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Gerente-Geral de Inspeo e Controle de Medicamentos e Produtos

Antnio Carlos da Costa Bezerra


Coordenao de Inspeo em Centros de Bioequivalncia
Cludia Franklin de Oliveira
E-mail: bioequivalencia@anvisa.gov.br
Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria
Manual de Boas Prticas em
Biodisponibilidade
Bioequivalncia
Volume II
Braslia
2002
Direitos reservados da Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria
SEPN 515, Edifcio mega, Bloco B, Braslia (DF), CEP 70770-502.
Internet: www.anvisa.gov.br
Copyright 2002. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria.
Permitida a reproduo total ou parcial desta obra, desde que citada a fonte.
1 edio - 2002
ISBN: 85-88233-06-1
Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria
Realizao: Coordenao de Inspeo em Centros de Bioequivalncia - Gerncia-Geral de
Inspeo e Controle de Medicamentos e Produtos
Coordenao Geral: Cludia Franklin de Oliveira / Coordenao de Inspeo em Centros de
Bioequivalncia
Reviso: Karla de Arajo Ferreira / Coordenao de Inspeo em Centros de Bioequivalncia
Divulgao: Unidade de Divulgao
Capas: Joo Carlos de Souza Machado / Gerncia de Comunicao Multimdia
Diagramao, composio e impresso: Dupligrfica Editora Ltda./DF
Impresso no Brasil
Manual de boas prticas em biodisponibilidade: bioequivalncia/Agncia
Nacional de Vigilncia Sanitria. Gerncia-Geral de Inspeo e
Controle de Medicamentos e Produtos. Braslia: ANVISA, 2002.
2 v.
QV38
1. Equivalncia teraputica. 2. Bioequivalncia. 3. Disponibilidade
biolgica. 4 . Medicamentos. I. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria.
Gerncia-Geral de Inspeo e Controle de Medicamentos e Produtos.
PREFCIO
Atualmente se acham em execuo no Brasil inmeros estudos clnicos com o objetivo de avaliar a
Biodisponibilidade/Bioequivalncia de produtos farmacuticos. A partir de junho de 2001, a Anvisa,
por meio da Coordenao de Inspeo em Centros de Bioequivalncia ligada Gerncia-geral de
Inspeo e Controle de Medicamentos e Produtos , passou a avaliar estes centros em inspees
peridicas, a fim de garantir a qualidade dos estudos.
No decorrer das atividades de inspeo, que a princpio tinham carter orientativo, a coordenao
observou a necessidade de esclarecer alguns pontos que restavam como dvidas tcnicas para os
centros, em especial a relativa padronizao de mtodos analticos, anlise estatstica dos estudos,
armazenamento de amostras biolgicas, confinamento de voluntrios e estudos de estabilidade de
frmacos, entre outros.
A partir da identificao desta necessidade, e buscando prevenir o comprometimento da qualidade
dos trabalhos realizados, surgiu a iniciativa da criao pela coordenao de ncleos de discusso,
com o objetivo de esgotar o esclarecimento de todos os aspectos relevantes conduo dos estudos
e integrao de suas fases. Esses ncleos contaram com a participao de 40 especialistas das reas
de Farmcia, Medicina, Estatstica e Qumica.
neste contexto que surge este Manual de Boas Prticas em Biodisponibilidade/Bioequivalncia,
composto por seis grandes tpicos apresentados de maneira didtica, buscando transpor as
dificuldades dos centros, e, por conseguinte, complementar as diretrizes j previstas na legislao
sanitria brasileira para a realizao dos estudos.
Os ncleos de trabalho iniciaram as discusses em setembro de 2001, cada um deles cuidando de
uma das trs etapas do processo Clnica, Analtica e Estatstica , sob a coordenao da Dra.
Cludia Franklin de Oliveira e inestimvel colaborao da professora Slvia Storpirts. Nos meses
subseqentes, foram realizadas diversas reunies, de modo a promover debates tcnicos e a alcanar
consenso nas questes. Desta forma, cada grupo elaborou um conjunto de tpicos relevantes que
devessem constar no manual. Posteriormente, todos foram objeto de cuidadosa pesquisa e os
resultados relatados de modo a propiciar um bom entendimento por parte do pblico-alvo.
O manual completo levou 11 meses para ser concludo. Este processo envolveu a participao, no
total, de cerca de 50 profissionais de diversas reas do conhecimento, entre pesquisadores de
universidades pblicas, tcnicos da Anvisa e fabricantes de instrumentao laboratorial e
equipamentos. A todos estes colaboradores a Anvisa registra sua gratido pela contribuio impar a
um trabalho to singular.
A estrutura final consta de dois volumes e cada qual possui trs mdulos. O primeiro volume traz
detalhadas tecnicamente cada uma das etapas dos estudos de Biodisponibilidade/Bioequivalncia
na seqncia natural de sua conduo: Mdulo 1: Etapa Clnica, Mdulo 2: Etapa Analtica e
Mdulo 3: Etapa Estatstica. O segundo volume abrange aspectos importantes no que diz respeito
instrumentao laboratorial e equipamentos utilizados na execuo da etapa analtica, considerados
crticos no processo. Neste volume, o Mdulo 1 refere-se Fundamentos e Operao de Micropipetas,
o Mdulo 2 aborda a gua para Anlises Qumicas Instrumentais e o Mdulo 3 possui contedo
relacionado Espectrofotometria de Ultra Violeta Visvel, Cromatografia em Fase Lquida (LC),
Cromatografia em Fase Gasosa (GC), Sistemas de Cromatografia Acoplados a Detectores de Massa
e Verificao de Desempenho de Instrumentos Analticos.
importante ressaltar o ineditismo, mesmo em nvel internacional, da reunio de informaes
provenientes de diversas disciplinas em um nico compndio, buscando a sintetizao de todos os
aspectos que envolvem as Boas Prticas em Biodisponibilidade/Bioequivalncia.
Claro fica que o objetivo maior deste trabalho o de aperfeioar a qualidade dos ensaios de
Biodisponibilidade/Bioequivalncia realizados no Brasil, e, por conseguinte, contribuir em parte
com a qualidade dos medicamentos genricos disponveis no mercado, por meio do fornecimento
de subsdios tcnicos amplamente estudados e minuciosamente elaborados. Neste sentido, esperamos
contribuir para a capacitao dos Centros de Biodisponibiliade/Bioequivalncia, alm de promover
a formao de monitores de estudos para a indstria farmacutica nacional e ajudar a formar agentes
multiplicadores de conhecimento nas universidades brasileiras.
A realizao deste manual s foi possvel graas ao importante trabalho de inmeras pessoas e
antecipadamente peo desculpas por eventual esquecimento de algum nome. Foram fundamentais
os editores Jos Pedrazzoli Jnior (USF/Unifag) e Joo Antnio Saraiva Fittipaldi (Pfizer), e os
colaboradores Fernanda Maria Villaa Boueri (Anvisa), Eliana Regina Marques Zlochevsky (Anvisa),
Cludia Simone Costa da Cunha (Ministrio da Sade) e Beatriz Helena Carvalho Tess (Ministrio
da Sade), no mdulo Etapa Clnica; os editores Cludia Franklin de Oliveira (GGIMP/Anvisa),
Rui Oliveira Macedo (UFPA), Flvio Leite (T&E Analtica) e Pedro Eduardo Froehlich (UFRGS), e
os colaboradores Pedro de Lima Filho (GGMEG/SP), Davi Pereira de Santana (UFPE), Rafael
Eliseo Barrientos Astigarraga (Cartesius), Silvana Calafatti de Castro (Unifag), Thas Reis Machado,
Jaime Oliveira Ilha (Cartesius), Itapuan Abimael Silva (Anvisa), Karen Noffs Brisolla (Anvisa),
Marcelo Cludio Pereira (Anvisa), no mdulo Etapa Analtica; os editores Arminda Lucia Siqueira
(UFMG), Chang Chiann (GGMEG/SP), Cicilia Yuko Wada (Unicamp), Karla de Arajo Ferreira
(Anvisa) e Gilberto Bernasconi (USF/Unifag), e os colaboradores Reinaldo Charnet (Unicamp) e
Renato Almeida Lopes (Anvisa), no mdulo Etapa Estattica; os editores Melissa M. Silva (Nova
Analtica) e Walter Pereira (Nova Analtica), Fundamentos e Operao de Micropipetas; o editor
Jos Muradian Filho (Millipore), gua para Anlises Clnicas; os editores Ivan Jonaitis (Agilent),
Renato Garcia Peres (Flowscience), Ricardo Lira (Flowscience), Renato Gouveia, Jos Aparecido
Soares (Varian), Josu D.M. Neto (Sync Brasil) Juarez Arajo Filho (Sync Brasil), Alexandre Rosolia
(Waters), Adauto Silva (Varian) e Reinaldo Castanheira (Agilent), Instrumentao Analtica; e a
equipe de coordenao formada por Cludia Franklin de Oliveira (GGIMP/Anvisa), Marcelo Cludio
Pereira (GGIMP/Anvisa), Max Weber Marques Pereira (GGIMP/Anvisa), Karla de Arajo Ferreira
(GGIMP/Anvisa), Karen Noffs Brisolla (GGIMP/Anvisa), Itapuan Abimael da Silva (GGIMP/
Anvisa) e Renato Almeida Lopes (GGIMP/Anvisa).
Dr. Gonzalo Vecina Neto
FICHA TCNICA
Volume II Mdulo 1 Micropipetas: Fundamentos e Operao
Editores:
Melissa M. Silva Nova Analtica
Valter A. Pereira - Nova Analtica
Coordenao:
Cludia Franklin de Oliveira ANVISA
Itapuan Abimael da Silva - ANVISA
Karen de Aquino Noffs Brisolla - ANVISA
Karla de Arajo Ferreira - ANVISA
Marcelo Cludio Pereira - ANVISA
Max Weber Marques Pereira - ANVISA
Renato Almeida Lopes ANVISA
SUMRIO
1. DEFINIO...................................................................................................................................... 5
1.1. Tipos de pipetas .......................................................................................................................... 5
2. PRINCPIO DE FUNCIONAMENTO.................................................................................... 6
2.1. Pipetas de deslocamento de ar .................................................................................................. 6
2.2. Pipetas de deslocamento positivo............................................................................................. 8
3. TCNICA DE OPERAO ....................................................................................................... 11
3.1. Como guardar a pipeta ............................................................................................................ 11
3.2. Ajuste do volume ...................................................................................................................... 11
3.3. Encaixe da ponteira .................................................................................................................. 12
3.4. Pr-rinsagem da ponteira ......................................................................................................... 13
3.5. Aspirao.................................................................................................................................... 13
3.6. Dispensa ..................................................................................................................................... 14
3.7. Ejeo de ponteiras................................................................................................................... 14
4. PONTEIRAS .................................................................................................................................... 15
4.1. Ponteiras para pipetas de deslocamento de ar ...................................................................... 15
4.2. Ponteiras para pipetas de deslocamento positivo ................................................................. 15
5. MANUTENO............................................................................................................................. 16
5.1. Limpeza ...................................................................................................................................... 16
5.2. Troca de peas ........................................................................................................................... 17
5.3. Verificao da performance..................................................................................................... 20
6. SUGESTES DE PROCEDIMENTOS.................................................................................. 21
7. ANEXO I: EXEMPLO DE PROCEDIMENTO DE LIMPEZA .................................... 22
7.1. Desmontagem ........................................................................................................................... 22
7.2. Limpeza ...................................................................................................................................... 23
7.3. Montagem.................................................................................................................................. 23
8. ANEXO II: VERIFICAO PADRO DA PERFORMANCE ....................................... 24
8.1. Consideraes gerais................................................................................................................. 24
8.2. Condies ambientais da sala de teste ................................................................................... 24
8.3. Operador .................................................................................................................................... 25
8.4. Ponteiras ..................................................................................................................................... 25
8.5. Equipamentos utilizados no teste ........................................................................................... 25
8.6. O procedimento de verificao............................................................................................... 27
9. ANEXO III: PROCEDIMENTOS DE DESCONTAMINAO.................................... 38
9.1. Qumica ...................................................................................................................................... 39
9.2. Microbiologia e cultura celular ................................................................................................ 40
9.3. Biologia molecular .................................................................................................................... 41
9.4. Espectro de ao dos mtodos ............................................................................................... 44
9.5. Vantagens e desvantagens ........................................................................................................ 45
9.6. Autoclavagem............................................................................................................................ 46
9.7. Irradiao UV............................................................................................................................ 46
9.8. Solues qumicas ..................................................................................................................... 46
10. ANEXO IV: DEFINIES ......................................................................................................... 50
11. GLOSSRIO E ABREVIAES ............................................................................................... 51
12. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ...................................................................................... 52
1. DEFINIO
Pipetas operadas por pisto so equipamentos para aspirar e dispensar volumes especficos de lquidos.
As pipetas de um nico canal possuem apenas um pisto. J as pipetas de mltiplos canais possuem
uma srie de receptculos simultaneamente. As pipetas podem ser ajustadas na fbrica para dispensar
um dado volume ou dispensar volumes selecionados pelo usurio dentro de uma faixa de volume
especfica, por exemplo, entre 10 !L e 100 !L. As pipetas operadas por pisto podem ser de dois
tipos: deslocamento de ar e deslocamento positivo.
1.1. Tipos de pipetas
As pipetas podem ser projetadas das seguintes maneiras:
Em relao ao volume:
Volume fixo, projetadas pelo fabricante para dispensar apenas seu volume nominal, como por
exemplo 100!L.
Volume varivel, projetadas pelo fabricante para dispensar volumes selecionados pelo usurio
dentro de uma faixa especfica de volume.
Em relao ao pisto:
Pode haver uma camada de ar entre o pisto e a superfcie do lquido (pipetas de deslocamento
de ar).
O pisto est em contato direto com o lquido (pipetas de deslocamento positivo ou deslocamento
direto). O capilar e o pisto podem ser reutilizveis ou descartveis.
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2. PRINCPIO DE FUNCIONAMENTO
Acopla-se a ponteira de plstico ou de vidro na pipeta. Com o pisto no limite inferior (posio de
aspirao inferior), mergulha-se a ponteira no lquido que se deseja transferir. Quando o pisto
sobe para a posio de aspirao superior, o lquido aspirado. O volume do lquido dispensado
quando o pisto impulsionado novamente para a posio inferior.
O princpio de funcionamento est detalhado abaixo de acordo com o tipo de pipeta (deslocamento
de ar ou deslocamento positivo).
2.1. Pipetas de deslocamento de ar
Quando o boto de uma pipeta de deslocamento de ar pressionado, o pisto localizado dentro do
equipamento se move para baixo, deslocando o ar em contato com ele para fora da pipeta (o volume
de ar expulso igual ao volume ajustado na pipeta). O volume de ar que permanece dentro da
pipeta inversamente proporcional ao volume da amostra: quanto menor o volume de ar dentro da
pipeta, maior o volume do lquido que ser aspirado.
a) Ajuste do volume (vlido somente para as pipetas de volume varivel)
O usurio ajusta o volume desejado. O pisto se move para a posio apropriada.
P.S.: nas pipetas de volume fixo, este posicionamento feito na fbrica.
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b) Preparo para aspirao
Pressiona-se o boto. O pisto se desloca para baixo e expele um volume de ar igual ao volume
selecionado (nas pipetas de volume fixo o volume de ar expelido igual ao volume nominal da
pipeta).
c) Aspirao do lquido
Mergulha-se a ponteira no lquido at que o orifcio fique submerso. Ao se liberar o boto, o pisto
retorna para a posio inicial e forma-se no interior da pipeta um vcuo parcial. A presso atmosfrica
fora a entrada do lquido pelo orifcio da ponteira.
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d) Dispensa do lquido
Pressiona-se novamente o boto. O pisto se move para baixo deslocando o ar e aumentando a
presso interna da pipeta. O ar comprimido expulsa o lquido para fora da ponteira.
e) Segundo estgio
Em algumas pipetas de deslocamento de ar o pisto pode se deslocar um pouco abaixo do limite
inferior (conseqentemente deslocando uma quantidade adicional de ar) o que permite a expulso
das ltimas gotas do lquido. O termo mais conhecido pelos usurios para este deslocamento adicional
segundo estgio.
2.2. Pipetas de deslocamento positivo
As pipetas de deslocamento positivo funcionam como uma seringa. No h volume de ar entre o
pisto e lquido. Como no h ar para contrair ou expandir, a fora de aspirao sempre constante
e inalterada pelas propriedades fsicas do lquido a ser manipulado. Este tipo de equipamento ideal
para a manipulao de lquidos viscosos ou de alta densidade.
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b) Preparo para aspirao
Pressiona-se o boto. O pisto desce at o final do capilar.
a) Ajuste do volume
O usurio ajusta o volume desejado. O pisto se move para baixo at a posio de incio.
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c) Aspirao do lquido
O orifcio do capilar imerso abaixo da superfcie do lquido. Ao se liberar o boto, o pisto se move
para cima e a presso do ambiente fora a entrada do lquido pelo orifcio do capilar.
d) Dispensa do lquido
Pressiona-se novamente o boto. O pisto se move para baixo e expulsa o lquido para fora do
capilar.
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3. TCNICA DE OPERAO
Uma boa tcnica de pipetagem fundamental para garantir bons resultados. A seguir, um roteiro
sobre alguns aspectos da tcnica que devem ser considerados durante a operao.
3.1. Como guardar a pipeta
A pipeta deve ser guardada na posio vertical por dois motivos:
Evita-se que ela entre em contato com superfcies que podem estar contaminadas, como por
exemplo a bancada de trabalho (ao se deitar a pipeta sobre a bancada ou no interior de uma
gaveta pode-se transferir para o corpo do instrumento contaminantes que estejam neste local e
estes podem ser transferidos ao experimento, posteriormente).
Se no for feita a ejeo da(s) ponteira(s) e houver sobrado uma quantidade residual do lquido
no interior da(s) ponteira(s), ao se deitar a pipeta este lquido pode escorrer para o interior do
instrumento contaminando e danificando as peas internas e/ou o porta-cone.
Exemplos de suportes:
3.2. Ajuste do volume
Para evitar o erro de paralaxe, o ajuste do volume deve ser feito ou com a pipeta na posio
horizontal. Caso o operador prefira ajustar o volume com a pipeta na posio vertical deve estar
com um dos olhos fechado.
Quando diminuir o volume, cuidadosamente chegue ao valor desejado e no ultrapasse a marca.
Quando aumentar o volume, ultrapasse o valor desejado 1/3 de volta e depois, cuidadosamente,
diminua o volume at chegar ao desejado, no ultrapassando a marca.
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3.3. Encaixe da ponteira
O encaixe da ponteira deve ser feito de acordo com as instrues do fabricante, garantindo a
formao de um selo adequado entre a ponteira e o porta-cone da pipeta.
P.S: Entenda-se por selo um anel opaco que se forma ao redor de todo o colar da ponteira, indicando
perfeita conexo entre o porta-cone e a ponteira. Um selo incompleto levar a resultados pouco
precisos.
Abaixo, sugestes para o encaixe das ponteiras:
Ponteiras soltas:
Segure a ponteira pelo colar (com cuidado para no tocar na ponta) e encaixe-a no porta-cone e
a pressione contra ele com um movimento rotacional, como indicado na figura abaixo. Isto
garante uma conexo perfeita entre a ponteira e o porta-cone (observe a formao do selo
citado acima).
Ponteiras em racks:
Encaixe o porta-cone na ponteira e pressione a pipeta para baixo com um movimento rotacional,
como indicado na figura.
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Encaixe em multi-canal:
Para encaixar simultaneamente em todos os canais, posicione os porta-cones nos colares das
ponteiras. Faa um movimento de vai e vem, como ilustrado na figura, o que assegura conexo
adequada de todas as ponteiras em todos os canais.
3.4. Pr-rinsagem da ponteira
Quando uma nova ponteira colocada (ou aumenta-se o volume a ser aspirado), necessrio se
fazer uma pr-rinsagem da ponteira. Para isso, basta aspirar e dispensar o lquido algumas vezes.
A ao de pr-rinsar a nova ponteira garante a exatido e preciso do volume a ser posteriormente
transferido. Isto porque, quando se aspira um lquido , forma-se um filme na parede interna da
ponteira . A natureza desse filme, que o causador de erro na primeira medida, depende do
lquido que est sendo transferido. Entretanto, este filme se mantm relativamente constante
aps algumas pipetagens com a mesma ponteira. preciso pr- rinsar a ponteira para maximizar
o desempenho da pipeta.
3.5. Aspirao
A aspirao deve ser feita de modo lento e constante, mantendo-se sempre a mesma profundidade de
imerso da ponteira (durante a aspirao e entre uma amostra e outra). Recomenda-se que a profundidade
de imerso seja em torno de 2 a 3 mm abaixo da superfcie do lquido. Alguns fabricantes sugerem que
a profundidade de imerso deve variar de acordo com o volume de trabalho, como discriminado na
tabela abaixo:
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A pipeta deve ser mantida na posio vertical durante toda a aspirao. Aguarde de 1 a 2 segun-
dos antes de retirar a ponteira do lquido. Se do lado de fora da ponteira restarem gotculas do
lquido, limpe-as usando papel macio (se a metodologia permitir). Cuidado para no encostar
no orifcio da ponteira.
3.6. Dispensa
Encoste a ponta da ponteira na parede interna do recipiente e incline a pipeta aproximadamente
30 a 45;
Pressione o boto continuamente at o final do primeiro estgio. Aguarde alguns segundos (de
1 a 3 dependendo da viscosidade do lquido) ento pressione o boto at o segundo estgio
(purga) para eliminar gotculas que possam ter permanecido na ponteira;
Mantenha o boto pressionado at o final. Retire a pipeta de dentro do recipiente mantendo a
ponteira em contato com a parede interna do recipiente (arranhe a ponta da ponteira na
parede interna do recipiente).
3.7. Ejeo de ponteiras
Descarte a ponteira pressionando o boto do ejetor de ponteiras;
Deve-se tomar todas as precaues necessrias quando se trabalha com materiais contaminados
e/ou radioativos. O procedimento adequado deve ser estabelecido pelo prprio laboratrio de
acordo com o tipo de material pipetado, considerando os aspectos de segurana do usurio e do
local de trabalho.
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4. PONTEIRAS
A qualidade dos resultados diretamente influenciada pela qualidade da ponteira utilizada. Bons
resultados exigem no s ponteiras de boa qualidade, mas tambm a mais adequada ao modelo e
marca de pipeta utilizada.
4.1. Ponteiras para pipetas de deslocamento de ar
O fabricante deve indicar qual marca de ponteira o usurio deve utilizar para alcanar as
especificaes indicadas no manual de operao da pipeta.
As ponteiras de plstico para pipetas de deslocamento de ar devem ser utilizadas uma nica vez.
No se deve limpar ou reutilizar estas ponteiras, pois suas caractersticas metrolgicas
no podem ser garantidas.
4.2. Ponteiras para pipetas de deslocamento positivo
O fabricante deve indicar qual marca de ponteira o usurio deve utilizar para alcanar as
especificaes indicadas no manual de operao da pipeta.
O encaixe entre o pisto e o capilar deve ser ideal (selo perfeito entre capilar e pisto) assim
como o deslocamento do pisto no interior do capilar o que garante dispensa por igual do
lquido aspirado.
Estas ponteiras podem ser reutilizadas ou descartveis (ao se trocar a ponteira deve-se trocar
simultaneamente o capilar e o pisto).
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5. MANUTENO
Neste captulo estaremos abordando trs etapas fundamentais do procedimento de manuteno:
limpeza, troca de peas e verificao da performance.
OBSERVAO
necessrio fazer uma adequao entre as informaes presentes neste captulo e o manual de
instrues do fabricante. Em particular devem ser observados os seguintes pontos:
Verificar se as peas aqui relacionadas podem ser submetidas lavagem;
Procedimento de montagem e desmontagem da pipeta;
Como trocar as peas danificadas;
Verificar se qualquer um destes procedimentos altera a calibrao da pipeta.
Se alterarem, necessrio realizar a verificao da performance do instrumento (vide anexo II) e
eventual ajuste do equipamento (segundo instrues do fabricante).
5.1. Limpeza
necessrio criar uma rotina de limpeza e inspeo das peas da pipeta. Para que se possa obter
sempre os melhores resultados, necessrio que as peas da pipeta estejam em boas condies de
funcionamento. Existem duas situaes distintas que exigem procedimentos de limpeza diferentes:
a) Limpeza padro
Os aerossis formados durante a pipetagem se depositam dentro da pipeta, prejudicando seu
funcionamento normal. Este depsito pode, alm de obstruir o orifcio do porta-cone, prejudicando
o deslocamento do ar dentro da pipeta, danificar as peas internas, como por exemplo o pisto
(risc-lo, corro-lo). Nas duas situaes, a pipeta vai operar fora das especificaes.
Para evitar esta situao deve-se limpar as peas internas da pipeta (porta-cone, ejetor, pisto, selo e
oring). Seguir o procedimento recomendado pelo fabricante. Um exemplo de procedimento de
limpeza est descrito no anexo I.
A limpeza a principal ferramenta do usurio para prolongar a vida til da pipeta e garantir
resultados confiveis. No existe uma previso da frequncia de limpeza que deve ser adotada
pelo laboratrio (isto depende do tipo de material manuseado, rotina a que a pipeta
submetida, nmero de usurios para a mesma pipeta e erros admissveis para o procedimento).
Para garantir resultados confiveis, a pipeta alm de limpa freqentemente deve ser submetida
a testes de performance (anexo II).
b) Pipeta utilizada na manipulao de materiais cidos ou corrosivos
O estado do pisto interfere diretamente nas especificaes da pipeta. Uma pipeta com pisto riscado
ou corrodo no atinge os padres estabelecidos para exatido e preciso. Materiais cidos (como
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por exemplo, cido sulfrico, cido clordrico, cido ntrico, fenol) ou corrosivos (como por exemplo
hidrxido de sdio, solventes clorados) podem danificar o pisto. Pisto danificado leva a resultados
no confiveis.
Para se evitar danos ao pisto recomenda-se limpar as peas da pipeta logo aps a manipulao
deste tipo de lquido.
Ao contrrio do procedimento descrito no item a, para esta limpeza no necessrio a utilizao
de um agente qumico, basta utilizar gua destilada.
Desmonte a pipeta de acordo com as instrues do fabricante.
Jogue gua destilada sobre as seguintes peas: ejetor, porta-cone, pisto, selos do pisto.
Deixe secar temperatura ambiente ou em estufa at 40.
Monte a pipeta de acordo com instrues do fabricante.
OBSERVAES
Confirme se as peas em questo podem ser lavadas e se o procedimento afetar sua calibrao
(ou seja, se necessrio executar o procedimento de verificao da performance logo aps a
limpeza).
O procedimento descrito no item b acima particularmente indicado para pipetas com pisto
metlico. Para pistes de outros materiais (vidro, plstico, cermica) usual a presena de graxa
de silicone para vedao do pisto, desta forma se recomenda verificar e seguir os procedimentos
especficos contidos no manual.
5.2. Troca de peas
Algumas peas da pipeta tm que ser trocadas periodicamente, pois sofrem desgaste e influenciam
diretamente a performance da pipeta.
5.2.1. Selo(s) de vedao do pisto
Esta(s) pea(s) faz(em) a vedao entre o pisto e o porta-cone (na parte superior). Devido ao uso,
se formam microvilosidades na superfcie destas peas e a vedao deixa de ser perfeita, levando a
perda de preciso do instrumento. Esta(s) pea(s) deve(m) ser trocada(s) uma vez ao ano (consulte
o procedimento para troca no manual do fabricante).
5.2.2. Porta-cone
Outro ponto de vedao importante a regio de contato entre o porta-cone e a ponteira. Devido
ao uso, ocorre desgaste da superfcie do porta-cone na regio de encaixe com a ponteira e o contato
entre eles se torna deficiente, o que prejudica a medida (perda de preciso). A troca deve ser feita
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sempre que se observar desgaste da regio de encaixe com a ponteira ou danos na pea (quebra,
lasca). Consultar o manual do fabricante para verificar se o procedimento afeta ou no a calibrao
do instrumento.
5.2.3. Outras peas
Outras peas influenciam na performance da pipeta. Abaixo, descrevemos um procedimento de
verificao bastante simples que auxilia no reconhecimento de peas danificadas. Alguns
procedimentos devero ser realizados com base no manual do fabricante (por exemplo: desmontagem,
montagem). Ressaltamos mais uma vez, a importncia de se certificar se ou no necessrio recalibrar
a pipeta aps qualquer um destes procedimentos (esta informao se encontra no manual do
fabricante).
1 ETAPA: APARNCIA GERAL
Verifique se no h nenhum defeito aparente.
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2 ETAPA: TESTAR AS FUNES
Gire o volmetro totalmente, percorrendo toda a faixa volumtrica da pipeta. Verifique se o
mnimo e o mximo volumes ajustveis correspondem real faixa volumtrica da pipeta.
Problemas e causas:
* Algumas pipetas podem ser autoclavadas e outras no. Consulte o manual do fabricante.
Com o volmetro ajustado no valor mximo especificado para o modelo da pipeta, pressione o
boto por todo o curso, para verificar a facilidade do movimento, sentindo eventuais obstculos
ou variaes na frico, o que pode revelar danos como corroso no pisto ou barra de operaes
torta. Oua o barulho da mola, o que pode indicar seu posicionamento incorreto.
Problemas e causas:
Encaixe uma ponteira na pipeta e pressione o boto do ejetor de ponteiras, para verificar a
eficcia da ejeo.
3 ETAPA: TESTE DO VAZAMENTO
Para pipetas que tenham um volume mximo maior do que 200 !l acerte seu volume no valor
mximo e aspire gua para encher a ponteira da pipeta. Observe a ponteira por 20 segundos. Se
aparecer uma gota na ponta da ponteira, significa que h vazamento. Isto tambm verdadeiro para
pipetas com faixas de volume abaixo de 200!L, mas para esta faixa de volume se deve adotar o
seguinte procedimento: aps observar 20 segundos se h ou no formao de gota, mergulhe a
ponta da ponteira no recipiente com gua. O nvel de gua dentro da ponteira no deve ser alterado.
Caso ele diminua, significa que h vazamentos.
A causa do vazamento pode ser:
Selos do pisto danificados;
Pisto riscado ou corrodo;
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Volume II / Mdulo 1 - Micropipetas: Fundamentos e Operao
Danos qumicos ou mecnicos no porta-cone, na regio onde se encaixa a ponteira;
Uso de ponteiras no recomendadas pelo fabricante (ver captulo 4).
4 ETAPA: DESMONTAGEM
Este processo deve ser adotado caso tenha ocorrido vazamento na etapa 3. Ao desmontar a pipeta
pode-se avaliar as peas internas e chegar a uma concluso sobre a causa do problema (pisto
danificado, selos de vedao ausentes ou comprometidos, etc.) e definir quais peas devem ser
trocadas. Abaixo, segue um exemplo de roteiro de desmontagem adotado para determinados modelos
de pipetas. No deixe de seguir as instrues do fabricante para desmontar a pipeta.
Puxe para baixo e retire o ejetor de ponteiras (em alguns modelos o ejetor no destacvel);
Retire a porca de conexo;
Remova o pisto cuidadosamente;
Verifique a superfcie do pisto (se est corroda e/ou riscada) e os selos de vedao.
5 ETAPA: MONTAGEM
Monte a pipeta segundo instrues do fabricante.
OBSERVAO
Recomendamos que as etapas de 1 a 3 sejam feitas diariamente antes do incio dos trabalhos e
registrados para controle do laboratrio. Se forem constatadas anormalidades, se deve realizar as
etapas 4 e 5.
Algumas peas podem ser trocadas pelo prprio usurio, sem comprometer a calibrao do
instrumento. Outras, aps troca, exigem a verificao da calibrao do instrumento e eventualmente
ajust-lo. Esta informao consta no manual de instrues da pipeta.
5.3. Verificao da performance
Para garantir medidas confiveis, alm dos procedimentos de limpeza e trocas de peas, o usurio
necessita verificar a performance da pipeta. Esta verificao analisa tanto a exatido (erro sistemtico)
como a preciso (erro aleatrio).
A verificao da performance, na realidade, avalia o conjunto pipeta + ponteira + operador (tcnica
de pipetagem). Para obtermos resultados confiveis no teste, o operador deve ser treinado e qualificado
(tcnica de pipetagem descrita no captulo 3) e as ponteiras devem ser as recomendadas pelo fabricante
da pipeta.
O usurio deve estabelecer uma freqncia de teste para suas pipetas, com base em: necessidades
em termos de exatido e preciso, frequncia de uso, nmero de usurios para uma mesma pipeta,
nmero de ciclos em cada utilizao da pipeta e a natureza dos lquidos pipetados. No anexo II
descrevemos o mtodo gravimtrico para avaliao da performance das pipetas (referncia: norma
ISO/ FDIS 8655- Piston-operated volumetric apparatus - Part 6 - Gravimetric test methods).
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6. SUGESTES DE PROCEDIMENTOS
Pipetas operadas por pisto so equipamentos para aspirar e dispensar volumes especficos de
lquidos.
Para se assegurar a confiabilidade dos resultados, necessrio implantar a seguinte rotina:
Verificao da aparncia geral, teste das funes e o teste do vazamento (etapas 1, 2 e 3)
descritos no item 5.2.3. deste documento. Se forem constatadas anormalidades, realizar as
etapas 4 e 5 do mesmo procedimento.
Limpeza peridica das peas da pipeta
A peridiocidade da limpeza deve ser estabelecida de acordo com freqncia de uso, nmero de
usurios para uma mesma pipeta, nmero de ciclos em cada utilizao da pipeta e a natureza
dos lquidos pipetados. Recomendamos aos laboratrios que realizem a limpeza a cada
trs meses (se houve acmulo de sujeira nestes trs meses reduzir os intervalos entre uma
limpeza e outra). muito importante que o laboratrio mantenha registros das limpezas
realizadas o qual deve conter o nmero de srie da pipeta, data da limpeza e o procedimento
utilizado.
Troca de peas
Os selos do pisto devem ser trocados anualmente (se o nmero de pipetagens ultrapassarem
100.000, os selos devem ser trocados em um perodo de tempo menor que deve ser estimado
a partir da rotina do laboratrio). O porta-cone deve ser trocado a cada 2 anos ou quando
a regio de encaixe com a ponteira estiver desgastada. Estas trocas devem ser registradas (o
registro deve conter o nmero de srie da pipeta, a data da troca e os dados sobre a nova
pea - lote ou nmero da nota fiscal de compra). Peas que afetem a performance da pipeta
(por exemplo: pisto, volmetro, haste) quando necessitarem de troca ou reparo, devem ser
enviadas para assistncia tcnica especializada e este reparo deve ser devidamente registrado,
alm do registro da nova calibrao da pipeta.
Verificar periodicamente a performance da pipeta (exatido e preciso), conforme descrito
no anexo II. Esta verificao deve ser feita a cada 3 meses e ser devidamente registrada
(exemplo de registro no anexo II item 8.6.5. deste documento). Os erros mximos encontrados
podem ser at 2 vezes maior do que os erros estabelecidos nas tabelas 1 e 2 deste documento
(anexo II, item 8.6.4.). quando houver troca de peas que afetem a calibrao da pipeta, o
procedimento de verificao deve ser executado (veja item acima troca de peas).
Teste do operador
Como a tcnica de operao fundamental na obteno de bons resultados, necessrio
testar e registrar a tcnica de pipetagem do operador. Para isso, com um equipamento que
esteja operando dentro das especificaes do fabricante, realize 10 medidas no volume mximo
e mnimo especificado para aquele modelo de pipeta. Faa a anlise da exatido e preciso
das medidas obtidas. Os erros mximos encontrados devem ser at 2 vezes os valores
especificados nas tabelas 1 e 2 deste documento (anexo II, item 8.6.4.). Registre os dados em
um relatrio (exemplo no anexo II item 8.6.5.) identificando o operador que foi testado.
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7. ANEXO I: EXEMPLO DE PROCEDIMENTO DE LIMPEZA
O exemplo a seguir pode ser utilizado por vrios modelos de pipetas, em particular aquelas com o
pisto metlico sem graxa; j para outros modelos ser necessrio adapt-lo. Siga as instrues do
fabricante contidas no manual do usurio. No deixe de confirmar se as etapas descritas aqui no
comprometem a calibrao da pipeta.
Ateno! No misture as peas de uma pipeta com as peas de outra pipeta
7.1. Desmontagem
necessrio que se desmonte a pipeta para fazer a limpeza (deve-se utilizar luvas quando houver
risco de contaminao). Segue um esquema geral das peas das pipetas:
RELAO DAS PEAS
Figuras 1 e 2
P.S. este esquema pode sofrer variaes de acordo com o modelo e marca da pipeta. Para maiores detalhes consulte o
manual do fabricante.
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Retire o ejetor de ponteiras (D) puxando-o;
Desconecte a porca de conexo (F) separando assim o corpo da pipeta (B) do porta-cone (C);
Remova o conjunto do pisto cuidadosamente e separe os selos do pisto (G e H), mantendo o
porta-cone com a parte mais fina para baixo.
Freqentemente os selos do pisto ficam presos dentro do porta-cone. Para retir-los deve-se recolocar
o pisto, pression-lo contra o porta-cone, como se fosse fazer uma pipetagem. Retire o pisto que
dever trazer preso a ele, os selos.
7.2.Limpeza
Coloque o porta-cone, o conjunto do pisto, ejetor de ponteiras, os selos (no colocar o handle)
em um bquer, completando seu volume com soluo de detergente neutro de 4% a 8% em
gua morna ( 50C);
Coloque o bquer no banho de ultra-som e deixe aproximadamente 15 minutos (caso no tenha
ultra-som, deixar na soluo por 40 minutos);
Descarte a soluo de detergente utilizada;
Lave cada pea com gua corrente;
Coloque as peas em um recipiente limpo e faa a ltima lavagem com gua destilada;
Seque na estufa a aproximadamente 50C (no ultrapasse esta temperatura), durante no mximo
2 horas, ou deixe secar a temperatura ambiente.
OBSERVAES
Use soluo de detergente neutro com concentrao de 4% para limpeza de pipetas que
apresentam pouca sujeira e concentrao de 8% para limpeza de pipetas que apresentarem
muita sujeira.
Para as pipetas que aps a lavagem continuarem apresentando algum tipo de sujeira, limpe com
algodo umedecido com lcool isoproplico, tomando cuidado para no danificar o pisto.
Sempre aps o uso da pipeta com solues cidas e/ou corrosivas, lavar todas as peas com
gua destilada ou etanol.
7.3. Montagem
Coloque o selo e oring no pisto, encaixando em primeiro lugar o selo;
Com uma das mos, segure o corpo da pipeta na posio vertical e coloque o pisto;
Encaixe o porta-cone no corpo da pipeta;
Em seguida coloque e atarraxe a porca da conexo;
Coloque o ejetor de ponteiras;
A pipeta est pronta para uso.
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8. ANEXO II: VERIFICAO PADRO DA PERFORMANCE
8.1. Consideraes gerais
Este anexo descreve o procedimento para verificao da performance das pipetas utilizando-se o
mtodo gravimtrico (segundo norma ISO/ FDIS 8655 - Piston-operated volumetric apparatus -
Part 6: Gravimetric tests). A utilizao dos procedimentos descritos neste mtodo garante
conformidade com as especificaes internacionais para exatido e preciso.
O teste de conformidade para verificao da exatido e preciso aplicvel a qualquer pipeta
(definies no captulo 1). Este teste, que est de acordo com padres internacionais, analisa o
sistema de pipetagem como um todo: pipeta, ponteira e operador.
O mtodo descrito neste documento inclui um procedimento para correo das perdas por
evaporao para pequenos volumes (abaixo de 50 !L). Tambm, na converso para volume das
massas obtidas na balana, so feitas correes referentes temperatura e presso no momento da
execuo do teste.
O usurio deve estabelecer uma rotina para testar suas pipetas com base em: necessidades em
termos de exatido e preciso, frequncia de uso, nmero de usurios para uma mesma pipeta,
nmero de ciclos em cada utilizao da pipeta e a natureza dos lquidos pipetados. No existe um
intervalo padronizado entre uma checagem e outra. Cabe ao usurio definir este intervalo.
A norma ISO/ FDIS 8655 define que a periodicidade mnima de uma vez por ano.
A pipeta deve ser desmontada e montada (de acordo com instrues no manual do fabricante) pelo
menos uma vez antes de se realizar o teste de verificao. A pipeta deve ser operada de acordo com
o manual do fabricante.
8.2. Condies ambientais da sala de teste
A sala de teste (laboratrio) deve ser limpa e ter controle de temperatura e umidade para que as
condies ambientais do local onde ser feita a verificao e a temperatura dos equipamentos utilizados
sejam estveis e homogneas antes e durante todo o procedimento.
A pipeta e a gua utilizada no teste gravimtrico devem estabilizar na temperatura da sala de verificao
pelo menos 2 horas antes do incio do procedimento. Idealmente, a verificao deve ser feita nas
seguintes condies:
1) Temperatura estvel (gua, pipeta e ambiente) entre 15 e 30C;
2) Umidade Relativa acima de 50%.
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8.3. Operador
8.3.1. Operao da pipeta
Um procedimento adequado de pipetagem contribui significantemente para a reprodutibilidade
dos resultados no teste de verificao. Operadores sem experincia podem ter variaes importantes
nos resultados. Para resultados confiveis, o operador deve ser bem treinado e qualificado. Os aspectos
da tcnica de pipetagem foram discutidos no captulo 3.
8.3.2. Treinamento
O teste de conformidade deve ser feito por um operador qualificado. Se necessrio, contate uma
empresa especializada para solicitar treinamento ao operador.
8.4. Ponteiras
A pipeta que ser testada deve ser operada segundo as instrues fornecidas pelo manual de operao.
Novamente, com base no manual de operao que acompanha a pipeta que ser testada, tenha
certeza, antes de comear o teste, que ela est limpa, montada corretamente e de estar utilizando as
ponteiras recomendadas pelo fabricante.
Consulte o captulo 4 para maiores detalhes.
8.5. Equipamentos utilizados no teste
Para garantir a integridade do procedimento de verificao, todos os equipamentos utilizados durante
o procedimento devem ser verificados regularmente.
8.5.1. Balana
As balanas devem ser calibradas e certificadas por pessoal qualificado usando pesos rastreveis a
autoridades reconhecidas nacionalmente (Empresas/ Instituies credenciadas pelo INMETRO e
pertencentes Rede Brasileira de Calibrao - RBC).
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Em termos prticos, o volume nominal (maior volume selecionvel pelo usurio) pode ser utilizado para a escolha da balana
A legibilidade da balana deve ser escolhida de acordo com o volume selecionado na pipeta que est
sendo testada.
8.5.2. Outros equipamentos
Termmetro: incerteza de medio mxima de 0,2C
Higrmetro: incerteza de medio mxima de 10%
Barmetro: incerteza de medio mxima de 0,5 kPa
8.5.3. Recipientes
Recipientes que sero utilizados durante o procedimento:
Recipiente de origem
o recipiente que contm a gua que ser utilizada para a realizao das medidas (o volume
deste recipiente deve ser suficiente para a execuo de TODAS as medidas).
Recipiente para pesagem
o recipiente que ser utilizado para a realizao da medida ( o que ser colocado no prato de
pesagem da balana).
Recipiente de descarte
um terceiro recipiente que recolher as alquotas que no sero pesadas.
Recomenda-se que, especialmente para o teste do menor volume da pipeta, a proporo mdia
entre o dimetro e a altura do recipiente para pesagem seja 3:1 ou que o recipiente tenha tampa.
Algumas empresas fornecem kits de recipientes adequados realizao do teste gravimtrico.
8.5.4. gua
No teste, utiliza-se gua destilada ou deionizada, nos dois casos deve ser degaseificada (gua grau 3
conforme a Norma ISO 3696) temperatura da sala onde ser feita a verificao. Para evitar flutuaes
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na temperatura da gua, use um recipiente de origem que seja suficientemente grande, pois este
deve conter gua suficiente para a realizao de todas as medidas.
8.6. O procedimento de verificao
A verificao da performance analisa tanto a exatido (erro sistemtico) como a preciso (erro
aleatrio). Condies, procedimentos e qualificaes previamente descritas neste documento devem
ser implantados para garantir a validade dos resultados dos testes.
Aps rinsar a ponteira, faa 10 pesagens* individuais para cada volume selecionado. Para as pipetas
de volume varivel, trs volumes diferentes devem ser selecionados de acordo com a faixa de volume
do modelo que est sendo avaliado. Estes volumes devem ser o volume nominal (mximo), 50% do
volume nominal (volume intermedirio) e o volume mnimo da faixa de volume do modelo (estes
volumes esto definidos no manual da pipeta). Para as pipetas de volume fixo utiliza-se apenas o
volume nominal.
1. Ajuste na pipeta o volume do teste (este deve ser mantido durante todo o procedimento).
2. Estime a taxa de evaporao (para volumes pequenos, menores do que 50!L). Vide a seguir o
procedimento.
3. Faa o teste de verificao: registre as massas no Relatrio de Verificao de Performance.
4. Faa os clculos: registre os resultados no Relatrio de Verificao de Performance.
5. Compare os resultados com as especificaes de exatido e preciso que esto relacionadas nas
tabelas 1 e 2 (item 8.6.4).
Estas etapas sero detalhadas adiante.
8.6.1. Estimando a taxa de evaporao (massa mdia evaporada por ciclo de pesagem)
Para volumes abaixo de 50!L necessrio o uso de um recipiente com tampa. O objetivo minimizar,
controlar e quantificar a perda por evaporao durante o ciclo de pesagem. O uso de pinas para a
manipulao deste recipiente tambm aconselhvel.
A evaporao pode ser estimada, realizando-se uma srie de quatro simulaes de pesagens, na qual
se repete o ciclo de pesagem sem que haja dispensa de gua no recipiente para pesagem. A diferena
total atribuda evaporao calculada e dividida por 4, para se obter uma mdia. A faixa expressa
em mg/ciclo (ou se for um nico ciclo, deve ser expresso em mg). Evite manipular excessivamente
o recipiente. O uso de pinas para manipular o recipiente para pesagem aconselhvel.
As taxas de evaporao geralmente esto entre 0,010 mg e 0,025 mg por ciclo de pesagem. Recalcule
a taxa de evaporao sempre que as condies ambientais forem alteradas (temperatura, presso e
umidade).
* O usurio pode selecionar o nmero de medidas de acordo com as especificaes de exatido e preciso aceitas
pela sua metodologia.
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Volume II / Mdulo 1 - Micropipetas: Fundamentos e Operao
1. Adicione gua ao recipiente para pesagem at que este esteja com 1/3 do seu volume cheio.
2. Coloque o recipiente tampado no prato da balana.
3. Com a pipeta, aspire a alquota do recipiente de origem.
4. Tare a balana e remova o recipiente para pesagem do prato da balana (o uso de pinas para
remov-lo aconselhvel).
5. Dispense a alquota no recipiente de descarte ou retorne-a para o recipiente de origem. No a
dispense no recipiente para pesagem.
6. Registre o resultado e
1
.
7. Repita as etapas de 3 a 8, trs vezes para obter e
2
, e
3
e e
4
.
8. Calcule a perda/ ciclo: e = (e
1
+ e
2
+ e
3
+ e
4
)/4 (mg).
9. A evaporao por ciclo e (mg) deve ser adicionada ao peso mdio antes do clculo do volume
mdio.
Um exemplo de clculo da taxa de evaporao dado ao final deste captulo
8.6.2. Teste gravimtrico
As tcnicas de aspirao e dispensa esto descritas no captulo 3. Embora vrios mtodos alternativos
de pipetagem sejam possveis, sempre utilize o modo normal (modo direto, no utilizar o modo
reverso). Para todas as pipetas, evite segurar ou esquentar o porta-cone com a mo durante o teste.
Para pipetas multi-canal, encaixe as ponteiras em todos os canais, mas teste um canal por vez. E
registre os resultados para cada canal.
1. Preparao
1.1. Coloque gua do recipiente de origem no recipiente para pesagem a uma profundidade de, no
mnimo, 3 mm.
1.2. Mea e registre a temperatura da gua do recipiente de origem (t
1
), a presso do ar e a umidade
relativa da sala. Se o recipiente para pesagem possui tampa, coloque-a.
1.3. Encaixe uma nova ponteira.
1.4. Selecione e ajuste o volume que ser testado (este no dever ser alterado durante o teste).
1.5. Pr-rinse a ponteira, aspirando a alquota do recipiente de origem e dispensando no recipiente
de descarte 5 vezes, para equilibrar a umidade do ar dentro da atmosfera da pipeta.
1.6. Coloque o recipiente para pesagem com gua no prato da balana e tare-a (m
0
= 0).
2. Ciclo do teste
Cada ciclo do teste deve demorar menos de 1 minuto. Entretanto, um ritmo constante durante a
operao de pesagem deve ser mantido (o ritmo do ciclo e entre os ciclos).
2.1. Encaixe uma nova ponteira na pipeta.
2.2. Pr-rinse a ponteira aspirando e dispensando no recipiente de descarte uma vez.
2.3. Aspire, como especificado no captulo 3, o volume a ser testado.
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Calcule a temperatura mdia (t) da gua destilada (a
variao mxima entre t
1
e t
2
: 0,2C)
t = (t
1
+ t
2
)/ 2
2. Clculo da presso mdia
Use a presso baromtrica mdia (B) e a temperatura
mdia (t) para determinar o Fator-Z correspondente na
tabela.
B = (B
1
+ B
2
)/ 2
3. Clculo do volume a partir da massa
Multiplique as massas (mg), depois das correes das
perdas por evaporao (para volumes abaixo de 50 !L)
pelo fator Z para obter os volumes (!L).
V
i
= Z (m
i
+ e)
V
i
= volumes individuais (!L)
m
i
= massas individuais (mg)
e = taxa de evaporao (mg)
Z= fator Z (!L/ mg)
4. Clculo do volume mdio
Aps calcular o volume individual das pesagens, calcule
o volume mdio (resultado expresso em !L).
V
i
= Volumes individuais
V = volume mdio
n= nmero de pesagens
2.4. Se o recipiente para pesagem possuir tampa, remova-a.
2.5. Dispense o volume testado no recipiente para pesagem e recoloque a tampa com o auxlio da
pina.
2.6. Registre a massa m
1
do volume testado.
2.7. Tare a balana.
3. Repita o teste descrito acima (do item 2.1 ao 2.7) at completar 10 medidas (m
1
a m
10
).
4. Aps a ltima medida, verifique e registre a temperatura da gua do recipiente de origem
(t
2
), a presso atmosfrica e a umidade relativa da sala.
8.6.3. Clculos
1. Clculo da temperatura mdia
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5. Exatido (erro sistemtico)
Diferena entre o volume mdio do teste e o volume
ajustado na pipeta. Para pipetas de volume fixo, substitua
V
s
por V
o
= volume nominal. A exatido pode ser
expressa em mL ou...
...como porcentagem:
e
s
= V - V
s
e
s
= erro mdio
V = volume mdio
V
s
= volume ajustado
e
s
= 100% (V - V
s
)/V
s
6. Preciso (erro aleatrio)
Disperso dos volumes dispensados ao redor da mdia
dos volumes dispensados. Tambm conhecida (de acordo
com o contexto) como desvio padro, reprodutibilidade
ou repetibilidade.
Vi = volumes individuais
V = volume mdio (calculado como
no item anterior)
n = nmero de medidas
DP = desvio padro
Como porcentagem, tambm conhecido como
coeficiente de variao (CV).
CV = (DP/ V)x 100%
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Clculos: fator Z
Z = fator de converso (mL/ mg), t (C) = mdia da temperatura* , B = presso atmosfrica (hPa)
* esta mdia obtida a partir do valor da temperatura da gua do recipiente de origem medida no
incio do teste (t
1
) e da temperatura da gua do recipiente de origem medida ao final do teste (t
2
).
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8.6.4. Especificaes
TABELA 1
Esta tabela de especificaes se aplica s pipetas de deslocamento de ar de volume fixo e para
pipetas de deslocamento positivo que utilizem capilares e pistes reutilizveis.
Esta tabela tambm pode ser utilizada para as pipetas de deslocamento de ar de volume varivel.
O volume nominal nestas pipetas o maior volume selecionvel pelo usurio e especificado
pelo fabricante. Por exemplo: uma pipeta com a faixa de volume especificada de 10 !L a 100 !L,
o volume nominal 100 !L. Os erros mximos aceitveis para o volume nominal se aplicam a
todos os volumes da faixa especificada: se considerarmos uma pipeta com uma faixa de volume
de 10 !L a 100 !L, o erro sistemtico mximo aceitvel para qualquer volume selecionado de
0,8 !L e o erro aleatrio mximo aceitvel para qualquer volume selecionado de 0,3 !L.
Para volumes intermedirios aos relacionadas na tabela, o valor absoluto dos erros mximos aceitveis do volume
imediatamente maior se aplicam. Por exemplo: para determinar os erros mximos aceitveis para 25 !L, usa-se os
valores especificados para 50 !L.
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TABELA 2
Esta tabela de especificaes se aplica s pipetas de deslocamento positivo que utilizem capilares e
pistes reutilizveis e/ ou com volume fixo.
Para volumes intermedirios aos relacionadas na tabela, o valor absoluto dos erros mximos aceitveis do volume
imediatamente maior se aplicam.
OBSERVAES
O usurio pode definir os erros mximos aceitveis (sistemtico e randmico) com base na sua
metodologia.
O usurio deve testar seu equipamento regularmente, como por exemplo, a cada trs meses.
Outros intervalos de tempo entre os testes podem ser estabelecidos (desde que no ultrapasse
um ano) com base nos seguintes aspectos: freqncia de uso, nmero de usurios da pipeta,
natureza agressiva do material transferido, os erro mximos aceitos pelo usurio.
Quando o teste for feito aps manuteno ou reparo do equipamento, os erros mximos aceitveis
(sistemtico e aleatrio) devem obedecer s tabelas relacionadas neste documento (tabela 1 e 2).
8.6.5. Relatrio do procedimento de verificao
Aps o teste, necessrio que as informaes sejam registradas. Anexamos um modelo de relatrio,
mas o usurio pode elaborar o seu prprio modelo, desde que este contenha as seguintes informaes:
Identificao da pipeta;
Data;
Condies do teste (temperatura, presso, umidade relativa);
As medidas obtidas para cada volume testado;
Os resultados dos clculos;
Resultado da comparao com a tabela de especificao.
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Volume II / Mdulo 1 - Micropipetas: Fundamentos e Operao
Identificao da pipeta
Modelo Nmero de srie Ponteiras utilizadas no teste
Identificao do tcnico
Empresa Nome Tel/Email
Tcnico Nome Tel/Email
Condies
Data/ Hora do teste Localizao
Temperatura (C) Umidade (%) Presso (hPa)
Balana
Modelo Nmero de srie Sensitividade
Resultados do teste
MODELO:
COMPARADO COM AS ESPECIFICAES: APROVADA "
REPROVADA "
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8.6.6. Exemplo numrico de verificao da performance
Vamos colocar um exemplo com os clculos que devem ser feitos na verificao da performance.
Tomaremos como base a verificao hipottica de 10 !L em um pipeta de deslocamento de ar de
volume varivel.
1. Como o volume testado menor do que 50 !L, a taxa de evaporao deve ser determinada
(item 8.6.1.).
Nmero de medidas: 04 (e
1
, e
2
, e
3
e
4
)
Taxa de evaporao mdia: e
e
1
= 0.016 e
3
= 0.021
e
2
= 0.018 e
4
= 0.017
e = (e
1
+ e
2
+ e
3
+ e
4
)/4 (mg)
e = (0.016 + 0.018 + 0.021 + 0.017)/4
e = 0.018 mg/ por ciclo
2. Registra-se a temperatura e a presso inicial do teste:
Ti = 21.5C
Pi = 1013
3. Realiza-se 10 medidas (item 8.6.2.) e os valores so registrados.
W1 = 9,84
W2 = 9,90
W3 = 9,91
W4 = 9,86
W5 = 9,87
W6 = 9,90
W7 = 9,92
W8 = 9,93
W9 = 9,95
W10 = 9,92
4. Registra-se a temperatura e a presso final do teste:
Tf = 21,5C
Pf = 1013
5. Clculo da presso e temperatura mdia:
T = (Ti + Tf) / 2
T = (21,5 + 21,5)/ 2
T = 21,5C
P = (Pi + Pf) /2
P = (1013 + 1013) / 2
P = 1013
Estes valores de temperatura e presso mdios sero utilizados na determinao do fator de converso
Z.
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6. Converso da massa para volume:
Vi = (Wi + e) x Z
Para uma temperatura de 21.5C e uma presso atmosfrica de 1013 hPa o fator Z igual a 1.0032
!L/ mg.
7. Clculo do volume mdio
V = (9,89 + 9,95 + 9,96 + 9,91 + 9,92 + 9,95 + 9,97 + 9,98 + 10,00 + 9,97)/10
V = 9,95 !L
8. Anlise da exatido
Erro sistemtico - E
E= V - Vo
Vo o valor ajustado na pipeta (volume nominal). Neste exemplo equivale a 10!L.
E = 9,95 - 10
E = - 0,05 !L
Erro relativo - E%
E% = (V - Vo) x 100/ Vo
E% = (-0.05*100)/ 10
E% = - 0,50 %
9. Anlise da preciso (repetibilidade - erro aleatrio)
Desvio padro - DP
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DP
2
v
=1/9 x [(9,89 - 9,95)
2
+ (9,95- 9,95)
2
+ (9,96 - 9,95)
2
+ (9,91 - 9,95)
2
+ (9,92 - 9,95)
2
+ (9,95 - 9,95)
2
+ (9,97 - 9,95)
2
+ (9,98 - 9,95)
2
+ (10,00 - 9,95)
2
+ (9,97 - 9,95)
2
+]
DP
v
= 0,03 !L
Coeficiente de variao CV
CV = (DP/ V)x 100%
CV= (0,03/9,95) x 100%
CV = 0,34 %
10. Colocamos os resultados no relatrio (item 8.6.5.)
Na tabela 1 (item 8.6.4.) temos as seguintes especificaes para 10 !L (tabela 1):
s comparar os resultados obtidos (relatrio) com o especificado na tabela. Neste caso, a pipeta
testada est aprovada.
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9. ANEXO III: PROCEDIMENTOS DE DESCONTAMINAO
Os procedimentos descritos a seguir podem ser utilizados para alguns modelos de pipetas, em
particular aquelas com pisto metlico. Por isso necessrio consultar as instrues do fabricante
antes de aplicar qualquer um dos mtodos descritos aqui.
INTRODUO
Neste documento, esto descritas uma srie de mtodos para descontaminao da pipeta,
especialmente as de pisto metlico. Estes mtodos podem ser fsicos (autoclavagem ou irradiao
UV) ou qumicos. De acordo com o tipo de utilizao da pipeta, deve-se escolher o mtodo de
descontaminao mais eficiente.
Entretanto, considerando o espectro de ao, as vantagens e desvantagens destes mtodos, conclumos
que o mtodo mais eficiente a descontaminao qumica.
Solues qumicas comerciais, compostas tanto de detergentes como de desinfetantes, garantem
uma descontaminao eficiente.
Como o mtodo de descontaminao qumica eficiente, rpido e fcil de realizar, o recomendamos
para os procedimentos de descontaminao de rotina.
Procedimento de descontaminao
Os tipos de contaminao podem ser: da amostra para o operador, de uma amostra para outra ou da
amostra para a pipeta. Isto pode afetar a segurana do operador, da amostra e conseqentemente o
resultado do experimento ou, finalmente, a pipeta.
Existem muitos mtodos para eliminar contaminantes, mas existem algumas dvidas em relao a
sua eficincia e sua compatibilidade com as pipetas.
Neste documento procuramos esclarecer as dvidas relacionadas ao processo de descontaminao,
considerando a variedade de aplicaes das pipetas. Assim, diferentes campos de aplicao sero
comentados (qumica, microbiologia e biologia molecular), e mtodos qumicos ou fsicos sero
discutidos. A eficincia do mtodo pode ser explicada atravs do seu mecanismo de ao. Quando
mais de um mtodo for proposto, ser feita uma comparao entre eles para auxiliar na escolha do
mais adequado. Aps a escolha do mtodo de descontaminao, consulte os protocolos no final
deste captulo.
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Campo de aplicao
9.1. Qumica
Simplesmente lavando as pipetas com gua destilada, as contaminaes por cidos, bases, tampes
ou solventes orgnicos so eliminadas.
Pode haver necessidade de remoo de outros produtos, tais como leos e graxas. Ento, necessrio
utilizar detergentes. Detergentes (surfactantes aninicos) so molculas orgnicas com uma
extremidade polar, hidroflica e outra no polar, hidrofbica. Devido a sua estrutura eles tornam
resduos insolveis (graxa, por exemplo) em solveis, sendo, portanto, agentes de limpeza eficientes.
9.1.1. Procedimento de limpeza padro (maiores detalhes consultar anexo I)
Este procedimento deve ser utilizado para eliminar os contaminantes provenientes do uso da pipeta
(por exemplo: protenas e tampes) e que no requerem tratamento especial para serem eliminados,
tais como microorganismos, radiatividade e outros, abordados adiante.
Retire o ejetor de ponteiras puxando-o;
Desconecte a porca de conexo separando assim o corpo da pipeta do porta-cone;
Remova o conjunto do pisto cuidadosamente e separe o(s) selo(s), mantendo o porta-cone
com a parte mais fina para baixo;
Coloque o porta-cone, o conjunto do pisto, o ejetor de ponteiras, o(s) selo(s) em um bquer
(no colocar o corpo da pipeta), completando seu volume com soluo de detergente de 4% a
8% em gua morna ( 50C);
Coloque o bquer no banho de ultra-som e deixe aproximadamente 15 minutos (caso no tenha
ultra-som, deixar na soluo por 40 minutos);
Descarte a soluo de detergente utilizada.
Freqentemente, o(s) selo(s) ficam presos dentro do porta-cone. Para retir-los deve-se recolocar o
pisto, pression-lo contra o porta-cone, como se fosse fazer uma pipetagem. Retire o pisto que
dever trazer preso a ele o(s) selo(s).
Coloque as peas em um recipiente limpo e faa a ltima lavagem com gua destilada;
Seque na estufa a aproximadamente 50C (no ultrapasse esta temperatura), durante no mximo
2 horas, ou deixe secar temperatura ambiente.
OBSERVAES
Use soluo de detergente com concentrao de 4% para limpeza de pipetas que apresentam
pouca sujeira e concentrao de 8% para limpeza de pipetas que apresentarem muita sujeira.
Para as pipetas que aps a lavagem continuarem apresentando algum tipo de sujeira, limpe com
algodo umedecido com lcool isoproplico, tomando cuidado para no danificar o pisto.
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Sempre aps o uso da pipeta com solues cidas e/ou corrosivas, lavar todas as peas com
gua destilada ou etanol.
Monte a pipeta.
9.2. Microbiologia e cultura celular
Nestes campos, necessria a eliminao de uma srie de microorganismos (por exemplo: vrus,
bactrias e/ou fungos, assim como leveduras).
Vrias tcnicas, com diferentes espectros e mecanismos de ao, podem ser utilizadas.
9.2.1. Autoclavagem
A caracterstica do ciclo de esterilizao depende da quantidade inicial de microorganismos (a chamada
carga microbial). Geralmente, aceita-se que a chance de um organismo vivel estar presente em um
item autoclavado menor do que 1 em 1 milho (Nvel de Garantia de Esterilidade de 10
-6
).
9.2.2. Irradiao UV
O comprimento de onda UV est entre 100 nm e 400 nm. Existem 3 tipos de radiao UV, de
acordo com o comprimento de onda: UVC (200 nm a 290 nm), UVB (290 nm a 320 nm) e UVA
(320 nm a 400nm).
9.2.3. Agentes qumicos
A escolha da soluo qumica deve ser feita considerando-se o tipo de microorganismo que se quer
eliminar.
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Na tabela a seguir, esto relacionados os principais microorganismos e alguns agentes qumicos
comuns. No caso de manipulao de cepas especiais, deve-se considerar produtos comerciais
especficos para destru-los, e ter certeza da compatibilidade qumica da pipeta com o respectivo
produto qumico (veja 3.3).
Nvel de atividade: +++: forte, ++: mdio, +: fraco, -: sem atividade.
Os mecanismos de ao destes agentes qumicos esto descritos na tabela a seguir:
9.3. Biologia molecular
Os bioqumicos e biologistas moleculares esto familiarizados com as fontes de contaminao como
proteases, cido nuclico contaminantes (DNA, RNA), nucleases (RNases, DNases) e radioatividade.
9.3.1. Proteases
Proteases so enzimas que degradam protenas. Vrios mtodos de descontaminao e seus
mecanismos de ao esto detalhados na tabela a seguir:
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9.3.2. cidos nuclicos (DNA e RNA)
A especificidade e a sensibilidade das tcnicas de PCR e RT-PCR possuem uma desvantagem: fcil
contaminao dos reagentes e das amostras, causando erros sistemticos
7
.
Outro mtodo:
Glicina/ Tampo HCl (pH=2). A ao desta soluo no documentada (veja protocolo mais
adiante)
Nota: todos estes mtodos degradam os cidos nuclicos a molculas de pesos moleculares menores,
que no so normalmente amplificadas; entretanto, estes mtodos no limpam.
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9.3.3. Nucleases
Nucleases so enzimas que degradam cidos nuclicos. Possuem uma larga distribuio, sendo
encontradas em clulas procariticas e eucariticas, vegetais e animais (na pele, na gua). As DNases
no so muito resistentes, no sendo muito crticas para a maioria das aplicaes em biologia molecular,
enquanto que as RNases so mais durveis e resistentes ao calor.
As DNases requerem ons metlicos para sua atividade e podem ser inativadas facilmente com
alguns tampes apropriados (com agentes quelantes como EDTA). As RNases no precisam de
ons metlicos, pois utilizam o grupo 2-hidroxil como reativo, no sendo, portanto, fceis de inativar.
9.3.4. Comentrios sobre os cidos nuclicos e nucleases
Todos os mtodos mencionados degradam parcialmente os cidos nuclicos e as nucleases, mas
nenhum se mostrou 100% eficiente.
A melhor maneira de evitar contaminao em biologia molecular ter alguns cuidados:
Separe reas e conjuntos de pipetas para a preparao da amostra e para conduo dos ensaios.
Use ponteiras com filtro para evitar a contaminao por aerossis.
Ou, ainda melhor, utilize pipetas de deslocamento positivo com capilares e pistes descartveis
(proteo total contra contaminao cruzada). Para protocolos crticos de PCR, a utilizao das
pipetas de deslocamento positivo requerida quando no pode haver contaminao.
9.3.5. Radioatividade
Para contaminao radioativa fraca, detergentes especficos contendo agentes complexantes podem
ser utilizados.
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Comparao dos mtodos
Os mtodos so comparados considerando primeiramente a sua eficincia em relao ao
contaminante, e depois as vantagens e desvantagens.
9.4. Espectro de ao dos mtodos
Considere duas abordagens:
1. Eu tenho os materiais necessrios para realizar este mtodo no meu laboratrio. O quanto ele
efetivo (leia a tabela verticalmente)?
2. Eu preciso eliminar este contaminante. O que posso fazer (leia a tabela horizontalmente)?
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Nvel de atividade: +++: forte, ++: mdio, +: fraco, -: sem atividade, SI: sem informao.
*: detergentes especficos (com agentes complexantes).
Para irradiao UV: +: alguma atividade, -: nenhuma atividade.
O limite de atividade da irradiao UV difcil de avaliar, j que sua ao no depende apenas do
comprimento de onda (entre 100 nm e 400 nm), mas tambm de outros fatores, como: tempo de
exposio, distncia da lmpada, densidade de emisso, ngulo de exposio e temperatura
atmosfrica.
9.5. Vantagens e desvantagens
Consulte a tabela a seguir. O mtodo deve preencher os seguintes requisitos:
Compatibilidade com os materiais de fabricao da pipeta.
Ao rpida.
Fcil e seguro de realizar.
* Aqueles feitos de PVDF. Porta-cone resistente radiao UV (feitos de PBT) esto disponveis
para P200 e P1000.
Assim sendo, os procedimentos qumicos podem ser considerados como os mais aplicveis para a
descontaminao das pipetas.
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Protocolos
De acordo com o mtodo utilizado, diferentes partes da pipeta podem ser descontaminadas.
Nota: Use luvas descartveis durante todo o procedimento de descontaminao.
9.6. Autoclavagem
Remova o ejetor de ponteiras e desrosqueie a porca de conexo. Limpe o porta-cone, a porca de
conexo e o ejetor de ponteiras com um detergente e depois autoclave por 20 min a 121C, 0,1
Mpa. Deixe as peas secarem ou coloque-as na estufa a 50 - 60C por aproximadamente 30min.
Nota: No autoclave estas peas a 134C, pois isto ir danificar as peas.
No autoclave nenhuma outra pea, alm das relacionadas acima.
9.7. Irradiao UV
Lmpadas UV podem ser instaladas no alto da bancada ou em uma capela de biossegurana, onde
as manipulaes podem ser realizadas. A combinao de bulbos de 254 nm e 300 nm durante 20
min pode destruir DNA dupla fita (seqncias longas so mais fceis de inativar)
7
.
9.8. Solues qumicas
Antes de utilizar uma soluo qumica, tenha certeza da compatibilidade com materiais utilizados na
fabricao das pipetas. O fabricante deve fornecer uma lista dos materiais utilizados na fabricao
da pipeta. Abaixo alguns exemplos:
PVDF, PBT, PC, PE, POM, borracha nitrlica, ao inoxidvel, ABS, PEI e PMP. Veja o Glossrio
e Abreviaes.
Nota: no aconselhvel embeber o selo e o oring.
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9.8.1. Descontaminao do porta-cone, ejetor de ponteiras e porca de conexo
Seguem dois exemplos de solues qumicas e seus protocolos.
Hipoclorito de sdio
O Hipoclorito de sdio possui uma larga atividade antimicrobiana, ao antibactericida rpida e
tambm denatura proteases, DNA e RNA. Alm disso, um agente qumico fcil de utilizar, no
txico nas concentraes utilizadas e possui baixo custo.
muito importante limpar a pipeta (com um detergente, como por exemplo Mucapur) antes de
realizar a desinfeco com hipoclorito de sdio, pois o mtodo pode perder sua eficincia na presena
de altas concentraes de material orgnico.
Limpeza
Remova o ejetor de ponteiras, desrosqueie a porca de conexo e remova o pisto do porta-
cone.
Dilua o detergente com gua quente a 50-60C em:
a) Um banho de ultra-som
ou em
b) Um bquer.
Coloque o porta-cone, o ejetor de ponteiras e a porca de conexo:
a) No banho de ultra-som por 15 min .
ou
b) No bquer - as peas devem ser escovadas.
Retire as peas e enxgue bem.
Antes de descartar a soluo de limpeza, adicione hipoclorito de sdio 10% soluo e deixe agir
por 10 minutos. Este procedimento para que a soluo de limpeza seja descontaminada antes de
entrar em contato com a rede de gua local.
Desinfeco
Dilua o hipoclorito de sdio em gua destilada a uma concentrao de 10% e coloque em
um bquer grande.
Coloque o porta-cone, ejetor de ponteiras e porca de conexo no bquer e deixe agir por 30
min.
Enxgue muito bem, primeiramente com gua corrente da torneira, e depois, com gua
destilada.
Deixe secar a 50C - 60C por aproximadamente 30 min.
Deixe em temperatura ambiente por 15 min antes de montar a pipeta (para que as peas
resfriem antes da montagem da pipeta).
Nota: a soluo de hipoclorito deve ser descartada aps 3 dias.
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Glicina/ Tampo HCl (pH2=2)
Prepare a soluo da seguinte maneira:
Tampo 10x: 30,6g de NaCl; 39,2g de glicina, completar com gua destilada at o volume de 523 ml.
Adicione HCl 1N em quantidade suficiente para um volume final de 1000mL.
Remova o ejetor de ponteiras, desrosqueie a porca de conexo e remova o pisto do porta-cone.
Coloque o porta-cone, a porca de conexo e o ejetor de ponteiras no tampo diludo 1x (diluio
1/10 do tampo descrito previamente) a 95C por 30 min.
Enxgue muito bem, primeiramente com gua corrente de torneira e depois com gua destilada.
Deixe secar a 50C - 60C por 30 min.
Deixe em temperatura ambiente por 15 min antes de montar a pipeta.
9.8.2. Descontaminao da parte inferior e do corpo da pipeta
Para a maioria das aplicaes, a descontaminao da parte inferior e do corpo da pipeta suficiente.
Uma mistura de agentes qumicos recomendada (detergente e desinfetante em um nico produto).
O corpo da pipeta deve ser limpo com uma soluo compatvel (veja item 3.3) apenas na sua superfcie
(no mergulhe o corpo da pipeta na soluo descontaminante). A parte inferior da pipeta, que inclui
pisto, ejetor de ponteiras, porta-cone e porca de conexo (com exceo dos selos do pisto) tambm
devem ser limpos (utilizando-se escovas pequenas para limpar a parte interna do porta-cone) ou
podem ser imersos seguindo o procedimentos seguir:
Remova o ejetor de ponteiras, desrosqueie a porca de conexo e remova o pisto do porta-cone.
Dilua o agente qumico selecionado (de acordo com as instrues do fabricante) em um bquer.
Coloque as partes inferiores (pisto, ejetor de ponteiras, porta-cone e porca de conexo)
desmontadas no bquer.
Enxgue muito bem, primeiramente com gua corrente de torneira e depois, com gua destilada.
Seque a 50 C - 60 C por 30 min.
Deixe as peas em temperatura ambiente por 15 min antes de montar a pipeta.
Concluso
O mtodo de descontaminao da pipeta selecionado de acordo com seu tipo de aplicao.
Descontaminar completamente as peas inferiores e limpar o corpo com a soluo de escolha
suficiente para a maioria das aplicaes (veja 3.3.2).
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Apndice 1
E os materiais descartveis (ponteiras, capilares e pistes e as Distritips)?
Mtodos utilizados para esterilizao dos consumveis plsticos das pipetas
No laboratrio, a autoclavagem o mtodo mais comum para a esterilizao das ponteiras. Entretanto,
este processo leva tempo: o tempo da autoclavagem em si, o ciclo de secagem e a estabilizao em
temperatura ambiente por algumas horas.
Nota: o processo de autoclavagem deve ser feito a 121C (20 min, 1 MPa). No recomendado
realizar a autoclavagem a 134 C , pois isto pode danificar os plsticos.
Dependendo do tipo de material, outros mtodos so utilizados pelo fabricante para deixar os
consumveis esterilizados: xido de etileno ou, mais frequentemente, irradiao (raios gama:
60
Co,
ou raios beta: feixe de eltrons).
Como o processo de fabricao automatizado, at, inclusive o estgio final, so normalmente
produzidas ponteiras limpas, sem nenhum contato manual.
Comentrios
O xido de etileno altamente txico e mutagnico. Portanto, seu uso tem sido muito questionado
por autoridades de sade e de controle ambiental em muitos pases.
A irradiao usada nos processos industriais para esterilizao no deixa os materiais radioativos. A
escolha da dosagem baseada em determinaes experimentais regulares.
Apndice 2
Pirognicos
A contaminao por pirognicos pode ser preocupante em alguns procedimentos farmacuticos,
nos quais aparelhos mdicos so utilizados para preparaes parenterais (mencionado em inmeros
mtodos da Pharmacopia)
4
.
Pirgenos so endotoxinas produzidas por bactrias Gram negativas, e so qumica e fisicamente
estveis. Muito pouco tem sido publicado sobre como elimin-los.
A utilizao de raios gama em altos nveis de energia (mnimo de 25 kGy) parece eliminar os riscos
da contaminao por pirognicos. Em outras palavras, para que um produto possa ser certificado
como livre de pirognicos, ele tem que ser fabricado e controlado como um equipamento mdico.
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10. ANEXO IV: DEFINIES
Exatido (erro mdio ou erro sistemtico): diferena entre o volume dispensado e o volume
nominal ou o volume selecionado na pipeta.
Calibrao: conjunto de operaes que estabelecem a relao entre o volume dispensado e o volume
nominal ou selecionado correspondente na pipeta.
Volume morto de ar: nas pipetas de deslocamento de ar, o volume de ar entre a parte inferior do
pisto e a superfcie do lquido.
Taxa de evaporao: estimativa da perda de gua causada pela evaporao durante o processo de
pesagem.
Anlise gravimtrica: procedimento geral baseado na determinao da massa das alquotas de
gua dispensadas por uma pipeta. Os valores so corrigidos com relao perda por evaporao, e
ento, a massa real e o volume so calculados, com base na densidade da gua em temperaturas
especficas com correes para a presso atmosfrica do local (fator Z).
Volume nominal: maior volume selecionvel pelo usurio e especificado pelo fabricante.
Nota: isto significa que, para uma pipeta de volume varivel com uma faixa de volume til de 10!l a 100!l, o seu
volume nominal 100!l.
Volume selecionado: volume ajustado pelo usurio, para a dispensa do volume escolhido dentro
da faixa de volume til.
Nota: para as pipetas e volume fixo, o volume selecionado igual ao volume nominal.
Preciso (erro aleatrio): disperso dos volumes dispensados ao redor da mdia dos volumes
dispensados. Tambm conhecida (de acordo com o contexto) como desvio padro, reprodutibilidade
ou repetibilidade.
Repetibilidade: a disperso entre os resultados de medidas sucessivas (realizadas em um curto espao
de tempo), onde no h alterao dos parmetros nem das condies.
Reprodutibilidade: a disperso entre os resultados de medidas realizadas em condies diferentes
(local ou operador diferente), mantendo todos os parmetros constantes.
Especificaes volumtricas (erros mximos admissveis): so os extremos permitidos (superior
e inferior) para o desvio entre o volume dispensado e o volume nominal ou o volume selecionado.
Faixa de volume til: parte do volume nominal que pode ser dispensado, dentro do erro mximo
especificado na Norma Internacional ISO/ DIS 8655. O valor superior da faixa de volume til
sempre o volume nominal. O valor inferior 10% do volume nominal, se no estiver especificado
de forma diferente pelo fabricante.
Recalibrao (ajuste feito pelo operador): um procedimento definido pelo fabricante e que
pode ser executado pelo usurio final, para garantir que a pipeta opere conforme as especificaes
publicadas.
Pesagem: pesar significa determinar a massa de uma alquota.
Fator Z: fator de converso (!L/mg) considerando-se a densidade da gua em contato com o ar,
em funo da temperatura e da presso.
Ex: Designao (abreviatura) de um instrumento projetado para dispensar volumes.
In: Designao (abreviatura) de um instrumento projetado para aspirar volumes.
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11. GLOSSRIO E ABREVIAES
Glossrio
Detergente: molculas orgnicas que tornam solveis resduos insolveis (leos e gorduras). So agentes
de limpeza eficientes (a maioria no elimina microorganismos).
Descontaminao: desinfeco de artigos infectados permitindo sua manipulao/ uso (reduo dos
microorganismos para um nvel aceitvel).
Nota: a descontaminao qumica implica em um processo prvio de limpeza com um detergente
para que o processo de descontaminao possa ser eficiente.
Desinfeco: eliminao seletiva de alguns tipos de microorganismos para prevenir a sua transmisso
(reduo do nmero de microorganismos infectantes abaixo do nvel necessrio para causar uma
infeco).
Esterilizao: eliminao completa de todos os organismos (por exemplo: clulas, esporos e vrus).
Abreviaes
DNA: cido Desoxirribonucleico
EDTA: cido Etileno DiaminoTetraactico
RNA: cido Ribonucleico
Materiais
ABS: Estireno Butadieno Acrilonitrila
PBT: PoliButileno Tereftalato
PC: PoliCarbonato
PE: PoliEtileno
PEI: Imida Polieter
PMP: PoliMetilPenteno
POM: PoliOxiMetileno
PP: PoliPropileno
PVDF: Fluoreto de PoliViniliDeno
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12. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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DNA contamination for PCR. Nucleic acids research, 18 (20): 6149.
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prEN ISO/ FDIS 8655-1 - Piston-operated volumetric apparatus
Guyomard, S., Goury, V., Laizier, J., Darbord, J.C. Defining of the pyrogenic assurances level (PAL)
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Part 1: terminology, general *
prEN ISO/ FDIS 8655-2 - Piston-operated volumetric apparatus
Part 2: pipettes *
prEN ISO/ FDIS 8655-6 - Piston-operated volumetric apparatus
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Taibi, C. Linfection existe, sa prvention aussi. Guide pratique dhygine hospitalire.
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Volume II / Mdulo 1 - Micropipetas: Fundamentos e Operao
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Le contrle des micro-organismes par les agents physiques et chimiques. Partie 4, chapitre 5: le
contrle des micro-organismes.
Extraction and purification of RNA. Extraction, purification, and analysis of messenger RNA from eukaryotic
cells (7.3-7.5).
Sterilization and sterility assurance of compendial articles, USPXXI. Sterilization and sterility assurance,
general information.
Avoiding Ribonuclease contamination. neb.com.
FICHA TCNICA
Volume II Mdulo 2 gua para Anlises Qumicas Instrumentais
Editor:
Jos Muradian Filho - Millipore
Coordenao:
Cludia Franklin de Oliveira ANVISA
Itapuan Abimael da Silva - ANVISA
Karen de Aquino Noffs Brisolla - ANVISA
Karla de Arajo Ferreira - ANVISA
Marcelo Cludio Pereira - ANVISA
Max Weber Marques Pereira - ANVISA
Renato Almeida Lopes - ANVISA
SUMRIO
1. GUA PARA ANLISES QUMICAS INSTRUMENTAIS .................................................. 5
1.1. Introduo............................................................................................................................................. 5
1.2. Os contaminantes da gua .................................................................................................................. 5
1.2.1. Compostos inorgnicos dissolvidos ........................................................................................ 6
1.2.2. Compostos orgnicos dissolvidos ........................................................................................... 6
1.2.3. Partculas e colides .................................................................................................................. 6
1.2.4. Microorganismos ....................................................................................................................... 7
1.2.5. Gases dissolvidos ....................................................................................................................... 7
1.3. Monitoramento e controle da qualidade da gua purificada .......................................................... 7
1.3.1. Monitorao de contaminantes inicos inorgnicos condutividade e resistividade...... 8
1.3.2. Monitorao de contaminantes orgnicos TOC ou COT carbono oxidvel total ..... 10
1.4. Especificaes de qualidade ............................................................................................................. 11
1.5. Tecnologias de purificao de gua para laboratrios................................................................... 12
1.5.1. Destilao ................................................................................................................................. 12
1.5.2. Deionizao.............................................................................................................................. 13
1.5.3. Osmose reversa ........................................................................................................................ 14
1.5.4. Eletrodeionizao contnua .................................................................................................... 16
1.5.5. Ultrafiltrao............................................................................................................................. 18
1.5.6. Microfiltrao em membrana................................................................................................. 19
1.5.7. Carvo ativado ......................................................................................................................... 20
1.5.8. Radiao ultravioleta (UV) ..................................................................................................... 20
2. ESPECIFICAES PARA GUA PURIFICADA................................................................ 23
2.1. Objetivo ....................................................................................................................................... 23
2.2. Monitoramento da qualidade dos diversos tipos de gua ..................................................... 24
2.3. Calibrao e qualificao ........................................................................................................... 24
2.4. Recomendaes de armazenagem............................................................................................ 25
2.5. Manuteno dos equipamentos de purificao de gua ........................................................ 25
2.6. Formulrios de controle............................................................................................................. 25
2.7. Documentos de referncia ........................................................................................................ 25
3. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS...................................................................................... 29
1. GUA PARA ANLISES QUMICAS INSTRUMENTAIS
1.1. Introduo
A gua, tal como se encontra na Natureza, contm diversas outras substncias que no a molcula
H
2
O: sais, compostos orgnicos, microorganismos, partculas, gases dissolvidos. Isso se deve
basicamente a sua to conhecida caracterstica de solvente universal.
No laboratrio, as vrias utilizaes dadas gua requerem maior ou menor grau de pureza. Esse
grau de pureza definido em funo da aplicao, do mtodo de anlise, seus interferentes e sua
sensibilidade e limite de deteco. Assim que a gua purificada e a sua qualidade so fatores
crticos para a preparao de solues em geral, tampes, fases mveis em cromatografia, brancos
e tambm outros usos mais comuns, como lavagem de vidraria (enxge final), os quais nem por
isso so menos importantes.
Definir, conhecer, remover e controlar os contaminantes da gua so passos essenciais para a obteno
de gua purificada no laboratrio, de forma eficaz e econmica, atendendo em especial as necessidades
que a aplicao especfica exige.
A seguir, apresentamos em quatro tpicos as informaes e conceitos que ajudaro a alcanar esses
objetivos e decidir qual o tipo de gua a ser utilizado em uma anlise instrumental especfica:
Os contaminantes da gua
Monitoramento e controle da qualidade da gua purificada
Especificaes de qualidade
Tecnologias que podem ser empregadas para purificao de gua em laboratrios
1.2. Os contaminantes da gua
Como j foi dito, os contaminantes tm relao direta com a anlise que se est realizando e a
sensibilidade e limite de deteco do mtodo empregado. Por exemplo, em HPLC Cromatografia
Lquida de Alta Eficincia as anlises que utilizam o detector ultravioleta so sensveis aos compostos
orgnicos que estejam presentes na gua (componente da fase mvel) e que absorvem no
comprimento de onda utilizado. Isso compromete os resultados e a prpria curva de calibrao.
Alm disso, os compostos orgnicos que no so detectados nesse comprimento de onda podem
ser retidos e se acumular na coluna de HPLC, comprometendo sua eficincia e funcionalidade e
provocando os chamados picos fantasmas num cromatograma.
Para fins didticos, dividimos os contaminantes da gua em cinco classes:
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1.2.1. Compostos inorgnicos dissolvidos
So basicamente os sais dissolvidos na gua, os ons inorgnicos presentes. Podem estar sob a forma
de ctions ou nions.
nions:
on cloreto (Cl
-
), on hipoclorito (HClO
-
), Nitratos, nitritos, carbonatos, Sulfatos, Silicatos,etc...
Ctions:
Sdio (Na
+
) , Clcio e Magnsio (Ca
++
, Mg
++
, Ferro (Fe
++
), Alumnio (Al
+++
), Metais pesados ( Pb,
Ni, Cr, Hg), etc...
1.2.2. Compostos orgnicos dissolvidos
Esta classe de contaminantes pode ter sua origem na Natureza ou em decorrncia da poluio ou
do prprio processo de potabilizao da gua para consumo humano.
Origem natural
Aqui se encontram os materiais orgnicos provenientes da decomposio de vegetais e animais. A
decomposio de vegetais ocorre muito comumente nos mananciais abertos (represas, reservatrios)
onde a gua captada para posterior tratamento. Podemos citar, entre outros exemplos, taninos,
ligninas, fenis, cidos hmicos (mistura complexa de macromolculas com estrutura de polmero
fenlico). Aqui, tambm, esto includos as protenas, enzimas (nucleases, por exemplo), aminocidos
e seus derivados.
Origem no natural
Trata-se dos compostos orgnicos que tm sua origem nas atividades humanas. Podemos destacar
todos os tipos de pesticidas solveis em gua (fungicidas, inseticidas, herbicidas), hidrocarbonetos
poliaromticos (PAHs), bifenis policlorados (PCBs), EDTA (agente quelante que est presente em
formulaes de sabes, detergentes e cosmticos), citratos (em regies prximas a culturas agrcolas
ctricas) .
1.2.3. Partculas e colides
As partculas podem ser rgidas (areia, pedras, terra) ou deformveis (restos vegetais). Sua caracterstica
como contaminante o fato de ser escudo protetor para microorganismos contra a ao dos raios
UV e agentes de desinfeco. So tambm um veculo para esses microorganismos j que as bactrias,
por exemplo, podem aderir s partculas.
Nas anlises instrumentais, as partculas tambm podem causar srios problemas diretamente. Em
HPLC, por exemplo, existe sempre o risco de entupimento da coluna e de dano ao pisto da bomba
de injeo. Como se isso no bastasse, as partculas imobilizadas na entrada da coluna podem se
transformar em outra fase estacionria, prejudicando de forma imprevisvel as caractersticas de
reteno da coluna e a separao propriamente dita.
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Colides so suspenses estveis de partculas orgnicas ou inorgnicas, com tamanho que varia
entre 0,1 a 0,001mm, apresentando a caracterstica de todas as partculas possurem a mesma carga
e mesmo sinal. A repulso que decorre disso mantm a suspenso estvel. So de difcil remoo
por filtrao microporosa, mas podem ser retidos com facilidade por osmose reversa ou ultrafiltrao.
1.2.4. Microorganismos
Os microorganismos bactrias, fungos (mofos e leveduras) e vrus - esto comumente presentes
na gua potvel distribuda em uma cidade. Ainda que as empresas de tratamento processem a gua
para remover microorganismos nocivos sade humana, a gua fornecida no , de forma alguma,
estril. Os demais microorganismos remanescentes da potabilizao podem causar problemas em
anlises.
1.2.5. Gases dissolvidos
Podemos encontrar todos os gases existentes na atmosfera, dissolvidos na gua.
O gs mais importante dissolvido na gua o gs carbnico (CO
2
). Encontra-se em equilbrio com
o cido carbnico e este com o on bicarbonato:
Este equilbrio origina um on importante, o bicarbonato, que pode interferir com anlises e prejudicar
processos de purificao.
A taxa de dissoluo de CO
2
e sua concentrao na gua depende da temperatura (quanto menor,
maior a taxa de dissoluo e absoro) e da presso parcial de CO
2
no ambiente em que gua est
exposta.
Outros efeitos dos demais gases presentes no ar:
Oxignio: causa corroso em tanques, tubulaes, etc.
Amnia: contaminante originado da adubao agrcola .
SO
2
contido em gases de escape de automveis e emanaes de indstrias.
1.3. Monitoramento e controle da qualidade da gua purificada
Como j dissemos, os contaminantes presentes na gua podero causar interferncias importantes
nas determinaes analticas. Por isso mesmo, importante quantific-los e assegurar que atendam
s especificaes de qualidade. Alm disso, essa quantificao uma medida da eficincia do processo
de purificao de gua.
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Neste tpico ser considerada basicamente a deteco de contaminantes inorgnicos (ons) e
orgnicos.
H uma variedade imensa de contaminantes inorgnicos e analis-los individualmente seria muito
difcil e trabalhoso. possvel fazer uma determinao da contaminao inica total de uma soluo
aquosa utilizando um parmetro apenas: a condutividade, que a condutncia especfica ou sua
recproca, a resistividade (resistncia especfica).
Igualmente, existem inmeros contaminantes orgnicos que podem ocorrer na gua purificada.
Aqui, tambm, um nico parmetro pode ser utilizado para quantific-los: COT Carbono Orgnico/
Oxidvel Total (ou TOC Total Oxydizable Carbon).
Quantificam-se bactrias e outros microorganismos utilizando-se mtodos que empregam a filtrao
em membranas microporosas e posterior incubao com meios de cultura ou, mais recentemente,
quimioluminescncia. Os resultados so expressos em ufc/mL (unidades formadoras de colnias
por mL).
A quantidade de partculas controlvel atravs de tecnologias de remoo especficas (microfiltrao,
ultrafiltrao e osmose reversa). Nos processos de purificao de gua, isso suficiente e em geral
no h preocupao em quantificar as partculas presentes atravs das tecnologias adequadas para
isso e que garantam que todas as partculas acima de um determinado tamanho sejam removidas.
1.3.1. Monitorao de contaminantes inicos inorgnicos condutividade e resistividade
A conduo de corrente eltrica depende dos ons presentes na gua. Quanto mais pura estiver a
gua, menor a concentrao desses ons e, portanto, menor a condutividade. Para uma condutividade
baixa, teremos sua recproca, a resistividade, alta, uma vez que so expresses diferentes do mesmo
fenmeno.
Portanto: C= 1/R ou R= 1/C
Unidades de medida:
Condutividade micromho/cm ou microSiemens/cm
Resistividade Megohm.cm
A condutividade da gua no limite terico de purificao, isto , quando praticamente todos os ons
foram removidos restando apenas H
+
e OH
-
, de 0,055 microSiemens/cm ou 18,2 Megohm.cm, a
25 C. Esta a chamada gua ultrapura do tipo I (ASTM).
O grfico 1 mostra que a temperatura um fator importante na medio da condutividade. Quanto
menor a temperatura, maior a resistividade (portanto, menor a condutividade). Isso ocorre por que
a baixas temperaturas, ocorre uma menor mobilidade dos ons na soluo e essa mobilidade
inversamente proporcional a resistividade ou diretamente proporcional condutividade.
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Grfico 1. Variao da Resistividade e Condutividade em funo da temperatura
Da a necessidade de se saber qual a temperatura da gua ao se comparar essas medies.
Condutivmetros eresistivmetros instalados nos equipamentos de purificao de gua, em geral
possuem um circuito de compensao de temperatura para 25
o
C, o que permite uma leitura direta.
medida que a gua fica mais pura, ou seja, sua condutividade diminui ou sua resistividade aumenta,
maior a tendncia e a velocidade com que a gua ir agregar contaminantes do meio ambiente,
voltando ao seu estado natural. Por isso, imprescindvel que a gua ultrapura no seja armazenada
e seja obtida no momento da sua utilizao.
O grfico 2 mostra essa avidez da gua altamente purificada para retomar contaminantes, ilustrada
pela queda acentuada da resistividade aps apenas alguns minutos da purificao. Essa queda de
resistividade ocorre pela contaminao com gs carbnico atmosfrico que na gua entra em equilbrio
com o on bicarbonato, cuja presena promove o aumento da condutividade (ou diminuio da
resistividade).
Grfico 2. Contaminao da gua ultrapura por gases atmosfricos - CO
2
(20 C)
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1.3.2. Monitorao de contaminantes orgnicos TOC ou COT carbono oxidvel total
Existem atualmente dois tipos de analisadores de COT. Os analisadores que utilizam a oxidao
fsico-qumica e os que utilizam a tecnologia patenteada pela Anatel Corporation.
A determinao de COT por mtodos fsico-qumicos envolve primeiramente a remoo de CO
2
da
gua a ser testada atravs de purga com nitrognio. Isto traz um problema: difcil remover todo o
CO
2
.
O segundo passo envolve a adio de reagentes (perxidos) e a ao de um catalisador (UV ou
calor) para iniciar a reao de oxidao. Uma vez completada esta oxidao, o gs carbnico por ela
produzido removido da amostra de gua por borbulhamento com nitrognio e recolhido por
adsoro em uma coluna. A seguir realizada uma desoro da coluna, atravs de aumento de
temperatura e carreamento com um fluxo de nitrognio puro. A presena de CO
2
detectada por
espectrometria infravermelha e a concentrao determinada pela integrao do pico.
Este mtodo apresenta diversas limitaes na medio de COT em gua ultrapura:
Primeiro, existe o risco de contaminao durante a amostragem e o mtodo no pode ser
facilmente adaptado para medies em linha.
difcil, como foi mencionado, remover os ltimos traos de CO
2
no estgio de purga.
Compostos orgnicos volteis tambm so carreados pelo nitrognio e, portanto, no so
computados no COT total.
Os reagentes de oxidao utilizados so mantidos em uma sala normal e, portanto, sujeitos a
contaminao com CO
2
.
A tubulao do instrumento e a coluna sofrem uma lenta e cumulativa contaminao por materiais
orgnicos que so adsorvidos e liberados de forma incontrolvel.
Por fim, a tcnica requer o uso de muito nitrognio de alta pureza, o que extremamente
dispendioso.
A segunda tcnica, desenvolvida pela Anatel Corporation, mais simples e envolve a oxidao de
compostos orgnicos pela radiao UV. A radiao UV de comprimento de onda 185 nm converte
O
2
em oznio (O
3
) que um agente oxidante forte. Oznio, por sua vez, regir com a gua para
formar, com a participao da radiao UV de 254 nm, radicais livres hidroxila que, ento, reagiro
com os compostos orgnicos, oxidando-os at gs carbnico. A queda de resistividade (ou aumento
de condutividade) resultante , ento, medida e correlacionada para leitura de COT.
As principais vantagens deste mtodo que ele permite medies em linha de forma rpida e
automtica, sendo bastante sensvel (< 1ppb COT), reprodutvel, no utiliza reagentes e determinam
todos os tipos de compostos orgnicos, inclusive os volteis.
Entretanto, este mtodo adequado apenas para guas com resistividade maior que 3 Megohm.cm.
A concentrao de COT expressa em ppb partes por bilho.
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1.4. Especificaes de qualidade
Diversos rgos normalizadores possuem suas especificaes de qualidade, voltados s atividades
especficas a que se dedicam. Temos as especificaes da ASTM American Society for Testing and
Materials, direcionadas para a instrumentao analtica e para a indstria eletrnica. Temos tambm
as especificaes da United States Pharmacopeia (USP) voltadas produo de medicamentos e as
da ISO International Organization for Standardization. Existem ainda a NCCLS National
Committee for Clinical Laboratory Standards que em conjunto com o CAP College of American
Patologists especifica os tipos de gua utilizados em laboratrios clnicos.
A norma da ASTM , designao D-1193-99, a mais adequada para especificar os tipos de gua
utilizados em laboratrios qumicos e, especialmente, anlise instrumental.
A ASTM historicamente foi o primeiro rgo a propor normas para gua de uso laboratorial, dividindo
a gua em quatro graus, de acordo com as aplicaes:
Tipo I - tambm chamada gua ultrapura, ou gua grau reagente, utilizada para aplicaes crticas
de laboratrio, includas a as anlises instrumentais por HPLC.
Tipo II - para aplicaes pouco exigentes, tais como enxge de vidraria, anlise qualitativa, ou
ainda sntese orgnica.
Tipo III - para aplicaes gerais em laboratrio: preparao de meios de cultura e enxge final de
vidraria em aplicaes no crticas.
Tipo IV - abastecimento de sistemas produtores de gua grau reagente.
Contaminao Microbiolgica quando o nvel das bactrias necessita ser controlado, o tipo de
grau dever ser promovido como se segue:
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1.5. Tecnologias de purificao de gua para laboratrios
Para purificar a gua at os nveis especificados na ASTM e os demais rgos, diversas tecnologias
esto disponveis:
Destilao
Deionizao
Osmose Reversa
Eletrodeionizao Contnua (EDI)
Ultrafiltrao
Microfiltrao em membrana
Carvo Ativado
Radiao Ultravioleta
1.5.1. Destilao
A destilao um processo clssico de purificao de gua, que utiliza a mudana de fase da gua de
lquida para vapor, com condensao para fase lquida. Nesse processo, muitos contaminantes so
removidos, mas ainda assim no possvel obter gua ultrapura tipo I utilizando-se a destilao.
Substncias orgnicas de baixo ponto de ebulio tambm passam para a gua destilada. Formam-
se tambm misturas azeotrpicas e at compostos de alto peso molecular so arrastados com o
vapor. Alm disso, quando o cloro reage com compostos orgnicos naturais a altas temperaturas,
formam-se compostos organoclorados que so igualmente carreados pelo vapor.
A slica extrada de destiladores em vidro, assim como ocorre com outros ons em destiladores
metlicos.
Alm disso, o processo de destilao consome grande quantidade de energia e tem um consumo
igualmente alto de gua para resfriamento.
DESTILAO
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1.5.2. Deionizao
O processo de deionizao realizado utilizando-se resinas globulares porosas de troca inica com
dimetros entre 0,3 e 0,8 mm. Essas resinas so fabricadas com cadeias polimricas contendo ligaes
cruzadas de estireno e divinilbenzeno nas quais esto ligados grupos qumicos carregados.
Nas resinas aninicas, ou seja, as resinas que capturam nions, esses grupos so de amnio quaternrio.
Nas catinicas resinas que capturam ctions utilizam-se grupos sulfnicos.
No incio de um processo de deionizao, quando a resina no foi ainda utilizada, os ons ligados
aos grupos negativos das resinas catinicas so os prtons H
+
e os ons ligados s aninicas so as
hidroxilas OH
-
.
Durante o processo, ctions presentes na gua (Na
+
, Ca
++
, etc.) iro se ligar resina catinica, e
deslocar o prton H
+
,enquanto que os nions (Cl
-
, NO
3
-
) iro se ligar resina aninica e deslocar
as hidroxilas.
A deionizao um processo muito eficiente para a remoo de ons e at de alguns compostos
orgnicos ionizados. Entretanto, as resinas constituem um excelente suporte para crescimento
bacteriano. Como a gua de alimentao no estril, o resultado que a contaminao bacteriolgica
da gua aps uma coluna de deionizao pode ser 1000 vezes maior do que a da gua de entrada.
Figura 1. Esquema do processo de deionizao em leito misto
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DEIONIZAO
A regenerao das resinas pode ser realizada no prprio laboratrio ou em prestadores de servio
que realizam esse processo, trocando uma coluna esgotada por outra regenerada. Isto pode ser
fonte de contaminao inica residual originria de utilizaes em que a gua de entrada ou do
prprio ambiente a que essas resinas estiveram expostas.
Resinas de um nico uso, portanto, no regenerveis, so as mais indicadas para evitar todos esses
problemas.
1.5.3. Osmose reversa
Figura 2. Esquema do princpio da osmose e da osmose reversa
Suponhamos que dispomos de um tubo em forma de U, com seus dois ramos separados por uma
membrana de osmose. No ramo esquerdo, temos gua com molculas dissolvidas (representadas
por pontos). De acordo com as leis termodinmicas, as molculas iriam se difundir do lado esquerdo
para o direito, at que suas concentraes ficassem equivalentes. Porm, estas molculas no
conseguem atravessar a membrana, mas as molculas de gua sim. Dessa forma, a gua atravessar
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a membrana a partir do ramo direito em direo ao esquerdo para diluir as molculas dissolvidas.
Esse processo continuar at gerar um diferencial de presso (presso osmtica) entre os ramos,
equilibrando assim a diferena de concentraes.
A osmose reversa exatamente o oposto desse processo: a gua contendo ons ou outros
contaminantes pressurizada contra uma membrana de osmose reversa e obtm-se gua pura no
outro lado da membrana. A presso exercida deve ser superior presso osmtica.
Membranas de osmose reversa rejeitam tipicamente 90% dos ons monovalentes, 95% dos bivalentes
e 99% dos polivalentes. So rejeitados tambm 99% dos compostos orgnicos com peso molecular
superior a 300, vrus e bactrias.
A fim de obter um fluxo contnuo de molculas de gua nessa membrana, torna-se necessrio
remover os contaminantes de forma regular. Isto pode ser realizado atravs do chamado fluxo
tangencial (figura 3), que permite que parte do fluxo de gua percorra a superfcie da membrana,
promovendo assim uma verdadeira varredura e impedindo o acmulo de contaminantes.
Nos equipamentos, essa configurao apresenta-se na forma de membranas enroladas em espiral,
constituindo um cartucho em que os canais de permeado e rejeitado esto perfeitamente separados
e estanques. Isso permite que se obtenha uma rea grande de separao em um volume relativamente
pequeno, permitindo assim a construo de sistemas compactos.
Sistemas de osmose reversa removem uma porcentagem razovel de todos os tipos de contaminantes,
porm, essa remoo, justamente por ser percentual, no suficiente para se obter os nveis de
pureza requeridos para gua, sequer do tipo II, na maior parte dos casos. No quadro a seguir so
mostradas as vantagens e desvantagens desse processo.
OSMOSE REVERSA
O nico uso de energia eltrica, neste processo, destinado apenas a movimentar a bomba de
pressurizao, portanto, um consumo bastante baixo se comparado ao da destilao.
As membranas de osmose tambm podem sofrer incrustraes e obstruo devido precipitao
de sais, principalmente carbonato de clcio, reduzindo a vazo e danificando a estrutura da membrana.
Por isso, faz-se necessrio um controle dos ons incrustantes para evitar esse tipo de problema.
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Figura 3. Esquema do fluxo tangencial em um sistema de osmose reversa
1.5.4. Eletrodeionizao contnua
Se mergulharmos dois eletrodos - nodo e ctodo numa soluo de NaCl, por exemplo, e aplicarmos
uma diferena de potencial entre os dois eletrodos, os ons Na
+
e Cl
-
iro migrar em direo ao
ctodo e ao nodo respectivamente.
Existem membranas denominadas membranas de troca inica permeveis seletivamente a
ctions ou a nions, que permitem controlar essa migrao. Estas membranas so fabricadas com
fragmentos de resinas de troca inica includos em uma matriz de polietileno. Esses fragmentos de
resinas catinicas ou aninicas permitem assim a passagem de ctions ou nions respectivamente.
Se introduzirmos essas membranas no sistema de NaCl e eletrodos que descrevemos, teremos o
controle da migrao dos ons Na
+
e Cl
-
, como mostra a figura a seguir.
Figura 4. Controle da migrao de ons por membranas de troca inica
Na membrana aninica, somente os ons cloreto de nosso modelo conseguem atravessar. Ao contrrio,
na catinica, somente os ons sdio. Se montarmos um sistema em que alternamos as duas membranas
e mantemos os eletrodos, temos o chamado sistema de eletrodilise (figura 5a).
Figura 5. Sistema de eletrodilise
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Na clula seguinte, prosseguindo direita, vemos que os ons cloreto conseguem sair, assim como
os ons sdio. Aqui observamos claramente uma depleo de ons e a eletroneutralidade tambm
mantida, pois para cada on cloreto, temos um sdio deixando a mesma clula.
Na prxima clula, ao contrrio, os ons esto se acumulando, uma vez que nem sdio nem cloreto
conseguem deix-la.
Como resultado, temos aqui um sistema em que os ons so concentrados em algumas clulas (fluxo
de descarte) e esto praticamente ausentes em outras (fluxo de produto). Este processo pode ser
utilizado para purificar gua, mas extremamente lento uma vez que os ons teriam que se mover de
uma clula a uma membrana e em direo ao eletrodo.
Para melhorar o desempenho do sistema, as clulas de produto so preenchidas com resinas de
troca inica de leito misto (aninicas + catinicas). Isto permite que haja uma transferncia inica
do centro da clula em direo membrana semipermevel em vez de trafegar a baixa velocidade na
gua, onde os choques devidos aos movimentos brownianos diminuiriam sua progresso. Assim, os
ons pulam de stio ativo em stio ativo da resina em direo ao eletrodo de sinal oposto. Esta
configurao permite tambm a captura de substncias orgnicas de carga fraca.
As resinas so continuamente regeneradas, pois no campo eltrico formado h a gerao de H
+
e
OH
-
, formando microambientes em torno das resinas.
Porm, o processo de purificao por eletrodeionizao contnua necessita ser alimentado com uma
gua j previamente purificada por osmose reversa, de forma que a concentrao de sais j esteja
atenuada.
Figura 6. Resinas de troca inica preenchendo as clulas de produto
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ELETRODEIONIZAO CONTNUA (EDI)
1.5.5. Ultrafiltrao
Figura 7. Representao do corte esquemtico de um ultrafiltro, mostrando a proporo
entre a camada ativa de separao (1) e a camada de suporte (100).
Ultrafiltros so membranas polimricas, assimtricas, com uma camada ativa muito fina (1 micrometro
de espessura) na parte superior e uma camada de suporte mais espessa (100 micrometros).
As membranas de ultrafiltrao (UF) operam sob presso. Nestas condies, molculas pequenas
conseguiro atravessar a camada ativa, enquanto as maiores sero retidas. O limite desse corte
denominado Limite Nominal de Peso Molecular (Nominal Molecular Weight Limit NMWL) e
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Volume II / Mdulo 2 - gua para Anlises Qumicas Instrumentais
expresso em daltons. Este valor usado para caracterizar as membranas UF porque o peso molecular
mais fcil de encontrar na literatura do que as dimenses das molculas.
O peso molecular relaciona-se diretamente ao tamanho da molcula, mas outros fatores tambm
precisam ser considerados: forma, estereoqumica e pH da disperso em que se encontram. Isto
fundamental no caso de protenas.
A tabela a seguir mostra as vantagens e desvantagens da UF.
ULTRAFILTRAO - UF
Como pode ser visto, estas membranas so muito eficientes na remoo de compostos orgnicos de
alto peso molecular.
1.5.6. Microfiltrao em membrana
Existem trs principais tipos de filtros: filtros de profundidade, de superfcie e de membrana.
Filtros de profundidade so fabricados com fibras aglomeradas e retm contaminantes em toda a
sua espessura. Possuem uma alta capacidade, mas no apresentam um limite de reteno muito
claro. Sua eficincia est por volta de 95% e varia com a vazo. Alm disso, podem liberar
contaminantes no filtrado, geralmente fibras ou material que foi retido.
Filtros de superfcie so geralmente fabricados com mltiplas camadas de material no fibroso,
capturando os contaminantes principalmente na sua superfcie e possuindo uma capacidade
intermediria de reteno e eficincia (98%).
Filtros de tela ou de membrana retm contaminantes na sua superfcie atravs de um efeito de
peneiramento. Possuem baixa capacidade, mas promovem 100% de reteno de contaminantes
cujo tamanho maior do que seu limite de corte bem definido. Filtros de tela tpicos so os de
membrana, onde a sua integridade pode ser verificada atravs de testes especficos como, por exemplo,
ponto de bolha ou difuso.
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Volume II / Mdulo 2 - gua para Anlises Qumicas Instrumentais
Figura 8. Representao de corte transversal de filtro de superfcie e microfotografia de
membrana Durapore# (Foto: cortesia de Millipore Ind. e Com. Ltda)
A principal vantagem dos filtros de membrana a remoo de 100% de todos os contaminantes
com tamanho superior ao do seu dimetro de poro. As membranas com poro de 0,22 !m de dimetro
so usadas na indstria farmacutica h muitos anos para filtrao esterilizante de solues.
1.5.7. Carvo ativado
O carvo ativado usado principalmente pela sua capacidade de adsoro de materiais orgnicos
devido a sua grande rea superficial: at 1000 m
2
/g.
Outra funo a reduo de oxidantes, como o cloro livre, presentes na gua e que poderiam afetar
membranas de osmose reversa ou resinas de troca inica. Trata-se, portanto, de uma tecnologia
voltada principalmente para o pretratamento e a proteo de outras etapas.
CARVO ATIVADO
1.5.8. Radiao ultravioleta (UV)
As radiaes UV apresentam comprimentos de onda entre 100 e 400 nm, divididos em quatro
campos: ondas ultracurtas, curtas (UV-C), mdias (UV-B) e longas (UV-A). Podem ser produzidas
facilmente por lmpadas com baixa presso de vapor de mercrio que emitem radiaes em dois
comprimentos de onda: 185 e 254 nm.
As radiaes com comprimento entre 200 e 300 nm destroem microorganismos pela quebra da
cadeia de DNA. Isso se processa de forma mais intensa no comprimento de 260 nm. Portanto, o
comprimento de 254 nm possui uma eficincia bem prxima (80%) do considerado timo para essa
finalidade.
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MICROFILTRAO EM MEMBRANA
Porm, necessrio um projeto bastante criterioso para que essa eficincia seja realmente alcanada,
levando em considerao principalmente capacidade de penetrao da radiao UV, da ordem de
1 cm. preciso promover uma vazo suficiente para que essa penetrao ocorra, respeitando o
tempo de residncia da gua na cmara de exposio.
Uma outra aplicao muito importante da radiao UV a reduo dos nveis de COT Carbono
Oxidvel Total (TOC) da gua purificada.
Na verdade, a UV no destri os compostos orgnicos diretamente, mas gera oznio oxidar as
substncias presentes na gua.
Como pode ser visto na figura abaixo, esquerda, dois comprimentos de onda diferentes so
necessrios para gerar os radicais livres hidroxila (OH) que posteriormente iro realizar a oxidao
dos compostos orgnicos.
Figura 9. esquerda: seqncia de reaes para a formao do radical livre hidroxila.
direita: reaes de oxidao de compostos orgnicos. Exemplo: metanol.
Ambos os mecanismos, descritos na literatura (Norrish et al., 1965 e Banford et al. 1967),
requerem a ao de comprimentos de onda de 185 e 254 nm e a presena de oxignio na gua. A
estequiometria de ambos os mecanismos a mesma e leva formao do mesmo nmero de radicais
hidroxila.
No lado direito da figura, apresentamos um exemplo de oxidao de um composto orgnico sem
carga: metanol. Trata-se de uma das mais simples molculas orgnicas, com apenas um tomo de
carbono. Esta molcula, sob a ao dos radicais livres hidroxila, oxidada sucessivamente na escala
crescente de oxidao: partindo de lcool, em seguida aldedo, cido e por fim gs carbnico e gua.
Como j vimos anteriormente, gs carbnico e gua esto em equilbrio com cido carbnico que
por sua vez est em equilbrio com o on bicarbonato e H
+
. A remoo do carbono, portanto, se d
nesta forma e realizada por resinas de troca inica.
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Observe-se que pela converso do carbono orgnico em um on de fcil remoo por deionizao,
foi possvel reduzir o nvel de COT da gua purificada.
RADIAO UV (185 + 254 nm)
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2. ESPECIFICAES PARA GUA PURIFICADA
2.1. Objetivo
Esta especificao cobre requisitos apropriados para gua para usos em mtodos de anlise qumica
e testes fsicos. Foi baseada nas especificaes da ASTM D1193-99, com alteraes.Quatro classes
foram especificadas:
A medida do pH da gua grau reagente tipo I, II e III eliminada das especificaes pelo fato da
gua nesses graus de purificao no conter componentes em quantidades suficientes para significar
a alterao do pH.
Os mtodos de preparao dos vrios tipos de gua determinam os limites de impurezas e devero
seguir as seguintes especificaes:
2.1.1. Grau tipo I de gua reagente dever ser preparado por um processo de pr-purificao
adequado, seguido por um polimento realizado com sistema de ultrapurificao composto
por resina de troca inica de leito misto e membrana final de 0.22m. A preparao deve ser
realizada sempre no momento do uso. recomendado, mas no obrigatrio, que o sistema
de ultrapurificao (polimento final) possua uma lmpada UV com emisso de 185 e 254 nm
de forma a reduzir ao mximo os nveis de COT. Alm disso, tambm recomendado, mas
no obrigatrio, que o equipamento de ultrapurificao (polimento final) possua um medidor
de COT em linha, para monitoramento constante dos contaminantes orgnicos. O
abastecimento (pretratamento) do passo final da gua dever apresentar no mximo 10 S/
cm de condutividade a 25
o
C.
2.1.2. Grau tipo II de gua reagente dever ser preparada por processo de osmose reversa
combinado por eletrodeionizao, destilao ou troca inica tendo uma condutividade menor
que 1,0 S/cm a 25
o
C. Troca inica, ou osmose reversa e adsoro orgnica podem ser
necessrios associados destilao se a pureza no for atingida por um nico passo de
destilao.
2.1.3. Grau tipo III de gua reagente dever ser preparado por osmose reversa seguida por
eletrodeionizao contnua, destilao, troca inica, ou uma combinao destes, seguidos
por um polidor com um filtro de membrana de 0,45m. O uso deste filtro torna-se necessrio
apenas em casos que a contaminao microbiolgica requerida.
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2.1.4. Grau tipo IV de gua reagente poder ser preparado por osmose reversa, destilao, troca
inica, osmose reversa seguida de eletrodeionizao contnua, eletrodilise, ou uma
combinao destes.
A escolha de um dos vrios tipos podem ser determinada pelo mtodo ou por investigao.
Esta especificao no pretende abranger os aspectos referentes a segurana, associados com a
aplicao. de responsabilidade do usurio estabelecer o padro apropriado de segurana e prticas
saudveis e determinar a aplicabilidade dos limites de regulamentao prioritrios ao uso.
2.2. Monitoramento da qualidade dos diversos tipos de gua
2.2.1. Condutividade e resistividade: Para a medio da condutividade ou resistividade dever
ser utilizado o condutivmetro ou resistivmetro do prprio equipamento de purificao de
gua, desde que devidamente calibrado. Nos casos em que se utiliza um destilador que no
possui esse medidor acoplado, a medio dever ser realizada com um condutivmetro porttil
igualmente calibrado.
2.2.2. COT carbono oxidvel (orgnico) total Ainda que se especifiquem os valores de
COT para todos os tipos de gua, apenas a gua Grau tipo I crtica nesse aspecto, pois
a gua que entrar em contato com os equipamentos analticos e nveis elevados de COT
podero causar resultados prejudicados. Este grau necessita, portanto, de acompanhamento
sistemtico dos nveis de TOC. A recomendao que nos casos de equipamentos de
ultrapurificao de gua (polidores finais), estes j tenham acoplado um medidor de COT
em linha, devidamente calibrado. Nos casos em que isto no ocorra, a medio dever ser
realizada em linha, por equipamento utilizando a tcnica de fotooxidao para resistividades
maiores que 3 megohm.cm.
2.2.3. Freqncia das medies:
2.2.3.1. Resistividade e condutividade:
2.2.3.1.1. Diariamente para gua tipo I, II, III ou IV.
2.2.3.1.2. No momento da retirada da gua, para gua tipo I.
2.2.3.2. COT carbono oxidvel total:
2.2.3.2.1. Nos casos em que no h medidor incorporado ao equipamento, a
medio de COT dever ser realizada pelo menos uma vez a cada
quinzena.
2.2.3.2.2. Nos casos em que o equipamento de ultrapurificao dispor do medidor
de TOC, a medio dever ser realizada no momento da retirada da
gua.
2.3. Calibrao e qualificao
2.3.1. Cada um dos sistemas de purificao de gua dever ter seus medidores calibrados e devero
ser qualificados nos aspectos Instalao, Operao e Desempenho.
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2.4. Recomendaes de armazenagem
2.4.1. gua grau tipo I No deve ser armazenada, pois sua degradao muito rpida. Dever
ser preparada no momento do uso.
2.4.2. gua grau tipo II, III e IV podero ser armazenadas em reservatrio protegido contra
contaminaes externas da atmosfera. Recomenda-se fortemente que o perodo de
armazenamento dessa gua purificada no exceda vinte e quatro horas a partir de sua
preparao.
2.5. Manuteno dos equipamentos de purificao de gua
Devero ser seguidas todas as indicaes do fabricante, principalmente com relao troca de
material de consumo e limpezas eventualmente necessrias. recomendvel estabelecer um programa
de manuteno preventiva para cada equipamento e manter um registro das substituies de material
de consumo e das manutenes realizadas.
2.6. Formulrios de controle
Os anexos 1 e 2 trazem modelos de formulrios de controle para registro das medies de resistividade
ou condutividade e TOC.
2.7. Documentos de referncia
D1193 Standard Specifications for Reagent Water
D1125 Test Methods for Electrical Conductivity and Resistivity of Water
D1129 Termninology Relating to Water
D1293 Test Methods for pH of Water
D4453 Practice for Handling of Ultra-Pure Water Samples
D4779 Test Method for Total, Organic, and Inorganic Carbon in High Purity Water by Ultraviolet
(UV) or Persulfate Oxidation, or Both, and Infrared Detection
D5391 Test Method for Electrical Conductivity and Resistivity of a Flowing High Purity Water
Sample
D5542 Test Method for Trace Anions in High Purity Water by Ion Chromatography
D5997 Test Method for On-Line Monitoring of Total Carbon, Inorganic Carbon in Water by
Ultraviolet, Persulfate Oxidation and Membrane Conductivity Detection
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Anexo 1. Modelo de formulrio de controle para equipamentos de ultrapurificao de gua
(polimento final) que dispem de medidor de COT acoplado.
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Anexo 2. Modelo de formulrio de controle para equipamentos de ultrapurificao de gua
(polimento final) que no dispem de medidor de COT acoplado.
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Anexo 3. Modelo de formulrio de controle para equipamentos de purificao de gua para
obteno de gua grau tipo II, III ou IV
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3. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
American Society for Testing and Materials D1193-99, Standard Specification for Reagent Water
(1999).
Millipore, site na Internet: http//millipore.com/H2O.
Millipore Indstria e Comrcio Ltda. Seminrios de Purificao de gua para Laboratrios.
Norrish et al., Proc.Roy.Soc.Ser. A. 288: 316 (1965).
Banford et al., Photochemistry and Reaction Kinetics. P.G. Ashmore et al., Ed. Cambridge (1967).
Volume II / Mdulo 2 - gua para Anlises Qumicas Instrumentais
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FICHA TCNICA
Volume II Mdulo 3 Instrumentao Analtica
Editores e Colaboradores:
Adauto da Silva VARIAN
Celso Ricardo Camargo - SINC BRASIL
Demian Rocha Ifa SINC BRASIL
Ivan Jonaitis AGILENTTECHNOLOGIES
Jos Apareido Soares - VARIAN
Luiz Rinalo Bizaio - VARIAN
Renato Guva - AGILENT TECHNLOGIES
Renato eres - FLOWSERVICE
Ricardo Lira - FLOWSERVICE
Robson Sanches Bizi - VARIAN
Coordenao:
Cludia Franklin de Oliveira ANVISA
Itapuan Abimael da Silva - ANVISA
Karen de Aquino Noffs Brisolla - ANVISA
Karla de Arajo Ferreira - ANVISA
Marcelo Cludio Pereira - ANVISA
Max Weber Marques Pereira - ANVISA
Renato Almeida Lopes - ANVISA
SUMRIO
1. INTRODUO................................................................................................................................ 7
2. ESPECTROFOTOMETRIA DE ULTRA VIOLETA VISVEL (UV-VIS).................... 8
2.1. Introduo .................................................................................................................................. 8
2.2. Princpio da tcnica ................................................................................................................. 10
2.2.1. Espectro luminoso ...................................................................................................... 10
2.2.2. Processos de absoro................................................................................................ 10
2.2.3. Espectro de absoro UV - Vis ................................................................................ 12
2.2.4. Efeito de solventes ...................................................................................................... 14
2.3. Descrio bsica do sistema ................................................................................................... 15
2.3.1. Fontes de radiao ...................................................................................................... 15
2.3.2. Monocromador ( ptica ) ........................................................................................... 16
2.3.2.1. Simples feixe ................................................................................................. 17
2.3.2.2. Arranjo de diodos ........................................................................................ 18
2.3.2.3. Duplo feixe.................................................................................................... 18
2.3.3. Compartimento de amostras ..................................................................................... 19
2.3.3.1. Acoplador de fibra ptica ........................................................................... 19
2.3.3.2. Sipper ............................................................................................................. 19
2.3.3.3. Suporte para amostras slidas .................................................................... 19
2.3.3.4. Acessrios de reflectncia ........................................................................... 20
2.3.4. Aquisio de dados ..................................................................................................... 20
2.4. Requisitos mnimos de instalao e operao ...................................................................... 20
2.5. Cuidados bsicos ...................................................................................................................... 21
3. CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA (GC) ................................................................... 22
3.1. Introduo ................................................................................................................................ 22
3.2. Princpio da tcnica ................................................................................................................. 22
3.3. Descrio bsica do sistema ................................................................................................... 23
3.3.1. Gases utilizados ........................................................................................................... 24
3.3.2. Controladores de fluxo e presso ............................................................................. 25
3.3.3. Injetores ........................................................................................................................ 25
3.3.3.1. Injetores empacotados ................................................................................. 25
3.3.3.2. Injetores capilares ......................................................................................... 26
3.3.4. Colunas ......................................................................................................................... 27
3.3.4.1. Forno de colunas .......................................................................................... 28
3.3.5. Detectores .................................................................................................................... 28
3.3.5.1. Detector de ionizao de chama (FID) ..................................................... 28
3.3.5.2. Detector de nitrognio e fsforo (NPD) ou
termo-inico especfico (TSD) .................................................................. 29
3.3.5.3. Detector de captura de eltrons ECD................................................... 30
3.3.6. Aquisio e processamento de dados ....................................................................... 31
3.4. Requisitos mnimos de instalao e operao ...................................................................... 31
3.5. Cuidados bsicos ...................................................................................................................... 32
4. CROMATOGRAFIA EM FASE LQUIDA(LC) .................................................................. 33
4.1. Introduo ................................................................................................................................ 33
4.2. Princpio da tcnica ................................................................................................................. 33
4.2.1. Modos de separao: .................................................................................................. 34
4.2.1.1. Cromatografia em fase normal ................................................................... 34
4.2.1.2. Cromatografia em fase reversa ................................................................... 35
4.3. Descrio bsica do sistema ................................................................................................... 36
4.3.1. Fase mvel ................................................................................................................... 37
4.3.2. Sistema de bombeamento de solventes ................................................................... 38
4.3.3. Introduo de amostra - injetor ................................................................................ 38
4.3.3.1. Injetor manual ............................................................................................... 38
4.3.3.2. Injetor automtico........................................................................................ 39
4.3.4. Colunas ......................................................................................................................... 39
4.3.4.1. Fases estacionrias base de slica ............................................................. 39
4.3.4.2. Fases quimicamente modificadas ............................................................... 40
4.3.5. Detectores .................................................................................................................... 40
4.3.5.1. Detectores de UV-VIS................................................................................. 41
4.3.5.2. Detector de fluorescncia ........................................................................... 43
4.3.5.3. Detectores eletroqumicos .......................................................................... 43
4.3.6. Aquisio e processamento de dados ....................................................................... 44
4.3.6.1. Porcentagens de rea ................................................................................... 45
4.3.6.2. Normalizao de rea .................................................................................. 45
4.3.6.3. Padro externo.............................................................................................. 46
4.3.6.4. Padro interno .............................................................................................. 46
4.4. Requisitos mnimos de instalao e operao ...................................................................... 47
4.4.1. Requisitos da bancada ................................................................................................ 47
4.4.2. Rede eltrica ................................................................................................................. 47
4.4.3. Condies ambientais ................................................................................................. 48
4.5. Cuidados bsicos ...................................................................................................................... 48
5. SISTEMAS DE CROMATOGRAFIA ACOPLADOS A DETECTORES
DE MASSA ....................................................................................................................................... 50
5.1. Introduo ................................................................................................................................ 50
5.2. Princpio da tcnica ................................................................................................................. 50
5.3. Descrio bsica do sistema ................................................................................................... 51
5.3.1. Fonte de ionizao ...................................................................................................... 51
5.3.1.1. Impacto de eltrons (EI) ............................................................................. 51
5.3.1.2. Ionizao qumica (CI) ................................................................................ 51
5.3.1.3. Electrospray (ES) ......................................................................................... 52
5.3.2. Analisadores de massas .............................................................................................. 54
5.3.2.1. Analisadores de massas quadrupolar .......................................................... 54
5.3.2.2. Analisadores de massas quadrupolar ion trap ....................................... 55
5.3.2.3. Espectrometria de massas seqencial (tandem mass spectrometry). ..... 57
5.3.3. Detectores .................................................................................................................... 58
5.3.3.1. Multiplicadores de eltrons ......................................................................... 58
5.3.3.2. Placas microcanais ........................................................................................ 59
5.3.3.3. Foto-multiplicador ....................................................................................... 60
5.3.4. Aquisio e processamento de dados ....................................................................... 60
5.4. Requisitos mnimos de instalao e operao ...................................................................... 61
5.4.1. Requisitos da bancada ................................................................................................ 61
5.4.2. Rede eltrica ................................................................................................................. 61
5.4.3. Condies ambientais ................................................................................................. 62
5.5. Cuidados bsicos ...................................................................................................................... 62
5.5.1. Sistema de vcuo ......................................................................................................... 62
5.5.2. Fonte de ons ............................................................................................................... 63
5.5.3. Sistema de nitrognio ................................................................................................. 63
5.5.4. Treinamento em cuidados bsicos ............................................................................ 63
5.5.5. Arquivos de sintonia ................................................................................................... 63
6. VERIFICAO DE DESEMPENHO DE INSTRUMENTOS ANALTICOS ....... 64
6.1. Introduo ................................................................................................................................ 64
6.1.1. DQ Qualificao de projeto................................................................................... 65
6.1.2. IQ Qualificao de instalao ................................................................................ 65
6.1.3. OQ - Qualificao de operao ................................................................................ 65
6.1.4. PQ Qualificao de desempenho .......................................................................... 66
6.2. Espectrofotometria de ultra violeta - visvel (UV-VIS) ...................................................... 66
6.2.1. Manuteno preventiva .............................................................................................. 66
6.2.2. Qualificao de operao (OQ) ................................................................................ 67
6.2.3. Qualificao de desempenho (PQ) ........................................................................... 67
6.2.3.1. Farmacopia europia.................................................................................. 67
6.2.3.2. Farmacopia americana ............................................................................... 68
6.3. Cromatografia em fase gasosa GC..................................................................................... 68
6.3.1. Manuteno preventiva de GC ................................................................................. 68
6.3.2. Qualificao de operao ........................................................................................... 68
6.3.2.1. Controle de fluxos ........................................................................................ 68
6.3.2.2. Controle de temperaturas ............................................................................ 69
6.3.2.3. Preciso de sinal do(s) detector(es) ............................................................ 69
6.3.2.4. Preciso do amostrador automtico .......................................................... 70
6.3.2.5. Clculos efetuados pelo sistema de dados ................................................ 70
6.4. Cromatografia em fase lquida HPLC................................................................................... 70
6.4.1. Manuteno preventiva de HPLC ............................................................................ 70
6.4.2. Qualificao de operao ........................................................................................... 71
6.4.2.1. Qualificao do detector ............................................................................. 72
6.4.2.2. Qualificao da bomba ................................................................................ 72
6.4.2.3. Qualificao do forno de colunas .............................................................. 73
6.4.2.4. Qualificao do amostrador automtico ................................................... 73
6.4.2.5. Sistema de dados .......................................................................................... 73
6.5. Sistemas de cromatografia acoplados a detectores de massas ........................................... 73
6.5.1. Manuteno preventiva de sistemas detectores de massas .................................... 73
6.5.1.1. Sistemas de vcuo......................................................................................... 73
6.5.1.2. Detector de massas ...................................................................................... 74
6.5.1.3. Cromatgrafo ............................................................................................... 74
6.5.2. Qualificao de operao ........................................................................................... 74
6.5.2.1. Preciso do injetor........................................................................................ 75
6.5.2.2. Linearidade do injetor .................................................................................. 75
6.5.2.3. Carry-over ..................................................................................................... 75
6.5.2.4. Linearidade do detector ............................................................................... 75
6.5.2..5 . Exatido de massas .................................................................................... 75
6.5.2..6. Sensibilidade................................................................................................. 75
7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .................................................................................... 76
1. INTRODUO
A utilizao de tcnicas de instrumentao analtica nos laboratrios uma necessidade no apenas
para caracterizar uma substncia ou garantir a qualidade de um produto, mas tambm para um
aumento de produtividade de anlises; com isto, temos um crescente nmero de instrumentos com
alto grau de automao, podendo ser operados remotamente. Contudo, temos que ter a conscincia
de que para uma boa utilizao e desempenho destes instrumentos so necessrias algumas regras
bsicas como: saber o propsito de sua utilizao, uma adequada instalao, evidncias de seu
desempenho, pessoal treinado em sua operao, seguir as orientaes do fabricante com cuidados
bsicos a serem tomados pelo operador e rotinas de substituio de materiais consumveis, pessoal
que tenha slidos conhecimentos na tcnica numa eventual implementao de um mtodo analtico,
um programa de manutenes preventivas e de verificao de desempenho compatvel com sua
utilizao em rotina, avaliao de parmetros que assegurem uma contnua garantia da qualidade
dos resultados obtidos, enfim, um planejamento detalhado sempre com evidncias do que est
sendo realizado. Estamos abordando neste captulo as principais tcnicas de instrumentao analtica
utilizadas num laboratrio de bioequivalncia para que o profissional desta rea possa iniciar seu
estudo e ter este material como referncia. Um outro propsito foi o de abordar a verificao de
desempenho de cada instrumento e conceitos de validao aplicados a instrumentao analtica.
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Volume II / Mdulo 3 - Instrumentao Analtica
2. ESPECTROFOTOMETRIA DE ULTRA VIOLETA VISVEL (UV-VIS)
2.1. Introduo
A espectrofotometria de Ultravioleta - Visvel uma tcnica analtica baseada na propriedade que
muitas espcies inicas ou moleculares possuem de absorver radiaes ultravioleta e visvel em
soluo. As radiaes nestas regies envolvem ftons com energia suficiente para provocar transies
dos eltrons de valncia, em funo de perturbaes que passam a ocorrer.
A perturbao produzida pelos campos eltricos e magnticos propaga-se pelo espao, originando
a expresso radiao eletromagntica. Deve-se ter em mente, que os campos eltricos e magnticos
so campos perpendiculares entre si e que os valores de propagao onde ocorrem os mximos e os
mnimos dos campos so sempre coincidentes, ou seja, os campos esto em fase, como uma onda.
Na figura 1, pode-se verificar que enquanto se propaga para a direita com velocidade V, um ponto
qualquer fixo sobre o eixo X passa a ter sucessivamente picos e vales da onda. Define-se,
ento, o comprimento de onda (l) como sendo a distncia percorrida pela onda para que os
dois mximos atinjam o ponto fixo de observao. O comprimento de onda usualmente expresso
em nanmetros (nm).
Figura 1. Comprimento de onda
As radiaes Ultravioleta - Visvel (UV-Vis) constituem uma parte relativamente pequena do espectro
eletromagntico no qual esto includos outras formas de radiaes como ondas de rdio, conforme
figura 2. Os limites destas regies so determinados pelos limites prticos de mtodos experimentais
de produo e deteco das radiaes.
A diferenciao das regies espectrais tem significado adicional para o qumico, no sentido de que
as interaes fsicas seguem diferentes mecanismos e fornecem diferentes tipos de informaes.
Quando uma radiao incidida em uma substncia semitransparente, a radiao somente
parcialmente transmitida. A radiao restante refletida ou absorvida em diversos ngulos
(figura 3), dependendo da substncia e do comprimento de onda da radiao.
O tipo e a quantidade de radiao, que absorvida, a que possui maior importncia analtica.
Infelizmente, no h um mtodo direto para determinar a radiao absorvida, entretanto, pode-se
obter a informao indiretamente pela medida da radiao transmitida.
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Figura 2. Espectro eletromagntico
Figura 3. Radiao absorvida, transmitida e refletida
Se a intensidade de uma luz transmitida representada graficamente em funo do comprimento
de onda, um espectro de absoro da substncia obtido. Esta a absoro seletiva da radiao a
qual fornece a base para anlise quantitativa e qualitativa por espectrofotmetro de absoro molecular.
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2.2. Princpio da tcnica
2.2.1. Espectro luminoso
A luz visvel a regio do espectro eletromagntico, cujas radiaes so capazes de sensibilizar a
retina. A radiao visvel compreende as radiaes cujos comprimentos de onda esto situados
entre 400 e 700nm, embora estes limites no sejam fixos em virtude da capacidade de percepo
variar de acordo com o observador. Nesta faixa de comprimentos de onda, pode-se separar em
subgrupos de acordo com a cor produzida em uma pequena faixa do espectro, como na tabela
abaixo.
Tabela 1. Faixas de comprimentos de onda na regio do visvel
2.2.2. Processos de absoro
Partindo do princpio que a luz uma forma de energia, a absoro de um fton de luz por uma
molcula resulta em um incremento de energia, $E, na energia contida na molcula. A quantidade
do incremento exatamente igual energia do fton, que $E = hn. O processo de absoro
representado esquematicamente no diagrama de nveis de energia simplificada na figura 4.
Figura 4. Diagrama de energia
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Se a molcula est inicialmente no estado normal ou estado fundamental, E
0
, antes da interao, o
processo de absoro aumenta a energia contida a um nvel mais alto ou um estado excitado, E
1
. O
processo de troca de energia pela luz absorvida no atenuado, mas ocorre na forma de mltiplas
unidades de energia chamadas quantum. O quantum (hen) caracterstico para cada espcie absorvida.
Para ser absorvido por uma molcula, o fton de energia deve corresponder precisamente diferena,
$E, entre os dois estados de energia.
O potencial energtico total de uma molcula, excluindo a energia do ncleo, pode ser considerado
como sendo a soma das energias eletrnicas, vibracional e rotacional. As energias eletrnicas esto
associadas com transies de eltrons no interior do tomo ou molcula. Esta somatria de energias
est representada na figura 5 como uma troca de orbitais.
Figura 5. Energia eletrnica
As energias vibracional e rotacional esto associadas com vibraes e rotaes moleculares. Na
figura 6, uma simples molcula diatmica ilustrada no movimento de compresso e alongamento
(vibrao). Na figura 7 est exemplificada uma rotao molecular.
Figura 6. Energia vibracional
Figura 7. Energia rotacional
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A diferena entre os estados de energia rotacional relativamente pequena, muito menor do que as
diferenas entre os estados de energia eletrnica. A diferena entre estados de energia vibracional
intermediria aos estados anteriores, conseqentemente:
Absores associadas a transies entre nveis de energia rotacional so geralmente encontradas
na parte de baixa energia ou alto comprimento de onda do espectro eletromagntico, ou seja,
regio do infravermelho afastado.
Absores associadas a transies entre nveis de energia eletrnica so encontradas na parte de
energia alta, baixo comprimento de onda, ou seja, regio de ultravioleta - visvel do espectro
eletromagntico.
Absores associadas a transies entre nveis de energia vibracional so encontradas entre os
dois anteriores, na regio do infravermelho.
Os vrios tipos de transies de energia no so independentes, mas esto interligados. Estados de
energia rotacional so sobre-posicionados nos estados vibracionais, e ambos esto sobre-posicionados
nos estados eletrnicos.
2.2.3. Espectro de absoro UV - Vis
A presena de insaturaes ou ligaes mltiplas so amplamente reconhecidas como um processo
caracterstico da absoro ultravioleta, enquanto o composto saturado for transparente.
Na teoria molecular de orbitais, os eltrons envolvidos na formao de ligaes simples como a
ligao C - H so chamados de eltrons sigma (%). Ligaes duplas como C = O envolvem eltrons
pi (&"). Na regiao do infravermelho prximo, as transies envolvendo eltrons pi proporcionam
uma melhor observao das bandas de absoro. Eltrons no ligados na molcula, contidos em
tomos como oxignio ou nitrognio so chamados de eltrons n, e as interaes entre eltrons pi e
n so responsveis por um grande nmero de bandas de absoro ultravioleta caractersticas.
Um cromforo um grupo no qual, quando introduzido um hidrocarboneto saturado, produz um
composto o qual possui uma banda de absoro entre 180 e 1000nm. Por exemplo, n-octano um
hidrocarboneto saturado o qual transparente nesta regio, entretanto, se um grupo nitrila
introduzido no radical octil, o composto octil-nitrila produzido. O grupo nitrila classificado
como um cromforo e apresentaria sinais de absoro de luz na faixa no ultravioleta.
A tabela 2 ilustra um pequeno grupo de simples cromforos com seus comprimentos de onda
mximos e absortividade molar. A absortividade molar a medida de intensidade da banda de
absoro. Como se pode observar, a intensidade de absoro de diversos cromforos varia
acentuadamente de um grupo para outro. Entretanto, todos os membros de uma classe normalmente
possuem bandas de absoro de igual intensidade e ocorrem em um faixa espectral relativamente
estreita. Por exemplo, os dados mostrados para o cido actico so tpicos de cidos carboxlicos
saturados provenientes de cido frmico para cido esterico, C1 a C18, todos possuem bandas de
absoro na regio de 204 a 210nm e absortividades molares de 40 a 75.
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Tabela 2. Grupo de cromforos
Se um ou mais cromforos ocorrem em uma molcula, suas posies relativas determinam o efeito
produzido no espectro. O 1-hexano possui uma absortividade molar de 10000 em 180nm e 1,5-
hexadieno possui uma absortividade molar de 20000 no mesmo comprimento de onda. O 2,4-
hexadieno, com banda em outra regio, possui uma absortividade molar de 25500 em 227nm.
A posio e a intensidade da banda de absoro do 1,5-hexadieno so aproximadamente o que ns
podemos esperar de duas molculas individuais de propileno. Obviamente, os dois grupos de
cromforos esto amplamente espaados e no interagem. Entretanto, quando os dois cromforos
esto conjugados como no 2,4-hexadieno, o efeito no o esperado de duas molculas individuais.
Observaes similares de um grande nmero de compostos tm realizado a argumentao bsica
para algumas regras gerais:
Quando dois cromforos em uma mesma molcula esto separados por mais de um tomo de
carbono, o espectro de absoro uma somatria simples do espectro de cada um dos depois
cromforos.
Quando dois cromforos em uma mesma molcula esto adjacentes, o mximo de absoro
encontrado em altos comprimentos de onda e a intensidade incrementada.
Quando dois cromforos em uma mesma molcula esto ligados a um mesmo tomo de carbono,
o resultado intermedirio entre os vistos anteriormente.
Na espectrofotometria de ultravioleta-visvel, os compostos mais interessantes so usualmente os
que possuem mais de um cromforo, especialmente quando os cromforos so conjugados (sistemas
conjugados).
Os compostos com no mnimo dois cromforos conjugados apresentam uma absoro na faixa do
visvel. Carboidratos saturados, gorduras, leos, teres simples, cidos, a maioria dos carboidratos e
protenas no absorvem luz na faixa visvel, j que suas estruturas no apresentam cromforos.
Molculas com o mesmo cromforo e com estrutura eletrnica similar apresentam espectros de
absoro parecidos.
A presena de vrios grupos cromforos vizinhos modifica o carter do espectro de absoro
molecular. As possveis resultantes podem ser divididas em 4 grupos:
Efeito Batocromo. Deslocamento das bandas de absoro em direo faixa vermelha do
espectro, ocasionando uma intensificao da colorao.
Efeito Hipsocromo. Deslocamento das bandas de absoro em direo faixa violeta do espectro
(de comprimento de onda menor).
Efeito Hipercromo. Aumento da intensidade das bandas de absoro.
Efeito Hipocromo. Diminuio da intensidade das bandas de absoro.
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Os auxocromos so grupos nos quais, quando introduzidos em um sistema como cromforo,
incrementam o comprimento de onda da banda de absoro mxima, que , o efeito batocromo. Os
auxocromos no possuem banda de absoro prpria em baixos comprimentos de onda. Por exemplo,
o grupo hidroxil um auxocromo. lcoois so transparentes e utilizados como solventes em baixos
comprimentos de onda, entretanto, se um grupo Hidroxil introduzido em um sistema contendo
um cromforo, isto causar um efeito batocromo. Os auxocromos tpicos so os grupos de amina e
seus derivados substitudos, halogneos, grupo alcalino, e outros.
2.2.4. Efeito de solventes
As anlises espectrofotomtricas na regio do UV so realizadas geralmente em solues.
Habitualmente, trabalha-se em baixas concentraes do analito de interesse, e os solventes utilizados
necessitam de um alto grau de pureza, j que devido a sua alta concentrao em relao ao analito,
suas impurezas podem provocar distores nos resultados. Alm disso, os solventes para a
espectrofotometria UV devem possuir um alto grau de estabilidade ptica, no sendo aconselhvel
utilizao de solventes de grau de pureza comercial, que dificilmente preenchem os requisitos
acima mencionados.
Os solventes mais usados na espectrofotometria de UV que devem ser elaborados especificamente para
este fim, so os carboidratos saturados, como n-hexano, cujas absores eletrnicas provocadas pelas
transies dos eltrons se do fora da faixa a ser analisada, tambm so utilizados solventes com
heterotomos, por exemplo, H3-COH-, que, devido s transies eletrnicas, s apresentam fracas bandas
de absoro. Deve-se tambm enfocar este problema partindo-se do grau de polaridade do solvente.
As bandas de absoro de muitas substncias so mais claras e podem mostrar estruturas finas
quando a medio se d em solventes de baixo momento bipolar. As interaes solvente soluto
so muito mais fortes quando esto envolvidas fortes foras bipolares.
A figura 8 mostra dois espectros realizados com fenol em iso-octano e etanol, onde se pode observar
a influncia do solvente orgnico na determinao de substncias.
Figura 8. Fenol em iso-octano (____ ) e etanol (-------)
Uma diferena de pH tambm pode provocar variaes, neste caso de deslocamento de comprimento
de onda.
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2.3. Descrio bsica do sistema
O sistema, figura 9, que compreende um espectrofotmetro de UV-VIS constitudo por:
1. Fonte de luz
2. Monocromador
3. Compartimento de amostra
4. Detetor
5. Sistema de leitura
Figura 9. Espectrofotmetro de UV-Vis
2.3.1. Fontes de radiao
A espectrofotometria de UV-Vis requer fontes capazes de produzir radiao contnua naquelas
regies espectrais de interesse. As fontes de energia radiante consistem de matria que podem ser
excitados por meio de aquecimento eltrico ou descarga de alta voltagem. No retorno aos nveis
energticos, os materiais excitados emitem ftons com energias correspondentes s diferenas entre
as energias dos estados excitados e as energias dos estados fundamentais. Alguns materiais apresentam
nveis energticos to numerosos e prximos que as freqncias emitidas formam uma faixa de
radiao contnua relativamente ampla.
As fontes de radiao utilizadas na construo de aparelhos para a prtica da espectrofotometria
UV-Vis devem preencher certos requisitos:
A fonte deve fornecer feixe com suficiente potncia radiante para permitir a deteco por meios
adequados.
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A fonte deve gerar uma radiao contnua, isto , contendo todos os comprimentos de onda,
dentro da regio espectral que o equipamento ir trabalhar.
A fonte deve ser estvel, ou seja, a potncia do feixe luminoso gerado deve permanecer constante
enquanto so realizadas as determinaes. Em instrumentos de feixe simples, esta condio
essencial para que as medidas da absorbncia possam ser reprodutveis. Nos instrumentos de
duplo feixe, estes so medidos simultaneamente, ento, uma alta estabilidade da fonte no to
crtica.
A fonte mais satisfatria para a obteno de radiao contnua na regio visvel a lmpada de
filamento incandescente de tungstnio com invlucro de vidro. O filamento opera a 2600-3000K,
fornecendo radiao contnua de 350 a 2500nm. A energia emitida na regio visvel varia
aproximadamente com a quarta potncia da voltagem de operao; portanto, a fonte requer um
rigoroso controle de voltagem para gerar radiao ou reguladores de voltagem eletrnicos.
As fontes de radiao ultravioleta mais usadas so as lmpadas de descarga de hidrognio ou deutrio
com janela de quartzo. O hidrognio baixa presso e submetido descarga eltrica produz um
feixe contnuo na regio do ultravioleta. A lmpada de deutrio produz um espectro contnuo de
180 a 380 nm.
As lmpadas de xennio de alta freqncia trabalham produzindo pulsos de radiao que realizam
a cobertura do espectro de 180 a 1100nm.
2.3.2. Monocromador (ptica)
Os monocromadores so dispositivos construdos a base de redes de difrao, que dispersam a
radiao complexa em seus comprimentos de onda componentes, e ento, isolam a faixa espectral
desejada. Os monocromadores permitem isolar vontade faixas de comprimentos de onda,
espectralmente puras e muito estreitas, ao longo das regies ultravioleta, visvel e infravermelho
prximas.
O desempenho fotomtrico de um espectrofotmetro esta diretamente ligado a qualidade do
monocromador (sistema ptico ).
A configurao do monocromador deve proporcionar uma alta resoluo do comprimento de onda
analisado da amostra e ao mesmo tempo, uma maior quantidade de luz transmitida e baixa quantidade
de luz espria ( quantidade de luz que no foi devidamente isolada pelo sistema ptico).
A configurao do sistema ptico tem que permitir:
Alta eficincia de transferncia entre a fonte de luz e o monocromador.
Adequada fenda de sada do monocromador para evitar a perda excessiva de luminosidade.
Maior focalizao do feixe da fonte de luz na amostra.
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Na figura 10, abaixo, a ilustrao de um monocromador normalmente utilizado na confeco de
espectrofotmetros de UV-Vis.
Figura 10. Monocromador Czerny Turner
Alm desta configurao, existem outras tambm usuais como: Littrow, Ebert e Concave Grating.
Estas configuraes de monocromadores podero estar presentes nos seguintes tipos de
espectrofotmetros de UV-VIS:
Espectrofotmetros UV-VIS de Simples Feixe
Espectrofotmetros UV-VIS de Arranjo de Diodos
Espectrofotmetros UV-VIS de Duplo Feixe
2.3.2.1. Simples feixe
Neste tipo de espectrofotmetro, a disperso do feixe de luz do monocromador totalmente
focalizada no compartimento da amostra e, conseqentemente, a luz no absorvida direcionada ao
sistema de deteco composto por um detector ; normalmente do tipo fotodiodo.
A construo de instrumentos de feixe simples requer componentes estveis de alta qualidade no
tocante preciso. Os espectrofotmetros de leitura direta operam com preciso moderada, em
torno de +/- 1% em transmitncia; so instrumentos relativamente baratos, de operao simples e
rpida e de fcil manuteno. O instrumento de feixe simples necessita incorporar um circuito de
zero para a medida de transmitncia, com a finalidade de melhorar a preciso de trabalho.
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2.3.2.2. Arranjo de diodos
Este tipo de espectrofotmetro possui uma configurao simples de monocromador, figura 11,
utilizando apenas uma grade de difrao e um sistema de deteco composto por vrios fotodiodos;
um feixe de luz policromtico inicialmente incide no compartimento de amostra e logo depois, a luz
transmitida direcionada ao monocromador, que aps a disperso da luz incide no sistema de deteco.
Figura 11. Monocromador policromtico
2.3.2.3. Duplo feixe
Os espectrofotmetros de feixe duplo partem a radiao original no espao (por meio de um espelho)
ou no tempo (por meio de um espelho setorial rotativo). Este tipo de espectrofotmetro
normalmente empregado para anlises que necessitam de maior preciso analtica. O feixe de luz
disperso no monocromador (figura 12) sincronizado por um dispositivo ptico, que far com que
o feixe incida ora em um compartimento da amostra (tambm chamado de feixe analtico), ora em
outro compartimento de referncia (tambm chamado de feixe de referncia ). A luz transmitida em
ambos os compartimentos sincronizada novamente ao sistema de deteco; com isto, poderemos
eliminar interferncias como: oscilaes da fonte de energia, variaes de tenso eltrica; bem como,
do prprio solvente utilizado no preparo da amostra.
Desta maneira, flutuaes na potncia da fonte, resposta do detector e ganho do amplificador so
compensados pela observao da diferena entre os sinais. Os espectrofotmetros de duplo feixe
so mecnica e eletronicamente mais complicados do que os de feixe simples e, conseqentemente,
de construo e manuteno mais caras.
Figura 12. Monocromador de duplo feixe
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2.3.3. Compartimento de amostras
O compartimento de amostras de espectrofotmetro UV-Vis possui uma grande variedade de
conexes e acessrios que permitem uma ampliao nas aplicaes possveis do instrumento. O
compartimento de amostras bsico vem equipado com suporte de amostra retangular para cubeta
de quartzo de 10mm. De acordo com a aplicao, possvel introduzir suportes de amostras para
cubetas de tamanhos variveis para cubetas de 1 a 100mm de comprimento.
2.3.3.1. Acoplador de fibra ptica
Em muitas situaes, utiliza-se o espectrofotmetro para medida de solues do modo clssico,
atravs de cubetas, mas existem amostras que apresentam uma grande dificuldade de anlise em
funo de seu tipo ou tamanho. Para facilitar a anlise destas amostras, pode-se utilizar um sistema
acoplador de fibra ptica onde alguns benefcios so obtidos:
Previne a manipulao de amostras, as quais possuam alta temperatura e/ou presso, ou
apresentam nveis de radiao.
Realiza medidas em amostras muito pequenas, como cristal, ou amostras muito grandes como
janelas de estruturas metlicas, as quais so impossveis de serem feitas em configuraes normais
de instrumentos.
Monitoramento em processos qumicos.
Determinaes em sistemas fechados (reatores).
Uma srie de sensores de fibra ptica so possveis de serem utilizados para atingir os objetivos
acima, como sensores de reflectncia, absorbncia, transmitncia em vidros, e fluorescncia.
2.3.3.2. Sipper
Um sistema composto por bomba peristltica pode ser utilizado para bombear a soluo da amostra
para uma cubeta de fluxo, sem a necessidade de transferncia manual da amostra para a cubeta,
diminuindo assim, a manipulao da amostra. Estas cubetas de fluxo podem estar posicionadas em
suportes especais que podem realizar o aquecimento da amostra.
2.3.3.3. Suporte para amostras slidas
Este tipo de suporte tem por objetivo permitir a realizao de obteno de resultados analticos em
amostras slidas que possuam transparncia, como vidros, plsticos e lentes. De fcil conexo ao
instrumento, este suporte pode possuir tambm uma verso na qual a amostra transparente caminha
em frente ao feixe ptico com a finalidade de obter-se um perfil de homogeneidade da amostra.
Um dispositivo rotatrio pode ser utilizado para verificar o comportamento desta mesma amostra
slida e transparente, mas com ngulos distintos de radiao incidentes.
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2.3.3.4. Acessrios de reflectncia
Amostras slidas que no sejam transparentes pode ser analisadas e o perfil (espectro de reflectncia)
da amostra pode ser obtido. Existem diversos tipos de acessrios de reflectncias disponveis e que
podem ser acoplados aos espectrofotmetros, como por exemplo: reflectncia especular, reflectncia
difusa, reflectncia temperatura e presso controladas, reflectncia de ps e cremes e comparao
de colorao de amostras slidas.
2.3.4. Aquisio de dados
Os dispositivos fotossensveis usados nos instrumentos para a medida da transmitncia convertem
a energia radiante em um sinal eltrico. Os detectores fotossensveis devem responder energia
radiante em uma faixa espectral ampla. Eles devem ser sensveis a baixos nveis de iluminao e
responder rapidamente radiao incidente. essencial que o sinal eltrico produzido seja diretamente
proporcional potncia do feixe incidente, isto ,
R = kP + k
Em que R a resposta eltrica do detector em unidades de corrente, resistncia ou f.e.m. A constante
k uma medida da sensibilidade do detector em termos da resposta eltrica por unidade de potncia
radiante. Certos detectores acusam uma pequena reposta k, chamada corrente escura, mesmo quando
no esto recebendo radiao incidente. Os detectores de energia radiante usados atualmente na
construo de instrumentos de medida so fotodiodos ou fotomultiplicadoras.
Os sinais detectados pela fotomultiplicadora ou fotodiodos aps amplificados, geram um grfico de
comprimento de onda por intensidade de transmitncia ou absorbncia, chamado de espectro de
ultravioleta-visvel. Com este espectro possvel sua identificao comparando-se a um espectro de
uma substncia padro ou a obteno da quantificao, fixando-se um comprimento de onda e
obtendo o respectivo valor de transmitncia ou absorbncia. Este valor ser proporcional
concentrao do componente presente na amostra e fazendo-se uso de um padro de concentrao
conhecida, determinada sua concentrao real.
2.4. Requisitos mnimos de instalao e operao
Para garantir a obteno de resultados confiveis e estar em conformidade com os requerimentos
da Qualificao de Instalao (IQ), necessrio que os requisitos de instalao e operao sejam
cumpridos; neste caso, podemos citar o seguinte:
Rede eltrica: que atenda as especificaes do fabricante, com ateno especial na estabilizao
da rede eltrica.
Instrumento localizado em condies devidas de umidade e temperatura.
Conhecimento operacional do instrumento para utiliz-lo corretamente.
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2.5. Cuidados bsicos
Os cuidados a serem tomados com relao ao instrumento para preservar a vida til e desempenho
do mesmo esto relacionados a dois grupos de atividades que so: atividades a serem executadas
pelo usurio e atividades referentes a manuteno preventiva normalmente executadas pelo fabricante.
Estaremos abordando nesta seo as atividades a serem exercidas pelo usurio, sendo que as atividades
a serem exercidas pelo fabricante esto descritas na seo verificao de desempenho.
As atividades que so realizadas no dia a dia pelo usurio so de fundamental importncia para a
atenuao de danos que podem ser causados ao instrumento. Estas atividades normalmente so
simples e podem ser resumidas em:
Limpeza externa do instrumento.
Limpeza do compartimento de amostras.
Lavagem das cubetas.
Consultar os manuais / fornecedor do instrumento para eliminar dvidas de operao /
manuteno.
Limpeza das janelas de quarto que fazem a interface dos feixes de luz com o compartimento de
amostras.
A utilizao de material de segurana durante o manuseio de amostras no instrumento essencial
para a segurana do operador. O material de proteo individual necessrio composto por:
avental e segurana, luva cirrgica, e culos de proteo com viso ampla.
O instrumento deve possuir itens de consumo, para que, se necessrio o prprio operador possa
executar atividades como troca de lmpadas. Os principais itens de consumo necessrios para estarem
junto ao instrumento so:
Lmpadas de deutrio e tungstnio, ou lmpada de xennio.
Cubeta de quartzo.
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3. CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA (GC)
3.1. Introduo
Cromatografia em fase gasosa uma tcnica analtica utilizada para separar mistura de substncias
qumicas. O objetivo da tcnica obter uma separao que ajude a identificar e quantificar as
substncias presentes na mistura.
Como principal elemento utilizado na tcnica de cromatografia em fase gasosa (GC), as primeiras
colunas cromatogrficas utilizadas eram constitudas de um empacotamento em um tubo de
comprimento tpico entre 1 a 5 m, e de dimetro de 2 a 4 mm. Com o avano da instrumentao
analtica, atualmente utiliza-se tubos abertos de slica fundida (capilares) com comprimentos variados
entre 10 a 100 m, e dimetros internos entre 0,1 a 0,8 mm , proporcionando melhores resultados.
3.2. Princpio da tcnica
A amostra introduzida no sistema atravs de uma seringa ou uma vlvula de injeo. Esta amostra
volatilizada, logo aps a sua introduo no sistema de cromatografia e dissolvida em um gs de
arraste inerte (fase mvel). Dissolvida no gs, esta amostra ser arrastada at a coluna cromatogrfica,
que contm uma fase lquida ou slida como fase estacionria, ocorrendo a separao dos compostos
nesta coluna. A separao ocorre porque os componentes da amostra tm diferentes afinidades
com a fase estacionria, resultando em diferentes velocidades de eluio dos componentes pela
coluna, ou seja, quanto maior a afinidade do componente pela fase estacionria, mais lentamente ele
caminha pela coluna e vice-versa.
Figura 1. Esquema bsico de um processo de separao cromatogrfica
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Aps os componentes da amostra serem separados, chegam ao detector, que gera um sinal eltrico,
atravs de um fenmeno fsico-qumico ( como p.ex., diferena de condutividade trmica, ionizao
atravs de uma chama). Estes detectores podem ser seletivos para um grupo qumico determinado
(p.ex. organo-clorados), podendo ser mais sensveis para a anlise dos mesmos. Este sinal amplificado,
pois geralmente est em uma intensidade muito baixa, e transmitido para uma estao de dados, onde
se visualiza este sinal em um grfico de intensidade de sinal em funo de tempo. Este grfico
denominado cromatograma. O sinal proporcional concentrao ou massa de cada composto,
sendo que pode haver respostas diferentes de composto para composto (nem sempre o composto que
tem mais quantidade gera o maior sinal). Da a possibilidade de se quantificar a amostra.
O GC permite a anlise de diversos tipos de substncias, desde alguns gases inorgnicos como O
2
,
CO, CO
2
, NO
2
e etc, como tambm milhares de substncias orgnicas de diversos grupos funcionais,
como p.ex., lcoois, cetonas, aminas, aromticos e outros. Com o uso de detectores altamente seletivos,
possvel determinar quantidades muito pequenas dos componentes em questo na amostra, como
p.ex., na ordem de picogramas (nvel de traos), como tambm pode se determinar em quantidades
maiores, como p.ex., na ordem de porcentagem.
3.3. Descrio bsica do sistema
Os mdulos que constituem um sistema bsico so os seguintes:
1. Sistema de gases: Os gases mais utilizados como fase mvel (gs de arraste) so o hlio, o
hidrognio, o argnio e o nitrognio. Outros gases podem ser utilizados. O uso de gases auxiliares
se faz necessrio, dependendo do detector a ser utilizado.
2. Controladores de fluxo e de presso: So utilizados para manter a uniformidade da vazo da
fase mvel. Alm disso, so utilizados tambm para medir a razo de diviso da amostra (splitter),
quando do uso dos injetores para colunas capilares e tambm para o controle de vazo dos gases
auxiliares dos detectores.
3. Injetores: Local onde a amostra efetivamente introduzida no sistema. Os injetores podem
ser para colunas empacotadas ou para colunas capilares, sendo que existem diferentes tcnicas
para o seu uso (on-column, flash vaporization, split, splitiless, etc). Tambm pode ser feito o uso
de vlvulas de amostragem, principalmente para gases. A automao pode ser utilizada para
aumentar a produtividade e reprodutibilidade.
4. Colunas: Nelas ocorre a separao das substncias presentes na amostra. Podem ser
confeccionadas em vidro, ao inox, nquel, teflon ou slica fundida e podem ser empacotadas ou
capilares. As capilares proporcionam melhores separaes.
5. Detectores: So dispositivos que monitoram a sada da substncia eluda da coluna, gerando
um sinal eltrico proporcional massa ou concentrao desta substncia. Podem ser universais
ou seletivos. Estes detectores esto ligados a amplificadores de sinal, chamados eletrmetros, os
quais amplificam o sinal e o transmitem para os dispositivos de sada de dados.
6. Sistema de aquisio e processamento de dados: Local onde se faz a aquisio dos dados
gerados no cromatgrafo, executa os clculos necessrios para a quantificao das substncias e
gera-se o cromatograma. Podem ser integradores ou softwares de integrao (PC).
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Figura 2. Sistema de cromatografia em fase gasosa (GC)
3.3.1. Gases utilizados
Existem duas classes de gases que podem ser utilizados no sistema cromatogrfico: os gases de
arraste (fase mvel) e os gases auxiliares.
Como gs de arraste, os mais utilizados so o nitrognio, argnio, hidrognio e o hlio. O gs mais
indicado o hlio, pois apresenta melhor desempenho cromatogrfico que os outros gases, porm
alguns fatores so decisivos na escolha do gs de arraste como:
Compatibilidade com o detector: necessrio analisar se o gs de arraste compatvel com o
detector e este pode causar perda de sensibilidade ou rudo excessivo. P.ex., para a anlise de gs
Hidrognio no TCD, o Nitrognio e o Argnio conferem maior sensibilidade do que o Hlio,
pois a diferena de condutividade trmica entre os dois primeiros e o Hidrognio maior que a
diferena de condutividade trmica entre o Hidrognio e o Hlio;
Custo;
Disponibilidade;
Desempenho;
Pureza: Deve-se respeitar a pureza dos gases, dependendo da aplicao. Os manuais dos
fabricantes contm as informaes necessrias.
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3.3.2. Controladores de fluxo e presso
O fluxo ou a presso do gs de arraste um parmetro importante que depende do dimetro e do
comprimento da coluna. Deve ser controlado durante a anlise. Para este controle so utilizadas
vlvulas controladoras de fluxo ou presso. O ajuste deste parmetro pode ser feito manualmente,
com o auxlio de um medidor de fluxo ou um bolhmetro, ou eletronicamente, atravs de software,
cujo objetivo obter a melhor eficincia cromatogrfica.
Para os gases auxiliares necessrio fazer o controle, pois o ajuste do fluxo fundamental para
atingir o melhor desempenho.
3.3.3. Injetores
A funo bsica de um injetor introduzir a amostra no sistema cromatogrfico. No injetor a
amostra entra em contato com o gs de arraste e se dissolve no mesmo. Para isso, no caso de
amostras lquidas, necessrio que o injetor esteja aquecido, tal qual que, garanta a total volatilizao
da amostra.
Existem dois tipos de classes de injetores, os injetores para colunas empacotadas e os injetores para
colunas capilares. Para amostras gasosas, a injeo pode ser feita com o auxlio de uma vlvula de
amostragem de gs, que pode ter ou no, um injetor em srie com a vlvula.
Para cada classe de injetores, existem opes dependendo da aplicao.
3.3.3.1. Injetores empacotados
So utilizados, como o nome diz, com colunas empacotadas. Podem ser utilizados para colunas
capilares do tipo megabore (com dimetro interno de coluna > 0,53 mm). Toda a amostra injetada
diretamente na cabea da coluna cromatogrfica. Com isso eliminada toda e qualquer perda da
amostra na transferncia para a coluna. o injetor indicado para amostras limpas, diludas e com
grande variao de volatilidade dos compostos presentes.
Figura 3. Injetor empacotado
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3.3.3.2. Injetores capilares
So injetores desenhados para o uso de colunas capilares. Os principais injetores so:
Injetor Split/Splitless: So os injetores mais utilizados. Permitem que se faa uma diviso da
amostra, a fim de que se possa trabalhar com as colunas capilares, pois estas tm uma capacidade
de receber uma pequena quantidade de amostra. Existem dois modos de operao:
Modo split A amostra injetada dividida entre a coluna e a sada para descarte do injetor
(vent). A vlvula que executa esta diviso chamada de splitter e utilizada para amostras
concentradas (em nvel de mg/mL).
Modo splitless Utilizado para amostras diludas. Neste caso, o splitter permanecer fechado durante
a transferncia do soluto para a coluna, aps isso o splitter aberto para o descarte do solvente.
Figura 4. Injetor split/splitless
Injetor on-column e/ou com temperatura programvel: Permite dois modos de operao:
Injeo on-column - Para amostras com larga faixa de peso molecular, eliminando o efeito de
discriminao de massa.
Injeo on-column com temperatura programvel Para amostras termolbeis, com baixa
temperatura de ebulio ou com baixas concentraes. Conhecido no mercado como Injetor
PTV ou SPI.
Figura 5. Injetor com temperatura programvel
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3.3.4. Colunas
A coluna a principal parte do sistema cromatogrfico, pois nela que ocorre a separao dos
componentes presentes na amostra, pois atravs das diferentes afinidades das substncias com a
fase estacionria, migrando com velocidades diferentes pela coluna. Podem ser classificadas em
dois grupos:
Colunas empacotadas: So as colunas mais antigas de cromatografia. Geralmente so fabricadas
em tubos de ao inox ou vidro, podendo ser empregados outros materiais na sua confeco. Na
parte interna deste tubo recebe um recheio que pode ser um adsorvente ou um suporte slido
impregnado com um filme de uma substncia que tenha baixa presso de vapor. Hoje em dia,
so pouco utilizadas, devido ao menor desempenho em relao s colunas capilares, sendo mais
utilizadas em anlise de gases inorgnicos.
Colunas Capilares: So as colunas mais utilizadas atualmente. So geralmente fabricadas em tubos
de slica fundida, recobertos de um filme de poliamida na parte externa do tubo, o que d grande
flexibilidade coluna. A fase estacionria depositada na parede interna, podendo ser um filme, ou
um adsorvente slido. Este tipo de coluna tem grande capacidade de separao e grande variedade
de substncias que se podem separar por cada tipo de coluna. A escolha da fase determina a
seletividade da coluna. Centenas de fases estacionrias esto disponveis no mercado, as quais tm
diversos nomes no mercado. Geralmente so escolhidas de acordo com a polaridade das substncias
que se ir analisar. Fases estacionrias polares geralmente so mais reativas, sendo assim com
temperatura limite de trabalho menor que as apolares.
Figura 6. Tipos de colunas capilares
Para escolher a coluna mais adequada, deve-se analisar os seguintes parmetros:
Comprimento e dimetro interno das colunas;
Espessura do filme (capilar);
Fase estacionria lquida;
Suportes Slidos;
Fases Estacionrias Slidas.
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3.3.4.1. Forno de colunas
O forno o local onde fica armazenada a coluna cromatogrfica. Para cada tipo de anlise deve-se
estabelecer uma temperatura de trabalho do forno ao qual os componentes de interesse de uma
amostra apaream separados e com eluio num menor tempo possvel.
Um bom forno tem preciso de medida e grande variedade de programao de rampa. A utilizao
de criogenia possibilita a anlise de compostos mais volteis.
3.3.5. Detectores
Existem diversos tipos de detectores, os universais (Condutividade Trmica (TCD), Espectrometria
de Massas (MS)), e os considerados seletivos ou at especficos (Ionizao de Chama (FID), Captura
de Eltrons (ECD), Termo-inico (TSD) ou Nitrognio-Fsforo (NPD), Fotomtrico de chama
(FPD ou PFPD)) e outros.
Tabela 1. Tipos de detetores e sua utilizao
Sero apenas abordados os mais utilizados em cromatografia em fase gasosa (GC).
3.3.5.1. Detector de ionizao de chama (FID)
Este detector o mais utilizado, apresentando simplicidade operacional, alta sensibilidade, e
incomparvel linearidade. O desenho abaixo apresenta um esquema do detector FID.
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Figura 7. Detector FID
A operao do detector envolve uma mistura de gases, ar e hidrognio formando uma chama com
temperatura a cerca de 2000C, onde a amostra queimada. Um par de eletrodos fica nas proximidades
da chama coletando sinal gerado pela formao de espcies ionizadas e eltrons oriundos da queima
de substncias na chama.
Este detector gera sinal para compostos que tenham carbono e hidrognio na molcula, com raras
excees como, por exemplo, CS
2
.
O detector deve trabalhar aquecido at uma temperatura aproximada de 400 C , porm a temperatura
escolhida deve garantir que no haja condensao das substncias eludas da coluna.
Concentraes tpicas a serem analisadas abrange a faixa de baixos valores (ppb) at altos valores
(%).
3.3.5.2. Detector de nitrognio e fsforo (NPD) ou termo-inico especfico (TSD)
O detector tem resposta seletiva para compostos contendo tomos de nitrognio ou fsforo,
possuindo internamente um sal de rubdio incorporado em uma prola refratria submetida
passagem de gases ar e hidrognio, e a prola quando aquecida eletricamente produz um plasma
gasoso temperatura de 600 a 900C.
A formao deste plasma suficiente para que substncias contendo N e P dem resposta ao
detector.
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Figura 8. Detector TSD ou NPD
3.3.5.3. Detector de captura de eltrons ECD
Este detector sensvel a molculas que apresentam tomos com muita afinidade eletrnica e possui
no seu interior uma fonte radioativa comumente de
63
Ni a qual um emissor de partculas beta.
Estas partculas causam ionizao do gs de arraste , normalmente nitrognio , e produz uma nuvem
de eltrons dentro da clula do ECD. Os eltrons produzem uma corrente de background estvel
atravs dos eletrodos da clula do ECD. Este sinal amplificado pelo eletrmetro do detector .
Quando uma espcie absorvente de eltrons passa pela clula , h uma diminuio de corrente, pois
os eltrons so capturados pela espcie absorvente , diminuindo o nmero de eltrons na clula.
Figura 9. Detector ECD
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3.3.6. Aquisio e processamento de dados
A aquisio e processamento de dados foram tratados no item 4.6 da tcnica de HPLC.
3.4. Requisitos mnimos de instalao e operao
Para garantir a obteno de resultados confiveis e reprodutivos e estar em conformidade com os
requerimentos de Qualificao de Instalao (IQ), necessrio que se verifique as condies que se
tem no local para executar a instalao. Para isso podemos citar as seguintes condies:
Rede eltrica: necessrio verificar se a rede eltrica possui a voltagem apropriada para a
especificao do equipamento. A estabilizao da rede e a posio dos pinos da tomada (fase
invertida) devem ter ateno especial, pois ambas podem influir na operao e vida til do
equipamento.
Condies ambientais: O instrumento deve ser instalado somente se no local houver condies
devidas de Umidade e Temperatura para o seu funcionamento. Alm disso, condies de segurana
devem ser observadas como a proximidade de agentes inflamveis e corrosivos.
Pureza dos Gases: Devem estar de acordo com as necessidades do sistema cromatogrfico,
principalmente em relao aos detectores.
Filtro de Gases: Devem ser utilizados para garantir a qualidade dos gases utilizados e das linhas
de gases do sistema. Devem ser trocados periodicamente.
Reguladores de Presso: Devem garantir as presses mnimas de trabalho especificadas do
equipamento. Tambm devem ter dispositivos de segurana como duplo estgio e diafragmas
metlicos.
Conhecimento operacional do equipamento: Para a utilizao correta do equipamento.
Tabela 2. Pureza dos gases
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3.5. Cuidados bsicos
Para a garantia de bons resultados, so necessrios alguns cuidados com o GC, que geralmente so
procedimentos simples, porm importantes para o bom funcionamento do equipamento.
Um dos cuidados mais comuns o da troca do septo do injetor, a qual deve ser feita tipicamente
entre 30 a 100 injees executadas dependendo da tcnica de injeo utilizada ( manual ou automtica).
O insersor de vidro do injetor tambm representa um item de grande importncia para o bom
desempenho do equipamento, desta forma sua substituio necessria e a freqncia deve ser
determinada em funo da aplicao e utilizao.
Outro cuidado importante se refere a utilizao das colunas, que devem ser condicionadas, e serem
submetidas a uma limpeza trmica sempre que necessria. Deve-se tomar cuidado para no aquecer
a coluna a uma temperatura acima do limite trmico da fase estacionria.
Quanto aos gases, alm dos cuidados de pureza conforme mencionado nos pr-requisitos,
importante realizar a substituio dos filtros de gases quando necessrio e tambm verificar
regularmente a presso no cilindro evitando sua utilizao at seu trmino, a fim de evitar uma
eventual contaminao causada pela entrada de ar ambiente por difuso.
Nos detectores, recomendada uma limpeza a cada seis meses ou sempre que houver queda de
desempenho. Os procedimentos desta limpeza esto descritos nos manuais de operao do
equipamento.
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4. CROMATOGRAFIA EM FASE LQUIDA (LC)
4.1. Introduo
A cromatografia lquida de alta eficincia ( HPLC) surgiu como a aplicao de cromatografia lquida
s teorias e instrumentaes desenvolvidas originalmente para a cromatografia gasosa.
A cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC) ocupa atualmente uma posio de destaque entre
os mtodos modernos de separao, pois considerada indispensvel, sendo a diferena entre a
cromatografia lquida e a cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC) a utilizao de fases
estacionrias com micropartculas (10, 5 ou 3mm) esfricas, de preferncia. Estas fases, por serem
muito menos permeveis, tornaram necessria a utilizao de bombas para a eluio da fase mvel.
4.2. Princpio da tcnica
A separao cromatogrfica baseia-se na migrao diferencial dos componentes de uma mistura,
que ocorre devido s diferenas entre duas fases imiscveis, a fase mvel e a fase estacionria, e no
alargamento de bandas, que dependente de processos fsicos e no da diferena de equilbrio.
Estas interaes podem ser realizadas por meio de interaes do tipo pontes de hidrognio, interaes
eletrostticas e hidrofbicas ou foras de Van der Waals, entre outras.
A migrao diferencial resulta da diferena de equilbrio dos analitos entre as duas fases imiscveis e
determinada pelos fatores que afetam este equilbrio: Composio da fase mvel, composio da
fase estacionria e temperatura da separao. Mudanas em qualquer um destes fatores levam a
alteraes na migrao diferencial.
A classificao da cromatografia lquida de acordo com a fase estacionria levou a uma grande
variedade de tipos. A primeira grande diviso feita foi cromatografia de adsoro e cromatografia de
partio, referindo-se s fases estacionrias slida e lquida, respectivamente. Levando-se em conta
a natureza das interaes e os fenmenos acima descritos, os modos de separao podem ser
classificados em: Cromatografia em fase reversa, em fase normal, por pareamento de ons ( troca
inica) e por excluso.
No caso das fases estacionrias serem lquidas, estas podem estar simplesmente adsorvidas sobre
um suporte slido ou imobilizadas sobre ele. No primeiro caso, a cromatografia referida como
cromatografia de partio.
A cromatografia de partio perdeu espao para a cromatografia de fases quimicamente ligadas,
devido maior estabilidade conferida por estas quando comparadas com as fases lquidas adsorvidas.
Estas fases, com suportes modificados, so consideradas parte por diferirem dos outros dois
modos em seu mecanismo de separao.
O grande desenvolvimento cromatogrfico obtido a partir das fases lquidas quimicamente ligadas
fez com que estas sejam as fases majoritariamente usadas em HPLC analtico.
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4.2.1. Modos de separao:
Existe sempre uma dependncia entre as interaes soluto-fase mvel, soluto-fase estacionria, e
fase mvel fase-estacionria. Desta forma, a escolha do modo de separao depende da escolha da
fase estacionria e da fase mvel, para cada classe de soluto.
Dois modos de reteno em cromatografia lquida foram propostos. O primeiro Scott e Kucera,
interao-solvente, e o segundo por Snyder, competio-solvente. Os dois modelos so equivalentes,
uma vez que ambos consideram que, em uma dada separao, a interao do soluto com a fase
estacionria permanece constante. Portanto, a reteno determinada pela composio da fase
mvel.
4.2.1.1. Cromatografia em fase normal
A fase estacionria mais polar que a fase mvel; o oposto ocorre em cromatografia no modo
reverso. Os solventes usados so geralmente uma mistura de solventes orgnicos sem a adio de
gua. As fases estacionrias so adsorventes orgnicos (slica, alumina) ou fases polares quimicamente
ligadas (ciano, diol, fenil, amino).
Os dois modelos de reteno, interao-solvente e competio-solvente tm sido usados com sucesso
para descrever o efeito da fase mvel em cromatografia lquida no modo normal. Independentemente
do modelo usado, a reteno em fase normal aumenta com o decrscimo da polaridade da fase
mvel.
A aplicao majoritria deste modo de cromatografia se d com molculas neutras, embora possa
ser utilizada tambm para a separao de molculas ionizveis ou inicas.
A ordem de eluio respeita a seguinte seqncia: molculas hidrofbicas (menos polares) so eludas
primeiro, ao passo que molculas hidroflicas (mais polares) so mais retidas.
Quando a dissoluo da amostra apresenta problemas em solventes polares, a injeo em fase reversa
dificultada, sendo recomendada a separao em fase normal.
O solvente para a eluio no modo normal selecionado escolhendo-se um solvente fraco e
misturando-o com um solvente forte para conseguir a fora desejada.
A presena de traos de gua na fase mvel a causa mais comum da pobre reprodutibilidade na
reteno, quando se trabalha com fase normal, especialmente quando se usa slica no-modificada
como fase estacionria. Este problema tem sido resolvido trabalhando-se com solventes anidros
com um volume conhecido de gua, metanol ou cido actico para desativar os grupos silanis mais
reativos da fase estacionria. Alm de melhorar a reprodutibilidade, melhora tambm o formato do
pico. O mesmo efeito pode ser obtido, adicionando-se trietilamina, essencial na separao de aminas
em slica gel.
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O uso de slicas quimicamente modificadas em eluio no modo normal tem sido preferido, uma
vez que elas oferecem stios de interao com o soluto, alm de uma superfcie mais homognea em
comparao com a slica gel, que tem uma variedade de grupos silanis de diferentes polaridades.
As fases quimicamente ligadas so teis para a cromatografia de compostos moderadamente polares.
Entretanto, estes solutos podem tambm ser eficientemente resolvidos no modo reverso de eluio,
e a escolha entre eluio no modo normal ou reverso , usualmente, mais dependente da matriz que
do soluto.
4.2.1.2. Cromatografia em fase reversa
Enquanto na cromatografia em fase normal a fase estacionria mais polar que a fase mvel, no
modo reverso a fase mvel mais polar que a fase estacionria. A cromatografia em fase reversa
mais utilizada em HPLC, uma vez que permite a separao de uma grande variedade de solutos e o
uso de fases mveis aquosas. A fase mvel mais comumente utilizada uma mistura de acetonitrila/
gua, sendo a acetonitrila, quando necessria, substituda por metanol ou tetrahidrofurano (THF).
O uso de apenas estes trs solventes deve-se pequena quantidade de solventes orgnicos miscveis
em gua. J no modo normal, h uma maior variedade de solventes disponveis.
O princpio da separao em fase reversa a hidrofobia e deve-se principalmente interaes entre
a parte no polar do soluto e a fase estacionria, isto , repulso desta parte do soluto pela fase
mvel aquosa.
importante ressaltar que a fora do solvente em fase reversa aumenta com o decrscimo da
polaridade do solvente. Assim, temos que a fora da gua (solvente mais fraco) menor que a do
metanol, acetonitrila, tetrahidrofurano e diclorometano, observada a ordem crescente (vide tabela
1). O diclorometano, por no ser solvel em gua, no usado em fase reversa, mas por ser um
solvente muito forte , s vezes, usado para limpar as colunas de fase reversa que tenham sido
contaminadas por solutos fortemente retidos.
Tabela 1. Comparao entre foras de diferentes fases-mveis
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A Acetonitrila, alm de poder ser usada em uma baixa faixa de absoro no ultravioleta, apresenta
solues aquosas com baixa viscosidade, o que desejvel. Deste modo, juntamente com metanol e
THF, estes so os solventes mais usados para controlar a seletividade e separao no modo reverso
de eluio.
Quando, por algum motivo, no se usa gua na fase mvel, e utiliza-se fases estacionrias apolares,
a cromatografia dita cromatografia no-aquosa de fase reversa. Ela s usada quando se trabalha
em solutos muito hidrofbicos, como lipdios e polmeros, e o solvente normalmente consiste em
uma mistura de solventes polares, como acetonitrila ou metanol (solvente A), com um solvente
mais fraco (B), como THF, clorofrmio, diclorometano, acetona, metil-t-butil ter. A reteno,
neste caso, tambm alterada pelo percentual do solvente B.
Existem outras modalidades de cromatografia de compostos inicos ou cromatografia de excluso
por tamanho (permeao e filtrao em gel, aplicadas a separaes de molculas por tamanho,
como por exemplo, polmeros, biopolmeros, protenas, peptdeos, etc) e por razo da pequena
aplicao em separaes de frmacos e medicamentos, no sero discutidas neste trabalho.
Outro aspecto importante envolvendo as separaes cromatogrficas em HPLC o modo de
separao: isocrtico ou gradiente. No modo isocrtico as condies de separao permanecem
inalteradas durante toda a corrida cromatogrfica, ficando restrita a uma nica composio de solvente.
No modo gradiente h uma variao na composio da fase mvel e/ou no fluxo durante a corrida
cromatogrfica.
Existem vrios parmetros importantes a serem considerados durante o desenvolvimento de um
mtodo cromatogrfico, como resoluo cromatogrfica, seletividade, fator de reteno, etc. Estes
parmetros so de extrema importncia no desenvolvimento, validao e utilizao de mtodos
cromatogrficos em HPLC.
4.3. Descrio bsica do sistema
Um sistema de HPLC basicamente composto por mdulos com funes especficas e
cuidadosamente projetados para proporcionar versatilidade, rapidez, reprodutibilidade e alta
sensibilidade s anlises a que se destina.
Os sistemas de HPLC, atualmente existentes no mercado, podem variar desde os mais simples,
onde as injees das amostras so feitas manualmente, at os mais complexos, com mdulo de
amostragem automtica e controlados por computadores com softwares capazes de controlar as
funes do sistema, adquirir, processar e imprimir os dados, mantendo-os de forma organizada
para futuras referncias.
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Para uma melhor compreenso de um sistema de HPLC, podemos divid-lo em seis mdulos principais:
1. Reservatrio da fase mvel
2. Sistema de bombeamento de solventes (Bomba)
3. Introduo da amostra (Injetor)
4. Compartimento para coluna
5. Sistema de deteco
6. Sistema de dados
4.3.1. Fase mvel
A fase mvel utiliizada em cromatografia lquida de extrema importncia para a obteno de uma
separao desejada, pois, tem contacto com o analito que esta sofrendo separao, bem como com
a coluna cromatografica e o sistema como um todo.
H uma grande variedade de solventes utilizados, no entanto, existem algumas propriedades desejveis
para seu uso em HPLC:
Alta pureza;
No decomposio do analito e da fase estacionria;
Compatibilidade com o sistema de deteco;
Baixa viscosidade;
Dissoluo da amostra;
Baixo custo.
Dentre os solventes utilizados para a cromatografia lquida, o que vem merecendo bastante ateno
quanto a suas caractersticas e pureza tem sido a gua, sendo desejvel a utilizao de gua ultrapura,
permitindo uma maior confiabilidade nos resultados. Sua resistividade uma excelente indicao de
qualidade sendo tipicamente 18.2 MO/cm a 25
o
C. Entretanto, os compostos orgnicos devem ser
Figura 1: Representao esquemtica de um sistema de HPLC:
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monitorados uma vez que podem interferir na sensibilidade dos detectores UV muito utilizados em
anlises por HPLC. Outro fator importante a utilizao desta gua sempre imediatamente, j que
o armanezamento da mesma modifica a condio de gua ultrapura.
4.3.2. Sistema de bombeamento de solventes
A principal funo da Bomba impulsionar a fase mvel atravs da coluna.
Como as colunas possuem recheio compactado, composto por partculas de dimetro muito pequeno,
da ordem de 3 a 10 um, elas oferecem uma grande resistncia a passagem da fase mvel, portanto,
o sistema de bombeamento dever ser capaz de ultrapassar esta barreira e proporcionar um fluxo
constante, reprodutivo e sem pulsaes.
A maioria das bombas utilizadas so do tipo reciprocantes, tambm chamadas de bombas de pisto
ou diafragma. Seu funcionamento baseia-se em um motor eltrico conectado a engrenagens que
movimentam um sistema de pistes.
Devido ao fato deste tipo de bomba produzir fluxos pulsantes, decorrentes do movimento de ida
e volta do (s) pisto (pistes), alguns recursos foram desenvolvidos para contornar este problema,
estes mecanismos so chamados de amortecedores de pulso.
As Bombas analticas atuais so projetadas para operar em altas presses e em taxas de fluxo que
variam entre 0,01 a 10mL/min. So normalmente construdas de material inerte como ao inoxidvel
nas cabeas de bombeamento, tubulaes e conexes, safira, quartzo, cermica ou titnio nos pistes,
rubi nas vlvulas de fluxo (check valves) e materiais inertes nos diversos selos de vedao existentes.
4.3.3. Introduo de amostra injetor
O injetor o mdulo no qual as amostras sero introduzidas no sistema de HPLC para que seja
realizada a separao na coluna.
O injetor pode ser manual, onde o usurio introduz a amostra com o auxlio de uma microseringa
de ponta reta, ou automtico, tambm chamado auto-injetor ou amostrador automtico o qual
capaz de injetar um grande nmero de amostras automaticamente e at mesmo realizar operaes
de diluio, derivatizao ou adio de reagentes.
4.3.3.1. Injetor manual
Os injetores manuais mais utilizados so basicamente do tipo vlvula, os quais possuem uma ala
de amostragem externa (loop), que nada mais do que tubulao de volume definido e preciso que
pode ser substituda para permitir a injeo de diferentes volumes de amostra.
A figura 2 mostra o diagrama esquemtico da vlvula. Os seis crculos menores representam os
orifcios internos da vlvula, enquanto que o crculo maior representa a porta de entrada da agulha
da seringa de injeo.
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Figura 2. Diagrama esquemtico de uma vlvula de injeo
A Vlvula possui duas posies: carregamento (LOAD) e injeo ( INJECT). Na posio LOAD ,o
fluxo da bomba desviado direto para a coluna (entra em 2 e sai em 3). Enquanto isto, a amostra
introduzida na ala de amostragem (LOOP) pelo orifcio da agulha, sendo o excesso imediatamente
descartado pela sada 6, ou seja, a preciso de injeo determinada pelo volume de amostra no
LOOP.
Na posio INJECT, a fase mvel agora segue atravs do LOOP arrastando a amostra para a coluna
(percurso 2-1-4-3).
4.3.3.2. Injetor automtico
Os injetores automticos so dispositivos amplamente utilizados em laboratrios que buscam alta
produtividade, pois trabalham de maneira no assistida alm de proporcionarem melhor
reprodutibilidade em relao aos injetores manuais. Alguns modelos possuem a capacidade de
termostatizar as amostras, aumentando a versatilidade do sistema cromatogrfico.
4.3.4. Colunas
4.3.4.1. Fases estacionrias base de slica
A slica sem dvida o material mais importante utilizado nas fases estacionrias para HPLC. um
material verstil, podendo ter sua superfcie modificada por derivao qumica, sendo que desta
forma pode dar origem a diversos materiais muito interessantes como fases estacionrias para
cromatografia lquida, pois possibilita o trabalho com diferentes mecanismos de separao.
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A slica uma forma amorfa, altamente porosa e parcialmente hidratada, preparada usualmente pela
hidrlise cida do silicato de sdio, seguida por emulsificao em uma mistura lcool/gua e
subseqente condensao, quando ento lavada e seca para o uso.
A superfcie da slica funo de suas condies de preparao, slicas com grande nmero de
silanis livres so mais cidas que as slicas com grupos hidroxilados ligados.
A slica bastante utilizada em cromatografia em fase normal , no sendo recomendada para o uso
em fase reversa.
4.3.4.2. Fases quimicamente modificadas
So as fases mais utilizadas na atualidade, pois sua aplicao a separaes de compostos polares foi
amplamente difundida devido dificuldade que se tinha com a utilizao das colunas base de
slica.
Com o advento das fases quimicamente ligadas, esta lacuna pode ser preenchida e atualmente pode-
se afirmar que aproximadamente 90% das separaes cromatogrficas sejam realizadas com a
utilizao destas fases, que possuem um mecanismo interessante de reteno de solutos por interaes
que no se baseiam apenas em polaridade.
A utilizao de grupos octadecil leva formao de fase octadecilsilano, conhecida como ODS ou
C
18
sendo que este grupo confere fase um carter apolar em relao slica no modificada.
A reteno nestas fases dependente da quantidade de carbono presente, geralmente expressa em
porcentagem. Desta porcentagem e da quantidade de silanis residuais depender a qualidade da
separao a que se aplica.
Esta derivao, por razes estricas, no atinge todos os grupos silanis. Os grupos restantes, em
alguns casos, ao interagir com o soluto, causam problema de cauda nos picos. Este problema pode
ser eliminado reagindo-se slica, aps a derivao, com trimetilclorosilano que, por ser menor, tem
acesso a alguns destes grupos, formando trimetilsilanos. Embora no seja possvel a derivao de
todos os grupos silanis, este processo chamado capeamento (end capping).
Algumas anlises requerem estabilidade de temperatura de coluna e, para isto, esto disponveis no
mercado dispositivos para este fim, e so conhecidos como forno ou compartimento de coluna.
4.3.5. Detectores
Detectores so os dispositivos transdutores que esto ligados logo aps a sada da coluna e so
responsveis por gerar os sinais eltricos proporcionais aos compostos que por ele passam. Vrios
tipos de detectores tm sido usados em HPLC dependendo das caractersticas fsicas ou fsico-
qumicas da amostra e da fase mvel. Um detector ideal deve possuir as seguintes caractersticas:
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Alta sensibilidade e baixo limite de deteco;
Resposta rpida a todos os solutos;
Insensibilidade a mudanas de temperatura e na vazo da fase mvel;
Resposta independente da fase mvel;
Pequena contribuio ao alargamento do pico pelo volume extra da clula do detector;
Resposta que aumente linearmente com a quantidade de soluto;
No destruio do soluto;
Segurana e convenincia para o uso;
Informao qualitativa do pico desejado;
Baixo custo.
Dificilmente todas estas caractersticas podem ser encontradas em um nico detector, portanto,
deve-se escolher o detector mais adequado amostra e que rena maior nmero das caractersticas
citadas.
Os detectores disponveis no mercado mais utilizados so:
Detectores de absorvncia no ultravioleta e visvel (UV-VIS);
Detectores de fluorescncia;
Detectores eletroqumicos;
Detectores de massas.
Outros:
Detectores de ndice de refrao;
Detectores de condutividade eltrica.
4.3.5.1. Detectores de UV-VIS
Estes detectores funcionam baseados na quantidade de luz que absorvida pelo soluto em um
determinado comprimento de onda caracterstico da mesma. Podem ser divididos em trs tipos
basicamente:
de comprimento de onda fixo;
de comprimento de onda varivel;
de arranjo de diodos.
4.3.5.1.1. Detectores de comprimento de onda fixo
So os mais simples de todos e no so muito comuns de se encontrar atualmente, pois so sensveis
s variaes de composio de fase mvel que compromete seu uso em sistemas de gradiente. O
comprimento de onda selecionado atravs de filtros pticos de comprimento de onda especficos.
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4.3.5.1.2. Detectores de comprimento de onda varivel
So os mais utilizados atualmente por possibilitar seu uso, tanto em sistemas isocrticos quanto em
gradiente. So utilizados pela maioria dos laboratrios nos quais a amostra e seu respectivo
comprimento de onda so conhecidos. A figura 3 mostra o diagrama esquemtico de um detector
de comprimento de onda varivel
Figura 3. Diagrama esquemtico de detector de comprimento de onda varivel
4.3.5.1.3. Detectores de arranjo de diodos
So detectores que tm a capacidade de gerar espectros de absovncia em uma velocidade compatvel
com o fluxo do eluente. Fornece dados em trs dimenses: absorvncia x tempo x comprimento de
onda. So utilizados em pesquisa e desenvolvimento quando no se conhece qual o melhor
comprimento de onda, deseja-se obter seu espectro para sua caracterizao (biblioteca) e obteno
da porcentagem de pureza de picos.
O diagrama esquemtico ilustrado na figura 4.
Figura 4. Diagrama esquemtico de um detector de arranjo de diodos
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4.3.5.2. Detector de fluorescncia
Os detectores de fluorescncia so especficos, pois o soluto tem que fluorescer e um dos mais
sensveis dentre os mais utilizados em HPLC.
Na figura 5 apresentado um diagrama esquemtico deste tipo de detector.
Figura 5. Esquema do detector de fluorescncia
Existem detectores de fluorescncia no mercado que tm a capacidade de gerar espectros de
fluorescncia de excitao e emisso durante a corrida cromatogrfica.
4.3.5.3. Detectores eletroqumicos
So os mais sensveis dentre os detectores e tambm os mais delicados para se trabalhar. As molculas
a serem analisadas devem possuir caractersticas que possibilitem a oxidao ou a reduo. A deteco
efetuada atravs de eletrodos conforme ilustra a figura 6.
Figura 6. Diagrama esquemtico de um detector eletroqumico
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4.3.6. Aquisio e processamento de dados
Como parte integrante do cromatgrafo, o sistema de aquisio e processamento de dados permitir
ao usurio verificar e documentar os resultados obtidos.
Basicamente dever receber o sinal eltrico enviado pelo(s) detector(es), convert-lo(s) em grfico(s)
denominado(s) cromatograma(s), fazer a integrao dos picos atravs de parmetros pr-estabelecidos
e, a partir de uma curva de calibrao, quantificar suas amostras.
Este grfico traado como sinal em funo do tempo de reteno apresenta duas caractersticas
importantes. A primeira, o tempo de reteno caracterstico e repetitivo para cada substncia; a
segunda, a rea ou altura do pico diretamente proporcional concentrao ou massa da substncia.
Veja a figura abaixo:
Inicialmente criado um arquivo que contm todas as informaes necessrias para anlise das
substncias de interesse, tais como:
Elaborao de texto descrevendo condies cromatogrficas como fase mvel e coluna utilizados;
Programao de parmetros para integrao dos cromatogramas.
Aps estabilizao do sistema, padres so injetados para verificao de desempenho.
Visto que est tudo em ordem, um padro contendo todos os componentes a serem quantificados
injetado para que possa ser criada uma tabela onde o sistema informado sobre os picos a
serem analisados atravs de seus respectivos tempos de reteno. Esta tabela necessria para a
criao de uma curva de calibrao.
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A seguir, os padres para elaborao desta curva so injetados e a mesma armazenada, finalizando
a criao deste arquivo de anlise.
As amostras devem ser injetadas tomando-se o cuidado de injetar padres de controle em intervalos
regulares, possibilitando a verificao da estabilidade do sistema.
A seguir ser feita uma abordagem sobre os quatro mtodos que podem ser utilizados para calibrao:
Porcentagem de rea.
Normalizao de rea.
Padro Externo.
Padro Interno.
4.3.6.1. Porcentagens de rea
A porcentagem de rea o mtodo mais simples de clculo, pois no requer padro.
baseado no princpio de que a resposta do detector proporcional quantidade de substncia que
passa pela clula do mesmo.
S pode ser utilizado para substncias que tm a mesma resposta no detector, ou seja, se injetadas
quantidades iguais das mesmas, deve-se obter reas iguais para todos os picos. O clculo para a
amostra o seguinte:
Conc. do componente A (%) = rea do componente A x 100
' reas de todos os componentes
4.3.6.2. Normalizao de rea
O princpio o mesmo da porcentagem de rea, porm se faz a correo da resposta do detector
para cada substncia, utilizando um dos picos como referncia de clculo. Para esse mtodo
necessria a injeo de um padro para o clculo do fator de resposta de cada pico como na frmula
abaixo:
Fator de resposta do = rea do componente A x Conc. do componente de Referncia
componente A Conc. do componente A rea do componente de Referncia
Tendo o fator de resposta de cada componente, podemos analisar a amostra utilizando a seguinte
equao:
Concentrao do = rea do componente A x Fator resposta do componente A
componente A (%) ' (reas de todos os componentes x Fat. resp. todos comp.)
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4.3.6.3. Padro externo
O padro externo o mtodo mais comum de calibrao.
Consiste em fazer a quantificao da amostra atravs da injeo de padres com concentraes
conhecidas.
Faz-se a relao da rea do padro com a concentrao e se obtm o fator de resposta para cada
composto, conforme equao abaixo:
Fator de resposta do = rea do componente A
componente A Concentrao do componente A
Com este fator de resposta gerado aps injeo do padro, injeta-se a amostra.
Com a rea gerada na amostra, divide-se esta rea pelo fator de resposta gerado pelo padro e
obtm-se a concentrao da amostra atravs da equao:
Concentrao do = rea do componente A
componente A Fator de resposta do componente A
4.3.6.4. Padro interno
O padro interno o mtodo mais preciso de calibrao, pois corrige as variaes de volume atravs
de uso de um padro de referncia, que adicionado na mesma quantidade tanto no padro como
na amostra.
A escolha deste padro de referncia deve obedecer as seguintes condies:
! No deve estar presente na amostra;
! No haver nenhum componente na amostra que tenha tempo de reteno muito prximo ao
padro;
! Ser puro, no reativo e de preferncia ser do mesmo grupo funcional do componente a ser
determinado.
Por estas condies, muitas vezes no possvel utilizar este mtodo, porm quando utilizado produz
resultados bem precisos, mesmo utilizando injeo manual.
O clculo consiste em determinar o fator de resposta relativa de cada componente, com a injeo
do padro, atravs da equao:
Fator de resposta do = rea do componente A x Conc. do padro interno
componente A Conc. do componente A rea do padro interno
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Com os fatores de resposta calculados, injeta-se a amostra com padro interno e, com as reas
obtidas, calcula-se a concentrao do componente utilizando a equao:
Concentrao do rea do Concentrao Fator de resposta
componente A = componente A x do padro interno x do componente A
rea do padro interno
Existem atualmente duas opes para aquisio e processamento de dados que so o integrador e o
computador pessoal com software dedicado. Ambos possibilitam executar as mesmas tarefas por
parte do usurio, sendo que a diferena bsica entre eles o sistema operacional.
preciso salientar a importncia de poder transferir os dados (cromatogramas) obtidos de uma
plataforma para outra, pois para fins de intercmbio interlaboratorial, isto no pode ser um empecilho
para comparao ou anlise de resultados.
4.4. Requisitos mnimos de instalao e operao
Para garantir a obteno de resultados confiveis e reprodutivos e estar em conformidade com os
requerimentos de Qualificao de Instalao (IQ), necessrio que se verifique as condies que se
tem no local para executar a instalao. Para isso podemos citar as seguintes condies:
4.4.1. Requisitos da bancada
A bancada onde ser colocado o HPLC deve ser dimensionada de maneira a acomodar bem o
equipamento e proporcionar conforto ao usurio que nela trabalha.
As dimenses do HPLC mais o sistema de dados (integrador ou computador), normalmente dois
metros lineares so suficientes para acomodar todo o sistema.
Os HPLCs atuais so geralmente modulares, dispostos de maneira que seus mdulos fiquem uns
em cima dos outros, em formato de torre, portanto, deve-se observar que a bancada no seja
demasiadamente alta pois far com que a torre fique muito alta, causando perigo para o operador
principalmente na manipulao de fase mvel.
A estrutura deve ser de forma a suportar em torno de 80 kg, de maneira firme, sem vibraes ou
balanos.
Os fabricantes de equipamentos fornecem em seus manuais de pr-instalao as descries detalhadas
da bancada necessria.
4.4.2. Rede eltrica
A rede eltrica deve ser devidamente aterrada e estabilizada. recomendado o uso de chave magntica
caso haja constantes quedas no fornecimento de energia eltrica.
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O nmero de tomadas deve ser suficiente e no padro correto para a instalao do sistema.
necessria uma tomada por mdulo, alm de tomadas para integrador e, no caso de configuraes
com computador, para a CPU, para o monitor e para a impressora. Para um HPLC tradicional, com
bomba, injetor automtico, forno, detector e computador de oito tomadas so suficientes. Deve-se
deixar uma tomada sobressalente para utilizao em assistncia tcnica e/ou validaes.
A figura 7 ilustra o modelo padro de tomada utilizada em HPLCs.
!Padro de tomadas para o cromatgrafo lquido
Figura 7. Padro de tomadas para HPLC
Com relao ao consumo, deve-se obter com o fabricante do respectivo HPLC o consumo de
energia por mdulo e total, e dado em Watts ou VA ou KVA. Deve-se consultar um profissional
da rea eltrica para o dimensionamento e distribuio de capacidade do sistema eltrico.
As oscilaes de rede eltrica no so toleradas pelos equipamentos, portanto, fundamental que se
conhea a estabilidade de tenso e que a mesma seja compatvel com as especificaes necessrias
de cada modelo.
4.4.3. Condies ambientais
As condies ambientais basicamente se resumem em temperatura e umidade.
A temperatura da sala onde o HPLC ser instalado deve ser controlada sem grandes variaes
durante o uso. O tpico requerido pelos fabricantes de 25
o
C, com variao de +/- 2
o
C.
A umidade deve estar abaixo de 95% e no dever ocorrer condensao.
4.5. Cuidados bsicos
A manuteno por parte do usurio de fundamental importncia para um bom funcionamento e
durabilidade de um cromatgrafo.
Aps a utilizao do equipamento, deve ser adotado um procedimento de limpeza (que depende do
tipo de fase mvel utilizada), e o mesmo vale para a coluna cromatogrfica que deve receber ateno
especial por se tratar do principal componente do sistema.
Para a limpeza da mesma siga cuidadosamente as instrues contidas no manual.
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O sistema que requer um cuidado maior o que trabalha com soluo tampo como fase mvel.
Aps o uso do mesmo imprescindvel que seja utilizada gua (100%) para completa remoo da
soluo tampo e depois a utilizao de uma mistura, por exemplo, metanol (ou acetonitrila) 70% e
gua 30%. Isto porque, deixando o sistema apenas com gua possibilitaria o surgimento de fungos.
O usurio deve estar familiarizado com a troca de peas consumveis de seu sistema. Toda interveno
de manuteno deve estar relatada em um caderno de atividades (logbook).
Aqui esto relatadas as principais partes de consumo para cada mdulo:
Bomba Selos, pistes, filtros.
Injetor manual Selo do rotor, ala de amostra (loop), conexes.
Injetor automtico Filtros, septos, selo do rotor, partes de unidade de seringa (quando houver),
frascos para amostras e reagentes, agulha, ala de amostra.
Detectores UV-Visvel e fluorescncia Lmpadas, lentes, o-rings.
Detector eletroqumico Eletrodos, soluo de KCl, o-rings.
O treinamento por parte do usurio, pelo exposto, alm da operao do equipamento, deve incluir
estes cuidados bsicos, sendo obstante que o profissional tenha formao compatvel para este nvel
de aprendizado.
Consultar os manuais tambm uma tima prtica, pois alm de informar com mais detalhes o
funcionamento do equipamento, serve para esclarecer vrias dvidas que o usurio possa ter.
importante observar os cuidados relativos segurana quando da manipulao do equipamento.
O uso de avental, luvas e culos de proteo previnem danos de conseqncias graves como a
cegueira ou contaminao com amostras, por exemplo, plasma.
A descontaminao do sistema obrigatria quando houver manuteno, visando sempre a
integridade da sade da pessoa que ir realiz-la.
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5. SISTEMAS DE CROMATOGRAFIA ACOPLADOS
A DETECTORES DE MASSA
5.1. Introduo
A cromatografia uma tcnica fundamental de separao em cincias da vida e reas correlatas da
qumica. Os detectores tradicionais como ultravioleta-visvel, eletroqumico, ndice de refrao (HPLC)
e ionizao de chama, conditividade trmica, etc (GC) so amplamente utilizados para quantificao
de compostos, pois geram dados em duas dimenses (resposta x tempo).
Os detectores de massas possuem a caracterstica de gerarem dados em trs dimenses (resposta x
tempo x espcie inica), ou seja, espectro de massas que podem dar informaes importantssimas
quanto ao peso molecular da amostra, sua estrutura molecular, identidade, quantidade e sua pureza.
Dados de espectros de massa adicionam especificidade s anlises tanto na parte quantitativa quanto
qualitativa.
Para a grande maioria dos compostos, os detectores de massas so mais sensveis e, de longe, mais
especficos do que os detectores tradicionais. Podem analisar vrios compostos e identificar
componentes em cromatogramas no separados, reduzindo assim a necessidade da cromatografia
perfeita. Os dados espectrais de massas podem complementar dados de outros tipos de detectores.
Enquanto dois compostos podem ter os espectros similares em UV ou em Massas, como no caso de
LC-MS, incomum isto acontecer simultaneamente, portanto, os dois tipos de dados em conjunto
podem ser utililizados para identificar, confirmar e quantificar compostos com grande certeza de
resultados.
Alguns espectrmetros de massas possuem a caracterstica de executar multiplos estgios de
espectrometria de massas em uma nica amostra. Eles podem gerar um espectro de massas, selecionar
um on especfico e a partir deste gerar um novo espectro. Alguns tm a capacidade de repetir este
ciclo por diversas vezes at que sua estrutura seja determinada (MS/MS ou MS
n
).
5.2. Princpio da tcnica
O espectrmetro de massas funciona basicamente atravs da ionizao das molculas e sua
fragmentao. Aps isto, os ons resultantes so identificados de acordo com sua relao massa/
carga. Os trs componentes-chave no processo so: a fonte de ons; o analisador e o detector. A
fonte de ons tem a funo de gerar ons. H vrios tipos de fonte de ons em cromatografia acoplada
detectores de massas. Cada tipo especfico para uma certa classe de compostos. H tambm
vrios tipos de analisadores, responsveis pela separao dos ons, e detectores responsveis pela
gerao de sinais mensurveis.
Cada um deles possue suas vantgens e desvantgens, dependendo do tipo de informao que se
esta buscando. Os detalhes dos tipos mais comuns de fontes, analisadores e detectores sero discutidos
seguir:
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5.3. Descrio bsica do sistema
5.3.1. Fonte de ionizao
A fonte onde ir ocorrer a ionizao e fragmentao das molculas. Muitas tcnicas de ionizao
existem, entre vrias podemos citar: Bombardeamento de tomos - FAB, Desorso por Laser - LD,
Termospray - TS, Feixe de partculas, etc. Porm, os tipos de fontes mais utilizados so:
5.3.1.1. Impacto de eltrons (EI)
A fonte de Impacto de Eltrons (EI) utiliza um filamento que responsvel pela emisso de eltrons
com uma energia definida de 70 eV, como a energia do feixe de eltrons bem maior que o primeiro
potencial de ionizao na maioria dos compostos da amostra, esta ionizada e depois fragmentada.
Este tipo de ionizao acoplado CG.
5.3.1.2. Ionizao qumica (CI)
A fonte de Ionizao Qumica (CI) utiliza agentes lquidos ou gasosos para promover uma reao
com as molculas, normalmente a ionizao ocorre atravs da transferncia de um prton molcula,
formando espcies denominadas pseudo on moleculares. Como esta forma de ionizar bem mais
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suave do que o impacto de eltrons, o espectro produzido contm poucos fragmentos e quase
somente o pseudo-on molecular, servindo, portanto, para determinao de peso molecular e/ou
anlises quantitativas. Este tipo de ionizao acoplado CG.
5.3.1.3. Electrospray (ES)
A Ionizao por eletrospray teve um grande impacto na utilizao da espectrometria de massas em
pesquisas biolgicas durante os ltimos anos. Foi o primeiro mtodo a estender a faixa de massa til
de instrumentos para mais de 50.000 Da. Embora introduzida em sua forma presente em 1984, a
tcnica volta a investigaes da disperso eletricamente assistida de lquidos no comeo deste sculo.
Na realidade, uma descoberta principal aconteceu quase desapercebida em 1968, quando Malcolm
Dole e colaboradores puderam trazer macromoleculas fase gasosa em presso atmosfrica. Isto
foi possvel borrifando uma soluo da amostra em um pequeno tubo com um forte campo eltrico
na presena de um fluxo de nitrognio morno para ajudar na desolvatao e medindo, ento, os ions
formados. Mais adiante, experincias inovadoras neste campo conduziram introduo da fonte de
ionizao por ES. Desde ento, uma gama extensiva de biomolculas foi investigada por ES. A
amostra normalmente dissolvida em uma mistura de gua e solvente orgnico, comumente metanol,
isopropanol ou acetonitrila, podendo ser infundida diretamente, ou injetada em fluxo contnuo, ou
seja, contida no eluente de uma coluna de HPLC ou coluna capilar de CE.
A fonte de ES simples, com a formao de um spray que acontece em um campo de alta voltagem
como mostrado na Figura 5. Em um mecanismo proposto, acredita-se que a formao do on o
resultado de um processo de evaporao de inica, primeiramente proposto em 1976. Um spray de
gotculas gerado pela disperso electrosttica do lquido lanado pela ponta do capilar. Favorecido
por um gs aquecido (normalmente nitrognio), as gotculas sofrem desagregao, perdendo
molculas de solvente no processo e eventualmente produzindo ons individuais. Em outro
mecanismo proposto, a desolvatao das gotculas conduz a uma densidade de carga crescente na
superfcie da gota que causar uma exploso coulombica que conduz eventualmente ons individuais.
Seja qual for o mecanismo proposto, os ons so formados presso atmosfrica e entram em um
orifcio localizado no vrtice de um cone que age como uma primeira barreira para a fase de vcuo.
Um coletor (skimmer) recolhe os ons e os guia ao espectrmetro de massas.
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A formao do spray a parte mais importante da tcnica de ES. normalmente aconselhvel
filtrar todos os solventes e concentraes altas de eletrlito devem ser evitadas porque estes podem
conduzir a supresses na ionizao e condies operacionais instveis. Altos fluxos, compativeis
queles utilizados em HPLC, hoje podem ser utilizados atravs de um gs de nebulizao aquecido
para ajudar na formao do spray.
Para macromolculas, cada um dos ons que normalmente entra no espectrmetro de massas tem
um alto nmero de carga. Como os espectrmetros de massas medem as relaes massa/carga em
lugar de massa, possvel para molculas de altas massas moleculares terem nmeros suficientes de
carga para carem na faixa de m/z de um quadruplo linear, tipicamente m/z 20-4000. Como mostrado
na Figura 6A, ons de altas massas moleculares tm freqentemente uma distribuio larga de estados
de carga. A figura mostra o espectro de massas da mioglobina de cavalo (massa molecular: 16951.5)
em baixa resoluo com cargas observadas de +12 a +21. Esta distribuio de ons permite o
clculo da massa molecular do analito original atravs de dois ons vicinais com valores m/z m1 e
m2 , com n1 e n2 cargas, respectivamente. Se m1 < m2, e n2 = n1-1, ento,
M = n1(m1-mA) = n2 (m2-mA) (1)
n2 = (m1-mA)/(m2-m1) (2)
onde M representa a massa molecular da molcula no carregada e mA a massa do aduto carregado
A (por exemplo H+, Na+, NH4+). Assim as equaes podem ser resolvidas para dar n2 e M. A
medida da distribuio de cargas em macromolculas nem sempre fcil ou reprodutvel, pois pode
sofrer alteraes com mudanas relativamente pequenas nas condies de anlise, como por exemplo:
pH; adio de solventes ou sais; denaturao parcial da protena; quebra de pontes disulfeto, etc.
A fonte de electrospray utilizada acoplada a todos os analisadores de massas comuns.
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5.3.2. Analisadores de massas
Aps a entrada das molculas na fonte de ons e posterior ionizao, se faz necessria a determinao
das respectivas massas dos ons formados a fim de obter o espectro de massas. A funo do analisador
de massas promover a separao dos ons a partir de suas relaes massas/carga e transmit-los
detector.
Existem diversos tipos de analisadores de massas, sendo os mais comuns e amplamente utilizados
os Quadruplos e os on Traps.
Os analisadores de massas quadrupolares so considerados de varredura, ou seja, a partir da entrada
de uma mistura de ons com diferentes relaes massa/carga (m/z) e diferentes abundncias, so
aplicados campos eltricos fazendo com que em um determinado momento, somente ons de uma
massa especifica consigam sair ilesos. Variando-se os valores do campo eltrico aplicado se consegue
fazer com que ons distintos sejam selecionados e registrados.
J os analisadores tipo Ion Trap no podem ser considerados como instrumentos de varredura
puros, pois nestes, os ons so armazenados antes de sua varredura propriamente dita.
5.3.2.1. Analisadores de massas quadrupolar
O instrumento baseado em quatro barras paralelas numa rea quadrangular onde o feixe de ons
focalizado no eixo central destas barras, um potencial eltrico fixo (DC) e um potencial de
rdiofreqncia (RF) so aplicados nestas barras diagonais e opostas. Para uma dada combinao
de RF e DC, ons de uma especfica faixa de massas m/z tm seu caminho alterado do eixo central.
Um espectro de massas obtido das componentes de tenso DC e RF de maneira sincronizada, ou
seja, mantendo a relao RF/DC constante. O potencial (
o
aplicado aos pares opostos de barras
determinado por:
(
o
= U + V cos (t
onde U uma tenso DC e V cos ( t, a tenso dependente do tempo na qual V a amplitude de RF
e (, a freqncia de RF.
Figura 2. Representao esquemtica de um analisador quadrupolar linear
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A operao do quadruplo (bem como do on trap, como veremos depois) pode ser tratada quali-
tativamente atravs do diagrama de estabilidade que correlaciona a amplitude do potencial DC, a
amplitude do potencial de RF com a trajetria de um on estvel (ou seja, um on que consegue
passar intacto pelo quadruplo). Isto est representado nas equaes e no grfico 1.
A equao de movimento para uma partcula carregada pode ser expressa como uma equao de
Mathieu na qual pode-se definir os parmetros a
u
, e q
u
,
a
u
= a
x
= -a
y
= 4zU / m(
2
r
o
2
q
u
= q
x
= -q
y
= 2zV / m(
2
r
o
2
com m/z sendo a relao massa/carga do on, e r
o
, a metade da distncia entre as duas barras
opostas. No h nenhum parmetro de z, porque o campo de RF s age no plano x/y (z o eixo
principal do quadruplo linear).
Grfico 1. Diagrama de estabilidade no analisador
Neste caso, o on m
2
o nico on que se mantm estvel (note que se encontra dentro da regio de
estabilidade do grfico), enquanto que m
3
e m
1
no conseguem atingir o detector. As retas de
R=100 2e R=10 representam duas combinaes distintas da relao DC/RF, atravs da alterao
destas relaes se consegue alterar a resoluo do filtro de massas, ou seja, a capacidade de diferenciar
ou filtrar massas muito prximas umas das outras. Os parmetros a e q so respectivamente
proporcionais aos valores de DC e RF.
5.3.2.2. Analisadores de massas quadrupolar ion trap
Este analisador de massa tem os mesmos princpios matemticos de funcionamento que o quadruplo
convencional, ou seja, estabilidade de ons dentro de uma trajetria especfica.
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Porm, o grande diferencial que no on trap os ons no seguem uma trajetria nica em direo
ao detector, e sim ficam aprisionados em rbitas dentro da estrutura do trap, surgindo assim a
razo da denominao on trap (armadilha de ons).
Enquanto que no quadruplo ns temos a formao dos ons na fonte de ons e posterior expulso
destes ons em direo ao analisador de massas, no trap ocorrem a formao dos ons e anlise de
massas na mesma regio do espao. Esta regio do espao onde se encontram os ons aprisiona-
dos corresponde a aproximadamente o volume de um cubo de 1 centmetro de lado.
Na figura abaixo temos a representao esquemtica do analisador on trap.
Figura 3. Representao esquemtica do analisador ion trap
Assim como os quadruplos, os on traps tambm se utilizam de campos eltricos, estes campos
eltricos so utilizados, no on trap, para manter os ons confinados e para a separao das massas
(anlise de massa).
Neste tipo de analisador de massa, o campo eltrico utilizado puramente de RF (rdiofreqncia
consistindo de uma onda senoidal de aprox. 1 Mhz de freqncia) que aplicada diretamente no
eletrodo anular central.
Desta maneira, dependendo da amplitude de RF aplicada, se mantm os ons estveis dentro do
trap ou incrementando-se esta amplitude faremos com que ons de massas maiores sejam ejetados
da regio de confinamento e atinjam desta maneira o detector.
Uma outra peculiaridade dos Ion traps que se faz necessrio um controle sobre o nmero de ons
presentes dentro da estrutura, visando evitar reaes destes ons com molculas ainda presentes.
Estas interaes podem provocar ligeira modificao no espectro final de alguns compostos,
dificultando sua interpretao/ identificao.
J nos quadruplos este problema no existe, visto que aps sua formao, os ons so quase que
imediatamente jogados fora da fonte de ons no tendo chance de interagir com molculas
presentes.
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Volume II / Mdulo 3 - Instrumentao Analtica
Em contrapartida, a sensibilidade final no modo de varredura completa (full scan) maior nos traps
devido ao fato de que todos os ons formados so necessariamente detectados, pois estes se encontram
confinados.
J nos quadruplos a situao distinta, ou seja, enquanto que o quadruplo est varrendo a faixa
de massas visando produzir um espectro, os ons que no se mantm estveis so perdidos e,
portanto, no produzem sinal detectvel. possvel, no entanto aumentar significativamente a
sensibilidade do quadruplo fazendo com que este fique sempre fixo em uma massa (ou algumas
poucas massas) de interesse sendo esta tcnica denominada SIM (Single Ion Monitoring).
5.3.2.3. Espectrometria de massas seqencial (tandem mass spectrometry).
A espectrometria de massas seqencial (Tandem Mass Spectrometry, MS/MS ou MS
n
onde n=2,
3...) usa dois ou mais estgios de anlise de massa, um para pr-selecionar um on e o outros para
analisar os fragmentos induzidos, por exemplo, por coliso (CID) com um gs inerte, como argnio
ou hlio. Esta anlise pode ser seqencial no espao ou no tempo.
Seqencial no espao significa ter vrios analisadores de massa em srie. Muitas combinaes so
possveis, as mais comuns dentre essas so: o triplo quadruplo (Q1qQ2), os de 4 setores e os
instrumentos hbridos. Nesta simbologia, Q representa um quadruplo filtro de massas e q um
quadruplo de apenas RF (cmara de coliso). No caso do triplo-quadruplo, um on de interesse
gerado na fonte de ionizao selecionado com o primeiro quadruplo Q1, dissociado na cmara
de coliso q com energias de at 300 eV e os produtos de fragmentao analisados com o segundo
quadruplo Q2.
Deste modo, possvel, por exemplo, obter informaes sobre a seqncia de um peptdeo
selecionando o on correspondente ao peptdeo protonado (denomidado on-precurssor) e analisando
os fragmentos de sua estrutura com Q2. Este processo chamado de varredura de ions-produto.
Muitos outros tipos de varredura ou experincias analticas podem ser realizadas. Por exemplo, a
procura de todos os precursores de um determinado fragmento denominada varredura de ons-
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precursores. Isto alcanado mantendo-se Q2 esttico na razo massa/carga do on em questo e
varrendo todos os ons presentes em Q1, enquanto se realiza dissociaes por colises em q. Em
outro modo de varredura, a identificao de ons que apresentam uma perda de um fragmento
especfico pode ser realizada varrendo-se Q1 e Q2 simultaneamente, mantendo-se a diferena de
massa entre os quadruplos igual massa do fragmento neutro perdido.
A seqncia no tempo pode ser conseguida atravs de dispositivos on trap e espectrmetros de
massa ICR (tambm chamados de FTMS). Estes instrumentos no esto de fato limitados a
experimentos MS/MS, mas podem atingir mltiplos estgios (MS/MS/MS/MS, ou MS
n
). Nestes
instrumentos, os ons so selecionados atravs da aplicao de pulsos de tenses especficas e as
dissociaes ocorrem normalmente por colises com outros gases.
5.3.3. Detectores
Aps feita a seleo de ons pelo analisador, estes so direcionados ao detector onde sero transfor-
mados em um sinal mensurvel. Os detectores podem ser divididos em trs grupos. As placas foto-
sensveis e as gaiolas de Faraday encontram-se no primeiro grupo e relacionam o sinal medido
diretamente quantidade do on analisado. No segundo grupo encontram-se os multiplicadores de
eltrons, os foto-multiplicadores e as placas microcanais que amplificam a intensidade do sinal
recebido. Estes so os mais utilizados e sero discutidos aqui. O terceiro grupo utilizado nos
aparelhos de ICR (FTMS) e consistem em um detector de radiofreqncia que aplicado aos ons
aprisionados.
5.3.3.1. Multiplicadores de eltrons
Quando ons positivos ou negativos atingem o dinodo de converso, no qual aplicado um poten-
cial negativo, estes causam a emisso de diversos eltrons secundrios. Esses eltrons so acelerados
para dentro de um multiplicador de eltrons e atingem suas paredes com energia suficiente para
arrancar alguns eletrns. Esses eltrons atingiro o outro lado da parede liberando assim, mais
eltrons. Este efeito cascata continua at que, finalmente, uma corrente mensurvel criada no final
do multiplicador de eltrons.
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5.3.3.2. Placas microcanais
Placas microcanais consistem em uma placa contendo microcanais cilndricos paralelos. O lado de
entrada destes microcanais mantido com um potencial negativo de aproximadamente 1kV em
relao ao lado de sada. A multiplicao dos eltrons iniciada pela coliso de um on nesses canais
proporcionada por uma substncia semi-condutora que reveste cada canal e gera eltrons
secundrios. Canais curvos previnem a acelerao de ons positivos em direo ao lado de entrada.
O efeito cascata dentro dos canais pode multiplicar o nmero de eletrns na ordem de 10
5
e o uso
de vrias placas acopladas permite uma amplificao que pode chegar at 10
8
. Na sada de cada
canal um nodo de metal coleta a corrente de eltrons e o sinal transmitido ao processador. Esses
detectores microcanais tm tambm como caracterstica um tempo de multiplicao de sinais
extremamente baixo, tornando-os apropriados para a deteco em instrumentos com analisador
por tempo de vo.
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5.3.3.3. Foto-multiplicador
Este tipo de detector composto por dois dinodos de converso; uma tela fosforescente e um foto-
multiplicador. Este detector, assim como o multiplicador de eltrons e as placas microcanais, permite
a deteco de ons positivos e negativos. Na deteco, os ons so acelerados de encontro ao dinodo,
que tem uma polaridade inversa a do on, desta maneira eltrons so ento liberados e acelerados
em direo tela fosforescente onde so convertidos em ftons. Os ftons so ento detectados
pelo fotomultiplicador. A superfcie da tela fosforescente recoberta por uma fina camada de alumnio
condutor a fim de evitar a formao de cargas, as quais poderiam previnir que novos eltrons a
atinjam. A amplificao atinge valores de 10
4
a 10
5
.
5.3.4. Aquisio e processamento de dados
A aquisio e processamento de dados so feitos integralmente atravs de programas computacionais
especficos. Estes programas so responsveis por tarefas que vo desde o controle do tempo em
que um on monitorado at a construo de curvas-de-calibrao onde as reas (ou alturas) de
picos de amostras desconhecidas so intrerpoladas gerando o dado quantitativo requisitado. Cada
fabricante possui seu programa de aquisio e tratamento de dados, com recursos e limitaes
diferentes. Portanto, a compreenso destes programas e posterior criao de procedimentos de
operaes padro (POP) so imprescindveis para conduo de qualquer estudo.
Detalhes sobre o processo de quantificao dos compostos podem ser consultados no item 4.6 da
tcnica de HPLC.
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5.4. Requisitos mnimos de instalao e operao
O propsito dos requisitos mnimos de instalao de assegurar que o local de instalao seja
devidamente avaliado e preparado com os itens de consumo e suprimentos necessrios para uma
perfeita instalao.
Os fabricantes fornecero uma lista de verificao para ser acompanhada antes da data da instalao.
Esta lista ser especfica do instrumento adquirido, porm, em linhas gerais, o que deve ser observado
est descrito nos itens seguintes.
5.4.1. Requisitos da bancada
A bancada onde ser colocado o LC/MS deve ser dimensionada de maneira a acomodar bem o
equipamento e proporcionar conforto ao usurio que nela trabalha.
As dimenses desta bancada devem ser compatveis com as dimenses do LC/MS mais o sistema
de dados (computador e impressora). Normalmente, trs metros lineares so suficientes para
acomodar todo o sistema.
A estrutura deve ser de forma a suportar o peso do equipamento com segurana, portanto, deve-se
considerar uma margem de 20% acima do peso do equipamento, de maneira firme, sem vibraes
ou balanos.
Deve-se considerar tambm espao livre na parte posterior da bancada (no deve estar encostada na
parede) para acomodao de itens necessrios ao funcionamento do equipamento, como por exemplo,
bombas de vcuo e sistema de refrigerao e circulao de gua.
Os fabricantes de equipamentos fornecem em seus manuais de pr-instalao as descries detalhadas
da bancada necessria.
5.4.2. Rede eltrica
A rede eltrica deve ser devidamente aterrada e estabilizada. recomendado o uso de chave magntica
caso haja constantes quedas no fornecimento de energia eltrica.
O nmero de tomadas deve ser suficiente e no padro correto para a instalao do sistema. Deve-se
considerar, alm do mdulo de LC/MS, tomadas para o sistema de HPLC e sistema de dados
incluindo a impressora.
O padro de tomada para o LC/MS vai depender da tenso necessria para seu funcionamento.
Geralmente estes sistemas, como consomem grandes potncias, requerem alimentao de 220 VAC
com capacidade para 1,5 a 2 KVA (apenas para o mdulo de MS). importante observar se o
equipamento requer 220 VAC em uma nica fase (single fase) ou em duas (split fase).
Com relao ao consumo, deve-se obter com o fabricante do respectivo LC/MS o consumo de
energia por mdulo e total, e dado em Watts ou VA ou KVA. Deve-se consultar um profissional
da rea eltrica para o dimensionamento e distribuio de capacidade do sistema eltrico.
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As oscilaes de rede eltrica no so toleradas pelos equipamentos, portanto, fundamental que se
conhea a estabilidade de tenso e que a mesma seja compatvel com as especificaes necessrias
de cada modelo.
5.4.3. Condies ambientais
As condies ambientais para sistemas de LC/MS no se resumem apenas temperatura e umidade.
Estes tipos de equipamentos requerem tambm alimentao de gs e alguns necessitam de circulao
de gua refrigerada, alm da exausto.
A temperatura da sala onde o LC/MS ser instalado deve ser controlada sem grandes variaes
durante o uso. O tpico requerido pelos fabricantes de 25
o
C, com variao de +/- 2
o
C. Um
sistema de LC/MS dissipa um calor de 6800 a 8000 BTUs que deve ser levado em conta no
dimensionamento do ar condicionado.
A umidade deve estar abaixo de 95% e no dever ocorrer condensao.
A alimentao de gs (nitrognio) pode vir de cilindros, compartimentos de nitrognio lquido ou
de geradores de nitrognio, sendo este ltimo o mais indicado. O consumo tpico da ordem de 15
L/min e a pureza deve ser de 99,5% para cilindros e 98,0% para as outras fontes de nitrognio. A
presso de trabalho deve ser de 80 a 100 psi.
O local tambm deve possuir exausto com capacidade mnima de 15 L/min que dever ser conectada
na sada da bomba de vcuo e da fonte de ionizao.
5.5. Cuidados bsicos
A manuteno por parte do usurio de fundamental importncia para um bom funcionamento e
durabilidade de qualquer equipamento.
Para um sistema de LC/MS devem ser observados, alm dos cuidados bsicos para o HPLC j
descritos no captulo 4, alguns itens imprescindveis descritos a seguir:
5.5.1. Sistema de vcuo
Os sistemas de alto vcuo possuem geralmente trs bombas sendo uma delas a auxiliar (mecnica)
e as outras duas turbo-moleculares.
A bomba mecnica requer a substituio do fluido no mnimo a cada seis meses, independentemente
se usada ou no. Algumas tambm possuem filtros e estes tambm devem ser substitudos e/ou
verificados em intervalos definidos pelo fabricante (tipicamente seis meses).
J as bombas turbomoleculares (alto-vcuo) so mais especficas e dependem do modelo e das
recomendaes de cada fabricante. Algumas possuem lubrificao permanente, outras precisam ser
lubrificadas em intervalos regulares. Outras ainda requerem que seus rolamentos sejam substitudos
em intervalos pr-determinados. Portanto, fundamental que as instrues de manuteno sejam
obtidas com o fornecedor e que o processo seja documentado e acompanhado, pois uma falha
nestes sistemas pode comprometer todo o equipamento de forma definitiva.
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Leituras de valores de vcuo (pr-vcuo e alto vcuo) devem ser feitas diariamente e seus valores
anotados em um logbook semanalmente.
5.5.2. Fonte de ons
A fonte de ons a parte do equipamento mais sujeita sujeira e contaminaes, pois ela quem
recebe a fase mvel com amostra presso atmosfrica e converte em ons para o sistema de vcuo.
Sua manuteno e limpeza devem ser feitas com base no histrico de uso de cada equipamento e
depender do tipo, concentrao e nmero de amostras injetadas. De qualquer forma, uma vez
estabelecido um intervalo de limpeza, este deve ser observado e documentado.
O usurio deve estar familiarizado com a troca de peas consumveis de seu sistema. Toda interveno
de manuteno deve estar relatada em um caderno de atividades (logbook).
5.5.3. Sistema de nitrognio
O sistema de nitrognio deve ser verificado em intervalos pr-determinados. Normalmente opta-se
pelo gerador de nitrognio pela vantagem na relao custo/benefcio e estes dispositivos tambm
possuem filtros, compressores, etc., que tambm requerem manuteno peridica.
5.5.4. Treinamento em cuidados bsicos
O treinamento por parte do usurio, pelo exposto, alm da operao do equipamento deve incluir
estes cuidados bsicos, sendo obstante que o profissional tenha formao compatvel para este nvel
de aprendizado.
Consultar os manuais tambm uma tima prtica, pois alm de informar com mais detalhes o
funcionamento do equipamento, serve para esclarecer vrias dvidas que o usurio possa ter.
importante observar os cuidados relativos segurana quando da manipulao do equipamento.
O uso de avental, luvas e culos de proteo previne danos de conseqncias graves como a cegueira
ou contaminao com amostras, por exemplo, plasma.
A descontaminao do sistema obrigatria quando houver manuteno, visando sempre a
integridade da sade da pessoa que ir realiz-la.
5.5.5. Arquivos de sintonia
Os sistemas de LC/MS possuem programas de sintonia (autotune) que devem ser executados em
intervalos regulares. Estes programas geram relatrios que devem ser arquivados para histrico de
bom funcionamento e ajuda em intervenes de reparos.
Os cuidados bsicos com o equipamento, assim como a verificao de seu desempenho variam
muito de um equipamento para outro. Desta maneira, os melhores procedimentos para realizao
destas tarefas so aqueles sugeridos pelo prprio fabricante. Estes procedimentos devem ser lidos e
um procedimento de operao padro (POP) criado estabelecendo a freqncia e o tipo de tarefa
a ser realizada. Qualquer no conformidade com este POP dever ser anotada e justificada.
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6. VERIFICAO DE DESEMPENHO DE
INSTRUMENTOS ANALTICOS
6.1. Introduo
Em meados dos anos 90, a verificao de desempenho de instrumentos comea a ter maior
importncia e o primeiro enfoque foi para sistemas de HPLC, em decorrncia de sua larga utilizao
nas indstrias farmacuticas; no entanto, hoje esta preocupao se estende a todos os tipos de
instrumentos utilizados em um laboratrio.
Da mesma forma que em sistemas de gerenciamento de dados, estes trabalhos normalmente so
oferecidos pelos fabricantes de instrumentos analticos, sendo que existem terminologias distintas
utilizadas dentre estes, muitas vezes referindo-se aos mesmos servios prestados. Como exemplo,
temos que a Verificao de Desempenho de um instrumento analtico poder tambm ser chamada
de Qualificao, Qualificao de operao (OQ) ou Recertificao.
No entanto, o que h de mais importante que qualquer que seja a terminologia utilizada pelos
fabricantes, esta dever corresponder a verificao de desempenho do sistema de instrumentao
analtica seguindo um procedimento documentado, de modo a atender as exigncias de um sistema
de qualidade e de acordo com as GLP (Boas Prticas Laboratoriais), realizado a intervalos de tempo
apropriado, definido por cada laboratrio em funo de sua utilizao e ou trabalho empregado.
As empresas de instrumentao recomendam esta verificao em perodos regulares a cada 6 meses
ou 1 ano e sempre que o instrumento for submetido a um servio ou reparo que possa ter influncia
direta em seu desempenho.
A terminologia Validao existe h muito tempo e apresenta algumas variaes de acordo com o
pas ou empresa. A melhor definio de validao o conjunto de atividade e/ou informaes
documentadas que evidenciam um alto grau de segurana que o processo / sistema no qual foi
produzido est dentro de especificaes pr - determinadas e com os devidos atributos de qualidade.
Portanto, validao no somente um processo de verificao de desempenho, qualificao,
qualificao de operao(OQ) ou recertificao, mas sim um processo que deve incluir as seguintes
fases:
! Qualificao do Projeto (DQ - Design Qualification);
! Qualificao da Instalao (IQ Instalation Qualification);
! Qualificao de Operao (OQ Operation Qualification);
! Qualificao do Desempenho (PQ Performance Qualification).
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6.1.1. DQ Qualificao de projeto
Na qualificao do projeto do instrumento, deve-se ter acesso a detalhes de desenvolvimento do
instrumento, como:
! Utilizao de rigorosos mtodos de especificao e projeto durante o desenvolvimento do sistema.
! Completa documentao dos procedimentos de garantia de qualidade e controle de qualidade.
! Utilizao de pessoal experiente e qualificado.
! Plano compreensvel de teste do instrumento.
! Dados de controle, relatrios de erros e procedimentos corretivos aplicados durante
desenvolvimento e confeco do sistema.
! Histrico de desenvolvimento do sistema.
Estas informaes devem ser fornecidas pelos fabricantes dos instrumentos, porm, com o objetivo
de verificao de suas especificaes e adequao ao uso proposto.
6.1.2. IQ Qualificao de instalao
A qualificao de instalao consta da verificao de toda documentao e informaes para a
instalao do instrumento e software, de acordo com especificaes do sistema descritas nos pr-
requisitos de instalao e regulamentaes locais. O IQ estabelece que o instrumento recebido
assim como foi especificado, adequadamente instalado e em condies de operao. Esta atividade
deve incluir:
! Verificao dos itens recebidos de acordo com a documentao adequada.
! Arquivamento de todos os detalhes de descrio e identificao dos componentes do sistema,
incluindo diagramas de conexo do instrumento.
! Cpias do certificado de teste do usurio e declarao de conformidade.
A Qualificao de Instalao (IQ) est sendo abordada em cada tcnica de instrumentao analtica
deste captulo como Requisitos Mnimos de Instalao.
6.1.3. OQ Qualificao de operao
A Qualificao de Operao deve estar documentada, verificando que o sistema est de acordo com
as especificaes operacionais. Um sistema de acompanhamento deve ser utilizado para verificar:
! A realizao do treinamento operacional, que deve ocorrer aps a instalao e antes do incio de
operao em rotina do instrumento.
! O comprometimento do usurio em se submeter a todas as etapas solicitadas.
! A realizao dos testes de desempenho, de acordo com o fabricante do instrumento, para assegurar
que o instrumento esteja em plenas condies de funcionamento.
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6.1.4. PQ Qualificao de desempenho
A PQ consiste na realizao de atividades que comprovem que todas as especificaes do instrumento
esto de acordo com a necessidade para uso. Esta deve ser rigorosa, envolvendo testes necessrios
para demonstrar a funcionalidade do instrumento e deve conter detalhes como:
! Testes especficos para componentes individuais ou sistema completo.
! Relao de testes.
! Freqncia dos testes.
! Resultados esperados.
! Critrio de aceitao.
! Como os testes so documentados.
! Qualificao necessria do operador.
! Aes em caso de falha nos testes.
Para algumas tcnicas de instrumentao analtica, existem rotinas definidas em literatura
internacionalmente reconhecida como a EP/BP (Farmacopia Europia), USP (Farmacopia
Americana), dentre outras, que estabelecem parmetros a serem determinados a fim de validar um
sistema analtico que podero ser utilizados pelo usurio, sendo estes muitas vezes executados por
fabricantes de instrumentos analticos.
Estaremos abordando os procedimentos normalmente utilizados para Verificao de Desempenho
das principais tcnicas em instrumentao analtica e quando aplicado, suas principais rotinas de
Qualificao de Desempenho (PQ) descritas em literatura internacional.
6.2. Espectrofotometria de ultra violeta visvel (UV-VIS)
Para a Verificao de Desempenho (Qualificao de Operao) de um instrumento analtico, o
primeiro passo a ser realizado uma Manuteno Preventiva, onde tem como objetivo verificar
previamente o estado de funcionamento do instrumento, prever e reparar possvel problema
encontrado.
6.2.1. Manuteno preventiva
A manuteno preventiva de um espectrofotmetro de UV-Vis parte vital para manter a vida til
do instrumento e deve ser realizada em intervalos de 6 meses, onde so realizadas atividades especficas
por um especialista. Uma rotina de manuteno preventiva deve incluir:
! Verificao dos itens de segurana do instrumento.
Inspeo do compartimento de amostras.
Verificao das tampas e sensores de proteo.
! Verificao do sistema ptico.
Verificao e limpeza da ptica externa.
Realizao dos testes de desempenho do instrumento: exatido e preciso de comprimento de
onda, correo de linha de base e rudo fotomtrico.
Verificao das condies e alinhamento das lmpadas.
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! Verificao eletrnica.
Verificao dos diagnsticos internos do instrumento.
Verificao de fonte de alimentao e rede eltrica.
Verificao de cabos e conectores.
Limpeza dos circuitos eletrnicos e verificao de desgaste, corroso ou defeitos.
! Verificao das partes mecnicas.
Realizao de testes dos motores no interior do instrumento.
Verificao de funcionamento e comunicao com acessrios.
6.2.2. Qualificao de operao (OQ)
A OQ de um espectrofotmetro de Ultravioleta-Visvel consiste na verificao das seguintes partes:
! Exatido de comprimento de onda;
! Preciso de comprimento de onda;
! Desvio de linha de base;
! Rudo fotomtrico.
6.2.3. Qualificao de desempenho (PQ)
Estaremos citando abaixo algumas das rotinas descritas para PQ que podero ser utilizadas em
espectrofotmetros de UV-Vis estabelecidas na EP e USP.
6.2.3.1. Farmacopia europia
Os testes abaixo so relacionados pela Farmacopia Europia e Britnica (EP/BP) para o processo
de validao do instrumento e esto divididos em:
! Exatido de comprimentos de onda. Testes que possuem o objetivo de verificar a exatido de
posicionamento de comprimento de onda com a finalidade de garantir um baixo desvio de
posicionamento do sistema ptico. A EP/BP recomenda a realizao de duas rotinas para
verificao deste item:
Mtodo de emisso da linha de deutrio, xennio ou mercrio.
Mtodo do perclorato de hlmio.
! Resoluo do monocromador. Teste que verifica se o monocromador do instrumento separa a
luz do espectro e envia uma pequena quantidade desta luz atravs do compartimento de amostras.
A realizao deste teste feita atravs do mtodo de Tolueno / Hexano.
! Stray Light (Luz Espria). A Luz Espria definida como sendo a quantidade de luz que chega
ao detector quando nenhum comprimento de onda foi selecionado. A luz espria causa desvios
na Lei de Beer-Lambert, reduzindo a linearidade do sistema. Este teste realizado atravs da
medida de transmitncia que estar passando por uma soluo e em seguida a mesma leitura
realizada, mas com a fonte desligada. O mtodo utilizado o do KCl em 200nm.
! Exatido fotomtrica. A exatido fotomtrica determinada pela medida de valores de
absorbncia conhecidos e calculando a diferena entre o valor esperado e o valor realmente
medido pelo instrumento. O mtodo utilizado o do Dicromato de Potssio.
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6.2.3.2. Farmacopia americana
Os testes abaixo so relacionados pela Farmacopia Americana (USP) para o processo de validao
do instrumento e esto divididos em:
! Controle de comprimentos de onda. Testes que possuem o objetivo de verificar a exatido de
posicionamento de comprimento de onda com a finalidade de garantir um baixo desvio de
posicionamento do sistema ptico. A USP recomenda a realizao de duas rotinas para verificao
deste item:
Mtodo de emisso da linha de deutrio, xennio ou mercrio.
Mtodo do xido de hlmio.
! Exatido Fotomtrica. A exatido fotomtrica determinada pela medida de valores de
absorbncia conhecidos e calculando a diferena entre o valor esperado e o valor realmente
medido pelo instrumento. Os mtodos utilizados so:
Mtodo de Dicromato de Potssio.
Mtodo atravs do Filtro NIST.
6.3. Cromatografia em fase gasosa GC
6.3.1. Manuteno preventiva de GC
Antes de se realizar a Qualificao de Operao ( OQ ) de um GC, necessrio a realizao dos
procedimentos de Manuteno Preventiva sugeridos pelo fabricante.
Em um Sistema de Cromatografia a Gs, fazem parte da rotina de Manuteno Preventiva:
! Limpeza do Sistema Pneumtico e verificao de vazamentos;
! Limpeza dos circuitos eletrnicos e verificao das tenses empregadas;
! Limpeza dos Sistemas de Ventilao e verificao de sua funcionalidade;
! Limpeza do(s) injetor(es) e detector(es), verificao de vazamentos e tenses empregadas;
! Teste de verificao de resposta do(s) detectores.
6.3.2. Qualificao de operao
A Qualificao de Operao de um sistema de cromatografia a gs consiste da verificao das
seguintes partes:
! Controle de Fluxos do gs de arraste e auxiliares;
! Controle de Temperaturas do Injetor(es), Detector(es) e Forno de Coluna;
! Repetibilidade de sinal do(s) Detector(es);
! Repetibilidade do Amostrador Automtico, quando aplicado;
! Clculos efetuados pelo Sistema de Dados.
6.3.2.1. Controle de fluxos
Esta verificao efetuada para que possamos obter repetibilidade nos tempos de reteno dos
compostos analisados, repetibilidade no volume de amostra introduzido na coluna cromatogrfica,
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no caso de injetores do tipo split e repetibilidade de resposta do detector. Normalmente, os
cromatgrafos podero estar configurados com controladores eletrnicos de fluxo (EFC) ou com
controladores manuais.
Os materiais necessrios para sua verificao em ambos os casos so:
! Medidor de Fluxo Digital Calibrado;
! Coluna cromatogrfica de referncia ou especfica para teste.
As verificaes dos controles de fluxo devero incluir no somente o fluxo de gs de arraste que
passa pela coluna, mas tambm incluir os fluxos da purga de septo, da taxa de diviso no caso de um
injetor split/splitless, fluxo do make-up e auxiliares do detector, Hidrognio e Ar no caso de
um detector FID. Estes testes normalmente so efetuados utilizando determinadas condies
previamente definidas em procedimentos documentados.
6.3.2.2. Controle de temperaturas
O forno de colunas a parte de maior importncia e influncia em uma anlise cromatogrfica;
pequenas variaes de temperatura no forno podero resultar em variaes significativas no tempo
de reteno e conseqentemente afetando a repetibilidade analtica.
Os materiais necessrios para esta verificao so:
! Medidores de Temperatura Calibrados:
! Coluna cromatogrfica de referncia ou especfica para teste;
! Amostra padro de referncia.
As verificaes de temperaturas dos Injetor(es) e Detector(es) so efetuados atravs das medies
em temperaturas operacionais fazendo o uso de medidores de temperatura; sendo que no forno de
colunas, alm da utilizao de medidores de temperatura, so feitos testes de repetibilidade de tempo
de reteno em condies e amostra de referncia previamente definidos.
6.3.2.3. Preciso de sinal do(s) detector(es)
Esta verificao tem como objetivo avaliar a repetibilidade do detector; no entanto, na maior parte
dos procedimentos utilizados, este poder servir de verificao de repetibilidade do sistema em sua
totalidade.
Os materiais necessrios para esta verificao so:
! Coluna cromatogrfica de referncia ou especfica para teste;
! Amostra padro de referncia.
Esta verificao normalmente efetuada em uma determinada condio analtica, realizando injees
consecutivas de uma amostra padro de referncia. O objetivo efetuar o clculo de desvio padro
relativo em porcentagem dos valores de reas desta amostra padro.
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6.3.2.4. Preciso do amostrador automtico
As condies para verificao de Amostradores Automticos so similares verificao de
repetibilidade de sinal de detectores; desta forma, os resultados obtidos em RSD% dos valores de
reas sero duplamente utilizados.
6.3.2.5. Clculos efetuados pelo sistema de dados
As verificaes normalmente efetuadas em Sistemas de Dados referem-se aos clculos utilizados na
estao de trabalho que so:
! Clculo dos Tempos de Reteno;
! Clculo das Contagens de reas;
! Clculo de Eventos de Tempo;
! Clculo dos Coeficientes das Curvas de Calibraes para Padronizao Externa e Interna;
! Clculo das Normalizaes de reas Corrigidas.
Normalmente estas verificaes so efetuadas por arquivos protegidos fornecidos pelo fabricante
do sistema de dados; estes arquivos, quando utilizados permitem verificar se os clculos efetuados
esto em conformidade com resultados definidos nestes arquivos referncia.
Uma vez concluda a Qualificao de Operao de um sistema de Cromatografia a Gs, todos estes
registros devero ser armazenados em local de fcil acesso.
habitual que os fabricantes possuam para fornecimento Manuais contendo toda a documentao
de conformidade do sistema de cromatografia; incluindo informaes para a Qualificao de Projeto
e Desenvolvimento do sistema (DQ), a Qualificao de Instalao (IQ) que deve conter as
informaes em que o sistema foi instalado e a Qualificao de Operao (OQ), incluindo todos os
procedimentos a serem realizados e armazenamento dos registros das verificaes efetuadas. Portanto,
todas as intervenes efetuadas devero ser evidenciadas neste Manual, servindo este de histrico
do sistema.
6.4. Cromatografia em fase lquida HPLC
6.4.1. Manuteno preventiva de HPLC
Antes do incio do processo de Qualificao de Operao (OQ) do Sistema de HPLC, necessrio
a realizao de procedimentos de manuteno preventiva sugeridos pelo fabricante.
Em um Sistema de HPLC, fazem parte da rotina de Manuteno Preventiva:
Parte eletrnica: limpeza das partes eletrnicas e verificao das tenses de alimentao e internas,
verificao de funcionalidade das lmpadas nos detectores e avaliao de sua vida til.
Parte hidrulica: Limpeza de tubulaes e componentes do sistema pneumtico, verificao e
eliminao de possveis micro vazamentos e eventual substituio de selos de vedao e filtros de
fase mvel e da bomba, verificao de funcionalidade do transdutor de presso e sistema de
amortecimento de pulsos quando aplicvel, limpeza e verificao de funcionalidade de sistema de
introduo de amostra.
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Parte mecnica: Limpeza e lubrificao de componentes mecnicos do sistema de bombeamento a
amostrador automtico.
6.4.2. Qualificao de operao
O processo de Qualificao de Operao que ser aqui demonstrado, est representado
esquematicamente na Figura1:
Figura 1. Visualizao esquemtica do processo de verificao de Desempenho de um
Sistema de HPLC.
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Como um sistema de HPLC normalmente constitudo por vrios mdulos, em cada um destes
mdulos dever ser realizada a Qualificao de Operao. Assim, a concluso do processo de
Validao ocorrer com a realizao da Qualificao de Desempenho (PQ) que sempre dever ser
realizada utilizando-se todo o sistema de HPLC na realizao de atividades que comprovem que
todas as especificaes do instrumento esto de acordo com a necessidade para uso.
6.4.2.1. Qualificao do detector
Os parmetros mais importantes que devem ser verificados em um detector de Absorbncia so:
! Exatido do Comprimento de Onda;
! Este teste tem como objetivo de verificar a exatido na seleo de comprimento de onda com a
finalidade de garantir um baixo desvio no posicionamento da grade de difrao do sistema
ptico;
! Preciso de Comprimento de Onda;
! Poder ser utilizado o mtodo de emisso da linha de deutrio ou xennio, ambos considerados
padro natural ou utilizando um padro certificado de uma substncia cromfora;
! Nvel de Rudo e Desvio da Linha de Base;
! Este teste tem como finalidade garantir a especificao de sensibilidade do detector, uma vez
que estes fatores esto diretamente correlacionados a esta medio. Poder ser utilizado o mtodo
de monitoramento e medio de linha de base em intervalos de tempo definidos e verificao
com valores padro.
6.4.2.2. Qualificao da bomba
6.4.2.2.1. Exatido de fluxo da fase mvel
Este teste tem como objetivo garantir que o fluxo programado o fluxo real de operao da bomba.
Poder ser determinada pela medida (volumtrica) do fluxo bombeado em um determinado perodo
de tempo
6.4.2.2.2. Teste de rampa e queda de presso
O Teste de Rampa verifica as vlvulas de entrada e sada, vazamento nas conexes e a capacidade da
bomba em operar a alta presso.
6.4.2.2.3. Exatido da mistura de gradiente
Este teste tem como finalidade verificar a exatido da composio esttica e dinmica das misturas
de fase mvel durante uma anlise em sistemas de gradiente.
Poder ser utilizado o teste de se bombear duas fases mveis em diferentes propores ao longo do
tempo e verificar a real composio estabelecida.
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6.4.2.3. Qualificao do forno de colunas
6.4.2.3.1. Exatido de temperatura do forno
Com o objetivo de verificar a exatido de temperatura do forno, poder ser utilizado o mtodo de se
programar uma temperatura no forno e efetuar a medio com um termmetro eletrnico calibrado
com ponta flexvel que se adapte ao compartimento interno do forno.
6.4.2.4. Qualificao do amostrador automtico
6.4.2.4.1. Preciso do amostrador automtico
Com o objetivo de garantir a preciso especificada do amostrador automtico, poder ser utilizado
o teste de injeo de amostras sucessivas de uma soluo padro, obtendo-se o RSD% entre as reas
dos picos, o qual recomenda-se que seja menor que 1%.
6.4.2.5. Sistema de dados
A Qualificao de Sistema de Dados para HPLC dever ser realizada seguindo os mesmos
procedimentos que a do GC.
Uma vez concluda a Qualificao de Operaco de um sistema de Cromatografia a Gs, todos estes
registros devero ser armazenados em local de fcil acesso.
6.5. Sistemas de cromatografia acoplados a detectores de massas
6.5.1. Manuteno preventiva de sistemas detectores de massas
Assim como os sistemas anteriores, a manuteno preventiva dos sistemas detectores de massas
deve ser executada antes do processo de Qualificao de Operao (OQ).
Cada fabricante fornece uma lista de verificao (check-list) do equipamento em questo e esta
deve ser solicitada e preenchida a cada interveno de manuteno preventiva.
Os itens que so verificados em uma manuteno preventiva so basicamente divididos em trs
mdulos:
Sistema de vcuo;
Detector de massas;
Cromatgrafo.
6.5.1.1. Sistemas de vcuo
O sistema de vcuo fundamental para o bom funcionamento de qualquer sistema de espectrometria
de massas e portanto, devem ser executadas manutenes regulares e estas devem ser registradas no
histrico de funcionamento do equipamento.
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Os itens verificados em um sistema de vcuo so:
Verificao e substituio dos fluidos lubrificantes das bombas ( auxiliar e alto vcuo);
Verificao de mangueiras e conexes de vcuo;
Medio e registro de leituras de alto-vcuo e pr-vcuo de maneira regular.
6.5.1.2. Detector de massas
Os detectores de massas possuem um programa de sintonia ou auto-calibrao (autotune) que deve
ser utilizado para avaliao do estado de funcionamento do equipamento. Este programa normalmente
gera um relatrio que deve ser arquivado, pois isto servir para acompanhar seu desempenho bem
como identificar falhas prematuramente como, por exemplo, a necessidade de limpeza da fonte de
ons. recomendvel que estes relatrios sejam arquivados com freqncia de pelo menos uma vez
por semana, com reteno igual ao intervalo de verificao de desempenho.
Os itens observados neste relatrio so a exatido de massas, resoluo dos picos e resposta em
funo da massa.
A limpeza da fonte de ons dever ser feita sempre que necessria, mas deve ser adotada uma
frequncia mnima de limpeza que depender de como o equipamento est sendo utilizado (tipo de
amostra, nmero de amostras, etc).
6.5.1.3. Cromatgrafo
A manuteno preventiva do cromatgrafo deve ser feita junto com a do detetor de massas e o
procedimento j foi descrito nos captulos respectivos (GC ou HPLC).
6.5.2. Qualificao de operao
A Qualificao de Operao fundamental para garantir que equipamento encontra-se funcionando
conforme s especificaes do fabricante e, portanto, deve ser realizada em intervalos regulares. Os
fabricantes recomendam que esta freqncia seja de no mnimo uma vez ao ano ou aps uma
grande interveno de reparo. O especialista que executou este tipo de interveno ter ferramentas
para recomendar que seja feita uma Qualificao de Operao aps o reparo ou no. Esta avaliao
dever estar documentada.
Os itens avaliados em uma Qualificao de Operao so:
Preciso do injetor;
Linearidade do injetor;
Teste de contaminao de amostra para amostra (carry-over);
Linearidade do detector (opcional);
Exatido de massa;
Sensibilidade.
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6.5.2.1. Preciso do injetor
Este teste feito executando vrias injees de um padro conhecido e verificando a reprodutibilidade
de rea e/ou altura. Toma-se entre seis e dez medidas e calcula-se o desvio padro relativo, que
dever estar dentro de padres pr-estabelecidos.
6.5.2.2. Linearidade do injetor
Neste teste so feitas vrias injees de um padro de concentrao conhecido e varia-se o volume
injetado. Observa-se ento a linearidade em funo do volume injetado utilizando uma curva de
calibrao onde o fator de correlao utilizado para fazer a avaliao do teste. Compara-se ento
os resultados com valores pr-estabelecidos de aceitao.
6.5.2.3. Carry-over
O teste de carry-over ou contaminao de amostra para amostra executado injetando um padro
de concentrao elevada e em seguida apenas solvente. O resultado ideal que na injeo de solvente
no aparea resduo do padro injetado anteriormente. Os limites so estabelecidos normalmente
como menor ou igual a uma determinada rea ou altura.
6.5.2.4. Linearidade do detector
Um detector de massas torna-se no-linear quando o aumento da concentrao de amostra no
produz um aumento proporcional na formao e deteco dos ons.
O teste feito traando-se diferentes concentraes e plotando-se o resultado em uma curva de
calibrao onde avaliado o fator de correlao, comparando-o com resultados pr-determinados
de aceitao.
6.5.2.5. Exatido de massas
A exatido de massas avaliada atravs da injeo de um padro conhecido, quer seja pelo sistema
de auto-calibrao, quer seja pelo injetor de amostras.
Os resultados so avaliados comparando-se a massa obtida atravs do equipamento com o valor
terico do padro escolhido. Cada fabricante tem seus padres recomendados e critrios de aceitao
para este teste.
6.5.2.6. Sensibilidade
O teste realizado injetando um padro conhecido e verificando a relao sinal-rudo do pico
especificado no cromatograma obtido. Cada equipamento possui diferente valor para aprovao
neste teste.
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7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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