Manejo de la Citometra de Flujo para las

Subpoblaciones Celulares

Alejandra Vzquez A.

XIII Simposio Internacional Trasplante de Clulas Progenitoras Hematopoyticas (CPHs)
28 de Octubre de 2013
Trasplante de Clulas Progenitoras Hematopoyticas (CPHs)
Los trasplantes de CPHs es el procedimiento mdico utilizado para
restaurar dichas clulas cuando la mdula sea ha sido destruida ya sea
por enfermedad, quimioterapia o radiacin.
En el caso de algunas enfermedades, tales como la leucemia, la
anemia aplsica y algunas enfermedades sanguneas hereditarias y del
sistema inmunolgico, las clulas madre de la mdula sea no funcionan
adecuadamente.
Indicaciones Clnicas para el Tx CPHs
Trasplante de Clulas Progenitoras Hematopoyticas (CPHs)
Dependiendo de la fuente de clulas madre, este procedimiento puede
llamarse trasplante de mdula sea, trasplante de clulas madre de la
sangre perifrica (SP), o trasplante de sangre del cordn umbilical
(CU). Cualquiera de estos tipos puede llamarse trasplante de clulas
madre hematopoyticas.
El primer trasplante de mdula sea exitoso se llev a cabo en 1968,
pero no fue sino hasta casi 20 aos ms tarde que las clulas madre
extradas del torrente sanguneo (sangre perifrica) se trasplantaron con
xito. Recientemente, se ha empezado a usar la sangre que hay en el
cordn umbilical de recin nacidos como otra fuente de clulas madre.
Indicaciones Clnicas para el Tx CPHs
Indicaciones Clnicas para el Tx CPHs
Existen tres tipos bsicos de trasplantes que reciben su nombre
dependiendo de la procedencia de las CPHs:
Autotrasplante (autlogo): las clulas provienen del paciente.
Alotrasplante (alognico): las clulas provienen de un donante
compatible emparentado o no emparentado con el(la) paciente.
Isotrasplante (singnico): las clulas provienen de su hermano(a)
gemelo(a) o trillizo(a) idntico(a).
Tipos de Trasplante:
Indicaciones Clnicas para el Tx CPHs
Rgimen de
condicionamiento
Pacient
e
Mieloablacin
del sistema
hematopoytic
o
cel.
donador
TCPHs
Quimerismo en
el Paciente
SC = Stem Cells DC = Clulas dendrticas
CPHs Movilizadas hacia la Sangre Perifrica
Las CPHs se movilizan de la MO hacia la SP con el uso de drogas citotxicas,
citocinas, o una combinacin de ambos.
Posteriormente se colectan por medio de afresis, en cantidades suficientes para
el trasplante
Reconstitucin hematopoytica
La fenotipificacin se basa en la identificacin de los antgenos de
diferenciacin leucocitaria (CD-del ingls cluster of differentiation), que
son molculas de superficie de los leucocitos y otras clulas que se
adquieren y/o pierden durante el proceso de maduracin celular.

Algunos de stos antgenos CD son caractersticos de cada clula y
otros se comparten entre algunas clulas y se identifican con el uso de
anticuerpos acoplados a un fluorocromo.

De esta forma podemos distinguir las distintas subpoblaciones celulares
del sistema hematopoytico.
Inmunofenotipificacin
Quin es responsable de la
reconstitucin hematopoytica?
Clulas Progenitoras Hematopoyticas (CPHs)
El primer antgeno de superficie en el sistema hematopoytico cuya
expresin se describi como restringida a las CPHs de todos los linajes
fue el CD34
+
, de modo que stas clulas son las responsables de la
reconstitucin hematopoytica.

I. Es una protena glicosilada pesada de estructura semejante a la
mucina, de 40 kD. Los eptopes reconocidos por los AcMo se
categorizan en tres clases dependiendo de su sensibilidad a la
neuramidasa y a la glicoproteasa.

Clase I: Sensibles a ambas enzimas (generan datos
inconsistentes)
Clase II: Sensibles a la proteasa
Clase III: Insensibles a ambas enzimas (son los de eleccin)

Tiempo promedio de injerto:
CPH de MO: da + 1
CPH de SP: da + 10
CPH de CU: da + 25


Recuperacin Celular:
Clulas NK: 3- 4 semanas
Linfocitos B: 3 meses
Linfocitos T: 6-12 meses (CD8
+
antes que CD4
+
)
IgG: Alrededor de un ao post-trasplante
Injerto y Reconstitucin Inmunolgica
Citometra: Antecedentes
Tcnica de anlisis celular que implica medir las caractersticas
de dispersin de luz y fluorescencia que poseen las clulas
conforme se las hace pasar a travs de un rayo de luz.
CITO METRIA
MEDICIN DE CLULAS
Clula Medicin
Laser
Cells
Citometra: Antecedentes
Ventajas de la citometra
Se analizan caractersticas de clulas individuales y ofrece informacin sobre
la poblacin.

Velocidad: anlisis de entre 1,000 y 100,000 clulas en segundos. La
variacin biolgica es amplia y una muestra grande es ms confiable para
definir poblaciones celulares

Precisin: permite resolver pequeas diferencias entre clulas.- tamao,
complejidad, fluorescencia

Sensibilidad: detecta seales fluorescentes dbiles; protenas reporteras,
anticuerpos, autofluorescencia.
Qu nos dice el citmetro acerca de una
clula?
Intensidad de fluorescencia relativa
La intensidad de la emisin es proporcional al nmero de fluorocromos
unidos a las molculas en la superficie celular o en el interior de la clula
(sitios de unin)
Qu nos dice el citmetro acerca de una
clula?
Sistemas que componen un Citmetro
de Flujo
Parmetros
Forward Scatter: Luz dispersada hacia adelante (tamao)

Side Scatter: Luz reflejada o dispersada lateralmente (complejidad)

Canales de Fluorescencia: FL1, FL2, FL3, etc., (Caractersticas
dependientes del anticuerpo conjugado al fluorocromo)
Side Scatter
(una dimensin)
Forward Scatter
(una dimensin)
Un histograma no
necesariamente muestra la
complejidad de las poblaciones
celulares.
Por ejemplo, lo que parece una sola
poblacin en el histograma FSC, son en
realidad, mltiples poblaciones que solo
se pueden distinguir observando los datos
en dos dimensiones
Scatter Plot (Diagrama de dispersin)
Forward Scatter
S
i
d
e

S
c
a
t
t
e
r

Se puede observar que los picos de los
histogramas FSC y SSC correlacionan
con los puntos coloreados en el
diagrama de dispersin
Scatter Plot (Diagrama de dispersin)
Scatter Plot (Diagrama de dispersin)
Forward scatter o tamao
S
i
d
e

s
c
a
t
t
e
r

o

c
o
m
p
l
e
j
i
d
a
d

Permite distinguir diferentes poblaciones
Este anlisis multi-paramtrico es la verdadera fortaleza de la
citometra de flujo
Anticuerpos especficos contra una molcula conjugados a un
fluorocromo
El lser excita al fluorocromo a un nivel de mayor energa
Cuando el fluorocromo regresa a su estado original, el cambio de
energa es en forma de luz emitida
Los filtros limitan la deteccin a determinadas longitudes de onda que
son amplificadas por los fotomultiplicadores (PMTs)
Uso de la Fluorescencia en citometra
Flourforo
Anticuerpo
Experimento de dos colores:
diagrama de dispersin
Conforme pasan las clulas por el detector, la seal generada las
va clasificando de acuerdo a la fluorescencia del marcador unido a
ellas
Experimento de dos colores:
diagrama de dispersin
Gating (Seleccin)
Gating (Seleccin)
Gating (Seleccin)
International Society for Hematotherapy and Graft Engineering
Cuantificacin de CD34
+
: Gua ISHAGE
Antes de 1995, se haba incrementado el uso de Clulas
Hematopoyticas de Sangre Perifrica Movilizada (PBSC) para
reconstituir la hematopoyesis autloga y alognica, sin embargo, no se
haba establecido un consenso para establecer un control de calidad de
los productos de PBSC. La evaluacin del injerto mediante la
cuantificacin de clulas CD34
+
por citometra de flujo deba
proporcionar un ensayo rpido, confiable y reproducible.

Sin embargo, aunque se haban establecido varios ensayos para la
cuantificacin, la falta de un mtodo estandarizado haba originado una
gran cantidad de datos muy divergentes.

Adems ninguno de stos mtodos haba sido validado como una
prueba interlaboratorios reproducible y no se haba evaluado la
idoneidad para aplicaciones clnicas generalizadas.
International Society for Hematotherapy and Graft Engineering
Cuantificacin de CD34
+
: Gua ISHAGE
Por ello, ISHAGE, estableci un comit para la evaluacin de clulas
progenitoras (stem cell) cuyo objetivo era validar un mtodo simple,
rpido y sensible para la cuantificacin de clulas CD34
+
en los
productos de afresis y sangre perifrica.

Tambin se buscaba establecer su utilidad en la variedad de citmetros
utilizados en los laboratorios clnicos y su reproducibilidad entre los
centros de trasplante.

De este modo se desarroll la metodologa de cuatro parmetros
adoptada por ISHAGE para su validacin en un estudio multicntrico en
los Estados Unidos.
Cuantificacin de CD34
+
: Gua ISHAGE
Esta gua presenta un mtodo que se basa en las caractersticas de
tamao, granularidad y flourescencia de las clulas progenitoras y la
estrategia de seleccin (gatting) para su cuantificacin.

De modo que las verdaderas clulas CD34
+
se pueden distinguir por :

expresan el antgeno CD34;
presentan una tincin dbil con el anticuerpo CD45 (CD45dim), es
decir detectable pero a niveles menores que los linfocitos y monocitos,
con dispersin lateral baja (SSClow) y
presentan tamao (FSC) bajo a intermedio caracterstico de los
blastos.

Se conoce como de doble plataforma (dual platform) porque para el
clculo del nmero absoluto de clulas CD34
+
requiere de los datos
obtenidos del anlisis en el citmetro (%) y de la cuenta de clulas
blancas obtenida de un analizador hematologico (wbc x10
3
/mL)
Gua de ISHAGE
Posteriormente se introdujeron los anlisis de una sola plataforma
(single- platform) donde se utilizan perlas o esferas fluorescentes de
referencia en una cantidad conocida, de modo que el equipo cuenta
estos eventos.

Se realiza un clculo con el # de esferas colocadas en el tubo, el # de
esferas contadas por el equipo, el volumen de la muestra (mL) y el # de
clulas CD34
+
contadas por el equipo; de modo que se obtiene el
nmero absoluto de clulas CD34
+
por mL
Gua ISHAGE: Estrategia de anlisis
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
CD45 FITC
1a Cos 1-11213.001
CD45
Leucocitos (clulas
CD45 positivas)
Detritos celulares y clulas
CD 45 negativas
Lmite de la
regin R1
Grafica 1 (SSC vs CD45-FITC)
No gate
Grafica 2 (SSC vs 7AAD)
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
7-AAD
1a Cos 1-11213.001
Viv as Lmite de la
regin R2
Clulas muertas
(7-AAD positivas)
No gate
Clulas vivas
(7-AAD negativas)
Gua ISHAGE: Estrategia de anlisis
Grafica 3 (SSC vs CD34-PE)
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
CD34 PE
1a Cos 1-11213.001
CD34+
Regin R3
Clulas CD34 positivas
Grafica 4 (SSC vs CD45-FITC)
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
CD45 FITC
1a Cos 1-11213.001
CD45
CD45 dim
Regin R4.
Clulas CD45 positivas
(con menor intensidad que
los leucocitos)
Gate R1 &
R2
Gate R1 & R2
&R3
Gua ISHAGE: Estrategia de anlisis
0 200 400 600 800 1000
Forward Scatter
1a Cos 1-11213.001
CD34+ Stem Cells
Regin R5
Clulas CD34
+
verdaderas
Grafica 5 (SSC vs FSC)
Gate R1 & R2 & R3 & R4
0 200 400 600 800 1000
Forward Scatter
1a Cos 1-11213.001
Grafica 6 (SSC vs FSC)
No
Gate
ANALISIS
SP 1-11213 1a Cosecha
Viabilidad = 94.22 %
% CD34+ = 0.35 %
File: 1a Cos 1-11213.001
Sample ID: Tubo 1
Patient ID: 1a Cos 1-11231
Acquisition Date: 15-Jun-10
Gate: No Gate
Total Events: 97434
Gate Events
G5, viable CD34+ Cells 246
G1, wbc 74371
G2, viable wbc 70073
G3 260
G4 252
Gua ISHAGE: Estrategia de anlisis
Estadstic
as
[%] Viabilidad de CB =
CB viables (G2)
x 100
CB (G1)
CB = Clulas
Blancas
Porcentaje de clulas
CD34
+
=
nmero de eventos en G5
x 100
nmero de eventos en G2
ANALISIS
SP 1-11213 1a Cosecha
Viabilidad = 94.22 %
% CD34+ = 0.35 %
0 200 400 600 800 1000
Forward Scatter
1a Cos 1-11213.001
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
CD45 FITC
1a Cos 1-11213.001
CD45
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
7-AAD
1a Cos 1-11213.001
Viv as
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
CD34 PE
1a Cos 1-11213.001
CD34+
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
CD45 FITC
1a Cos 1-11213.001
CD45
CD45 dim
0 200 400 600 800 1000
Forward Scatter
1a Cos 1-11213.001
CD34+ Stem Cells
File: 1a Cos 1-11213.001
Sample ID: Tubo 1
Patient ID: 1a Cos 1-11231
Acquisition Date: 15-Jun-10
Gate: No Gate
Total Events: 97434
Gate Events
G5, viable CD34+ Cells 246
G1, wbc 74371
G2, viable wbc 70073
G3 260
G4 252
Valores normales de CD34
+
y Dosis
Requerida para el Injerto
Valores normales de CD34
+
:
Mdula sea (MO): 1- 4%
Sangre de Cordn Umbilical (CU): < 1% o entre 10-100 cls
/mL
SP movilizada: % variable (0.1-1%) o entre 5-200 cls /mL
Sangre Perifrica: <0.1% (0.01-0.1%), menos de 5
cls /mL


Dosis Celular Requerida :
Entre 2-6 x10
6
CD34
+
/Kg de peso del paciente
Cuantificacin de Subpoblaciones
Cuantificacin de Subpoblaciones
Cuantificacin de Subpoblaciones
Tiempo promedio de injerto:
CPH de MO: da + 1
CPH de SP: da + 10
CPH de CU: da + 25


Recuperacin Celular:
Clulas NK: 3- 4 semanas
Linfocitos B: 3 meses
Linfocitos T: 6-12 meses (CD8
+
antes que CD4
+
)
IgG: Alrededor de un ao post-trasplante
Cuantificacin de Subpoblaciones
XXXXXde CD34
+
:
Importante para monitorear la reconstitucin inmunolgica del
paciente.

Sangre de Cordn Umbilical (CU): < 1% o entre 10-100 cls
/mL
SP movilizada: % variable (0.1-1%) o entre 5-200 cls /mL
Sangre Perifrica: <0.1% (0.01-0.1%), menos de 5
cls /mL


XXXXXXar Requerida :
Entre 2-6 x10
6
CD34
+
/Kg de peso del paciente
GRACIAS
Departamento de Inmunogentica, InDRE