ACTIVIDAD CATALTICA Y DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD

ENZIMATICA DE LA -AMILASA








Las enzimas son molculas de naturaleza proteica que catalizan reacciones
qumicas, siempre que sean termodinmicamente posibles: Una enzima hace que
una reaccin qumica que es energticamente posible pero que transcurre a una
velocidad muy baja transcurra a mayor velocidad que sin la presencia de la
enzima. En estas reacciones, las enzimas actan sobre unas molculas
denominadas sustratos, las cuales se convierten en molculas diferentes
denominadas productos. Casi todos los procesos en las clulas necesitan enzimas
para que ocurran a unas tasas significativas. A las reacciones mediadas por
enzimas se las denomina reacciones enzimticas. Las enzimas son un ejemplo de
que no slo es importante lo que comemos sino que adems es indispensable una
buena capacidad de absorber esos nutrientes.

PROPSITOS

Experimentar sobre diferentes aspectos de la actividad enzimtica.
Comprender la forma como diversos factores influyen sobre la actividad
cataltica de las enzimas.
Evaluar la dependencia que puede presentar una reaccin enzimtica con
respecto a la acidez del medio y a la temperatura.


GENERALIDADES

El almidn es la principal fuente de reserva de carbohidratos de las plantas
superiores, hallndose en granos de los cereales, las semillas de las leguminosas
y en las frutas. Es el principal constituyente de rizomas y tubrculos. En relacin
con la dieta humana, el almidn funciona como fuente de energa, y sus
propiedades fsicas ayudan a mejorar la textura y aceptabilidad de los alimentos.
Estructuralmente el almidn es un polmero de glucosas (glicano) unidas por
enlaces -glicosdicos y formada por dos compuestos diferentes: la amilosa (10
20%) y la amilopectina (80 90%).

La amilosa es un polmero lineal que puede contener hasta 1000 unidades de
glucosa, ligadas entre si por enlaces -1,4 sin ramificaciones. Es la fraccin del
almidn que con el yodo forma un complejo de coloracin azul intensa. La
amilopectina es un polmero ramificado que puede contener hasta 1 milln de
unidades de glucosa, agrupadas en centenares de cadenas cortas lineales de 20
25 glucosas, ligadas entre si por enlaces -1,4; un extremo de cada una de estas
cadenas se une a otra mediante un enlace -1,6, originando as la mltiple
ramificacin del polmero.

Junto a la sacarosa y la lactosa, el almidn completa la triada de carbohidratos
que normalmente hacen parte de la dieta humana. Para ser absorbido a travs de
la pared intestinal, el almidn debe ser digerido e hidrolizado hasta las unidades
de glucosa, lo cual es realizado gradualmente por las enzimas digestivas que se
hallan en la boca (amilasa salival), en el estomago (amilasa mas HCl) y en el
intestino delgado (amilasas pancreticas (a y b) y el complejo (maltasa-
glicamilasa). La amilasa salival solo ataca las uniones -1,4 y genera
basicamente maltosa y maltotriosa. Las amilasas pancreticas hacen el mismo
trabajo pero sobre los almidones que llegan intactos al intestino. El complejo
maltasa-glicamilasa ataca tanto las uniones -1,4, como las -1,6 y convierte la
maltosa, isomaltosa y la maltotriosa en glucosa.

Las fuentes amilceas son de gran utilidad en las industrias alimenticias y
qumicas, debido a que varios de sus derivados como las malto dextrinas y jarabes
de glucosa hacen parte de las materias primas esenciales para estas industrias.
Es por esto, que desarrollar procesos enzimticos que sean ms econmicos y
competitivos con respecto a los procesos qumicos tradicionales para la obtencin
de dichas materias primas es de vital importancia.

Termamyl 120L es un producto enzimtico liquido que contiene alfa-amilasa
sobresaliente termoestable expresada en y producida mediante una cepa
genticamente modificada de Bacilluslicheniformis. Se utiliza en las industrias de:
Almidn: Licuefaccin contina del almidn en cocedores a presin o en
equipos que operan a similar temperatura.
Alcohol: Adelgazamiento del almidn en los macerados de la destilacin.
Cervecera: Licuefaccin del almidn.
Azcar: Rompimiento del almidn presente en el jugo de cana. Por lo que el
contenido de almidn en el azcar crudo se reduce y la filtracin en la
refinera se facilita.

La enzima es una endoamilasa que hidroliza las uniones 1,4-alfa-glucosidicas de
la amilosa y amilopectina. Por lo que el almidn se rompe rpidamente en
dextrinas solubles y oligosacridos.

Los pasos para transformar el almidn en jarabe glucosado son dos: licuefaccin,
y sacarificacin. Durante el proceso de licuefaccin se obtienen malto dextrinas
empleando la enzima alfa amilasa. Estas malto dextrinas contienen diferentes
oligosacridos y dextrinas y es ligeramente dulce. Luego se puede continuar la
conversin a glucosa usando la enzima amiloglucosidasa conocida tambin como
glucoamilasa. Esta ultima etapa se conoce como sacarificacin, donde la
amiloglucosidasa puede transformar las malto dextrinas casi completamente en
glucosa; en la practica se produce tambin un poco de maltosa.

Materiales y Reactivos

Solucione Buffer 0.1M Fosfato con pH:6.3


Procedimiento

1. Preparar la siguiente solucin:

20 ml de Almidn al 1% m/v en buffer fosfato pH 6.3
20 ml de enzima diluida 1:150 (Preparada por el monitor)


2. Determinacin de la actividad enzimtica

Preparar las siguientes diluciones de la solucin de almidn en tubos de
ensayo: 0.8, 0.6, 0.4, 0.2, 0.1 g/L.
Adicionar 2.5ml de la solucin de almidn diluida en un tubo de ensayo
Temperar por 3 minutos a 90
o
C
Agregar 0.5ml de la enzima diluida a los tubos y los tubos nuevamente a la
90C por 30 minutos.
Parar la reaccin agregando 0.5ml de NaOH 2M a todos los tubos.
Tomar 0.5ml de todos los tubos y agregar 30 L de lugol a cada uno
Realizar protocolo de DNS para la determinacin de los azucares
reductores.
Comparar la intensidad entre los tubos comparar cada uno de los tubos
NOTA: La actividad enzimtica ser reportada como mol de azucares formados
por litro de solucin por minuto por cantidad de enzima.

CURVA DE CALIBRACION DE AZUCARES REDUCTORES. METODO DNS



ANEXO 1

Procedimiento para determinar el % de azcares reductores utilizando DNS

a. Realizar las respectivas disoluciones de la muestra con agua destilada
b. Tomar 1 ml y adicionar 1 ml de reactivo DNS.
c. Tapar los tubos con papel para film y ponerlos en bao a ebullicin por 5
minutos.
d. Pasar los tubos a un bao de hielo, dejarlo por 5 minutos.
e. Leer Absorbancia de todas las soluciones a 540 nm.
PREGUNTAS

1. Como se define la actividad enzimtica.
2. Que factores afectan la actividad enzimtica.

y = 0.8421x + 0.0432
R = 0.9985
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200
C
O
N
C
E
N
T
R
A
C
I

N

(
g
/
L
)

ABS
CURVA DE CALIBRACIN DE DNS