalidad Por lo tanto, con 100 muestras, excluir los dos valores más altos y más bajos, o un total de cuatro. Tabular los valores de referencia según el tipo de células para cada método.

  • 8. CRONOGRAMA DE TRABAJO

Gráfica de GANTT

   

MAYO

   

JUNIO

   

JULIO

 

ACTIVIDADES

Sem. 1

Sem. 2

Sem. 3

Sem. 4

Sem. 1

Sem. 2

Sem. 3

Sem. 4

Sem. 1

Sem. 2

Sem. 3

Sem. 4

1. Diseño y aprobación del proyecto

 

X

                   

2. Selección de la población de estudio

X

3. Aplicación de instrumentos en la población

x

X

  • X X

4. Recolección de datos

X

  • X X

5. Procesamiento de los datos

X

  • X X

2
2
6. Análisis estadístico de los datos X 7. Análisis e interpretación de los resultados X 8.
6. Análisis estadístico de los
datos
X
7. Análisis e interpretación de los
resultados
X
8. Redacción Preliminar
X
9. Revisión y crítica de la
redacción
X
X
10. Presentación del informe
X
11. Sustentación
X

8.1.

PRESUPUESTO

A) BIENES

 

CANTIDAD

PRECIO S./

 

MATERIAL PUBLICITARIO

Cinta adhesiva

2

2.00

 

MATERIALES DE FLEBOTOMIA

Algodón

¼ kilo

2.50

Bolsas de bioseguridad

3

3.0

Esparadrapo

1unidad

5.00

Tubos vacuteiner tapa morada

20

10.00

Agujas N°21

20

10.00

Ligadura

3 ligaduras

4.50

Campo

18

3.50

Rotuladores

2

5.0

 

INSTRUMENTOS E INSUMOS

Tips amarillos

1 bolsa

50.00

Tips azules

1 bolsa

50.00

Reactivos

Detergente

1 bolsa

3.20

Papel toalla

1 rollo

2.50

 

MATERIALES DE ESCRITORIO

Hojas bond

2
2
 

Lapiceros

MONTO TOTAL

 

B) SERVICIOS

 

CANTIDAD

PRECIO S./

 

Refrigerio

Transportes

PRESUPUETO TOTAL

 

PRECIO S./

TOTAL BIENES

TOTAL SERVICIOS

PRESUPUESTO TOTAL

  • 9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

    • 9.1. BIBLIOGRAFÍA CITADA

1) Claudia Patricia Aldana Acajabón (2003). Correlación entre la determinación Enzimática, el cálculo por la fórmula de Friedewald y el análisis de regresión en la determinación de la lipoproteína de baja densidad. Informe Final de Tesis. Guatemala. Pag 7-23

  • 9.2. BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA

1) Koepke J.A. (1978).Differential Leukocyte Counting (ed.). College of America Pathologists

2) John

A.

Koepke, M.D.(1992).Reference Leukocyte Differential

Count(Proportional) and Evaluation of Instrumental Methods. NCCLS

Document H20-A. VOLUME 12 NUMBER 1

2
2

ANEXO N°1:

10. ANEXOS

2
2

ANEXO N°2:

ANEXO N°2: ANEXO N°3: 2

ANEXO N°3:

2
2
ANEXO N°4: ANEXO N°5: 2

ANEXO N°4:

ANEXO N°5:

2
2