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Practica 7

Ftima Sarai Lpez Hernndez, Mnica Adriana Rodrguez Zavala, Sarai Ziga Estupian,
Abraham Lpez Arellano
29/10/2011

Campus UAZ Siglo XXI | ACS, UACQ, QFB, Sptimo Semestre grupo C
Laboratorio de I nmunologa Diagnostica

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Universidad Auto noma de Zacatecas
Francisco Garca Salinas
A rea de Ciencias de la Salud
Unidad Acade mica de Ciencias Qumicas
Qumico Farmace utico Bio logo
LABORATORIO DE INMUNOLOGIA DIAGNOSTICA
PRACTICA 7
DETERMINACIN DEL ANTGENO ESPECFICO DE
PRSTATA (PSA)
* Ftima Sarai Lpez Hernndez, Mnica Adriana Rodrguez Zavala,
Sarai Ziga Estupian, Abraham Lpez Arellano
Docente: Aracely Gmez Corvera
*7Semestre Grupo C Programa educativo Q.F.B. UACQ, ACS, Campus
UAZ Siglo XXI, carretera Zacatecas-Guadalajara Km 6 s/n ejido La Escondida Cp.
98160 Zacatecas Zac.
Agosto-Diciembre 2011
OBJETIVO
Realizar la determinacin semi-cuantitativa del antgeno especfico de la prstata
(PSA) en el suero humano.

INTRODUCCIN Y FUNDAMENTO
El antgeno prosttico especfico (PSA), tambin llamado calicrena III, seminina,
semenogelasa, -seminoprotein y antgeno P30, es una glicoprotena de 34 kD producida
casi exclusivamente por la glndula prosttica. El PSA es producido con el fin de licuar el
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semen eyaculado y permitir un medio para que los espermatozoides se movilicen
libremente. Tambin se cree que es til para disolver la capa mucosa cervical, permitiendo
la entrada a los espermatozoides. Bioqumicamente, el PSA es una enzima sern-proteasa el
gen de la cual est localizado en el cromosoma 19 (19q13).
Es una protena cuya sntesis no es exclusiva de la prstata. Una pequesima parte
de este PSA pasa a la circulacin sangunea de hombres enfermos, y es precisamente esta
PSA que pasa a la sangre, la que se mide para el diagnstico, pronstico y seguimiento del
cncer tanto localizado como metastsico y otros trastornos de la prstata, como la
prostatitis. Los niveles normales en sangre de PSA en los varones sanos son muy bajos, del
orden de millones de veces menos que el semen, y se elevan en la enfermedad prosttica.
Los valores de referencia para el PSA srico varan segn los distintos laboratorios,
aunque el valor normal aceptado actualmente es de hasta 2,5 ng/ml. Su produccin depende
de la presencia de andrgenos y del tamao de la glndula prosttica.
El PSA aumenta con el agrandamiento de la prstata, llamado tambin hiperplasia
benigna de prstata o HBP, fenmeno que ocurre en muchos hombres conforme van
avanzando en edad. Tambin puede aumentar en caso de irritacin, prostatitis una
inflamacin de la glndula prosttica y en el infarto prosttico. El PSA tambin puede
aumentar normal y lentamente conforme avanza la edad del hombre, incluso si la prstata
es normal. La eyaculacin puede provocar un aumento temporal del PSA en la sangre,
razn por la que se recomienda abstenerse de relaciones sexuales un mnimo de 2 das antes
de la extraccin de sangre para el estudio del PSA. Al contrario de lo que se ha credo
durante aos, el tacto rectal no altera significativamente los niveles del PSA. Utilizando
conjuntamente el valor del PSA y el tacto rectal se puede descubrir ms del 60% de los
cnceres de prstata que todava no estn localizados.
FUNDAMENTO
La prueba PSA ELISA est basada en el principio de un ensayo inmunoabsorbente
vinculado a las enzimas de fase slida. El sistema de ensayo utiliza un anticuerpo Anti-PSA
de ratn dirigido hacia el PSA intacto para la inmovilizacin de la fase slida(en los pozos
de la microplaca) un anticuerpo Anti-PSA monoclonal conjugado para peroxidasa de
rbano (HRPO) se encuentra en la solucin de conjugado de enzima-anticuerpo.
La muestra de la prueba es permitida reaccionar primero con el anticuerpo de conejo
inmovilizado a T C ambiente por 60los,pozos son lavados para remover cualquier
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antgeno no adherido. El conjugado HRPO Anti-PSA monoclonal es entonces reaccionado
con el antgeno inmovilizado por 60a T C ambiente provocando que las molculas de
PSA se encuentren entre la fase slida y los anticuerpos vinculados a la enzima. Los pozos
son lavados con agua para remover anticuerpos etiquetados no adheridos.
Una solucin de reactivo TMB es agregada e incubada a T C ambiente por
20provocando el desarrollo de un color azul. El desarrollo del color es frenado con la
adicin de solucin de frenado cambiando el color a amarillo. La concentracin de PSA es
directamente proporcional a la intensidad del color de la muestra de prueba. La absorbancia
es medida espectrofotomtricamente a 450 nm.
INTERPRETACIN

En la hiperplasia benigna prosttica, los valores de PSA son directamente
proporcionales al tamao de la glndula prosttica. Un valor de PSA mayor de 10 ng/ ml
siempre es patolgico, y en un 50 % de los casos se diagnostica un cncer prosttico
mediante biopsia.
Trabajos de investigacin han descripto que pacientes con hiperplasia benigna
prosttica tienen mayor proporcin de PSA libre respecto a aquellos con cncer prosttico.
La combinacin de ambos ensayos y la expresin del resultado a travs del ndice de PSA
libre/total permitira utilizar el mismo para evaluar el riesgo relativo de CP .El valor de
corte de este ndice no ha sido claramente definido. Segn la metodologa utilizada el punto
de corte seria de 0.15-0.25 (valores por debajo indicaran mayor probabilidad de cncer).

Se ha reportado su utilidad para valores de PSA total entre 4 -10 ng/ml
Segn el criterio establecido por Mayo Clinic (USA):
PSA < 4 ng/ml el riesgo de Cancer de prostata(CP) es bajo
PSA > 4ng/ml y PSAL/PSA total <0,25 indica aumenta del riesgo de CP
PSA < 4ng/ml y PSAL/PSA total <0,18 indica aumenta del riesgo de CP




Nota: Los resultados de laboratorios pueden variar segn la metodologa utilizada.


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Figura 1 esquema del Mtodo Elisa tipo sndwich
(1) Anti-PSA de ratn en fase slida.
(2) Inmovilizacin del PSA en la placa
(3) Unin del anticuerpo anti-PSA monoclonal conjugado con HRPO
(4) Aplicacin del reactivo TMB y desarrollo de color.
MATERIALES REQUERIDOS PARA LA PRUEBA
1. Placa de microvaloracin revestida con anti-PSA de conejo 2 pozos
2. Micropipetas de precisin de 50-100l
3.-Puntas de pipetas desechables
4. Recipiente para residuos
5. Gradilla
6. Papel absorbente
7. Piseta
MATERIAL BIOLGICO.
Muestra de suero
REACTIVOS
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1. Estndar de referencia, que contiene PSA 0, 2, 4, 15, 60,120 ng/ml, liofilizado, 1 juego.
2. Buffer Cero, 7ml.
3. Reactivo de conjugado de enzima, 12 ml
4. Reactivo TMB (1 paso) ,11ml.
5. Solucin de frenado (1 N HCl), 11ml.
6. Agua destilada.
Nota: Permitir que todos los reactivos alcancen la temperatura ambiente
PROCEDIMIENTO
Diagrama del mtodo del ensayo
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OBSERVACIONES Y RESULTADOS

1. Vertir 50l de
estandar 4 y 50l
muestra en los pozos
apropiados.
2. Depositar en cada
pozo 50l de buffer
cero.
3. Mezclar durante
30 s
4. Incubamos a 25 C
45
5. Lavamos 5 veces
con agua
6. Aadimos 50l de
reactivo conjugado
7. Incubamos 45a
25 C
8. Lavamos 5 veces
ms con agua
destilada
9. Agregamos 100l
de TMB
10. Incubamos 20
11. Agregamos por
ultimo 100l de
solucin de frenado.
12. Mezclamos y
observamos el color
comparamos con un
estandar.
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Se realiz la observacin macroscpica de la placa para comparar el color
desarrollado en el pocillo de muestra con el obtenido en las soluciones estndar de 2, 4 y 15
ng/ml de PSA.
TABLA 1. Representacin de la placa y la correlacin con las concentraciones de PSA
Contenido de
pozo
Estndar
15ng/ml
Estndar
4ng/ml
Estndar
2ng/ml
Muestra
Representacin






Figura 2 fotografa de la placa en donde se muestra la coloracin obtenida en cada caso.
De izquierda a derecha std 15ng/ml , std 4ng/ml, std 2ng/ml y Muestra.
Se observa que la muestra desarrollo una coloracin muy similar a la mostrada
en el pocillo de estndar de 2ng/ml.
INTERPRETACION
Los hombres saludables se les espera tener valores de PSA debajo de 4ng/ml. La
concentracin mnima detectable de PSA en este ensayo es calculado ser 0.25ng/ml.
Llevamos a cabo una interpretacin semicuantitativa de PSA en la muestra de suero
al comparar el color desarrollado en los estndares de concentracin conocida de PSA con
el color obtenido en pocillo de muestra con lo que pudimos determinar que el suero del
paciente contena una concentracin de aproximadamente 2ng/ml, asentando este resultado
en base a que tienen colores casi iguales.
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PSA < 4 ng/ml el riesgo de cncer de prstata es bajo

DISCUSIN
El principal tema de discusin en este mtodo es la cuantificacin del PSA ya que
no se realiz conforme a lo establecido en el inserto del kit, esto debido a que no se
cuenta en el laboratorio con un lector de microplaca, por lo que debi hacerse una
consideracin semicuantitativa de comparacin visual del color desarrollado y
correlacionarlo con la concentracin aproximada de PSA en la muestra.
CONCLUSIONES
El resultado aproximado de PSA < 4 ng/ml nos indica que el riesgo de cncer de
prstata es bajo en el paciente.
Tiene que considerarse el resultado como una aproximacin. Y utilizarse como una
adicin a otros procedimientos diagnsticos e informacin disponible por el medico
al momento de descartar la presencia de un cncer de prstata.

REFERENCIAS
Harrison Principios de Medicina Interna 16a edicin. Parte V. Oncologa y hematologa. Seccin1:
Enfermedades neoplsicas.
Mytrle JF (1989). Normal Levels of Prostate-Specific Antigen (PSA). Clinical Aspects of Prostate
Cancer. Assessment of New Diagnostic and Management Procedures. Proceedings of a workshop of the
Prostate Cancer Working Group of the National Cancer Institute's Organ Systems Program, held October
16-19, 1988 at Prout's Neck, Maine, U.S.A.. New York: Elsevier. pp. 183-9.