EXTRACCIN DEL ADN

I. OBJETIVO

Examinar un extracto crudo de ADN de clulas animales y
confirmar su estructura fibrilar.

II. INTRODUCCIN
Hay 2 tipos de cidos nucleicos (AN): el cido desoxirribonucleico
(ADN) y el cido ribonucleico (ARN), y estn presentes en todas las
clulas. Su funcin biolgica no qued plenamente demostrada
hasta que Avery y sus colaboradores demostraron en 1944 que el
ADN era la molcula portadora de la informacin gentica.














Los cidos nucleicos son polmeros lineales de una unidad repetitiva
llamada nucletido (Figura de la derecha), cada nucletido est
formado, mediante un enlace ster, por un c. fosfrico y un
nuclesido(zona sombreada de la figura), este ltimo se constituye
por la unin de una pentosa (la D-ribosa o la 2-desoxi-D-ribosa), y
una base nitrogenada (purina o pirimidina).
Las bases nitrogenadas pueden ser purinas: ADENINA y GUANINA, las
bases pirimidnicas son: CITOCINA, TIMINA y URACILO. La timina
solo puede formar ADN y el uracilo solo est presente en el ARN.




El ADN lo aisl por primera vez, durante el invierno de 1869, el
mdico suizo Friedrich Miescher mientras trabajaba en la
Universidad de Tubinga. Miescher realizaba experimentos acerca de
la composicin qumica del pus de vendas quirrgicas desechadas
cuando not un precipitado de una sustancia desconocida que
caracteriz qumicamente ms tarde. Lo llam nuclena, debido a
que lo haba extrado a partir de ncleos celulares. Se necesitaron
casi 70 aos de investigacin para poder identificar los
componentes y la estructura de los cidos nucleicos.
El acido ribonucleico (ARN) y el acido desoxirribonucleico (ADN) son
macromolculas que intervienen en el almacenamiento y en la
transferencia de la informacin gentica. Son componentes
fundamentales de la clula y constituyen, en conjunto, entre el 5 y
el 10% del peso seco.
Normalmente no se encuentran solos sino que se hallan formando
nucleoprotenas, ya que suelen unirse a determinados tipos de estas
como las histonas. Hay 2 clases de protenas de unin del ADN. Las
histonas son la principal clase de protenas de unin al ADN
involucradas en mantener la estructura compacta de la cromatina.
Hay 5 diferentes protenas de histona identificadas como HI, H2A,
H2B, H3 y H4. La otra clase de protenas de unin al ADN es un
diverso grupo de protenas llamadas simplemente, protenas no
histonas. Esta clase de protenas incluyen los distintos factores de
transcripcin, polimerasas, receptores hormonales y otras enzimas
nucleares. En cualquier clula dada hay ms de 1000 diferentes
tipos de protenas no histonas unidas al ADN.
Una clula tpica contiene 10 veces ms ARN que ADN. El ARN se
localiza tanto en el citoplasma celular como en el ncleo,
mitocondrias y cloroplastos, mientras que en el ADN se sita
fundamentalmente en el ncleo de la clula, y tambin cloroplastos
y mitocondrias en pequeas cantidades. Poseen una importancia
manifiesta por el hecho de que ellos dirigen y llevan a cabo la
sntesis de protenas y, por tanto, de las enzimas necesarios para el
funcionamiento celular. Por otra parte, el ADN es el vehculo de la
herencia, que se transmite de padres a hijos, de generacin en
generacin.
El ADN es la molcula que guarda el cdigo gentico de todas las
clulas. Sin importar que el organismo sea multinuclear, eucariota
o procariota incluyendo los virus viroides, todos tienen ADN o ARN
como material hereditario y como vehculo de su cdigo gentico.
Dogma central de la Biologa
El mensaje gentico se encuentra en la/las cadenas de ADN. Para
que la clula se divida este ADN debe duplicarse: REPLICACIN,
repartindose entre las clulas hijas.
Durante la interfase el funcionamiento de la clula est dirigido por
las protenas. A partir del ADN se forma una molcula de ARN
(TRANSCRIPCIN) que sale del ncleo: ARN y es "ledo" por el RNA
r
con la ayuda del

RNA
t
que le provee los aminocidos para la
formacin de las protenas: TRADUCCIN.









Esta serie de procesos se conoce como el dogma central de la
Biologa

III. MATERIALES:

Material biolgico:
Hgado de pollo timo o gnadas de choro (el tejido debe
ser fresco y conservado en frio).

Materiales de laboratorio y reactivos

2 tubos de ensayo grandes
1 vaso de precipitado de 250 ml
Embudo
Gasa
Agitador de vidrio
Gradilla
Mortero
Pipetas
Termmetros
Probetas
Solucin salina de NaCl al 0.15M/EDTA 0.1M, ph: 8.
Dodecil hidrogeno sulfato sdico (SDS) 10%
NaCl 5M
Solucin cloroformo alcohol isoamlico (24:1)
Alcohol etlico 96 helado

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

1. Homogeneizar 2g de la muestra biolgica en una licuadora o
mortero en 10ml. de solucin salina de NaCl al 0.15M/EDTA
0.1M, pH: 8 .Con ello, se consigue homogeneizar la muestra: las
clulas se rompen y los ncleos quedan sueltos.








2. Transferir el homogeneizado anterior filtrando a una probeta de
100 ml y aadir 2 ml del detergente anonico Dodecil
hidrogeno sulfato sodico (SDS) 10% Mezclar.














3. Colocar en bao Mara a 60C por 5 min.






4. Aadir 6ml de solucin de NaCl 5M Mezclar.

5. Aadir la solucin cloroformo alcohol isoamlico (24:1) en un
volumen igual a lo obtenido en la etapa anterior. Agitar
vigorosamente.








6. Centrifugar a 2500 rpm por 10 min. En este paso estamos
aplicando un mtodo fsico.










7. Separar el sobrenadante con todo cuidado y colocando en una
probeta de 10ml y agregar 2 volmenes de alcohol 96%. El
alcohol debe aadirse lentamente.










8. Observar las hebras de ADN.













V. RESULTADOS

Se logr observar las hebras del ADN, que con la combinacin de
diferentes reactivos nos han permitido obtener a tal punto que la
clula no haya sido daada y as poder extraer el ADN dentro del
ncleo, mediante el rompimiento de dichas membranas y paredes
celulares.












VI. CUESTIONARIO

1. Con que objetivo se utiliza el CINa/EDTA?

Es romper la envoltura celular y permitir que se libere el ADN
a la solucin.
El EDTA es un agente quelante que acta removiendo traza
de metales necesarios por endonucleasas para actuar. De
esta manera se previene que las endonucleasas que estn
presentes en el citoplasma de la clula acten degradando el
constituyente celular de inters. El EDTA tambin tiene una
funcin de ser como un anticoagulante para pruebas
qumicas en sangre.

2. Qu finalidad tiene el uso de SDS y la solucin
concentrada de NaCl?

SDS

Empleado en diversos productos de higiene personal
como champ y jabones de bao, mayormente usado
como detergente.
Se emplea comnmente en la preparacin de protenas
para electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).
El SDS acta rompiendo enlaces no covalentes en las
protenas, desnaturalizndolas, provocando que estas
molculas proteicas pierdan su conformacin nativa.
Esto ocurre porque el SDS se une a las zonas apolares
del polipptido. Adems, la cantidad de SDS unido es
similar para muchas protenas: una molcula de SDS por
cada dos residuos aminocidos, correspondiendo a unos
1,4 g SDS/g protena. Ello proporciona al polipptido
una carga negativa que resulta proporcional a la
longitud de la cadena (el nmero de aminocidos) y,
por tanto, a la masa molecular de la protena. Este
aporte de carga negativa es sustancialmente mayor que
la carga original de la protena. La repulsin
electrosttica creada por la unin del SDS a la protena
es uno de las causas de que la protena pierda su
conformacin nativa, eliminndose de este modo las
diferencias en conformacin de las diferentes protenas
que han de ser separadas en el gel.

Solucin concentrada de NaCl

Produce un estallido en los ncleos para as que queden
libres las fibras de cromatina. Gracias a ello la clula no
se daa ya que se encuentra en un medio isotnico.

3. Qu efecto causa la solucin de cloroformo/alcohol
isoamlico y el uso de etanol frio en la extraccin de ADN?

El cloroformo/alcohol isoamlico extrae las protenas que
componen el ADN y luego el etanol frio 96% precipita la
solucin del ADN, que es soluble en agua pero, cuando se
encuentra en alcohol se desenrolla y precipita en la interfase
entre el alcohol y el agua.

4. Cmo se justifica la gran cantidad de ADN presente en la
muestra?

Para seleccionar un tejido como fuente de ADN debe reunir
dos condiciones: contener gran cantidad de material
gentico y poseer baja actividad de desoxirribonucleasa
(DNAasa) que rompe la macromolcula en pequeos
fragmentos.




VII. Referencias

Curtis, H. Biologa. 2002.
Genes, Benjamin Lewin, Andrs Aguilera Lpez.