GENTICA FORENSE

Autores: Felipe Gonalves Murga

Srgio Paulo Lopes Fernandes




Professora: Zulmira Lacava






Braslia
2008

LISTA DE ILUSTRAES

Figura 1 Esquema da amplificao de DNA pela reao em cadeia da polimerase 9
Figura 2 Seqenciamento de DNA pelo mtodo de Sanger 14
Figura 3 Eletroferograma de uma anlise de DNA mitocondrial 15
Figura 4 Perfis de STR de dois diferentes indivduos 19
Figura 5 Tabela de loci utilizados em determinados mtodos multiplexados 20
Figura 6 Anlise de STR de um indivduo homem 21
Figura 7 Anlise de STR de um indivduo mulher 22

LISTA DE ABREVIATURAS

ABI Applied Biosystems, Inc.

CODIS Sistema Conjunto de Indexao de DNA [Combined DNA Index System]

DNA cido desoxirribonuclico

DNAmt DNA mitochondrial

EDNAP European DNA Profiling Group

ENFSI European Network of Forensic Science Institutes

IPCR Inverse-PCR

LCN Low Copy Number

mRNA cido ribonuclico mensageiro

PIA Paternally imprinted allele

PCR Reao em cadeia da polimerase

RACE Rapid Amplification of cDNA Ends

RFLP Polimorfismo do comprimento dos fragmentos de restrio [restriction fragment
length polymorphisms]

RT Transcriptase reversa

rTth enzima que realiza simultaneamente a transcrio reversa e a reao em cadeia da
polimerase

SGM Sistema multiplex de segunda gerao

STR Repeties curtas enfileiradas [short tandem repeats]

Taq DNA polimerase derivada da Thermus aquaticus

XL PCR PCR extra-longas

SUMRIO

1 Introduo 1
2 Histrico 3
3 DNA fingerprinting 6
4 Reao em cadeia da polimerase (amplificao de DNA in vitro) 8
5 Seqenciamento 13
6 Futuro 15
6.1 Amplificao de quantidade trao de DNA 15
6.2 Banco de dados 16
6.2.1 Seleo de loci STR para multiplexao forense 17
6.2.2 Nomenclatura do locus STR 18
6.3 Patentes 22

BIBLIOGRAFIA CONSULTADA 23

ANEXOS 24
Anexo A Genetic Fingerprinting 24

1 Introduo:
Barry Scheck e Peter Nefeuld expressaram bem a questo no prefcio de seu
livro Actual innocence: Os testes de DNA so para a justia o que o telescpio para as
estrelas; no uma lio de bioqumica, no uma exibio das maravilhas da lente de aumento,
mas uma maneira de ver as coisas como realmente so. O que poderia haver de errado nisso?
O cido desoxirribonucleico (DNA) o cdigo gentico de muitos organismos.
O DNA de humanos e de muitos outros organismos como gatos, ces, ovelhas, tigres, cavalos,
plantas (e.g., Cannabis sativa), e bactrias tem sido utilizado em aplicaes forenses. Os
primers para humanos podem ser utilizados para amplificar DNA de alguns outros primatas.
A maioria do DNA humano est presente no ncleo da clula. Ele est
empacotado nos 46 cromossomos da maioria das clulas. Este DNA denominado DNA
nuclear. Entretanto, uma pequena poro do DNA de cada clula est localizada nas
mitocndrias. Este DNA mitocondrial herdado por um mecanismo diferente e tratado de
forma diferente no contexto forense.
A maioria das clulas humanas diplide, isto significa que elas tm duas
cpias de cada cromossomo. So excees, as clulas sexuais (esperma ou vulos), que so
haplides (tem uma cpia simples de cada cromossomo), e as clulas do fgado, que so
poliplides triploidia (69,XXX) e tetraploidia (92,XXXX) so diferentes de aneuploidia
(47,XXX) e (48,XXXX). As clulas diplides contm 46 cromossomos em 23 pares (durante
40 anos considerou-se 48 cromossomos). Os cromossomos humanos so numerados de 1 a
22, no qual o maior recebe o nmero 1 e o segundo maior o nmero 2. Os 23 pares
compreendem os cromossomos X e Y, que d o sexo do indivduo. Este par pode ser
denominado como no autossmico ou germinativo.
Cada cromossomo possui um centrmero. Esta estrutura est envolvida na
organizao do DNA durante a diviso celular. Ele sempre fora do centro e por
conseqncia produz o brao curto e o brao longo do cromossomo.
Uma fmea normal tem dois cromossomos X enquanto que um macho normal
tem um cromossomo X e um Y. Um dos cromossomos X da fmea desativado em cada
clula, tornando-se uma estrutura visvel ao microscpio conhecida como corpo visvel de
Barr. O cromossomo X desativado pode diferir entre cada clula. Em mamferos, a existncia
de um cromossomo Y determina que o organismo seja macho. De fato, a existncia de uma
pequena seo do brao curto do cromossomo Y resultar em um macho (outras ordens de

vida, tais como os rpteis, determinam o sexo utilizando outros mecanismos). Um

cromossomo de cada um dos 23 pares herdado da me e outro do pai.
Pela anlise de um nico indivduo, no possvel dizer que cromossomo veio
do pai ou da me, com a exceo do cromossomo sexual de um indivduo macho cujo
cromossomo Y advm de seu pai e cujo cromossomo X advm de sua me. Entretanto, h
estudos recentes utilizando identificao do tipo paternally imprinted allele (PIA) que
sugerem que isto pode ser possvel para alguns loci. Em mamferos, alguns genes sofrem
impresso paterna e tanto o alelo da me quanto do pai pode ser preferencialmente expresso
nos seus descendentes. A razo para isto ainda desconhecida. A impresso parece estar
associada com a metilao diferencial do alelo. Trinta e nove genes humanos tm sido
identificados como sujeitos impresso paterna.
Quando o perfil de DNA da maioria dos indivduos verificado, eles mostram
um ou dois alelos para cada locus. Se eles apresentam um, ns assumimos que eles sero
homozigticos isto significa que eles tm recebido duas cpias de um mesmo alelo, um de
cada pai. Se os indivduos mostram dois alelos, ele ou ela denominado heterozigtico. Em
tais casos, o indivduo herdou diferentes alelos de cada pai. A exceo causada pelos alelos
nulos ou silenciosos.
Acredita-se que todos os humanos, exceto os gmeos idnticos, diferem em seu
DNA nuclear. Mesmo gmeos idnticos podem diferir em menor proporo. No h uma
prova formal deste conceito de unicidade, contudo isto tem pouca influncia nos trabalhos
forenses porque somente algumas poucas regies ou loci do genoma humano so examinadas.
As reas do genoma humano utilizadas para os perfis de DNA STR [short tandem repeats]
so largamente intrnicas. Isto significa que elas so segmentos de DNA que no codificam
para protenas distribudas entre reas do DNA que codificam para protenas. Elas foram
inicialmente consideradas no funcionais; entretanto, acumulam-se evidncias de que estas
regies de DNA podem, certamente, ter uma funo. Uma das funes para essas regies
pode ser a regulao do desenvolvimento de eucariotos. Interessantemente, grandes reas de
DNA que no codificam protenas, muitas das quais no esto relacionadas regulao, so
fortemente conservadas entre as espcies. Isto pode ser uma forte evidncia que elas tambm
so, certamente, funcionais.
Introns so peculiares de eucariotos e acredita-se que se desenvolveram
posteriormente na evoluo eucaritica. Eles apresentam uma caracterstica de conter regies
polimrficas, ou seja que tm muitas formas diferentes. Acredita-se que isto se deve

pequena ou quase nenhuma presso seletiva em alguns destes loci e, que por conseqncia,
diferentes formas podem subsistir lado a lado na populao.
Algumas alteraes allicas tm sido registradas em clulas da mucosa oral e
colorretal de pacientes com cncer e isto pode afetar a genotipagem quando um DNA de
referncia tomado de um tecido diferente do corpo na amostra de cena de crime.

2 Histrico:
At meados da dcada de 1980, a amplificao de uma determinada regio do
DNA dependia do mtodo Cohen-Boyer de clonagem molecular, a saber: recortar o pedao
desejado de DNA, inseri-lo num plasmdeo, e inserir o plasmdeo modificado numa clula
bacteriana. Essa clula ento se replicava, duplicando em cada replicao o segmento inserido
de DNA. Quando as bactrias se multiplicassem o suficiente, purificava-se o segmento de
DNA desejado separando-o da massa total de DNA da populao bacteriana. Embora
houvesse sido aprimorado desde os experimentos originais de Boyer e Cohen, esse
procedimento continuava sendo trabalhoso e demorado. A descoberta da reao em cadeia da
polimerase (PCR) foi, portanto, um grande avano: alcanava-se o mesmo fim a
amplificao seletiva de um segmento de DNA em poucas horas, sem a necessidade de ficar
lidando com bactrias.

Nesta poca, a controvrsia genmica estava no auge, talvez porque a
tecnologia forense estivesse sendo aplicada cada vez mais, embora ainda se usasse a tcnica
original, ainda no aperfeioada, de Jeffreys a barulhenta e obscura anlise dos
polimorfismos do comprimento dos fragmentos de restrio [conhecidos pela sigla em ingls
RFLP = restriction fragment length polymorphisms]. Inevitavelmente, alguns resultados eram
difceis de interpretar e, com isso, a identificao genmica passara a ser contestada por
motivos tcnicos e legais.

No incio, quando a identificao genmica era realizada em laboratrios
forenses no especializados no manuseio e na anlise do DNA, erros crassos no eram
incomuns. Os rgos de segurana pblica logo perceberam que, se quisessem que essa nova
e poderosa arma continuasse sendo usada, essas questes teriam de ser resolvidas. Foi quando
um novo tipo de marcador gentico as chamadas repeties curtas enfileiradas,
conhecidas pela sigla em ingls STRs [short tandem repeats] substituiu o mtodo dos

RFLPs. O tamanho das STRs pode ser medido com bastante preciso, eliminando-se assim a
avaliao subjetiva das faixas de RFLPs num filme de raios X. E a comunidade da cincia
forense tambm resolveu rapidamente o problema da competncia tcnica varivel ao
estabelecer no s um cdigo uniforme de procedimentos para a identificao genmica, mas
tambm um sistema de credenciamento de laboratrios.

Na Rssia, a identificao dos resqucios esqueletais da famlia do czar
Romanov foi recebida com certo ceticismo, especialmente pela discrdia entre os cientistas
russos e uma equipe americana que participava do projeto. Mas, em setembro de 1992, o dr.
Pvel Ivanov levou nove amostras de ossos ao laboratrio de Peter Gill, do Servio de Cincia
Forense [Forensic Science Service] da Gr-Bretanha. Gill e um colega, David Werrett, eram
co-autores do primeiro trabalho que Alec Jeffreys publicou nesse campo e haviam fundado o
Servio de Cincia Forense, o primeiro laboratrio do Reino Unido especializado em
identificao genmica.
Gill desenvolvera um mtodo de identificao que utilizava DNA mitocondrial
(DNAmt) que, como vimos na anlise dos restos neandertais, muito mais profcuo quando
o DNA disponvel velho ou difcil de obter (o DNAmt muito mais abundante do que o
DNA cromossmico do ncleo celular).
A primeira incumbncia de Gill e Ivanov foi o delicado trabalho de extrair
DNA nuclear e DNAmt das amostras de ossos. A anlise mostrou que cinco corpos eram
aparentados e que trs deles pertenciam a trs irms. Mas seriam ossos dos Romanov? No
caso da czarina Alexandra, pelo menos, era possvel encontrar uma resposta comparando a
impresso genmica do DNAmt de seus ossos com a impresso do DNAmt de seu sobrinho-
neto, o prncipe Phillip, duque de Edimburgo. As impresses eram simtricas.
Encontrar um parente do czar foi bem mais difcil. O corpo do gro-duque
Georgij Romanov, irmo caula do czar, jazia num requintado sarcfago de mrmore
considerado precioso demais para ser arrombado. O sobrinho do czar recusou-se a cooperar,
ainda rancoroso com a recusa do governo britnico em conceder asilo sua famlia quando
irrompeu a revoluo. Sabia-se da existncia de um leno ensangentado no Japo, que o czar
usara aps ser atacado por um espadachim homicida em 1892. Gill e Ivanov obtiveram um
pequeno pedao do leno, mas verificaram que ao longo dos anos a relquia fora to
contaminada por DNA estranho que se tornara intil para esse fim. S quando dois parentes

distantes puderam enfim ser localizados que se confirmou que a impresso do DNAmt era
realmente do czar.
Contudo, a anlise guardava mais uma surpresa: as seqncias de DNAmt do
suposto czar e de seus parentes modernos eram semelhantes, mas no idnticas.
Especificamente, na posio 16.169, o DNAmt do suposto czar continha um C e o dos dois
parentes apresentava um T. Testes subseqentes mostraram outras complicaes. O DNA
mitocondrial do czar era, na realidade, uma mistura de dois tipos (C e T), uma condio
bastante rara conhecida como heteroplasmia a coexistncia num mesmo indivduo de mais
de um tipo de DNAmt.
Alguns anos depois, as dvidas de todos (exceto as dos mais ferrenhos adeptos
de teorias conspiratrias) foram finalmente resolvidas. O governo russo concordara em
romper o sarcfago e proporcionar a Ivanov uma amostra de tecido de Georgij Romanov,
irmo do czar. As mitocndrias do gro-duque apresentavam exatamente a mesma
heteroplasmia encontrada nos ossos do fosso em Koptiaki. Agora no havia dvida de que os
ossos eram do czar.

Quando Brian Sykes fundou uma empresa para oferecer servios de
identificao genmica, um dos primeiros clientes foi a Sociedade John Clough, cujos
membros remontam suas origens a um breto de mesmo nome que emigrara para
Massachusetts em 1635. A sociedade sabia tambm que certo antepassado de John Clough,
Richard, da linhagem galense da famlia, recebera o ttulo de cavaleiro por feitos numa
cruzada Terra Santa. Mas no havia nenhuma prova histrica que associasse suas famlias
quelas do outro lado do Atlntico. A empresa de Sykes analisou o DNA de cromossomos Y
dos Clough de Massachusetts e de um homem que descendia diretamente de sir Richard: eram
idnticos comprovao para o ramo de Massachusetts. Mas nem todos os Clough
americanos tiveram a mesma sorte, pois se constatou que membros da sociedade no Alabama
e na Carolina do Norte no tinham parentesco nem com sir Richard nem com os Clough de
Massachusetts.

Um caso recente mereceu vrias manchetes devido ao grande interesse
histrico do suposto pai. H muito suspeitava que Thomas Jefferson, terceiro presidente dos
Estados Unidos e principal autor da Declarao de Independncia, fora mais do que um dos
pais fundadores da nao, pois teria tido um ou mais filhos com sua escrava, Sally Hemings.

A primeira acusao data de 1802, apenas doze anos aps o nascimento de um menino, Tom,
que adotaria o sobrenome de um de seus donos subseqentes, Woodson. Alm disso, uma
forte semelhana com Jefferson havia sido notada no ltimo filho de Hemings, Eston. Mas era
o DNA que estava fadado a resolver a questo.
Thomas Jefferson no deixou descendentes homens legtimos, de modo que era
impossvel determinar os marcadores do seu cromossomo Y. Em vez disso, os pesquisadores
obtiveram amostras do DNA dos descendentes masculinos do seu tio paterno, Field Jefferson
(cujo cromossomo Y teria sido idntico ao do presidente), e as compararam com amostras dos
descendentes masculinos de Tom Woodson e Eston Hemings. Os resultados identificaram
uma inconfundvel impresso jeffersoniana no cromossomo Y, mas a impresso genmica
no estava presente nos descendentes de Tom Woodson. A reputao de Jefferson conseguiu
escapar ilesa dessa bala. Todavia, nos descendentes de Eston Hemings, a assinatura
jeffersoniana no cromossomo Y estava clara e distinta. O que o DNA no pode confirmar sem
razovel sombra de dvida a origem desse cromossomo. No podemos dizer com certeza se
o pai de Eston foi realmente Thomas Jefferson ou se algum outro homem da linhagem
jeffersoniana teve acesso a Sally Hemings.

3 DNA fingerprinting:
DNA fingerprinting ou identificao genmica [literalmente, datiloscopia
do DNA], como chamada a tcnica que salvou Marvin Anderson de uma priso perptua
indevida, foi uma descoberta acidental de um geneticista britnico, Alec Jeffreys. Desde o
incio da revoluo instaurada pela tecnologia do DNA recombinante, Jeffreys se interessara
pelas diferenas genticas entre as espcies. Suas pesquisas na Universidade de Leicester se
concentraram no gene da mioglobina, que produz uma protena semelhante hemoglobina,
encontrada principalmente em tecido muscular. Foi durante essa dissecao molecular que
ele constatou algo muito estranho; um pequeno trecho de DNA que se repetia continuamente.
Um fenmeno similar havia sido observado em 1980 por Ray White e Arlene Wyman, que, ao
examinarem outro gene, constataram que o nmero dessas repeties variava de indivduo
para indivduo. Jeffreys concluiu que faziam parte do DNA-lixo, por no participarem de
codificao de protenas, mas logo verificou que esse lixo em particular poderia ser muito
bem aproveitado.
Jeffreys constatou que esse curto trecho de DNA repetitivo aparecia no apenas
no gene da mioglobina, mas espalhado por todo o genoma. E, embora os trechos variassem

um pouco de uma repetio para outra, todos tinham em comum uma seqncia curta,
praticamente idntica, de cerca de quinze nucleotdeos. Ele decidiu usar essa seqncia como
uma sonda: utilizando uma amostra purificada da seqncia, marcada com uma molcula
radioativa, ps-se a caar a seqncia por todo o genoma. O DNA do genoma espalhado
numa folha de nilon especial e, por emparelhamento das bases, a sonda ir grudar na sua
seqncia complementar sempre que a encontrar. Usando um filme de raios X sob a folha de
nilon, Jeffreys pde registrar o padro desses pontos radioativos. Quando revelou o filme
desse experimento, ficou pasmo com o que viu. Embora a sonda houvesse detectado muitas
seqncias similares em inmeras amostras de DNA, ainda restava tanta variao entre uma
amostra e as demais que, mesmo naquelas extradas de membros da mesma famlia, era
possvel distinguir um indivduo do outro. Como disse no artigo que escreveu a respeito para
a revista Nature em 1985, o perfil nos fornece uma fingerprint [impresso digital] especfica
de cada indivduo.
O nome identificao genmica, ou DNA fingerprinting, pertinente, pois essa
tecnologia tem a capacidade de identificar indivduos por meio da sua impresso
impresso digital na datiloscopia tradicional, uma impresso genmica no caso do DNA
fingerprinting. Jeffreys e seus colegas extraram amostras de DNA do prprio sangue e as
submeteram ao mesmo procedimento. Conforme esperado, as imagens estampadas no filme
de raios X permitiram distinguir, sem ambigidade, cada um deles. Jeffreys percebeu que
havia um amplo espectro de utilidades possveis.

Hoje, as repeties curtas enfileiradas (STRs = short tandem repeats)
substituram os polimorfismos do comprimento dos fragmentos de restrio (RFLPs =
restriction fragment length polymorphism) como o principal mtodo de identificao
genmica. As STRs, cujas seqncias de duas a quatro bases podem se repetir at dezessete
vezes, so segmentos comumente amplificados pela reao em cadeia da polimerase. Os loci
STR selecionados tm alelos muito menores, entre 100 e 400 pares de base (pb). Por exemplo,
a D7S820 uma regio do cromossomo 7 onde a seqncia AGAT pode ocorrer entre sete e
quatorze vezes. No entanto, a DNA polimerase no muito eficiente em copiar esses trechos
repetidos de DNA seu sistema de contagem no muito preciso , de modo que h um
grande nmero de mutaes nas cpias que ela faz da seqncia AGAT na posio D7S820 (a
DNA polimerase de procariotos no apresenta unidades de verificao como as de
eucariotos). Em outras palavras, h muita variao no nmero de cpias de AGAT em cada

ser humano. Como possumos duas cpias do cromossomo 7 (uma de nosso pai, outra de
nossa me), costumamos ter um nmero diferente de repeties AGAT em cada uma
digamos, oito em uma das cpias e onze na outra , mas isso no significa dizer que um
indivduo no possa ser homozigtico para um determinado nmero de repeties (e.g., onze
e onze). Se realizarmos uma anlise de identificao genmica numa amostra de sangue
encontrada na cena de crime e constatarmos que ela corresponde s caractersticas do suspeito
na regio D7S820 (digamos, oito e onze repeties), haver um indcio, mas no uma prova
conclusiva da sua culpabilidade afinal, muitas outras pessoas tambm tm um gentipo 8/11
na regio D7S820. Portanto, necessrio examinar diversas regies; quanto maior o nmero
de regies em que o DNA da cena de crime corresponder s do suspeito, maior a
probabilidade de ele ser culpadas e mais remotas as chances de o DNA encontrado no local de
crime ter vindo de outra pessoa. No sistema do FBI, a identificao genmica se faz mediante
anlise de doze regies, mais um marcador que determina o sexo do indivduo de quem a
amostra de DNA foi retirada.

4 Reao em cadeia da polimerase (amplificao de DNA in vitro):
Ela para os genes aquilo que o sistema de impresso de Gutenberg foi para a
palavra escrita. A tcnica de reao em cadeia da polimerase [Polymerase Chain Reaction
(PCR)] pode amplificar uma seqncia desejada de DNA de fita simples ou dupla de qualquer
origem (DNA genmico, DNA viral, seqncias clones, lisados de clulas, DNA bacteriano,
DNA de planta, ou DNA antigo, por exemplo) centenas de milhes de vezes em questo de
horas, uma tarefa que teria exigido muitos dias com a tecnologia recombinante. A tcnica de
PCR especialmente valiosa porque a reao altamente especfica, facilmente automatizada,
e capaz de amplificar diminutas quantidades de amostra. Por estas razes, a PCR tambm tem
proporcionado um grande impacto na medicina clnica, no diagnstico de doenas genticas,
na cincia forense, e na biologia evolucionria.
A PCR um processo baseado em uma enzima polimerase especializada, que
pode sintetizar uma fita complementar para uma dada fita de DNA, utilizando uma mistura
contendo a seqncia alvo, as 4 bases do DNA, 2 fragmentos (primers, cada qual com cerca
de 20 bases de comprimento), e geralmente 10 mM de tampo Tris-HCl, 50 mM de KCl para
conferir fora inica, e Mg
+2
como um co-fator (concentraes timas de Mg
+2
podem ter que
ser determinadas para cada reao).

A reao em cadeia da polimerase foi originalmente descrita em 1986 e desde

ento tem se tornado uma das tcnicas mais freqentemente utilizadas e largamente aplicadas
na biologia celular. Em sua forma mais simples, dois oligodesoxiribonucleotdeos (oligos) so
utilizados para selecionar uma seqncia alvo especfica de uma mistura de molculas de
DNA e atuar como primers para a extenso do DNA utilizando o DNA alvo como molde.

Figura 1: Esquema da amplificao de DNA pela reao em cadeia da polimerase:


A reao em cadeia da polimerase um processo ao mesmo tempo requintado
e simples. Por meio de mtodos qumicos, sintetizamos dois primers pequenos trechos de
uma nica fita de DNA, normalmente com vinte pares de bases de comprimento cuja
seqncia corresponde s regies que margeiam o segmento de DNA em que estamos
interessados. Os primers, que delimitam o gene desejado, so adicionados ao molde de DNA,
que foi extrado de uma amostra de tecido e que essencialmente contm o genoma inteiro.
Quando o DNA aquecido a 95 C 1C, as duas fitas se separam. Isso permite que cada
primer se ligue aos fragmentos de vinte pares de bases do molde cujas seqncias sejam
complementares s suas. A T
m
(temperatura na qual metade das molculas est na forma de

10

fita dupla e metade na forma de fita simples) freqentemente utilizada para a temperatura de
acoplamento e ento ajustada para cima ou para baixo se necessrio [se o primer tem 18 bases
de comprimento ou menos, a T
m
pode ser estimada pela seguinte frmula: T
m
= 4 C (nmero
de pares de base GC) + 2 C (nmero de pares de base AT)]. Desse modo, formamos duas
pequenas ilhas, com vinte pares de bases de DNA de dupla fita, ao longo das fitas simples do
molde de DNA. A DNA polimerase a enzima que copia DNA incorporando novos pares de
bases em posies complementares ao longo de uma fita de DNA s funcionar a partir do
ponto em que o DNA j for de fita dupla. Portanto, a DNA polimerase passa a atuar na ilha de
fita dupla criada pela unio do primer com a regio complementar do molde quando a
temperatura baixada para 72 C. A polimerase faz uma cpia complementar do molde de
DNA a partir de cada primer, copiando assim a regio-alvo. No final do processo, a
quantidade total do DNA-alvo ter dobrado. Em seguida, repetimos a etapa de aquecimento e
o processo todo ocorre novamente. E, mais uma vez, dobra-se o nmero de cpias do DNA
delimitado pelos dois primers. Cada ciclo do processo resulta na duplicao da regio visada.
Aps 25 ciclos da reao em cadeia da polimerase ou seja, em menos de duas horas , nosso
DNA-alvo ter sido amplificado 2
25
vezes (cerca de 34 milhes de vezes). Com isso, a
soluo resultante, que comeou como uma mistura de molde de DNA, primers, enzimas
DNA polimerase e As, Ts, Gs e Cs livres, ter se tornado uma soluo concentrada da regio-
alvo do DNA.
Um grave problema inicial da reao em cadeia da polimerase que a DNA
polimerase, a enzima responsvel pela multiplicao, destruda a 95 C. Portanto, torna-se
necessrio obter enzimas novas em cada um dos 25 ciclos do processo. A polimerase cara,
de modo que logo ficou evidente que a sua reao em cadeia, por maior que fosse o potencial,
no seria uma ferramenta economicamente vivel se significasse transformar em fumaa
enormes quantidades do material. Mas a natureza acabou dando uma mozinha. Muitos
organismos vivem em temperaturas muito superiores aos 37 C ideais para a E. coli, a fonte
original da enzima; as protenas dessas criaturas, incluindo enzimas como a DNA polimerase,
foram se adaptando ao longo de milnios de seleo natural para suportar o calor. Hoje, a
reao em cadeia da polimerase costuma ser realizada usando uma forma de DNA polimerase
derivada da Thermus aquaticus (Taq), uma bactria que vive nas termas quentes do parque
nacional Yellowstone. Embora a Taq apresente taxas baixas de erro, suficientemente exata
para a maioria das aplicaes. Se a exatido for fundamental para o experimento, pode ser
necessrio utilizar uma polimerase que tenha uma exonuclease 3-5 intrnseca, com atividade

11

de verificao, como a polimerase vent. Para a amplificao de seqncias de mais do que 10

kpb, devem ser utilizadas condies de PCR extra-longas (XL PCR), e, por esta razo, torna-
se fundamental utilizar uma polimerase com atividade de verificao, porque os erros podem
levar a terminao da sntese.
Repetidos ciclos de aquecimento e resfriamento multiplicam o DNA alvo
exponencialmente, pois cada nova fita dupla se separa para servir de molde para as snteses
subseqentes. Em aproximadamente 1 hora, 20 ciclos de PCR podem amplificar o alvo por
um milho.
A DNA polimerase utilizada no PCR especfica para DNA, mas possvel
analisar RNA mensageiros (mRNA) utilizando o mtodo de PCR pela incorporao de uma
etapa com uma transcriptase reversa (RT) de forma a converter mRNA em uma fita dupla
complementar de DNA; esta tcnica conhecida como RT-PCR. A transcrio reversa e a
PCR podem ser realizadas por uma nica enzima, rTth, porque ela apresenta tanto atividade
de transcriptase reversa como de polimerase.
Para alguns experimentos, necessrio e mais eficiente amplificar um nmero
de produtos diferentes simultaneamente em uma nica reao, usando diferentes primers. Isto
denominado PCR multiplexado. Para o PCR multiplexado, faz-se necessrio otimizar a
escolha dos primers
1
e as condies da reao de modo a eliminar produtos de amplificao
esprios. A reao em cadeia da polimerase pode ser utilizada para: amplificao de DNA (na
identificao e isolamento de uma ou poucas cpias de uma seqncia alvo especfica de uma
matriz complexa); na manipulao de DNA (os primers de PCR podem ser desenvolvidos
para ter um stio de restrio incorporado extremidade 5, desta forma torna-se possvel
utilizar o PCR para amplificar genes inteiros ou pores de genes para propsitos de
engenharia gentica); na clonagem de genes com primers degenerados (PCR utilizada para
clonar genes mesmo quando a seqncia exata do gene de interesse no conhecida, por
exemplo, quando a seqncia de um gene determinada por traduo reversa da seqncia de

1
H vrias consideraes no desenvolvimento de primers para PCR. Embora a extremidade 3 do primer,
sobretudo suas duas ltimas bases, seja importante para a especificidade e logo deveria ser complementar
seqncia alvo, possvel acoplar seqncias no complementares ao terminal 5, por exemplo, stios de enzima
de restrio (para facilitar a clonagem dos amplicons de PCR) ou promotores. Os pares GC so mais estveis do
que os pares AT (os pares GC tm trs pontes de hidrognio e os pares AT tm duas), e prefervel ter Gs ou
Cs na extremidade 3 do primer e um contedo GC de 45 a 55%. Existem programas de computador que
ajudam a desenvolver primers mais eficientes para seqncias conhecidas. Idealmente a temperatura para ambos
primers deveria ser a mesma (dentro da fixa de 1 a 2 C) de maneira que ambos acoplamentos ocorram na
mesma temperatura. De forma a prevenir o acoplamento entre primer, que reduziria a eficincia da amplificao,
os primers no devem ser complementares entre si ou em relao a cada outro.

12

uma protena); na recombinao e na mutagnese de stios especficos; na clonagem de

seqncias desconhecidas: Inverse-PCR (IPCR) e Rapid Amplification of cDNA Ends
(RACE); no mapeamento gentico utilizando PCR; na anlise de expresso gnica; no
seqenciamento de DNA; e na anlise forense e na anlise de DNA antigo (a sensibilidade da
PCR e sua habilidade para detectar uma molcula alvo em uma mistura complexa, e o fato de
que a PCR utilizada para amplificar produtos de amostras de DNA no clonveis quando o
DNA no tem sido purificado ou quando ele parcialmente degradado tem feito da PCR
uma ferramenta valiosa quando o material inicial limitado ou de baixa qualidade. Por estas
razes, a tcnica de PCR tem se mostrado especialmente til na anlise de DNA antigo
isolado de, por exemplo, espcimes de museu, lminas, mamutes congelados, ou insetos em
mbar).
A tcnica de PCR utilizada na cincia forense pelas mesmas razes que ela
aplicada na anlise de DNA antigo. Ela ajuda na produo de material de alta qualidade
suficiente para as anlises subseqentes. Por este motivo, a anlise de marcadores baseado na
tcnica de PCR muito mais rpida do que os mtodos antigos, tais como a anlise de RFLP,
para confrontar amostras (tais como amostras de sangue ou esperma) com indivduos.
A introduo da anlise de STR baseada na tcnica de PCR expandiu a
utilidade de perfil de DNA. Eis os motivos:
O desenvolvimento de PCR melhorou a sensibilidade da anlise;
O tempo por anlise foi reduzido a menos de 24 horas;
O custo efetivo do mtodo foi amplamente melhorado devido reduo do
trabalho necessrio;
Loci STR menores permitiram a anlise de amostras de DNA degradados, que
so freqentemente encontrados pelos peritos forenses. Isto ocorre porque
esses segmentos menores de DNA apresentam mais chances de estarem
intactos aps degradao do material;
Loci STR podem ser multiplexados juntos utilizando diferentes tipos de pares
de primers para amplificar diversos loci em uma reao. A multiplexao foi
posteriormente facilitada pelo desenvolvimento de primers marcados que
podiam ser analisados em um seqenciador automtico;
A coleta de dados foi automatizada, e a anlise de dados foi parcialmente
automatizada.

13

5 Seqenciamento:
O outro burro de carga foi o prprio mtodo de seqenciar DNA. Tambm
aqui, a teoria qumica subjacente no era nova; o Projeto Genoma Humano usou o mesmo
mtodo desenvolvido por Fred Sanger em meados dos anos 1970. A inovao estava na
escala, na mecanizao do processo de seqenciamento.
Os dois mtodos bsicos de seqenciamento, Maxam-Gilbert e Sanger, diferem
principalmente na forma que os fragmentos de DNA so produzidos. Ambos os mtodos
funcionam porque a eletroforese em gel produz separaes de elevada resoluo de molculas
de DNA; mesmo fragmentos que diferem por apenas um simples nucleotdeo podem ser
resolvidos. O seqenciamento de Maxam-Gilbert (tambm chamado mtodo de degradao
qumica) utiliza substncias qumicas para quebrar o DNA em regies de bases especficas,
resultando em fragmentos de diferentes tamanhos. Um refinamento do mtodo de Maxam-
Gilbert, conhecido como seqenciamento multiplexado, tornou os pesquisadores capazes de
analisarem aproximadamente 40 clones de um nico seqenciamento em gel de DNA.
O seqenciamento de Sanger (tambm chamado de terminao da cadeia ou
mtodo da didexi) utiliza um procedimento enzimtico para sintetizar cadeias de DNA de
comprimentos variveis por meio de quatro diferentes reaes, parando a replicao do DNA
nas posies ocupadas por uma das quatro bases, e, portanto, determinando o tamanho dos
fragmentos resultantes. Cada tubo de reao de seqenciamento (T, C, G, e A) no diagrama da
figura 2 contm: um molde de DNA, uma seqncia primer, e uma DNA polimerase para
iniciar a sntese de uma nova fita de DNA a partir do ponto no qual os primers hibridizam
com o molde; quatro trifosfato deoxinucleotdeos (dATP, dTTP, dCTP, e dGTP) para
estender a fita de DNA; um trifosfato de deoxinucleotdeo (usando um elemento radioativo ou
corante); e um trifosfato de dideoxinucleotdeo, que termina o alongamento da cadeia quando
ele incorporado. O tubo A tem didATP, o tubo C tem didCTP, etc.
Por exemplo, no tubo de reao A, a razo de dATP para didATP ajustada de
forma que o tubo tenha uma coleo de fragmentos de DNA com uma didATP incorporada
para cada posio de adenina nos fragmentos moldes de DNA. Os fragmentos de tamanhos
variados so ento separados por eletroforese (1) e as posies dos nucleotdeos analisadas
para determinar a seqncia. Os fragmentos so separados com base em seu tamanho, com os
fragmentos mais curtos movendo-se mais rapidamente e aparecendo na base do gel. A
seqncia lida da base para o topo (2) (figura 2).

14

Figura 2: Seqenciamento de DNA pelo mtodo de Sanger:


A automao do seqenciamento comeou a ser desenvolvida no laboratrio de
Lee Hood, no Caltech.
Na verdade, o seqenciamento automatizado nasceu das idias de Lloyd Smith
e Mike Hunkapiller. Quando trabalhava no laboratrio de Hood, Hunkapiller procurou Smith
para falar sobre um mtodo de seqenciamento que usava um corante diferente para cada tipo
de base. Em princpio, a idia prometia tornar o processo de Sanger quatro vezes mais
eficiente: em vez de quatro reaes de seqenciamento separadas, cada uma numa banda de
gel distinta, o cdigo de cores permitiria realizar tudo num nico conjunto de reaes e obter
o resultado numa nica banda de gel. Smith mostrou-se inicialmente pessimista, temendo que
as quantidades de corantes exigidas pelo mtodo seriam pequenas demais para detectar. Mas,

15

sendo um especialista em aplicaes de laser, logo concebeu uma soluo usando corantes
especiais que ficam fluorescentes sob raios laser.
Segundo o mtodo de Sanger, cria-se uma srie de fragmentos de DNA, que
so selecionados pelo gel de acordo com o tamanho de cada um. Cada fragmento marcado
com o corante fluorescente que corresponde ao seu nucleotdeo didexi demarcador de
cadeia; desse modo, a cor emitida pelo fragmento identifica qual a base. Em seguida, um
laser rastreia o fundo do gel, ativando a fluorescncia, e uma clula fotoeltrica ali colocada
detecta a cor emitida por cada pedao de DNA. Essas informaes so alimentadas
diretamente num computador, evitando-se assim o extenuante processo de digitar dados que
transtornava o seqenciamento manual.

Figura 3: Eletroferograma de uma anlise de DNA mitocondrial:


6 Futuro:
6.1 Amplificao de quantidade trao de DNA:
Com os mtodos antigos, anteriormente descritos, se necessitava tipicamente
de 500 ng de material. Por outro lado, com a tcnica da reao em cadeia de polimerase, 1 ng
ou menos pode ser analisado. Geralmente, a perfil de STR baseado em PCR sensvel a cerca
de 250 pg; no entanto, uma concentrao de 0.5 a 1.0 ng geralmente analisada. Para
aumentar a sensibilidade de amostras de DNA abaixo deste limiar, podem ser empregados at
34 ciclos. Isto d um fator de amplificao terico de 17.179.869.184 e permite analisar
amostras que tem somente quantidades trao de DNA tais como superfcies que foram
tocadas. Na verdade, possvel amplificar o DNA de uma nica clula. A anlise de vestgios
de DNA em quantidades trao denominada low copy number (LCN). Os relatrios de

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anlise de vestgios de LCN so diferentes dos relatrios de perfil de DNA convencional

devido ao aumento da incerteza na origem do DNA e ao aumento de artefatos.

6.2 Banco de dados:
Em 1990, o FBI montou uma base de dados de DNA, o Sistema Conjunto de
Indexao do DNA [CODIS = Combined DNA Index System], que, em junho de 2002,
continha 1.013.746 impresses genmicas. Dessas, 977.895 eram de criminosos condenados e
35.851 provenientes de amostras obtidas no local de crimes no resolvidos. Desde a sua
criao, o CODIS j efetuou 4.500 identificaes que no teriam sido possveis de outra
maneira.
Uma das principais justificativas para uma base de dados nacional o potencial
de se fazer cold hits identificaes a partir exclusivamente de dados j cadastrados. Suponha
que investigadores encontrem um pouco de DNA sangue numa janela quebrada, smen
numa pea ntima no local de um crime e determinem a impresso genmica dessa amostra.
Suponha agora que eles no tenham obtido nenhum outro tipo de pista convencional. Porm,
quando a impresso genmica cadastrada no CODIS, o sistema acusa uma correspondncia.
Foi o que aconteceu em Saint Louis em 1996. A polcia investigava o estupro de duas jovens
em regies opostas da cidade e, embora as duas amostras de smen analisadas pelo mtodo
dos RFLPs mostrassem que o mesmo homem cometera ambos os crimes, no tinha sido
possvel identificar um suspeito. Trs anos depois, as amostras foram re-analisadas usando as
STRs e os resultados comparados com as impresses cadastradas no CODIS. Com isso, se
encontrou o estuprador em 2001, certo Dominic Moore, cuja impresso genmica fora
cadastrada no CODIS ao confessar trs outros estupros em 1999.
O intervalo entre o crime e o cold hit pode ser ainda mais impressionante;
alguns malfeitores devem ter levado um choque ao se depararem com o jaccuse molecular de
vtimas h muito tempo enterradas. Na Gr-Bretanha, Marion Crofts, de catorze anos, foi
estuprada e assassinada em 1981, muito antes de as tcnicas de identificao genmica
entrarem em uso. Felizmente, algumas provas materiais foram preservadas, tornando possvel
estabelecer uma impresso genmica em 1999. Mas as autoridades e a famlia pesarosa de
Crofts acabaram desapontadas mais uma vez, ao serem informadas agora de que no havia
impresso correspondente na Base Nacional de Dados de DNA do Reino Unido. Dois anos
depois, em abril de 2001, Tony Jasinskyj foi preso por atacar sua esposa e uma amostra de

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DNA foi extrada dele como procedimento de rotina. Aps ser inserida na base de dados, a
correspondncia veio tona; Jasinskyj era o estuprador desconhecido de vinte anos antes.
Assim, os perodos de prescrio visam a impedir erros judicirios. O DNA,
entretanto, uma testemunha de outra ordem. Amostras armazenadas em condies
apropriadas permanecem estveis por muitos anos, enquanto as impresses genmicas nunca
perdem seu poder incriminativo.
O Departamento de Defesa Americano instituiu o Armed Forces Repository of
Specimen Samples for Identification of Remains [Repositrio das Foras Armadas para
Amostras de Espcimes para Identificao de Restos Mortais]. Desde ento, amostras de
sangue e de DNA so obtidas de todos os novos membros das foras armadas, tanto os da
ativa como os reservistas, e em maro de 2001 o repositrio continha mais de 3 milhes de
amostras.

6.2.1 Seleo de loci STR para multiplexao forense:
Loci STR consistem de segmentos repetidos de duas a oito bases. Eles so
denominados dimricos, trimricos, e assim por diante. Loci dimricos no so utilizados para
aplicaes forenses devido ao grande nmero de bandas esprias que se formam durante a
amplificao, as quais so difceis de interpretar. Loci trimricos, tetramricos, e pentamricos
so menos sujeitos a este problema.
Diversos fatores so considerados na escolha de um loci STR:
Deseja-se um alto nvel de variabilidade dentro de um locus de forma que o
locus tenha uma baixa probabilidade de coincidncia.
O comprimento dos alelos deve estar entre 90 e 500 pb. Tipicamente, quanto
maior o peso molecular dos alelos, menor a preciso de sua medida. Alelos
menores so menos afetados pela degradao.
Loci podem ser selecionados com base na localizao cromossmica para
garantir que loci prximos no sejam escolhidos. Na figura 4, h localizao de
alguns loci comuns. Como um guia rpido para a nomenclatura de localizao
do locus, aqueles que comeam com D5 esto no cromossomo 5.
Robustez e reprodutibilidade de resultados so essenciais.
De forma a facilitar a interpretao, desejvel que os loci no repitam
excessivamente.

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Sistemas multiplexados antigos foram baseados em uns poucos loci STR. O
sistema de quatro locus quadruplex foi provavelmente o primeiro a ser largamente utilizado
para propsitos forenses. A probabilidade de coincidncia era baixa para os padres
modernos, na ordem de 10
-4
. Em 1996, um sistema de seis locus STR combinado com o teste
do sexo da amelogenina foi introduzido. Esse sistema, conhecido como multiplex de segunda
gerao (SGM) tinha mais loci e inclua os loci complexos HUMD21S11 e
HUMFIBRA/FGA, que so altamente polimrficos. A probabilidade de coincidncia esperada
foi diminuda para aproximadamente 1 em 50 10
6
. Sistemas multiplexados com mais loci e
maior poder de discriminao esto tornando-se cada vez mais disponveis.
Com base nos exerccios iniciais da European DNA Profiling Group (EDNAP)
e nas recomendaes da European Network of Forensic Science Institutes (ENFSI) e nos
trabalhos da Interpol, quatro sistemas foram definidos como padro europeu de loci:
HUMTHO1, HUMVWFA, HUMD21S11, e HUMFIBRA/FGA. Recentemente, trs
posteriores loci foram adicionados: HUMD3S1358, HUMD8S1179, e HUMD18S51. Um
processo similar ocorreu no Canad e nos Estados Unidos, onde a padronizao foi baseada
no sistema Conjunto de Indexao do DNA [CODIS = Combined DNA Index System] de 13
loci. Os 13 loci designados pelo CODIS e os 8 loci (os sete mencionados acima mais a
amelogenina) designados pelo ENFSI esto assinalados na figura 4.
No momento, h sete loci que so comuns entre os Estados Unidos e a Europa.
As posies cromossmicas desses loci tambm so mostradas na figura 4. Os braos curtos e
longos de um cromossomo so designados como p e q, respectivamente. Note que no sistema
CODIS, h dois loci no cromossomo 5.

6.2.2 Nomenclatura do locus STR:
Diferentes classes de loci STR tm sido definidas. Urquhart et al classificou os
diferentes loci de acordo com a complexidade de suas seqncias. Um dos mais ubquos loci
STR usados o HUMTHO1. Ele consiste de uma seqncia de repetio simples (TCAT)
5-11

com um alelo no consensual (TCAT)
4
CAT(TCAT)
5
. Loci STR compostos, tais como
HUMVWFA31, consistem de seqncias repetidas (ATCT)
2
(GTCT)
3-4
(ATCT)
9-13
, enquanto
que repeties complexas tais como HUMD21S11 so menos uniformes. Informaes
detalhadas podem ser obtidas do STRBase.

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Figura 4: Perfis de STR de dois diferentes indivduos:

20

Figura 5: Tabela de loci utilizados em determinados mtodos multiplexados:

21

Figura 6: Anlise de STR de um indivduo homem.

22

Figura 7: Anlise de STR de um indivduo mulher:

6.3 Patentes:
Hunkapiller deixou o laboratrio de Hood em 1983 e foi trabalhar para a
Applied Biosystems, Inc. (ABI), uma fabricante de instrumentos que acabara de ser fundada e
que produziria a primeira mquina de seqenciamento Smith-Hunkapiller. Desde ento, a
eficincia do processo aumentou imensamente: os gis (lentos e difceis de manusear) foram
descartados e substitudos por sistemas capilares de grande vazo finssimos tubos nos quais
os fragmentos de DNA so separados em alta velocidade de acordo com o tamanho. Hoje, a
ltima gerao de seqenciadores da ABI de uma rapidez descomunal, sendo alguns
milhares de vezes mais geis do que o prprio prottipo. Com um mnimo de interveno
humana (cerca de quinze minutos a cada 24 horas), essas mquinas conseguem seqenciar at
meio milho de pares de bases por dia.
Estes loci esto includos no sistema multiplexado comercial fabricado pela PE
Applied Biosystems, Promega Corporation, e outros.

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7 Bibliografia Consultada:
WATSON, James D. DNA: o segredo da vida. So Paulo: Companhia das Letras, 2005.

U.S. DEPARTMENT OF ENERGY. DOE Human Genome Program: primer on
molecular genetics. Washington: Office of Health and Environmental Research, 1992.

BUCKLETON, John; TRIGGS, Cristopher M. Forensic DNA Evidence Interpretation.
Wasshington: CRC Press, 2005.

CREIGHTON, Thomas E. Encyclopedia of Molecular Biology. Nova Iorque: John Wiley &
Sons, Inc., 1999.