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ISSN 1517 - 5111

Dezembro, 2002
58
Princpios da Cultura de
Tecidos Vegetais
Documentos 58
Solange Rocha Monteiro de Andrade
Princpios da Cultura de
Tecidos Vegetais
Planaltina, DF
2002
ISSN 1517-5111
Dezembro, 2002
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria
Embrapa Cerrados
Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento
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Reviso de texto: Maria Helena Gonalves Teixeira /
J aime Arbus Carneiro
Normalizao bibliogrfica: Shirley da Luz Soares
Capa: Chaile Cherne Soares Evangelista
Editorao eletrnica: Leila Sandra Gomes Alencar
Impresso e acabamento: Divino Batista de Souza /
J aime Arbus Carneiro
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impresso (2002): tiragem 100 exemplares
Todos os direitos reservados.
A reproduo no-autorizada desta publicao, no todo ou em
parte, constitui violao dos direitos autorais (Lei no 9.610).
Andrade, Solange Rocha Monteiro de.
Princpios da cultura de tecidos vegetais / Solange Rocha Monteiro de
Andrade. Planaltina : Embrapa Cerrados, 2002.
16 p. (Documentos / Embrapa Cerrados, ISSN 1517-5111; 58)
1. Cultura vegetal - Tecido vegetal. I. Ttulo.
II. Srie.
571.538 - CDD 21
A553p
Embrapa 2002
CIP-Brasil. Catalogao-na-publicao.
Embrapa Cerrados.
Solange Rocha Monteiro de Andrade
Bil., Ph.D., Embrapa Cerrados,
solange@cpac.embrapa.br
Autora
Apresentao
A cultura de tecidos vegetais uma ferramenta com alto potencial para aplicao
no melhoramento vegetal. Ela pode ser utilizada desde a multiplicao de material
gentico, para a troca e a avaliao de germoplasma, at a produo de mudas
livres de vrus. Sua aplicao tambm se estende ao aumento da variabilidade
gentica mediante a produo de variantes somaclonais e como fase essencial
para a obteno de plantas transgnicas. No entanto, poucas so as publicaes,
em portugus, sobre cultura de tecidos vegetais. A Embrapa, com a publicao
dos livros Tcnicas e Aplicaes da Cultura de Tecidos de Plantas, em 1990 e
Cultura de Tecidos e Transformao Gentica de Plantas, em 1998, tem
contribudo para preencher essa lacuna. No entanto, ainda existe a necessidade
de bibliografia de carter mais bsico sobre esse assunto, visando a atingir um
pblico leigo, mas curioso sobre o assunto.
Nesse sentido que a Embrapa Cerrados apresenta essa publicao com
conceitos bsicos da cultura de tecidos, explicando cada conceito de forma clara
e concisa, alm de descrever cada etapa do processo e as aplicaes dessa
ferramenta biotecnolgica.
Carlos Magno Campos da Rocha
Chefe-geral da Embrapa Cerrados
Sumrio
Aspectos Gerais ......................................................................... 9
Fatores que Afetam a Regenerao in vitro ...................................... 10
Etapas e Vias de Regenerao in vitro ............................................. 12
Principais Aplicaes da Cultura de Tecidos ..................................... 14
Concluso .................................................................................. 15
Referncias Bibliogrficas ............................................................. 15
Abstract .................................................................................... 16
Princpios da Cultura de
Tecidos Vegetais
Solange Rocha Monteiro de Andrade
Aspectos Gerais
A cultura de tecidos vegetais uma tcnica com grande aplicao na agricultura.
Nessa tcnica, pequenos fragmentos de tecido vivo, chamados explantes, so
isolados de um organismo vegetal, desinfestados e cultivados assepticamente,
por perodos indefinidos em um meio de cultura apropriado. O objetivo obter
nova planta idntica original (Figura 1), ou seja, realizar uma clonagem vegetal
que definida como uma propagao assexuada de clulas ou organismos de
modo a obter novo indivduo, mantendo-se o gentipo idntico quele do
ancestral comum (Torres et al., 2000). Na Figura 1, ilustra-se o princpio geral
da cultura de tecidos vegetais visando reproduo de determinada matriz.
A cultura de tecidos vegetais feita de um explante (Figura 1) que todo
segmento de tecido ou rgo vegetal utilizado para iniciar uma cultura in vitro.
Pode ser um fragmento de folha, de raiz, de caule ou de qualquer tecido que
responda s condies de induo do meio de cultura, com vistas regenerao
vegetal in vitro (Torres et al., 2000). Essa regenerao fundamentada na
capacidade de a proliferao das clulas vegetais organizarem-se em tecidos e,
eventualmente, em plantas completas (Kerbauy, 1997; Mantell et al., 1994).
Essa capacidade denominada totipotncia e considera que as clulas vegetais
manifestam, em momentos diferentes e sob estmulo apropriado, a potencialidade
de iniciar novo indivduo multicelular (Torres et al., 2000). Teoricamente,
considera-se que todas as clulas vegetais so capazes de expressar sua
totipotncia. No entanto, os explantes so uma mistura de clulas em variados
10 Princpios da Cultura de Tecidos Vegetais
estados: fisiolgico, bioqumico e de desenvolvimento. Nesse sentido, espera-se
que a exposio desses explantes a um ambiente in vitro estimule reaes
diversificadas nos diferentes tipos celulares, fazendo com que somente algumas
clulas desse explante respondam s condies de cultura in vitro, levando
regenerao de um novo indivduo (Mantell et al., 1994). Essa habilidade que uma
clula ou um grupo de clulas tem ao responder a um estmulo indutivo visando a
um processo de desenvolvimento denominada competncia (Torres et al., 2000).
Figura 1. Princpio geral da cultura de tecidos.
Fonte: (Kerbauy, 1997).
Fatores que Afetam a Regenerao
in vitro
Existem trs fatores que afetam a regenerao da planta in vitro: o gentipo (qual
espcie, cultivar ou variedade que est sendo utilizada), a fonte de explantes
(folha, raiz, caule, meristema, etc) e a condio da cultura (meio de cultura, luz,
temperatura, vasilhame). O sucesso da iniciao e da regenerao da cultura in
vitro depende da deciso correta no estabelecimento de todos esses fatores. Na
realidade, muito ainda precisa ser conhecido sobre os mecanismos de hormnios
vegetais e sobre os processos que controlam o desenvolvimento das plantas. A
melhor via para o desenvolvimento de sistemas de regenerao in vitro continua
sendo aquela baseada em testes que incluem esses trs fatores. O objetivo
desses testes obter uma combinao tima dos fatores para que o processo
seja bem-sucedido (Caldas et al., 1998).
11 Princpios da Cultura de Tecidos Vegetais
A escolha do gentipo a ser utilizado na cultura de tecidos vai depender dos
objetivos experimentais. interessante notar que variedades de uma mesma
espcie respondem de maneira diferente s condies de cultivo. No entanto,
alguns autores consideram que toda espcie e toda cultivar so capazes de
responder s condies de cultura in vitro desde que seja utilizada uma
combinao correta dos demais fatores que afetam a regenerao in vitro
(Mantell et al., 1994).
A fonte de explante (Figura 1) tambm fator importante no sucesso da
regenerao in vitro, pois a capacidade de regenerao depende da maturidade,
do estdio fisiolgico e do tecido utilizado. Por exemplo, uma folha em
senescncia j perdeu grande parte de seus nutrientes e est em processo
degenerativo, no sendo uma boa fonte de explante. De modo geral, tecidos
jovens e em crescimento so utilizados como fonte de explante.
As condies de cultura, principalmente, o meio de cultura so decisivos para o
sucesso da regenerao in vitro. O meio de cultura constitudo de sais minerais
(micro e macronutrientes), nitrognio reduzido, uma fonte de carbono, vitaminas
e reguladores de crescimento, necessrios para manter a diviso celular e a
proliferao dos explantes. A combinao adequada entre esses componentes,
associada s demais condies da cultura como luz (intensidade, qualidade e
fotoperodo), temperatura e vasilhame da cultura (tamanho e permeabilidade a
trocas gasosas) a base da tecnologia da cultura de tecidos vegetais (Kerbauy,
1997). Na Figura 2, ilustra-se uma cmara de crescimento em que so
controlados e estudados os diferentes fatores que afetam a regenerao in vitro.
Figura 2. Cmara de
crescimento utilizada na
tecnologia de cultura de
tecidos vegetais.
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Etapas e Vias de Regenerao
in vitro
Os explantes, antes de serem inoculados em um meio de cultura, precisam ser
desinfestados (Figura 1). A desinfestao um processo de esterilizao da
superfcie do explante visando a eliminar os microrganismos como bactrias,
fungos, leveduras. A contaminao dos explantes por microrganismos um
problema da cultura de tecidos, porque alm de competirem pelos nutrientes,
alguns deles produzem toxinas que influenciam o processo de regenerao do
explante. Os explantes so geralmente desinfestados em solues de hipoclorito
de clcio 2% ou hipoclorito de sdio 0,5 a 1%, durante 5 a 20 minutos, sendo,
em seguida lavados cuidadosamente em gua destilada autoclavada. A
concentrao de hipoclorito, o tempo e modo de desinfestao variam com o
tipo e a idade do tecido.
Feito o processo de desinfestao, as plantas podem ser regeneradas por
organognese ou embriognese somtica (Figura 1). Organognese uma via de
desenvolvimento na qual rgos vegetais (brotos, razes) ou ambos so
induzidos diferenciao a partir de uma ou vrias clulas. A organognese
pode ser direta ou indireta. Na direta, tambm chamada adventcia, o rgo
vegetal induzido e desenvolve diretamente de um explante, isto , sem passar
por uma fase inicial de calo. Na indireta, h uma fase inicial de proliferao e
crescimento de calo, seguido por induo de brotos ou razes e desenvolvimento
desses tecidos (Mantell et al., 1994). Calo um grupo ou massa de clulas,
com crescimento desordenado que pode apresentar certo grau de diferenciao
(Figura 3) (Torres et al., 2000) .
Figura 3. Calo de amor-
perfeito (Viola tricolor)
contendo embries em
diferentes estdios de
desenvolvimento. F
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A embriognese somtica uma via de desenvolvimento na qual a formao de
embries induzida de clulas somticas. Como a organognese, a
embriognese somtica pode ocorrer diretamente de um explante sem o
aparecimento de calos. Entretanto, a via de embriognese indireta (Figura 3), na
qual embries somticos so induzidos e desenvolvidos de proliferaes de
calos a mais comum. Assim como ocorre na organognese, certo perodo de
tempo necessrio para desdiferenciar e obter competncia para a via
embriognica, iniciada de uma cultura celular (Mantel et al., 1994).
Outra via de regenerao a micropropagao, tomando-se como base explantes
meristemticos. Essa via tem a vantagem de as plantas regenerarem-se
diretamente de um tecido organizado sem a necessidade do estdio de calo.
Desse modo, tem-se uma economia de tempo, bem como elimina-se a variao
somaclonal, que associada a longos perodos de cultura de calos. A variao
somaclonal uma variao gentica espontnea de plantas regeneradas de
cultura de clulas ou tecidos in vitro a qual indesejada quando o objetivo
obter uma planta idntica planta-matriz (Mantell et al., 1994).
A regenerao de plantas por organognese ou embriognese somtica, direta ou
indireta, normalmente, requer uma fase ou de macropropagao, ou aclimatao,
depois que as plntulas so produzidas. Essa fase envolve a exposio das
plantas ao ambiente externo que possui umidade relativa mais baixa e variaes
das condies de luz e temperatura (Figura 4). Depois do crescimento
sustentvel, nesse meio ambiente, as plntulas podem ser colocadas em casa de
vegetao (Figura 5) (Mantell et al., 1994).
Figura 4. Etapas da
aclimatao.
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Principais Aplicaes da Cultura de
Tecidos
A cultura de tecidos pode ser empregada para a multiplicao de espcies de
difcil propagao, como por exemplo, algumas espcies nativas do Cerrado.
Outro exemplo de grande importncia a limpeza clonal por meio da qual
possvel, em algumas espcies, como abacaxi, citrus, morango, batata e outras,
a produo de mudas livre de vrus (Ferreira et al., 1998). Essa tcnica consiste
em cultivar meristemas livres de vrus e induzir a formao de material
propagativo geneticamente idntico aos parentais.
A cultura de tecidos tambm pode ser empregada de diferentes maneiras dentro
de um programa de melhoramento vegetal. Embora no estejam diretamente
envolvidas no desenvolvimento de cultivares, muitas vezes, essas tcnicas
oferecem solues exclusivas nas diferentes fases desse processo. No
melhoramento de espcies que apresentam problemas de dormncia de
sementes, pode-se utilizar a tcnica de germinao in vitro. Em alguns casos,
quando o desenvolvimento do fruto um processo prolongado, pode-se utilizar
a cultura de embries imaturos, na germinao, para aceler-la.
A variabilidade gentica a base para um programa de melhoramento e,
normalmente, conservada em acessos de bancos de germoplasma in vivo. No
entanto, em alguns casos, sobretudo, em espcies propagadas vegetativamente,
Figura 5. Casa de
vegetao.
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a manuteno in vitro uma alternativa menos dispendiosa que in vivo. A
cultura de tecidos tambm pode aumentar a variabilidade gentica pela variao
somaclonal ou dando suporte para outras tcnicas como a introgresso de genes
e a transformao gentica. Finalmente, a cultura de tecidos permite a
multiplicao do material gentico, auxiliando a troca de germoplasma para
avaliao em diversos ambientes, como por exemplo, a multiplicao de
gentipos para anlise em experimentos replicados. (Ferreira et al., 1998).
Concluso
A cultura de tecidos uma ferramenta que oferece solues originais para o
programa de melhoramento vegetal, solues essas que podem resultar na
otimizao do tempo e na qualidade das cultivares a serem lanadas por esse
programa.
Referncias Bibliogrficas
CALDAS, L. S.; HARIDASAN, P.; FERREIRA, M. E.; Meios nutritivos. In:
TORRES, A . C.; CALDAS, L. S.; BUSO, J . A . Cultura de tecidos e
transformao gentica de plantas. Braslia: Embrapa SPI: Embrapa CNPH, 1998.
v. 1, p. 87-132.
FERREIRA, M. A .; CALDAS, L. S.; PEREIRA, E. A . Aplicaes da cultura dos
tecidos no melhoramento gentico de plantas. In: TORRES, A . C.; CALDAS, L.
S.; BUSO, J . A . Cultura de tecidos e transformao gentica de plantas.
Braslia: Embrapa SPI: Embrapa CNPH, 1998. v. 1, p. 21-43.
KERBAUY, G. B. Clonagem de plantas in vitro. Biotecnologia Cincia e
Desenvolvimento, Braslia, v. 1, n. 1, p. 30-33, maio 1997.
MANTELL, S. H.; MATTHEWS, J . A .; McKEE, R. A . Tcnicas de cultura de
tecidos. In: MANTELL, S. H.; MATTHEWS, J . A.; McKEE, R. A . Princpios de
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TORRES, A . C.; FERREIRA, A . T.; S, F. G.; BUSO, J . A .; CALDAS, L. S.;
NASCIMENTO, A . S.; BRGIDO, M. M.; ROMANO, E. Glossrio de
biotecnologia vegetal. Braslia: Embrapa Hortalias, 2000. 128 p.
16 Princpios da Cultura de Tecidos Vegetais
Plant Tissue Culture
Abstract - Plant tissue cultures is a process through which small fragments of
plant tissue (explant) are isolated from a plant organism, disinfected and
aseptically cultivated during indefinite periods in a culture medium. A plant
regenerated by tissue culture represents a genetic duplication of an organism
through asexual reproduction of cells or tissues, in order to obtain a new
individual with an identical genotype to that of the common ancestral. Explant is
any kind of plant organ or segment used to settle an in vitro culture, e.g., leaf
fragments, root, stem, or any tissue that respond to the induction conditions of
the medium tissue culture. In vitro plant regeneration is based on the idea that
plant cells are capable, in different stages and under appropriate conditions, to
give rise or to form a new individual or plant part which is called totipotence.
Theoretically, it is accepted that all plant cells are capable to express totipotence.
However, the explant is a mixture of cells in different physiological, biochemical
and of developmental stages. Thus, it is supposed that the induction of these
cells to in vitro medium stimulates diversified responses in the different cell
types. The result of this heterogeneity is that only some cells of the explant will
be capable to respond to the in vitro culture conditions, leading to the
regeneration of a new individual. This ability of a cell or a group of cells to
respond to an inductive conditions results in a development process named
competence. Three factors affect the in vitro plant regeneration which are:
genotype, explant source and medium condition of the culture. Therefore, the
development of an in vitro regeneration system is based on tests among these
three factors until their combination becomes a success.
Index terms: Tissue culture, micropropagation, regeneration, in vitro culture.