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UNIVERSIDADE DE LISBOA

FACULDADE DE FARMCIA


MESTRADO EM ANLISES CLNICAS
HOSPITAL DR. NLIO MENDONA, FUNCHAL


ORIENTADORA:
DRA. MARLENE PIRES


ALUNO: EILYN MARISOL GOMES RODRIGUES




LISBOA, 2013


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ndice
Resumo .................................................................................................................. 7
Lista de abreviaturas ............................................................................................... 8
1- Controlo de qualidade em anlises clnicas ................................................. 10
1.1- Fase pr-analtica ....................................................................................... 11
1.1.1- Colheita de amostras biolgicas .......................................................... 12
1.2- Fase analtica .............................................................................................. 16
1.3- Fase ps-analtica ....................................................................................... 17
2- Resduos hospitalares ....................................................................................... 17
Microbiologia ...................................................................................................... 19
I- Bacteriologia .................................................................................................... 20
I- 1- Diagnstico das infees bacterianas e fngicas ...................................... 21
I- 1.1- Amostras ............................................................................................. 22
I- 1.2- Exame microscpico ........................................................................... 23
I- 1.3- Meios de cultura slidos ..................................................................... 27
I- 1.4- Meios lquidos de enriquecimento ...................................................... 32
I- 1.5- Geradores ............................................................................................ 33
I- 1.6- Floras bacterianas e fngicas normais ................................................ 33
I- 2- Provas de identificao de bactrias e fungos leveduriformes ................. 37
I- 3- Processamento dos produtos para exame bacteriolgico .......................... 39
I- 3.1- Urina ................................................................................................... 39
I- 3.2- Hemocultura ....................................................................................... 41
I- 3.3- Vias respiratrias: superiores e inferiores .......................................... 43
I- 3.4- Exsudado ocular e exsudado do ouvido ............................................. 45
I- 3.5- Feridas, abcessos, exsudados purulentos, bipsia de tecido e contedo
de bomba ........................................................................................................ 45
I- 3.6- Lquidos biolgicos ............................................................................ 47
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I- 3.7- Fezes ................................................................................................... 49
I- 3.8- Aparelho genital .................................................................................. 51
I- 3.9- Pontas de cateter ................................................................................. 53
I- 4- Teste de sensibilidade aos antimicrobianos .............................................. 54
I- 4.1- Mtodos laboratoriais utilizados no estudo da atividade dos
antibiticos ..................................................................................................... 54
I- 4.2- Mtodos automatizados-VITEK ......................................................... 59
I- 5- Teste de despiste de resistncia meticilina do Staphylococcus em meio
de cultura slido ................................................................................................ 62
I- 6- Controlo de qualidade interno e externo na Bacteriologia ........................ 64
II- Serologia ......................................................................................................... 65
II- 1- Colheita e amostra ................................................................................... 65
II- 2- Metodologia ............................................................................................. 66
II- 2.1- Metodologia automatizada ................................................................ 66
II- 2.2- Metodologia manual .......................................................................... 68
II- 3- Testes serolgicos realizados na Serologia.............................................. 69
II- 4- Interpretao e validao das provas serolgicas .................................... 70
II- 5- Controlo de qualidade interno e externo na Serologia ............................ 71
III- Parasitologia e Urinas tipo II...................................................................... 72
III- 1- Pesquisa de sangue oculto ...................................................................... 72
III- 2- Exame parasitolgico nas fezes .............................................................. 73
III- 3- Urianlise (Urinas Tipo II) ..................................................................... 74
III- 3.1- Anlise bioqumica .......................................................................... 75
III- 3.2- Sedimento urinrio ........................................................................... 76
III- 4- Controlo de qualidade interno e externo na seco de Parasitologia e
Urinas ................................................................................................................ 77
IV- Hematologia .................................................................................................. 78
IV- 1- Amostra .................................................................................................. 81
IV- 2- Metodologia ........................................................................................... 82
IV- 3- Hemograma ............................................................................................ 82
4

IV- 4- Esfregao de sangue perifrico .............................................................. 86
IV- 4.1- Colorao de May-Grnwald-Giemsa ............................................. 87
IV- 5- Separao de hemoglobinas ................................................................... 88
IV- 5.1- HbA1C ............................................................................................. 88
IV- 5.2- HbA2 e HbF ..................................................................................... 89
IV- 6- Teste da fragilidade osmtica ................................................................. 90
IV- 7- Velocidade de sedimentao .................................................................. 91
IV- 8- Coagulao ............................................................................................. 91
IV- 8.1- Avaliao laboratorial ...................................................................... 94
IV- 8.2- Patologias mais comuns na seco de Hematologia ........................ 97
IV- 9- Controlo de qualidade interno e externo em Hematologia .................... 98
V- Bioqumica ..................................................................................................... 99
V- 1- Amostra ................................................................................................... 99
V- 2- Metodologia e anlises efetuadas na seco de Bioqumica ................. 101
V- 2.1- Equipamento automatizado e mtodo ............................................. 103
V- 2.2- Urina de 24h .................................................................................... 105
V- 2.3- Lquidos biolgicos ......................................................................... 106
V- 2.4- Testes de diagnstico rpido ........................................................... 107
V- 3- Controlo de qualidade interno e externo em Bioqumica ...................... 108
VI- Hormonologia ............................................................................................. 109
VI- 1- Amostra e metodologia ........................................................................ 110
VI- 2- Anlises efetuadas na seco de Hormonologia .................................. 112
VI- 3- Controlo de qualidade interno e externo em Hormonologia ................ 114
VII- Imunologia ................................................................................................ 115
VII- 1- Amostra ............................................................................................... 116
VII- 2- Metodologia ........................................................................................ 116
VII- 2.1- Tcnicas ........................................................................................ 116
VII- 2.2- Equipamentos automatizados ....................................................... 118
VII- 3- Anlises efetuadas na seco de Imunologia ...................................... 120
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VII- 3.1- Teste de diagnstico rpido para a pesquisa da protena de Bence-
Jones............................................................................................................. 121
VII- 4- Controlo de qualidade interno e externo em Imunologia ................... 121
VIII- Bibliografia .............................................................................................. 122



















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Agradecimentos

Deixo aqui expressos os meus agradecimentos Dra. Graa Andrade, pela
oportunidade de realizar o meu estgio no Hospital Dr. Nlio Mendona,
Funchal.

s minhas orientadoras, a Dra. Marlene Pires e a Prof. Leonor Correia, por todo
o apoio, ateno, carinho, exigncia, disponibilidade e pacincia que dispensaram
neste meu percurso.

A todas as pessoas das seces do Servio de Patologia Clnica em que estagiei,
que contriburam para que eu fizesse deste estgio uma grande experincia a
nvel de formao e a nvel pessoal.

Ao servio de Hemato-Oncologia, pela informao cedida, sobre os doentes de
mieloma mltiplo. Ao Departamento de Informtica e ao Departamento de
Estatstica Dra. Alexandra Borges por toda a ajuda prestada.

minha famlia e amigos.

E por fim, um agradecimento muito, mas muito especial, minha me, por toda a
ateno e carinho, por estar sempre presente em todas as fases da minha vida,
pelo apoio incondicional e pelos seus grandes conselhos. Sem ti, nada disto seria
possvel.




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Resumo
O meu estgio teve lugar no Hospital Dr. Nlio Mendona, situado na avenida
Lus de Cames, no Funchal. Passei por todas estas valncias do Servio de
Patologia Clnica: Bacteriologia; Serologia; Parasitologia e Urinas; Bioqumica;
Hormonologia; Imunologia; Hematologia, por um perodo total de 6 meses. Este
servio est integrado no Hospital Dr. Nlio Mendona a par dos restantes
servios clnicos, departamentos clnicos, unidades clnicas, unidades de apoio
clnico, consulta externa, servio de urgncia e outros servios. Funciona 24
sobre 24 horas dando resposta aos pedidos de anlise de rotina e urgncia.
Este servio tambm recebe as colheitas efetuadas no Hospital dos Marmeleiros e
no Hospital Joo da Almada, assim como, nos restantes centros de sade da
Regio Autnoma da Madeira, casas de sade, lares, domiclio, que esto todos
estes integrados, no Servio de Sade da Regio Autnoma da Madeira.












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Lista de abreviaturas
Ac/Acs- Anticorpo/anticorpos
ADA- Adenosina desaminase
Ag/Ags- Antignio/ antignios
AT- Aspirado traqueal
ATB- Antibiograma
ATCC- American type culture collection
BAAR- Bacilo lcool-cido resistente
CDE- Coeficiente de disperso eritrocitria
CHGM- Concentrao de hemoglobina globular mdia
CLSI- Clinical and laboratory standards institute
CMI- Concentrao mnima inibitria
EDTA- Etilenodiaminotetraacetato tripotssico
ELFA- Enzyme linked fluorescent assay
ELISA- Enzyme-linked immunosorbent assay
EQAS- External quality assurance services
EXP- Expetorao
FT- Fator tecidular
HbA1C- Hemoglobina glicada
hCG- Hormona gonodatrofina corinica humana
HGM- Hemoglobina globular mdia
HPLC- High-performance liquid chromatography
INSA- Instituto Nacional de Sade Dr. Ricardo Jorge
ITU- Infeo do trato urinrio
LBA- Lavado bronco-alveolar
LCR- Lquido cefalorraquidiano
LDH- Lactato desidrogenase
McK- MacConkey
NEQAS- National external quality assessment service
PNAEQ- Programa nacional de avaliao externa da qualidade
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RAM- Regio autnoma da Madeira
RID- Imunodifuso radial
RLV- Unidade de luz relativa
RNI- Razo normal internacional
RPR- Rapid plasma reagin
SB- Secrees brnquicas
SESARAM- Servio de sade da regio autnoma da Madeira
SS- Salmonella & Shigella
TP- Tempo de protrombina
TPHA- Treponema pallidum haemagglutination
TSA- Teste de sensibilidade antibitica
TTP- Tempo de tromboplastina parcial
TTPA- Tempo de tromboplastina parcial ativada
VDRL- Venereal disease research laboratory
VGM- Volume globular mdio
VS- Velocidade de sedimentao
vW- VonWillebrand







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1- Controlo de qualidade em anlises clnicas
A qualidade consiste num espetro de atividades e processos que formam as
caractersticas de um produto ou servio. Esse espectro divide-se em 5 nveis:
qualidade total ou gesto total da qualidade ou melhoria contnua da qualidade; a
gesto da qualidade; o sistema da qualidade; a garantia da qualidade e o controlo
da qualidade.
Atualmente, a maioria dos servios de sade operam duas etapas: a nvel da
garantia da qualidade, que consiste num conjunto de atividades que demonstram
que uma organizao atingiu um nvel aceitvel de qualidade; e a nvel do
controlo de qualidade, que se baseia em tcnicas operacionais para medir,
comparar com objetivos, identificar erros ou problemas e respetivas medidas
corretivas.
Para que uma organizao como um hospital atinja os padres de qualidade
desejados necessria a participao ativa de todo os seus funcionrios. Num
hospital, as funes de cada grupo funcional tm que estar definidas na estrutura
da gesto da qualidade da instituio.
O conceito de qualidade nas anlises clnicas dever, portanto, ser encarado
como parte do conceito mais vasto da qualidade dos servios de sade. Assim,
cada laboratrio dever procurar implementar sua escala o sistema de
qualidade.
Para implementar um sistema de qualidade no laboratrio tem de ser
implementado pelo menos estes trs conceitos:
Controlo de qualidade
Resume numa monitorizao contnua das prticas de trabalho, do equipamento e
dos reagentes, em que o prprio pessoal faz a avaliao dos resultados/dados,
chamando-se assim o controlo de qualidade interno.
Avaliao da qualidade
Ou a avaliao do desempenho, que se apoia na avaliao por terceiros, do
desempenho do laboratrio atravs da anlise dos resultados obtidos em anlises
de material de controlo (amostras fictcias) realizados da forma e nas condies
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habituais do laboratrio, como se de uma amostra de um doente se tratasse,
denominada como a avaliao da qualidade externa ou controlo de qualidade
externo.
Garantia da qualidade
o processo total que garante a qualidade dos resultados finais fornecidos pelo
laboratrio. Esta garantia da qualidade compreende no s o controlo da fase
analtica mas tambm das fases pr e ps analticas do ciclo analtico. O controlo
da fase analtica compreende tanto o controlo de qualidade interno como o
externo.
1.1- Fase pr-analtica
Esta fase consiste todo o processo que envolve e antecede fase de execuo
analtica da amostra, a solicitao da amostra, a preparao do paciente, o registo,
a colheita da amostra biolgica, a preparao, o transporte e a receo da
amostra.
Esta fase da inteira responsabilidade pelo pessoal administrativo e do pessoal
da triagem dentro do servio de Patologia Clnica (SPC), em caso das no
conformidades e das medidas corretivas. H erros que tm de ser
resolvidos/retificados nesta fase para que no cheguem fase analtica, por
exemplo, uma incorreta identificao da amostra (erro no nome do utente), este
problema sendo resolvido na fase pr-analtica, evitar certos problemas na
atribuio dos valores analticos obtidos a um utente que no fez colheita,
gastando desta forma o hospital, recursos humanos e materiais, levando o
laboratrio algum prejuzo. A maior parte dos erros executados no ciclo
laboratorial cometida na fase pr-analtica, cerca de 60%.
Na solicitao das anlises, seja em formato eletrnico ou em papel, necessrio
adquirir a mxima e correta informao sobre o utente: o servio requisitante, a
informao clinica, os dados completos do paciente, a data de solicitao e
carimbo.
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Na preparao do doente, necessitou-se fornecer as recomendaes corretas do
preparo prvio para a colheita, no jejum, no realizar atividade fsica, no
consumir drogas e/ou lcool antes da colheita e evitar o stress.
1.1.1- Colheita de amostras biolgicas
A avaliao das funes fisiolgicas, recorrendo a exames laboratoriais hoje
em dia importante e indispensvel.
Os problemas mais comuns aquando da colheita e no armazenamento das
amostras podem ser:
Hemlise: trata-se da lise dos glbulos vermelhos. Estes libertam lactato
desidrogenase e potssio, resultando numa amostra no representativa do estado
real do paciente. A hemlise pode ser causada por centrifugao excessiva,
agitao brusca, congelamento das clulas, colheita mal executada;
Hemoconcentrao: acontece quando o garrote deixado muito tempo no brao,
podendo ocorrer estase na veia e alguns constituintes do sangue podem ficar mais
concentrados em relao ao sangue, numa circulao normal;
Centrifugao: s deve ser feita depois do sangue repousar cerca de 20-30
minutos, aps a colheita, para obteno de soro;
Evaporao: quando as amostras no se encontram devidamente tapadas;
Contaminao qumica: quando as amostras mltiplas de sangue so obtidas com
o sistema fechado de colheita por vcuo. Os tubos de soro devem ser colhidos
antes dos tubos com anticoagulantes.
A colheita deve ser feita 12 horas aps a ltima refeio, e a recolha deve ser
feita antes da realizao de determinados procedimentos diagnsticos ou
teraputicos. Na altura da colheita, procede-se confirmao de toda a
informao com o utente.
As administrativas, aps receberem a requisio mdica e preencherem a ficha
informtica, emitem e anexam as etiquetas de cdigo de barras (tantas quanto
forem necessrias, conforme a requisio e os tubos de colheita necessrios). A
etiqueta possui os seguintes elementos: nome completo, sexo, idade, servio, n
do processo clnico, se urgente ou de rotina e a data da colheita.
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As amostras so rececionadas na sala de triagem, vindas das diversas unidades de
sade do servio de sade da regio autnoma da Madeira (SESARAM), e as
administrativas processam os pedidos de requisio. As amostras so rejeitadas
se estiverem indevidamente acondicionadas, mal vedadas e com derramamento
de produto, coaguladas, hemolisadas ou se as propores de sangue
anticoagulante no foram respeitadas.
A colheita da amostra constitui uma das etapas mais importantes para assegurar
um resultado laboratorial correto. Representa o primeiro contato entre o
laboratrio e o paciente. O sangue o produto biolgico mais utilizado no
laboratrio.
O mtodo mais comum para obter uma amostra de sangue atravs de uma
puno venosa. O sangue venoso retirado atravs de uma agulha e recolhido
para uma seringa ou para um tubo de vcuo.

1.1.2- Execuo da puno venosa
A execuo da puno venosa, executou-se em vrias etapas:
1- Preparao do utente:
Identificou-se e preparou-se o paciente: identificao completa; requisio
analtica corretamente preenchida; explicao do procedimento;
Efetuou-se um exame visual e a palpao das veias: viabilidade,
estabilidade, direo e profundidade da veia. As veias mais
frequentemente utilizadas so: veia ceflica mediana, veia cubital
mediana, veia ceflica e veia baslica;
Procedeu-se aos seguintes cuidados: seleo do brao do paciente do lado
de uma mastectomia e /ou onde fora submetido a uma infuso intravenosa,
de um local com hematoma, edema ou contuso, e de um local com
mltiplas punes;
Caso as veias anteriormente referidas no forem viveis h outros locais de
puno: regio dorsal da mo/ face plantar do p.


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2- Preparao do material de colheita
Depois de escolhido o local de puno, deu-se a seleco do material necessrio,
as etiquetas para identificao das amostras, as luvas, o algodo ou gaze
esterilizada, o lcool etlico a 70%, o adaptador para colheita por vcuo e a
butterfly ou seringa (o mtodo mais utilizado no SPC o sistema fechado de
colheita por vcuo tipo Vacuette)
Os tubos de vcuo mais utilizados no SPC so:
Tampa de cor amarela (bioqumica)
Possuem um gel ativador da coagulao para obteno de soro. Os tubos para
bioqumica so revestidos internamente com partculas de slica micronizada, as
quais ativam a coagulao quando os tubos so gentilmente invertidos. Esses
tubos contm uma barreira de gel presente no fundo do tubo. Este material possui
densidade intermediria entre o sangue coagulado e o soro. Durante a
centrifugao, a barreira de gel move-se para cima posicionando-se entre o soro e
o cogulo, onde forma uma barreira estvel, separando o soro dos outros
componentes celulares. O soro pode ser utilizado diretamente do tubo de colheita
(tubo primrio). Esta barreira permite a estabilizao da maioria dos parmetros
no tubo primrio, sob as condies de armazenamento recomendadas, at 48
horas.
Tampa de cor lils (hematologia)
Com anticoagulante etilenodiaminotetraacetato tripotssico (EDTA) que um
quelante do clcio, forma sais de clcio insolveis e impede a coagulao do
sangue. As anlises no setor de Hematologia so executadas em sangue total.
Tampa de cor azul (coagulao)
Com anticoagulante citrato de sdio que forma sais de clcio e remove o clcio.
Tampa de cor verde
A parede interna deste tubo revestida com heparina de ltio. Esse anticoagulante
ativa as enzimas antiplaquetrias, bloqueando, assim, a coagulao em cascata
dos elementos do sangue. Normalmente so utilizados nos exames de qumica
clnica.
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Cada tipo de anticoagulante exerce o seu efeito de maneira prpria. A proporo
do anticoagulante em relao ao volume de sangue uma varivel importante, de
forma a evitar erros nos resultados.

3- Execuo da colheita da amostra
Assegurou-se o correto posicionamento do antebrao e desinfeco do local da
puno com uma mecha de algodo, ou gaze embebida em lcool etlico a 70 %,
e deixou-se secar ao ar livre, logo de seguida:
1- aplicou-se o garrote;
2- associou-se a agulha ao adaptador;
3- descapsulou-se a agulha;
4- com o indicador ou o polegar de uma das mos, esticou-se a pele do paciente
fixando a veia escolhida e, com o sistema agulha-adaptador na outra mo,
puncionou-se a veia com preciso e rapidez (movimento nico). O sistema
agulha-adaptador deve estar a um ngulo de 15 em relao ao brao do paciente;
6- com a outra mo pegou-se no tubo de colheita adequado e conectou-se ao
adaptador;
7- com o tubo de colheita dentro do adaptador pressionou-se com o polegar, at
que a tampa ficasse perfurada;
8- logo que o sangue flui para dentro do tubo, retirou-se o garrote;
9- medida que foram sendo preenchidos os tubos, homogeneizou-se
gentilmente por inverso os tubos com anticoagulante;
10- aquando da utilizao ltimo tubo, retirou-se a agulha. A agulha foi
descartada no contentor para resduos corto-perfurantes;
11- colocou-se os tubos no suporte, devidamente identificados que de seguida
foram levados para a sala de triagem;
12- pediu-se ao paciente que exercesse presso sobre o local da puno com
algodo, sem dobrar o brao, at que parasse de sangrar e aplicou-se um penso
rpido.


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Consideraes aquando da colheita
Todo o produto de origem humana deve ser considerado um potencial
transmissor de infeo e, como tal, manuseado de acordo com regras de
segurana. Contudo, necessrio especial cuidado com os produtos provenientes
de doentes com hepatites, sida e com patologias infecto-contagiosas.
Na preveno do risco biolgico, no ato da colheita, deve-se:
- usar luvas descartveis de plstico ou de borracha. Se houver um risco alto,
tomar outras precaues adicionais como usar um avental de plstico descartvel
e uma mscara;
- ter cuidado para prevenir feridas com agulhas e lancetas. No manipular
agulhas usadas;
- utilizar sempre seringas, agulhas e lancetas descartveis;
- o material usado nas colheitas (compressas e algodo) deve ser deitado no
contentor preto de PVC;
- as amostras devem ser enviadas ao laboratrio em contentores prprios,
suficientemente resistentes, para evitar acidentes.
1.2- Fase analtica
Aps a obteno das amostras, seguiu-se a marcha laboratorial analtica. O
controlo desta fase analtica compreende tanto o controlo de qualidade interno
como o externo.
Esta fase compreende a execuo da amostra, bem como tudo o que lhe est
inerente: as tcnicas, os reagentes, os equipamentos, os controlos, os
calibradores, a refrigerao.
Monitorizou-se todos os reagentes e todas as tcnicas todos os dias, com uma
especial ateno, na seco de Bioqumica, em que as tcnicas so mais sensveis
e os valores so mais apertados (e.g. creatinina), bem como nas seces de
Hormonologia e Imunologia.
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1.3- Fase ps-analtica
Muito sucintamente, esta fase surge depois da fase analtica e nesta deu-se a
validao dos resultados, de acordo com a informao clnica do doente e a
entrega atempada ao mdico ou ao servio requisitante.
2- Resduos hospitalares
Triagem e acondicionamento dos resduos hospitalares
No SPC e em qualquer outro hospital, existem preocupaes ambientais e com a
sade pblica, existindo um sistema de triagem e de acondicionamento de
resduos em todos os sectores (quadro I).

Quadro I: Gesto de resduos dos grupos I, II, III e IV

Resduos dos grupos I e II
(resduos no perigosos):
Resduos dos grupos III e IV (resduos
perigosos):
So resduos equiparados a urbanos no
apresentam exigncias especiais no seu
tratamento (I) e resduos hospitalares no sujeitos
a tratamentos especficos, podendo ser
equiparados a urbanos (II).

Depositam-se nos
sacos de plstico preto e destinam-se lixeira
comum. A ttulo de exemplo, invlucros de
vrios materiais em papel plastificado, papel
autocolante, papel encerado, papel metalizado,
toalhetes de papel, material de escritrio.
So resduos de risco biolgico: resduos
contaminados ou suspeitos de contaminao,
suscetveis de incinerao ou de outro pr-
tratamento eficaz, permitindo uma posterior
eliminao como resduo urbano (III) e resduos
hospitalares especficos; resduos de vrios tipos
de incinerao obrigatria (IV). So depositados
nos contentores de polietileno, de cor preta, e
destinam-se incinerao. Encaixam-se nessa
categoria: tubos j analisados, frascos de reagentes
vazios, calibradores vazios, controlos utilizados,
monovettes utilizadas, compressas, qualquer
material que teve contacto com os produtos
biolgicos.

Resduos corto-perfurantes
Deu-se a colocao destes resduos (exemplos: lminas, agulhas e restante
material corto-perfurante que constituem um risco potencial de ocorrer acidentes
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por picada ou corte.) nos contentores estanques e rgidos, identificados com o
smbolo de BioHazard, geralmente so de cor amarela e vermelha.












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Microbiologia
A microbiologia mdica uma cincia que estuda a interao entre o ser humano
e os microrganismos, nomeadamente as bactrias, vrus, fungos e parasitas.
A microbiologia clnica ocupa-se primordialmente com a etiologia das doenas
infeciosas, com o estudo da suscetibilidade aos antimicrobianos e o controlo da
infeo associada aos cuidados de sade. Esta valncia no Hospital Dr. Nlio
Mendona est dividida em 5 seces: Bacteriologia I; Serologia; Biologia
Molecular, que do apoio aos vrios hospitais, a Bacteriologia II e seco de
Parasitologia / Urinas direcionadas essencialmente para a sade pblica.
Na seco de Bacteriologia I, na qual realizei o meu estgio, deu-se resposta ao
diagnstico hospitalar, desde consulta externas e servios de internamento dos
trs Hospitais (H. Dr. Nlio Mendona (HNM), H. dos Marmeleiros e o H. Dr.
Joo de Almada) incluindo o Servio de Urgncia.
Na seco de Bacteriologia II, respondeu-se aos pedidos de todos os centros de
sade da regio e da unidade Dr. Agostinho Cardoso.
A seco de Serologia contempla as anteriores Bacteriologias, I e II e onde se
realizaram anlises de biologia molecular e micobacteriolgico.
Na seco de Parasitologia e Urinas, executou-se a anlise sumria da urina
(urinas Tipo II), as pesquisas de parasitas e tambm de sangue oculto nas fezes.
O meu estgio teve a durao de dois meses, durante os quais acompanhei as
seces de Bacteriologia I, onde permaneci por um perodo maior, da Serologia e
da Parasitologia/Urinas.






20

I- Bacteriologia
No campo das doenas infeciosas, os resultados laboratoriais dependem, em
grande parte, da qualidade da amostra, do momento em que o produto colhido,
dos cuidados a ter com a sua manipulao, bem como dos conhecimentos e
experincia dos profissionais.
Na maior parte dos casos de doena infeciosa, o diagnstico de entrada feita pelo
mdico um diagnstico presuntivo, tendo em conta os sinais e sintomas
apresentados pelo doente, sendo o diagnstico definitivo realizado aquando da
identificao do agente patognico.
O diagnstico microbiolgico abrange a caracterizao de milhares de agentes
que provocam doenas infeciosas ou esto associadas a elas, sejam elas causadas
por bactrias, vrus, parasitas e fungos. As tcnicas utilizadas para caracterizar
estes agentes infeciosos dependem da clnica e do tipo de agente que est a ser
investigado, tendo em conta, sempre, a flora normal da amostra para saber o que
realmente patolgico a fim de fazer uma correta reportao de resultados.
Nenhum teste, por si s, permite o isolamento ou a caracterizao de todos os
organismos patognicos potenciais. As informaes clnicas do paciente e toda a
diagnstica envolvente, como a Bioqumica ou a Hematologia, so de extrema
importncia e um auxlio para um correto diagnstico com a mxima qualidade e
fidelidade.
A maior parte dos microrganismos patognicos cresce lentamente, levando no
mnimo 24 horas ou mais, dias ou mesmo at semanas, para o seu isolamento e
identificao. Porm o tratamento a administrar ao paciente no pode ser adiado
at que esse processo tenha sido concludo. Aps a obteno das amostras
adequadas e da informao do diagnstico clnico presuntivo ao laboratrio, o
mdico inicia o tratamento antibitico emprico contra o(s) microrganismo(s),
eventuais responsveis pela infeo do paciente. Quando obtm resultados do
laboratrio o mdico poder ponderar a eventual mudana de teraputica e
reavaliar o diagnstico. Essas informaes por parte do laboratrio consistem em
21

relatrios preliminares dos resultados, obtidos em cada etapa de isolamento e
identificao do agente etiolgico da doena.
I- 1- Diagnstico das infees bacterianas e fngicas
O exame laboratorial bacteriolgico iniciou-se com o exame direto, seguindo-se
do exame cultural, ambos realizados em ambiente estril. Se for isolado um
microrganismo especfico na cultura passa-se respetiva identificao e a
avaliao quanto a sua suscetibilidade aos antimicrobianos.
Utilizou-se os seguintes procedimentos laboratoriais (metodologia) no
diagnstico clnico das causas infeciosas:
- Exame macroscpico;
- Exame microscpico;
- Sementeira em meios de cultura adequados para o enriquecimento, isolamento e
seleo de colnias;
- Caraterizao das bactrias patognicas ou potencialmente patognicas
isoladas:
Caratersticas morfolgicas;
Caratersticas culturais;
Caratersticas tintoriais;
Caratersticas bioqumicas;
Estrutura antignica;
- Provas de sensibilidade aos agentes quimioteraputicos e a respetiva
interpretao de acordo com o microrganismo identificado e origem do produto a
partir do qual foi isolado;
- Deteo do antignio do agente por ensaio imunolgico (aglutinao do latex)
ou anticorpos marcados com fluorescena ou com peroxidase (Serologia);
- Hibridizao DNA-DNA ou DNA-RNA para a deteo de genes especficos do
agente patognico nas amostras do paciente (biologia molecular).
22

I- 1.1- Amostras
Deu-se a identificao adequada da amostra e rotulao, com a introduo da
informao clnica relevante ao diagnstico, os dados de identificao do
paciente, a identificao do mdico e servio requisitante. Estes critrios esto
enquadrados na fase pr-analtica, tanto na microbiologia, como nas outras
valncias do SPC, dado que um erro a esse nvel pode comprometer as fases
seguintes: a analtica e a ps-analtica.
Uma colheita correta da amostra constitui uma das etapas mais importantes da
marcha laboratorial, visto que os resultados vo depender em grande parte desta
etapa (pr-analtica).
A amostra deve ser obtida do local que provavelmente h presena do agente
infecioso (num determinado estadio da doena), devendo ser manipulada de
modo a favorecer a sua sobrevida e crescimento do microrganismo.
Algumas regras gerais da colheita e manipulao das amostras:
a) a quantidade de material deve ser adequada e bem representativa (e.g. uma
amostra salivar em vez de uma expetorao);
b) obteno de amostras significativas para o diagnstico preferencialmente antes
da administrao de antimicrobianos;
c) evitar a contaminao da amostra , utilizando apenas equipamento estril e
sempre com precaues asspticas;
d) a amostra deve ser levada de imediato para o laboratrio e processada o mais
rapidamente possvel.
Acompanhou-se a rotina do laboratrio, e adquiriu-se treino na execuo do
exame bacteriolgico de diferentes produtos:
- urina;
- sangue;
- expetorao (EXP), secrees brnquicas (SB), aspirado traqueal (AT), lavado
bronco-alveolar (LBA);
- exsudados nasais, farngeos, ocular e ouvido;
23

- pus e lquidos biolgicos (LCR, L. asctico, L. pleural, L. peritoneal, L.
pericrdico e L. sinovial);
- exsudado vaginal, uretral e perianal;
- fezes;
- pontas de cateter.
I- 1.2- Exame microscpico
O exame macroscpico a primeira etapa do estudo, seguido do exame
microscpico e identificao de um microrganismo com a observao e anlise
da forma, tamanho e organizao/agrupamento dos microrganismos.

o Exame a fresco
O exame a fresco utilizado por e.g. no estudo das urinas, com a visualizao do
sedimento urinrio (e.g. com a presena de leuccitos em caso de infeo) e no
estudo micolgico no exsudado vaginal para a visualizao de elementos
leveduriformes (Candida albicans). Este tipo de exame utilizado sempre que
necessrio ou em caso de dvidas.

o Exame direto
O exame direto constitui um mtodo relativamente simples, permite o
diagnstico presuntivo devendo ser sempre acompanhado pelo exame cultural.
um exame de baixo custo e institui-se como uma ferramenta de apoio
identificao do microrganismo (embora muito menos sensvel que o exame
cultural).
No laboratrio so efetuados dois tipos de colorao: a colorao pelo mtodo de
Gram; a colorao para as bactrias lcool-cido resistentes (BAAR) de Ziehl-
Neelsen:




24

Colorao pelo mtodo de Gram
Constitui um procedimento de grande utilidade no diagnstico microbiolgico.
Quando h suspeita de infeo bacteriana, deve-se efetuar um esfregao, corado
pelo mtodo de Gram, figura 1, e examinadas ao microscpio









Fig. 1: Colorao pelo mtodo de Gram.

Os corantes combinam-se quimicamente com o protoplasma bacteriano. Se a
clula ainda no estiver morta, o prprio processo de colorao ir destru-la.
Os corantes mais utilizados so os sais. Os corantes bsicos consistem num
catio dotado de cor com um anio incolor e os corantes cidos comportam-se de
modo inverso.
As clulas bacterianas so ricas em cido nucleico, que apresentam cargas
negativas na forma de grupos fosfato que se combinam com os corantes bsicos
de carga positiva. Os corantes cidos no coram as clulas bacterianas e podem
ser utilizados para corar o material de fundo com uma cor contrastante. Os
corantes bsicos coram uniformemente as clulas bacterianas, a no ser que o
RNA citoplasmtico seja inicialmente destrudo. Entretanto, podem-se utilizar
tcnicas especiais de colorao para diferenciar flagelos, cpsulas, paredes
celulares, membranas celulares, grnulos, ncleos e esporos.



1.Fixao com calor ou lcool 96%: 1min.;
2.Cobrir com soluo de cristal de violeta: 1
min.;
3.Lavar com H2O;
4.Cobrir com Iodo: 5 min.;
6.Descorar lcool-acetona: 10 a 30s;
7. Cobrir com Safranina: 1min.;
8. Lavar com H2O e secar.
25

Colorao de Ziehl-Neelsen
Utilizada para corar as BAAR, que so aquelas que retm carbol-fucsina (fucsina
bsica dissolvida numa mistura de fenol-lcool-gua), mesmo quando descoradas
com cido clordrico em lcool. Um esfregao de clulas em lmina banhado
com carbol-fucsina e aquecido em vapor, procedimento aps o qual a
descolorao com cido- lcool efetuada. Por fim, aplica-se um contra corante
contrastante (azul de metileno). As BAAR (micobactrias e alguns dos
actinomicetos relacionados) adquirem cor vermelha, enquanto as outras
apresentam a cor do contra corante.
Os verdadeiros bacilos da tuberculose caracterizam-se pela sua lcool-cido-
resistncia, isto , o lcool etlico a 95% contendo 3% de cido clordrico
descolora rapidamente todas as bactrias, exceto as micobactrias. As amostras
destinadas pesquisa de BAAR, so para a pesquisa de Mycobacterium
tuberculosis. Estas so pesquisadas normalmente no trato respiratrio no LBA,
na EXP, nas SB, no LCR e no suco gstrico.
Na bacteriologia, s se realizam as coloraes para suspeita de tuberculose,
sendo o resto do diagnstico realizado na Serologia: o exame cultural, o teste de
sensibilidade antibitica (TSA) e tambm a confirmao por Biologia Molecular.
Sendo a M. tuberculosis a BAAR mais comum, as amostras de excelncia
destinadas para a sua pesquisa so: LCR, lavado bronco alveolar e suco gstrico.
No exame direto, corado pelo mtodo de Gram, os microrganismos Gram +
apresentam uma colorao prpura-azulada, ao passo que a cor vermelha
indicadora de microrganismos Gram -. Este exame tambm permite avaliar a
morfologia (cocos, bacilos, vibrio, etc.) das bactrias (fig.2).
26



Fig.2: Morfologia bacteriana.

Embora no permitindo a identificao da espcie, clarifica-nos apenas se so
bactrias gram-positivas ou gram-negativas, e tambm se so cocos, bacilos,
diplococos. Este mtodo de Gram permite realizar um diagnstico presuntivo e
orientar o estudo para a identificao do microrganismo, por exemplo, se forem
observados cocos gram-positivos dispostos em cadeia so sugestivos de
estreptococos e cocos gram-positivos dispostos em cacho so sugestivos de
estafilococos. Algumas bactrias gram-positivas no viveis podem exibir
colorao gram-negativa, da a importncia de uma boa colorao para que no
haja enganos na identificao do tipo de bactrias presentes.

o Exame cultural
O exame cultural consiste em semear amostras biolgicas, em meios de cultura,
gerais ou seletivos. Este processo feito em meio prprio (culturas) que permita
a nutrio, o crescimento e a multiplicao de microrganismos. Para cada
produto biolgico, so utilizados diferentes meios, consoante os microrganismos
possveis de se encontrar nessa amostra e o diagnstico clnico do doente. Este
exame permite, tambm, a identificao do gnero/espcie do agente causador da
infeo.

27

Nota: Para a realizao do exame cultural, a amostra deve conter pelo menos 10
5

microrganismos por mililitro (mo/ml) para que possam ser detetados num
esfregao. O meio de cultura lquido contendo 10
5
mo/ml tem um aspeto
macroscopicamente turvo, que tambm pode ser observado em algumas amostras
lquidas (urina turva pode ser um sinal de infeo). Nas amostras que contm 10
2
a 10
3
mo/ml h crescimento em meios slidos de culturas, enquanto as que
contm 10 mo/ml ou menos bactrias podem produzir crescimentos em meios
lquidos, sendo estes meios utilizados apenas para enriquecimentos para garantir
o crescimento da bactria.
I- 1.3- Meios de cultura slidos
Os meios de cultura utilizados para a realizao do exame cultural, so muito
mais sensveis e especficos que o exame direto.
Para o diagnstico bacteriolgico utilizaram-se vrios meios de cultura gerais,
seletivos e diferenciais para as bactrias aerbias, as anaerbias facultativas e
obrigatrias.
O conhecimento sobre os mecanismos e exigncias da nutrio microbiana
permite, aos microbiologistas, cultivar microrganismos em laboratrio, usando
meios de cultura adequados. Uma m escolha do tipo de meio compromete, de
certo modo, a amostra e o tempo de identificao. Nos meios de cultura, os
microrganismos multiplicam-se, o que vai permitir isola-los e identifica-los. Para
alm dos nutrientes necessrios s exigncias dos microrganismos, os meios de
cultura devem ser estreis.
Para caracterizar individualmente um microrganismo, necessrio obt-lo em
cultura pura (apenas um tipo de microrganismo). Essas culturas podem ser
obtidas pelos mtodos de estrias ou de espalhamento em placa, obtendo-se
colnias, que so visveis macroscopicamente e so provenientes da
multiplicao celular. partida, as colnias individualizadas e bem distanciadas
umas das outras, so originadas, em princpio a partir de uma nica clula.
O isolamento de uma estirpe bacteriana, em cultura pura a partir de uma cultura
mista (cultura que tem mais do que um tipo de microrganismos), requer o uso de
28

meios de cultura seletivos e/ou diferenciais. Os meios seletivos so formulados
para suprimir o crescimento dos microrganismos que no interessam, permitindo
o crescimento dos microrganismos que se desejam isolar.
I- 1.3.1- Meios de cultura no seletivos
Meios de cultura no seletivos utilizados na Bacteriologia do HNM:
Gelose de sangue
um meio de cultura padro para qualquer tipo de amostra. Geralmente
preparado com 5% de sangue de carneiro, sendo um meio geral, permite a
deteo da maioria dos microrganismos aerbios e anaerbios facultativos,
bactrias exigentes e tambm permite a evidncia de hemlise.
Gelose de chocolate Polivitex
um meio que contm sangue aquecido com ou sem suplementos sendo um
meio no seletivo. Alguns microrganismos que no crescem em gelose de sangue
como a Neisseria spp. e Haemophilus spp. patognicos e crescem nesta gelose.
Muller-Hinton
Este meio usou-se para o estudo da suscetibilidade aos antimicrobianos.

I- 1.3.2- Meios seletivos
Meios seletivos utilizados:
Gelose chocolate PolyVitex V.C.A.T
Normalmente denominada por gelose de chocolate. Pode ser suplementada para o
isolamento de determinadas bactrias, uma vez que inclui os seguintes
antibiticos vancomicina, colistina, anfotericina e trimetropim com incubao a
35C em atmosfera enriquecida com 5% de CO2, o que provoca o isolamento de
Neisseria gonorrhoeae em amostras com flora autctone, mais utilizado para os
gonococos, visto que uma bactria muito exigente.
A gelose chocolate com bacitracina vai favorecer o crescimento de Haemophilus
spp. nos produtos com flora mista, devido inibio das bactrias gram-positivas
e a maioria das Neisserias spp..
29

Gelose MacConkey (McK)
um meio de cultura seletivo para bactrias gram-negativas suprimindo as gram-
positivas (atravs dos sais biliares).
Num meio diferencial podem crescer vrios tipos de microrganismos, mas devido
ao diferente aspeto que tomam nesse meio, podem distinguir-se entre si as
colnias microbianas (e.g. o meio de cultura McK contm lactose e vermelho
neutro, um indicador de pH que amarelo, a pH neutro, e rosa ou vermelho, a pH
cido. A Escherichia coli fermenta lactose e produz cidos originando nesse
meio colnias vermelhas ou rosa. A Salmonella, no fermenta a lactose, origina
colnias incolores nesse meio, ou seja, a presena de lactose permite diferenciar
as bactrias fermentadoras das no fermentadoras).
As amostras que so semeadas para a pesquisa de anaerbios obrigatrios devem
ser semeadas em pelo menos dois tipos de meios, um que seja enriquecido e
suplementado e um meio seletivo contendo substncias que inibem o crescimento
de bacilos gram-negativos e cocos gram-positivos anaerbios facultativos.

Gelose de Chapman (manitol salgado)
um o meio de cultura que favorece o crescimento dos gram-positivos,
precisamente para o isolamento de Staphylococcus spp. e identificao
presuntiva de S. aureus (fermentao do manitol).

Gelose de CNA (meio de azido)
Gelose com sangue, colistina e cido nalidxico, onde a colistina e o cido
nalidxico inibem o crescimento das Enterobacteriaceae e Pseudomonas spp., o
que torna o meio seletivo para bactrias gram-positivas. Contudo, algumas
bactrias gram-negativas como Gardnerella vaginalis e alguns Bacteroides spp.
tambm se desenvolvem neste meio.

Gelose CLED (cistina- lactose - dfice de eletrlitos)
um meio no seletivo, diferencial, que vai permitir o isolamento dos agentes
mais frequentes de infeo urinria. A insuficincia de eletrlitos inibe o
30

swarming dos Proteus spp. e a lactose permite diferenciar os fermentadores dos
no fermentadores.

Gelose Salmonella & Shigella (SS)
Para a cultura de fezes existem meios especficos, seletivos e diferenciais como,
por exemplo, a gelose SS que favorece o crescimento da Salmonella e da
Shigella e o seu isolamento. As colnias distinguem-se pela cor. Este meio inibe
tambm dos coliformes pelo verde brilhante e sais biliares. A presena de sais
de ferro permite a deteo das estirpes produtoras de H2S.

Gelose SMID
um meio cromogneo para o isolamento seletivo e de diferenciao destinado
deteo das Salmonella a partir de fezes
A colorao das colnias obtm-se atravs da associao de substratos:
- Dois substratos nutritivos hidrocarbonados (sorbitol e glucuronato) combinados
com um indicador colorido (vermelho neutro) que provoca a colorao rosa das
colnias de Salmonella;
- Dois substratos cromogneos que provocam a colorao azul das colnias que
possuem uma -glucosidade (no Salmonella).

Gelose campylobacter
um meio para campylobacter, requer uma temperatura muito particular de
crescimento, os 42C durante 3 dias.

Gelose sorbitol
um meio cromogneo especfico para Escheriachia coli O157, em que as
colnias apresentam-se de cor violeta. Se houver outro tipo de bactrias no meio,
estas apresentam-se de cor azul metlico. A incubao durante 18h, a uma
temperatura de 35-37C.


31

Gelose sabouraud
Para o isolamento de fungos, um meio que possui essencialmente glicose.
Muitas leveduras crescem em gar de sangue. Os fungos dimrficos, na fase de
miclio crescem bem em meio sabouraud. As culturas para fungos costumam ser
efetuadas em duplicado, sendo um conjunto incubado entre 25 e 30C e o outro
entre 35 e 37C (isto em zonas endmicas com essas temperaturas que
desenvolvam esse tipo de fungos).

Gelose candida (CAN)
um meio seletivo e cromognico destinado ao isolamento das leveduras,
identificao imediata de Candida albicans e diferenciao de um conjunto de
espcies agrupando C. tropicalis, C. lusitaniae e C. Kefyr.
A hidrlise especfica de um substrato cromogneo de hexosaminidase na
presena de um indutor da enzima leva colorao azul das colnias de C.
albicans. A hidrlise de um segundo substrato permite diferenciar as culturas
mistas e orientar a identificao para as outras espcies. As colnias que
hidrolisam este substrato so pigmentadas a rosa.
A inibio da flora bacteriana obtida pela adio de uma mistura de
antibiticos.

Gelose de Lowenstein-jensen
Para a cultura das micobactrias (realizado na Serologia) utilizado o meio
slido com uma incubao at 45 dias. As culturas so observadas
periodicamente durante o perodo de incubao, ao fim do qual, se no houver
crescimento, dado como resultado negativo. A colnia da micobactria muito
particular, sendo em forma de couve-flor. utilizado tambm um meio lquido
de referncia que leva ao crescimento mais rpido destas colnias do que no
meio slido.
32

I- 1.4- Meios lquidos de enriquecimento
As culturas em caldo em meios altamente enriquecidos, os caldos de carne, so
importantes para culturas de lquidos biolgicos e tecidos obtidos de bipsia.

Caldo Cooked Meat Medium (caldo de carne) e caldo Todd Hewitt
Meio lquido em tubo para o crescimento de micro-organismos.

Caldo selenito
Os meios de cultura que permitem o crescimento de uma espcie bacteriana em
detrimento de outras, caldo selenito ou caldo de tetrationato permitem o
crescimento de Salmonella a partir de fezes, sem o crescimento da flora
autctone existente no intestino. A subcultura para meio slido deve ocorrer
entre as 6 e 12 horas, pois esse o prazo mdio de inibio de outras estirpes, tal
como o Proteus spp..

Granada (IGLB) - caldo bifsico
Meio seletivo para o rastreio e a identificao dos estreptococos do grupo B (S.
agalactiae).

Frascos de hemocultura BACTEC


TM
Os meios existentes nestas garrafas so constitudos por:
- caldo nutritivo prprio para aerbios, anaerbios e fungos, de acordo com a
garrafa em questo;
- anticoagulante, para alm da sua atividade anticoagulante, tem uma ao
fagoctica e anti-complemento e inativa parcialmente alguns antibiticos;
- penicilinase, que inativa certas penicilinas e outros antibiticos -lactmicos
presente no sangue do doente;
- resinas, inativam a maioria dos antibiticos pela absoro dos mesmos
superfcie das partculas de resina e outros componentes especficos do meio.
33

I- 1.5- Geradores
H tcnicas especiais de crescimento para microrganismos anaerbios e
microaeroflicos. Os anaerbios estritos exigem uma ausncia total de oxignio
para o seu crescimento, enquanto os microaerfilos requerem cerca de 5% de O
2
.
Para isso, esto disponveis comercialmente geradores que permitem obter as
diferentes atmosferas necessrias para a cultura de microrganismos patognicos
em laboratrio, em CO
2
, microaerofilia e anaerobiose. Para a anaerobiose,
incuba-se 24 horas a 37C usando o Genbox anaer. Para o meio em CO
2
incuba-
se 24 horas a 37C usando o Genbox CO
2
. Para obter uma atmosfera
microaeroflica, incuba-se 72 horas a 42C usando tambm o Genbox.
I- 1.6- Floras bacterianas e fngicas normais
O termo flora normal refere-se populao de microrganismos que habita
normalmente num dado local anatmico (pele e nas mucosas) dos indivduos
saudveis. Alguns microrganismos, como a Mycobacterium tuberculosis, a
Salmonella thyphi e as espcies da Brucella spp., so considerados bactricas
patognicas sempre que encontradas em pacientes.
Muitas infees so causadas por microrganismos que fazem parte da flora
normal ou que colonizam transitoriamente um determinado local anatmico,
como e.g., a Escherichia coli, que faz parte da flora gastrointestinal normal e
constitui a causa mais comum das infees do trato urinrio. Da mesma forma, a
grande maioria das infees bacterianas mistas por anaerbios causada por
microrganismos que fazem parte da flora normal.
O nmero relativo de microrganismos encontrados numa cultura importante
quando se trata de microrganismos da flora normal. Quando existe um
predomnio, poder ser ele o prprio o responsvel pela infeo. Por e.g. sempre
que os bacilos gram-negativos so numerosos como a Klebsiella pneumoniae,
estas so encontradas em associao a algumas bactrias nasofarngeas normais
em amostras como a expetorao. Os bacilos gram-negativos so fortemente
suspeitos como causa da pneumonia, visto que normalmente no se encontram
em grande nmero na expetorao ou nas secrees brnquicas como tambm na
34

flora nasofarngea, logo, necessrio proceder identificao destes
microrganismos.
J os abcessos abdominais costumam conter uma distribuio normal de
microrganismos aerbios, anaerbios facultativos e anaerbios obrigatrios
representativos da flora gastrointestinal. Nestes casos, no se justifica a
identificao de todas as espcies presentes, sendo significativo as trs
predominantes, comparando-as com a flora normal gastrointestinal e logo que
possvel reportando-as ao mdico.
Os fungos, em pequeno nmero, podem fazer parte da flora normal, sobretudo,
nos locais anatmicos com comunicao com o exterior, e.g. o nariz, os ouvidos.
Normalmente, no esto presentes em zonas profundas, do aparelho respiratrio
inferior, e.g. nos pulmes, desta forma quando encontrados (e.g. Aspergillus
spp.) tm de ser estudados, identificados e reportados.
Segue-se a tabela I com alguns os microrganismos residentes na flora normal nos
diferentes tratos, nomeadamente, da pele, da nasofaringe, do gastrointestinal e
por fim no genital.















35

Tabela I: Flora normal nos indivduos saudveis.
Bactrias da flora normal

Pele
Staphylococcus epidermidis; Staphylococcus aureus (em <n); Micrococcus
spp.; Neisseria spp. no-patognicas; Estreptococos -hemolticos e no-
hemolticos; Difterides; Proponibacterium spp.; Peptostreptococcus spp.;
Outros microrganismos em < n: Candida spp., Acinobacter spp..



Nasofaringe
- Qualquer quantidade observada dos seguintes microrganismos:
Difteroides, Neisseria spp. no-patognicas, Estreptococos -hemolticos e
no-hemolticos, Staphylococcus epidermidis, anaerbios (e.g. cocos
anaerbios, Fusobacterium spp.).
- Em menor nmero, os seguintes microrganismos quando acompanhados com
os citados anteriormente:
Leveduras, Haemophilus spp., pneumococos, Staphylococcus aureus, bacilos
gram-negativos, Neisseria meningitidis.



Gastrointestinal

Vrias enterobactrias, exceto Salmonella spp., Shigella spp., Yersnia spp.,
Vibrio e Campylobacter .
Bacilos gram-negativos no-fermentadores de glicose, Enterococos,
Estreptococos -hemolticos e no-hemolticos, Difteroides, Staphylococcus
aureus e Leveduras (em pequeno n) anaerbios em grande nmero (e.g.
Bacteroides fragilis, Fusobacterium spp., Clostridium perfringens e
Bifidobacterium spp.-lactobacilos anaerbios)





Genital

Qualquer quantidade observada dos seguintes microrganismos:
Corynebacterium spp e Lactobacillus spp.,estreptococos -hemolticos e no-
hemolticos, Neisseria spp. no-patognicas.
Os seguintes microrganismos quando presentes e no predominantes:
enterococos, enterobactrias e outros bacilos gram-negativos, Staphylococcus
epidermidis, Candida albicans e outras leveduras.
Anaerbios; quando em crescimento puro ou nitidamente predominante o
Clostridium spp. e Peptostreptococcus spp. podem ser importantes. O
estreptococo do grupo B faz parte da flora em 25% nas mulheres durante o
perodo da gravidez, o que preocupante na altura do parto passe para o beb
o que pode levar a uma spsis neonatal e meningite (no ltimo trimestre).

36

O isolamento de bactrias e fungos so de uma importncia significativa se o
microrganismo for isolado de um local normalmente estril, ou seja desprovido
de microrganismos como, por exemplo, o sangue ou lquidos biolgicos. No
entanto, muitas partes do corpo possuem uma flora microbiana normal que pode
ser alterada por influncia endgena ou exgena e o isolamento de
microrganismos potenciais nestes locais, como e.g. nas vias respiratrias, na
pele, no trato intestinal, devem ser considerados no contexto da flora normal de
cada trato.




















37

I- 2- Provas de identificao de bactrias e fungos leveduriformes
Na seco realizou-se alguns mtodos de identificao dos vrios
microrganismos, tais como:

Provas rpidas de caracterizao bioqumica, nomeadamente: a prova da
coagulase (a coagulase liga-se protrombina e juntas tornam-se enzimaticamente
activas iniciando o processo de polimerizao) muito importante para distinguir
os Staphylococcus spp. de coagulase negativa da positiva; a prova da catalase
(converte o perxido de hidrognio em H
2
O e O2), um exemplo, na
diferenciao de um estafilococo (positivo) de um estreptococo (negativo);

Provas de suscetibilidade a antibiticos: optoquina, novobiocina e a
bacitracina;

Provas com discos impregnados com fatores de crescimento (fator X:hemina e
V:NAD);

Prova de filamentao para a identificao presuntiva de Candida albicans;

Testes imunoqumicos:
- aglutinao com partculas de ltex (Identificao de Streptococcus -
hemolticos do grupo A, B, C, G e F);
- aglutinao direta para a caracterizao antignica de Salmonella,
Shigella e E. coli O157:H7.;
Galerias de identificao manual, Api

/ID 32, consistem em testes


bioqumicos, com leitura visual ou automtica, por comparao com uma base de
dados:
- Api 20 Strepto, para identificao de Streptococcus spp.;
- Api NH, para identificao de Haemophilus spp. e Neisseria spp.;
- Api 20E, para identificao de Enterobacteriaceae;
38

-Api 20 NE, para identificao de bactrias Gram negativas no
fermentativas;
- Api Coryne, para identificao de Corynobacteriaceae;
- Api Campy, para identificao de Campylobacter;
- ID 32 C, para identificao de fungos;

Sistema de identificao Vitek.




















39

I- 3- Processamento dos produtos para exame bacteriolgico
I- 3.1- Urina
A infeo do trato urinrio (ITU) a infeo mais comum no homem. A urina
um produto estril. A uretra possui a sua flora normal. Quando a urina normal
eliminada, contm um pequeno nmero de bactrias. Como necessrio
distinguir os microrganismos contaminantes dos etiologicamente importantes,
apenas o exame quantitativo da urina pode fornecer resultados significativos.
A colheita da amostra muito importante visto que, se no houver uma boa
colheita, facilmente esta se contamina e torna-se necessria a sua repetio. Para
que isso no acontea, tem de haver uma boa higienizao dos rgos genitais
exteriores antes da colheita da amostra, devendo ser colhida urina do jacto mdio
e colocada num recipiente estril.
Nos doentes algaliados, a amostra nunca deve ser obtida do saco coletor mas sim
por puno da alglia, aps clampagem, com a respetiva desinfeo. necessrio
transmitir essa informao ao laboratrio, visto que estas urinas normalmente
vm contaminadas por mais que um microrganismo (sendo apenas um s
microrganismo o causador da infeo).
necessrio ter ateno ao analisar as urinas, a condio clnica em que o
paciente se encontra, se provm do ambulatrio, se est hospitalizado, se est
algaliado, ITU sucessivas, com ou sem antibioterapia.
Devido rpida multiplicao dos microrganismos na urina temperatura
ambiente, estas amostras devem ser rapidamente levadas at ao SPC ou
refrigeradas sem ultrapassar uma noite.
O sedimento urinrio realizou-se aps uma centrifugao e, posteriormente, so
analisados ao microscpio: o n de leuccitos, das clulas epiteliais, dos
eritrcitos e a presena de leveduras. A presena de muitos leuccitos bem como
de eritrcitos faz suspeitar de uma infeo. A observao de numerosas clulas
epiteliais escamosas, de lactobacilos ou flora mista, sugere uma m colheita.
O exame cultural na urocultura, para ser significativa tem que ser efetuada de
modo quantitativo.
40

O Uriline

, o meio de cultura usado na seco, tambm um meio de transporte,


que consiste num recipiente estril, contendo uma lmina com 2 meios de cultura
slidos contrapostos: o CLED (meio geral) e o McK. (meio seletivo para gram-
negativos).
Aps a incubao da amostra, confirmou-se, se a bacteriria era positiva (igual
ou superior a 10
5
colnias/mililitro), e em caso ser positiva, verificou-se se a
cultura era pura (presena de 1 microrganismo), caso contrrio, seria necessrio
proceder a novo isolamento para os meios slidos (geralmente para gelose McK,
gelose manitol chapman, gelose azido e gelose Candida).
Incuba-se os meios durante 24 horas 37C. Findo este tempo, se as colnias j
se apresentarem puras, efetuam-se o seu estudo de identificao e antibiograma.
Se a cultura se encontrar pura logo de incio, o microrganismo j pode ser
identificado e efetuar o antibiograma.
So realizadas reservas das placas primrias para uma gelose de sangue e McK
caso sejam positivas, com o intuito de confirmar se a cultura se encontra mesmo
pura ou se existe mais que um microrganismo.

Notas:
- Quando as culturas se encontram puras, h provas rpidas de identificao
como j foi anteriormente referido, como a catalase. H evidncias que tm de
ser levadas em conta, como as caractersticas morfolgicas das colnias, o odor,
se so lactose+ ou lactose (bactrias que fermentam ou no a lactose) e o teste
da oxidase (Pseudomonas so oxidase +). Por e.g. a Escherichia coli que o
microrganismo mais predominante nas ITU tem caractersticas muito
particulares, as colnias so secas, pequenas, vermelhas tem um cheiro
caracterstico e no fermentam a lactose.
- Quando a cultura se encontra com mais de um microrganismo sem predomnio
sugerido repetio de colheita. A condio clnica em que o paciente se
encontra (algaliado, doente renal, m colheita, falta de higienizao) tem de ser
sempre tida em conta no estudo da anlise de urina assptica.
41

I- 3.2- Hemocultura
A hemocultura uma anlise que consiste na deteo de uma infeo sistmica
causada por bactrias e fungos. A hemocultura fornece informaes na
abordagem de pacientes com picos febris associados a complicaes clnicas com
ou sem sinais e sintomas localizados e tambm na suspeita de endocardite
infeciosa.
Nos indivduos sem infeo generalizada, a amostra de sangue devidamente
obtida dever ser estril, embora os microrganismos provenientes das floras,
respiratria e gastrointestinais normais possam penetrar na corrente sangunea,
mas so rapidamente removidos pelo sistema reticuloendotelial. Estes
microrganismos transitrios, raramente, afetam na interpretao das
hemoculturas positivas.
A seco de Bacteriologia dispe de um equipamento, o Bactec 9240, que
permite detetar a positividade das hemoculturas. Este equipamento de rpida
deteo de bactrias e fungos em amostras clnicas de sangue. As amostras so
colhidas dos pacientes e injetadas diretamente nos frascos de cultura Bactec.
Existem 4 tipos de frascos de hemocultura:
- frasco peditrico: Bactec Pds Plus;
- frasco adulto aerbio: Bactec Plus + Aerobic;
- frasco adulto anaerbio: Bactec Plus + Anaerobic;
- frasco micolgico.
Quando as hemoculturas chegam ao laboratrio, colocam-se no Bactec, ficando a
incubar durante 5 dias. Este procedimento no se aplica aos fungos que ficam a
incubar durante 14 dias, a uma temperatura de 37C.
Na presena de microrganismos, os nutrientes do meio de cultura so
metabolizados libertando dixido de carbono. assim modulada a quantidade de
luz absorvida pelo material fluorescente do sensor. Os fotodetetores do
instrumento medem o nvel de fluorescncia a cada dez minutos, que
corresponde quantidade de CO
2
libertada pelos microrganismos. A medio
ento interpretada pelo sistema de acordo com parmetros de positividade pr-
42

programados. Uma leitura positiva indica a presena presuntiva de
microrganismos viveis no frasco.
Quando o equipamento deteta positividade ( necessrio excluir uma
contaminao, que na maior parte das vezes acontece atravs da flora da pele,
devido a erros procedidos durante a colheita). Efetuam-se subculturas para meios
de cultura slidos e exame direto pela colorao de Gram, consoante o respetivo
frasco:
Frasco peditrico e frasco adulto aerbio:
- gelose de sangue
- gelose manitol Chapman
- gelose chocolate polyvitex (em jarra CO
2
)

Frasco adulto anaerbio:
- gelose de sangue em anerobiose
- gelose de chocolate polyvitex

Frasco micolgico:
- gelose de Sabouraud
- gelose de sangue

Nota: O crescimento de microrganismos da flora normal da pele (e.g.
Staphilococcus epidermidis) ou cocos gram-positivos anaerbios em apenas uma
das vrias culturas sugere contaminao, mas, se estes microrganismos crescerem
em mais de uma cultura, aumenta a probabilidade de ser mesmo uma
bacterimia.
Os fungos raramente so isolados no sangue.



43

I- 3.3- Vias respiratrias: superiores e inferiores
Segundo os sinais e sintomas clnicos do paciente, vo indicar o
comprometimento de determinada rea das vias respiratrias, superior ou
inferior, sendo a colheita efetuada de acordo com a suspeita.
I- 3.3.1- Vias respiratrias superiores
Exsudado farngeo
Nas vias respiratrias superiores, o microrganismo de principal interesse o
estreptococo beta-hemoltico do grupo A, um dos principais responsveis por
infees respiratrias altas, nomeadamente, amigdalite, faringite e a escarlatina.
Torna-se muito importante diferenciar as infees por estreptococos do grupo A
de outras infees (por e.g. infees virais) de modo a prescrio teraputica ser
adequada ao doente. O diagnstico precoce destas infees permite reduzir a
severidade dos sintomas.
Realizou-se o exame direto em esfregao por colorao de Gram e o exame
cultural em gelose de sangue e caldo Todd e incubou-se a 35-37C durante 24h,
para colocar em evidncia e identificar o agente infecioso.
Aquando da solicitao do teste rpido para a pesquisa do antignio do
estreptococcos do grupo A, utilizou-se a tcnica de imunocromatografia
(Streptatest

) que permite a deteo direta do antignio especfico do


estreptococo do grupo A a partir de uma amostra colhida em zaragatoa, tornando
o diagnstico rpido (5 minutos).
I- 3.3.2- Vias respiratrias inferiores
Tipo de amostras mais comuns:
A EXP o AT o LBA e a SB.

O objetivo do estudo destas amostras diagnosticar uma possvel pneumonia,
uma bronquite ou uma tuberculose. As amostras de LBA so muito teis em
doentes imunocomprometidos com pneumonia.
44

Os agentes mais frequentes nas infees do trato respiratrio inferior so: o
Streptococcus pneumoniae e a Klebsiella penumoniae e em infees pulmonares
crnicas a Mycobacterium tuberculosis tambm um agente infecioso comum.
A EXP uma das amostras mais rotineiras do laboratrio, fcil de obter sem
sujeitar o paciente a tcnicas invasivas, como por e.g. um LBA. Na colheita da
EXP, h possibilidade de contaminao pela flora bucal, nomeadamente pela
saliva. Uma boa EXP para ser significativa, deve ser proveniente das vias
inferiores, sendo possvel observar macroscopicamente pelo seu aspeto mucoso e
purulento, ou seja, com alguma consistncia.
No caso das SB lquidas e LBA a amostra tem que ser bem homogeneizada e
centrifugada (se a quantidade for superior a 1ml). O LBA deve ser processado
imediatamente assim que chegue ao SPC.
Nestas amostras, o procedimento laboratorial efetuou-se na cmara de fluxo
laminar. Realizou-se o exame direto pelo mtodo de Gram e pelo mtodo de
Ziehl-Neelsen, e o exame cultural, semeou-se em gelose de chocolate
Haemophilus (jarra com CO
2
), gelose de sangue, gelose manitol Chapman,
gelose McK e gelose de sabouraud (quando solicitado). Incubou-se a 37C,
durante 24 a 48h em aerobiose.

Notas:
- A presena de numerosas clulas epiteliais escamosas numa EXP, observadas
no exame direto pela colorao de Gram, sugere uma amostra salivar que tem de
ser reportada ao mdico, visto que uma amostra pouco representativa, devendo
o paciente realizar a repetio da colheita. A presena de leuccitos,
nomeadamente de polimorfonucleares, sugere uma boa colheita em caso de uma
infeo. Esta indispensvel, para avaliar o n e tipo de microrganismos e a
presena de leuccitos polimorfonucleares. Caso existam leveduras necessrio
isolar para Sabouraud e para um meio especfico de Candida.
- O exame direto pela colorao de Ziehl-Neelsen, para a pesquisa de BAAR,
sempre efetuada nestas amostras (em caso de suspeita ou no de uma
tuberculose).
45

- Os meios utilizados para as culturas tm como objetivo isolar bactrias como os
pneumococos, as pseudomonas, as micobactrias, a Klebsiella spp. e outras
enterobacteriaceas e outros microrganismos.
I- 3.4- Exsudado ocular e exsudado do ouvido
No exame direto em ambos os exsudados realizou-se um esfregao para a
colorao de Gram.
No exame cultural semeou-se em gelose de Haemophillus (jarra com CO
2
),
gelose de sangue, gelose de McK, gelose de manitol Chapaman e em leio lquido
de Todd Hewitt. Incubou-se a 3C durante 24 a 48h em aerobiose.
Aps a incubao, sub cultivou-se do meio lquido, para meios slidos.
Normalmente a passagem feita para gelose de McK, gelose manitol Chapman,
gelose azido, gelose sabouraud e incubar a 37C, durante 24 a 48h em aerobiose.
I- 3.5- Feridas, abcessos, exsudados purulentos, bipsia de tecido e
contedo de bomba
O estudo microscpico destes produtos, por exame direto e pelo exame cultural,
apresentam regra geral sempre mais que um microrganismo ( exceo do
contedo de bomba).
Quando estudados estes microrganismos, importante ter sempre em conta a
flora normal de cada local proveniente. Estas amostras possuem indicaes
iniciais e importantes quanto natureza do microrganismo, ajudando assim, na
escolha dos meios e posteriormente dos antimicrobianos.
O pus em abcessos fechados contm, normalmente, apenas um microrganismo
como agente causador de infeo, sendo os agentes mais comuns, os
estafilococos, estreptococos e bacilos gram-negativos. Muitos so os
microrganismos encontrados com frequncia em abcessos abdominais bem como
em feridas abertas. No caso das feridas abertas, por e.g. as escaras em que a
amostra colhida por zaragatoa trata-se, de uma amostra no muito
representativa, podendo estar contaminada com flora colonizadora da pele. Neste
46

caso, o ideal seria colher o pus atravs de seringa e, em caso de suspeita de uma
bacterimia colher hemocultura.
Relativamente ao pus em zaragatoa, realizou-se o exame cultural em gelose de
sangue, gelose de chocolate (jarra com CO
2
),

gelose de manitol Chapman, gelose
McK e em meio lquido caldo de carne, e realizou-se tambm lmina para
colorao de Gram. Incubou-se a 37C, durante 24 a 48h em aerobiose. Aps a
incubao, subcultivaram-se os meios lquidos em meios slidos para gelose
McK, gelose manitol Chapman e gelose azido.
No que concerne ao pus no superficial, semeou-se nos mesmos meios mais o
meio de gelose de sangue para anaerbios, e realizao de lmina pela colorao
de Zhiehl-Neelsen. Nos casos em que a cultura em anaerobiose foi positiva,
procedeu-se apenas pesquisa da bactria isolada usando a colorao Gram
(neste servio no feita a identificao das bactrias anaerbias por falta de
recursos humanos).
Em geral, o objetivo saber o tipo de microrganismo presente, por isso,
semeado em todos os meios possveis (primeiro gelose de sangue e meio lquido
de enriquecimento, depois se houver turvao ento procede-se ao cultivo para
meios seletivos) para estuda-los posteriormente e por fim ponderar qual (ais) o
(s) agente (s) predominante (s) (at 3 microrganismos) relacionando sempre com
a informao clnica.
O St. aureus, Pseudomonas, Enterobactrias, Streptococcus beta hemolticos e
Enterococos foram os agentes mais frequentemente isolados em amostras com
pus.
As amostras de bipsias de tecido no so muito comuns na rotina do laboratrio,
so semeadas numa gelose de sangue (se o tecido tiver consistncia), em caldo de
enriquecimento e realizado o esfregao para exame direto com colorao de
Gram e Zhiel-Neelsen. valorizado qualquer crescimento microbiano.
O contedo de bomba uma amostra estril. Colocou-se a amostra num
recipiente estril, adicionou-se caldo de carne e incubou-se a 37C em aerobiose
durante 5 dias. O meio foi observado diariamente para a avaliao do
crescimento bacteriano (turvao do meio). Quando a amostra tinha turvao,
47

sub-cultivou-se em gelose de chocolate Polyvitex (em CO
2
) e quando lmpida,
realizou-se a passagem apenas ao 5 dia, tambm para gelose de chocolate
Polyvitex (em CO
2
).
I- 3.6- Lquidos biolgicos
Os lquidos biolgicos, pleural, peritoneal, pericrdico e sinovial devem ser
aspirados com uma tcnica de assepsia, visto que se tratam de lquidos estreis
porque qualquer contaminao na colheita atrasa e dificulta o estudo.
Aquando da amostra purulenta, efetuou-se diretamente da amostra os esfregaos
e culturas, caso contrrio, o lquido teria de ser centrifugado, 5 minutos a 3000
rpm, sendo o sedimento utilizado para exame direto (Gram e Zhiel-Neelsen) e
para exame cultural, geloses de sangue, para aerobiose e anaerobiose, e gelose de
chocolate Polyvitex em jarra com CO
2
(culturas para o crescimento de
microrganismos suspeitos, micobactrias, microrganismos anaerbios e as
bactrias piognicas).
Utilizou-se meio lquido de enriquecimento (caldo Todd e caldo de carne),
porque estes produtos tm uma flora pobre. A sua passagem para meios slidos
efetuou-se de acordo com o diagnstico do paciente, mas normalmente foram
para os meios de cultura, gelose de chocolate em CO
2
e gelose de sangue em
aerobiose. Incubou-se os meios slidos e lquidos a 37C, durante 24 a 48 horas.

Nota: A colorao de Gram de extrema importncia porque na presena de
polimorfonucleares e bactrias (caso existam) indicador de infeo. O estudo
citolgico dos esfregaos e contagem tambm podem revelar/sugerir a natureza
da infeo seja bacteriana, viral ou neoplsica.
I- 3.6.1- Lquido cefalorraquidiano
O lquido cefalorraquidiano (LCR) ocupa uma posio de destaque na urgncia
clnica, tornando essencial o seu diagnstico precoce, rpido e preciso.
A meningite a grande suspeita e preocupao no LCR porque o risco de morte
ou leso irreversvel grande, a no ser que o tratamento seja iniciado de
48

imediato. As amostras, antes do tratamento, so essenciais ao diagnstico
etiolgico.
O objetivo do diagnstico com urgncia diferenciar uma meningite bacteriana
de uma viral. O diagnstico inicia-se com a contagem de clulas e a avaliao do
tipo de clulas que predominam (se so mononucleares poder tratar-se de uma
infeo viral ao contrrio na presena de polimorfonucleares que indicam tratar-
se de uma infeo bacteriana) (realizado no laboratrio da urgncia do SPC). Nos
parmetros bioqumicos, analisa-se a concentrao da glicose e de protenas e o
exame microscpico para a identificao de microrganismos caso existam
(estudados na Bacteriologia).
No sector de Bacteriologia, avaliou-se o volume da amostra de LCR. Se o
volume for superior a 1ml, centrifugar durante 6 minutos uma baixa rotao, se
for inferior, no centrifugar e homogeneizar a amostra antes de semear.
Semeou-se (colocou-se 3 gotas em cada meio) em gelose de chocolate (jarra em
CO
2
) e gelose de sangue, incubando a 37C, durante 24 a 48h.
Realizou-se 2 esfregaos (1 gota em cada lmina) em lminas para colorao de
Gram e Ziehl-Neelsen.
O restante produto foi colocado em meio de enriquecimento, o caldo Todd, e
incubou-se a 37C, durante 24h. Ao fim das 24h, fez-se a passagem dos meios
lquidos para os seguintes meios slidos, gelose de sangue e gelose de chocolate
Polyvitex.
No caso de se tratar de um individuo imunodeprimido, outro agente a considerar,
o Criptococcus neoformans (fungo) em que a pesquisa feita atravs do exame
a fresco com tinta-da-china, da pesquisa do antignio e do exame cultural.
Os principais microrganismos de interesse clnico so Neisseriae meningitidis,
Streptococcus pneumoniae e o Haemophilus influenza.
A monitorizao destes doentes por parte do SPC feita pela normalizao da
glicose e da contagem do nmero de clulas no LCR. Estes parmetros vo
revelar a boa ou no resposta ao tratamento.
49

I- 3.7- Fezes
Os sintomas relacionados com o trato gastrointestinal, quando associadas a uma
infeo so sobretudo nuseas, vmitos e diarreia, e diagnosticada com o
auxlio de uma coprocultura.
A flora bacteriana normal do intestino muito rica. O aspeto macroscopicamente
das fezes j induz em algumas orientaes em caso de infeo (e.g. se so
moldadas ou diarreicas especialmente nas crianas).
Qualquer tentativa de isolar bactrias patognicas nas fezes requer a separao
dos agentes infeciosos patognicos dos microrganismos da flora normal com o
uso de meios de cultura seletivos. Os microrganismos patognicos mais comuns
so: a Shigella spp.; a Salmonella spp.; o Campylobacter spp.; a Escherichia coli
enteropatognica (serotipo mais comum Escherichia coli O157:H7), e menos
comuns, o Clostridium spp., e o Vibrio spp..
Nesta amostra realizou-se o exame direto para colorao de Gram com o objetivo
de observar a flora e as percentagens relativamente a gram-positivos e gram-
negativas e presena de polimorfonucleares (sinal de infeo).
No exame cultural, utilizaram-se meios especficos para os microrganismos
anteriormente referidos, gelose de sangue, gelose de Mck, gelose de SS, Gelose
campi (Campylobacter) e caldo selenito. Incubou-se a 37C, durante 24h em
aerobiose. O mesmo no se aplica gelose campi, que teria que ser incubada a
uma temperatura de 42C, durante 48h, numa atmosfera microaerfila.
Aps a incubao, efetuou-se a passagem do meio lquido para os seguintes
meios slidos, gelose SS, gelose SMID, gelose McK e incubou-se a 37C
durante, 24h em aerobiose.
I- 3.7.1- Identificao de Campylobacter spp.
No caso de colnias suspeitas de serem Campylobacter spp., procedeu-se da
seguinte forma:
- executou-se o teste da catalase e oxidase (deve ser positivo);
- corou-se a lmina com fucsina previamente fixada;
50

- executou-se um (TSA (em microaerofilia durante 48h) com cefalotina (deve ser
resistente) e com cido nalidixico (deve ser sensvel);
- efetuou-se um isolamento de novo para 2 placas de gelose de sangue, colocou-
se uma aerobiose (no deve haver crescimento) e outra em microaerofilia (deve
haver crescimento).
I- 3.7.2- Identificao de Escherichia coli
Perante a suspeita de Escherichia coli O157 (meio sorbitol), procedeu-se a
aglutinao direta com um antissoro E.coli O157 para confirmao, e
posteriormente realizou-se o TSA.
I- 3.7.3- Identificao de Salmonella spp.
Entre os diversos antissoros existentes para a identificao da Salmonella, a
seco de Bacteriologia utiliza apenas 3: os antissoros O:9; O:4 e 5 e O:8, de
acordo com a frequncia desta bactria na RAM. Aquando na presena de uma
Salmonella. Procedeu-se da seguinte forma:
- colocou-se uma gota omnivalent numa lmina, se aglutinar trata-se de uma
Salmonella, caso contrrio, significa que a bactria testada no uma
Salmonella;
- aglutinou-se posteriormente com antissoro monovalente O:9, se positiva, indica
Salmonella do grupo D. Procedeu-se ento a utilizao dos antissoros S. typhi e
S. enteritidis, para a identificao do serotipo;
- se o resultado for negativo, aglutinar com antissoro monovalente O:4,5 que
identifica a Salmonella do grupo B, se o resultado for positivo, utilizar o
antissoro S. typhimurium. Se negativo, aglutinar com o anti-soro monovalente
O:8 que deteta a Salmonella do grupo C2.
I- 3.7.4- Identificao de Shigella spp.
Na presena de uma Shigella, a seco de Bacteriologia dispe de 4 tipos de
antissoros que possibilita a identificao da Shigella pertencentes aos grupos de
A, B, C e D.
51

Retiraram-se as colnias suspeitas de Shigella e colocou-se numa lmina,
adicionou-se uma gota de antissoro Shigella flexineri (identifica as Shigella do
Grupo B). Se ocorrer aglutinao, indica reao positiva para a bactria testada.
Repetiu-se o procedimento com os antissoros Shigella sonnei (identifica Shigella
do Grupo D), Shigella dysenteriae poly A1 e poly A2 (identifica Shigella do
grupo A) e com o antissoro Shigella boydii (identifica Shigella do Grupo C).
I- 3.7.5- Identificao de rotavrus e adenovrus
No caso das crianas, procedeu-se ao cultivo da amostra da mesma forma, mas
com a realizao da pesquisa do rotavrus e do adenovrus, em fezes diarreicas.
Utilizou-se para tal, o teste imuno-cromatogrfico (Vikia

Rota-Adeno) que
permite a dupla deteo qualitativa do rotavrus e do adenovrus.
Os rotavrus e os adenovrus so responsveis por gastroenterites agudas,
principalmente nas crianas mais novas. As diarreias virais, frequentemente
sazonais, evoluem favoravelmente. No estado agudo da doena, so excretadas
grandes quantidades de vrus, sendo estes responsveis pela propagao da
epidemia. A cultura dos rotavrus e dos adenovrus difcil, o que explica a
utilizao preferencial das tcnicas imunolgicas.
I- 3.8- Aparelho genital
A Neisseria gonorrhoeae uma bactria associada a uma doena sexualmente
transmissvel, a Gonorreia. transmitida por contacto sexual e nos homens a
infeo assintomtica. A infecciosidade to elevada que a probabilidade de
contrair a infeo de uma nica exposio sexual no protegida a partir de um
parceiro infetado de 20 a 30% nos homens e uma probabilidade ainda maior
nas mulheres.
As amostras de eleio so um exsudado vaginal ou num exsudado uretral e
necessrio fazer a pesquisa do gonococo quer em meios de cultura (Gelose de
Chocolate em CO
2
), quer em esfregaos corados pelo mtodo de Gram. Neste
ltimo mtodo, possvel observar nos polimorfonucleares, a incluso destas
bactrias intracelulares obrigatrias (diplococos gram-negativos).
52

I- 3.8.1- Exsudado vaginal e uretral
No exsudado vaginal, o estudo bacteriolgico, micolgico e parasitolgico.
No exame a fresco, pesquisaram-se clulas, leuccitos e os elementos
leveduriformes. Aquando da presena de leveduras, a amostra semeou-se para
um meio de Candida spp., que, na maior parte das vezes, albicans. Para alm
da gelose de Candida, o exame cultural tambm se executou para uma gelose de
sangue e uma gelose chocolate polyvitex (jarra com CO
2
) e incubou-se a 37C,
durante 24h em aerobiose.
Efetuou-se a pesquisa de Trychomonas vaginalis, um parasita flagelado.
possvel visualiza-lo, pela sua movimentao no exame a fresco (uma
caracterstica particular, para confirmar a presena deste parasita) e causador de
infeo na vulva, na vagina e no colo uterino, em geral no se estende para o
tero. A sua transmisso feita por via sexual.
I- 3.8.2- Exsudado vaginal e perianal na grvida
O exsudado vaginal e perianal consiste numa pesquisa orientada para o estudo de
Streptococcus agalactiae (Streptococcus beta hemoltico do grupo B de
Lancefield). Estes estreptococos do grupo B fazem parte da flora normal da
vagina em 5 a 25% das mulheres.
Esta pesquisa feita nas grvidas no ltimo trimestre de gravidez (entre as 35 e
as 37 semanas), para poder prevenir a colonizao no recm-nascido por estes
estreptococos. Se o recm-nascido for infetado pode desenvolver uma meningite,
uma spsis fulminante ou at mesmo um sndrome respiratrio.
No exame direto realizou-se o esfregao para a colorao de Gram e no exame
cultural fez-se uma gelose de sangue e o meio granada (IGLB).
Incubou-se a 37C, durante 24 a 48h em aerobiose.



53

I- 3.9- Pontas de cateter
O uso generalizado de acessos vasculares cria uma porta de entrada de risco
significativo de bacterimia.
Os Staphylococcus spp. so bactrias que, mais frequentemente colonizam, os
cateteres pois tm adesinas especiais para os plsticos de que eles so feitos. Os
Staphylococcus coagulase negativa so colonizadores mais frequentes que os
Staphylococcus aureus.
O cateter semeou-se por rolamento, pela tcnica de Maki, em gelose de sangue.
Aps 24h de incubao, a 37C, realizou-se a avaliao semiquantitativa do
crescimento bacteriano, sendo valorizado e identificado um nmero de colnias
15.
O microrganismo normalmente isolado em cateter e de importncia clnica o
estafilococo coagulase negativa.

Notas:
- Em caso de infeo associada a cateter (um fragmento do cateter), enviado ao
laboratrio, associado ou no a uma hemocultura, caso esteja associado, tanto o
cateter, como a hemocultura tem que se obter o mesmo microrganismo em caso
de infeo, e descartar a hiptese de contaminao da flora da pele ou dos
procedimentos.
- Para fazer o diagnstico de bacterimia relacionada com cateter necessrio o
isolamento do mesmo microrganismo nas amostras obtidas de diferentes locais
em espaos de tempo diferentes, (hemocultura perifrica, ponta do cateter,
zaragatoa da zona de insero do cateter). O crescimento de diferentes
microrganismos em frascos de cultura diferentes pode sugerir uma contaminao.



54

I- 4- Teste de sensibilidade aos antimicrobianos
Os TSA so indicados para qualquer microrganismo que contribua para um
processo infecioso, que justifique uma terapia antimicrobiana.
O reconhecimento do padro de sensibilidade teraputica antimicrobiana
fundamental na medida em que se assiste ao aparecimento de estirpes
microbianas resistentes a alguns antibiticos que, por isso, deixam de ser eficazes
no tratamento das infees.
Os antibiticos distinguem-se em:
- bactericidas: quando eliminam as bactrias, provocando a destruio da parede
bacteriana;
- bacteriostticos: detm o crescimento das bactrias, deixando ao sistema
imunitrio a tarefa de eliminar a infeo.
O estudo do comportamento de uma bactria aos antibiticos permite avaliar a
sua sensibilidade ou a sua resistncia.
Existem vrios mtodos de execuo do TSA ou antibiograma (ATB). A sua
seleo deve ter em conta, para alm da rapidez do resultado e de uma resposta
facilmente interpretvel pelo clnico, a poltica de utilizao de antibiticos do
hospital, assim como, a poltica nacional de administrao destes frmacos.
I- 4.1- Mtodos laboratoriais utilizados no estudo da atividade dos
antibiticos
Para avaliar in vitro a suscetibilidade bacteriana aos antibiticos, podem usar-se
vrias metodologias, o mtodo de diluio, o mtodo de difuso (Kirby-Bauer e
E-test) e mtodos automatizados (VITEK).
O mtodo de diluio consiste em meios de cultura lquidos ou slidos
adicionados de concentraes crescentes de um dado antibitico. Para cada um
destes meios, adiciona-se a mesma quantidade de inculo (suspenso bacteriana).
Aps a incubao temperatura adequada, observa-se se ocorreu crescimento
bacteriano. Deste modo, avalia-se a concentrao mnima inibitria (CMI) em
mg/L de antibitico.
55

A CMI a mais fraca concentrao de um antibitico em soluo, capaz de
impedir o crescimento de uma estirpe, em relao qual se determina a CMI
relativamente a um determinado antibitico, num meio de composio
estandardizada.
O mtodo de difuso consiste na utilizao de meios slidos, a inoculao de
uma dada suspenso bacteriana por espalhamento superfcie do meio. Na
superfcie do meio slido inoculado, colocam-se discos de papel impregnados
com antibiticos. Aps incubao de 24 horas temperatura adequada, medem-
se os halos de inibio volta dos diferentes discos de papel impregnados com os
diferentes antibiticos.
O tamanho dos halos expresso em milmetros, avaliado em sensvel (S)
resistente (R) e intermdio (I). sensvel quando o microrganismo responde
teraputica com o antimicrobiano utilizando a dosagem normalmente
recomendada para aquele tipo de infeo e espcie bacteriana (aparece um halo
na placa, volta do disco do antibitico). resistente quando no h uma boa
resposta teraputica, s concentraes de antimicrobiano atingidas, com as
dosagens habitualmente utilizadas com aquele antimicrobiano, e/ou logo, est
presente um mecanismo especfico de resistncia (no aparece o halo). E por fim
intermdio quando a CMI do antimicrobiano para o microrganismo prxima
do valor que ele pode atingir no sangue ou tecidos, para a qual a resposta clnica
inferior de uma estirpe sensvel.
Na seco de Bacteriologia utilizou-se os mtodos de difuso de Kirby-Bauer e o
E-test.
Mtodo Kirby-Bauer
Consiste num mtodo qualitativo que permite classificar os microrganismos em
resistentes, sensveis ou intermedirios em relao a uma grande variedade de
agentes antimicrobianos.
Nesta tcnica utilizado o meio de cultura Mueller-Hinton. A densidade da
suspenso bacteriana a inocular deve ser equivalente a 0,5 unidade Mac Farland e
a concentrao de cada antibitico em discos de papel determinada segundo as
regras Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). A droga difunde-se
56

radialmente, ocorrendo em simultneo a multiplicao do microrganismo. Em
reas onde a concentrao do agente antimicrobiano inibitria, no ocorre
crescimento, formando-se uma zona (halo de inibio) volta de cada disco. O
halo de inibio corresponde ao nmero de microrganismos mortos.
Seleo dos antibiticos
A seleo dos discos de antibiticos, depende do produto donde provm o
microrganismo isolado. Os discos utilizados na seco foram adaptados da FDA-
EUA e recomendado pelo CLSI. Segue-se algumas tabelas (II-VIII), da seleo
dos antibiticos utilizados, consoante o microrganismo isolado e o respetivo
produto (amostra) e/ou espcie.

Tabela II: Seleo de antibiticos em cada produto biolgico, na presena de
Enterobacteriaceaeas.
Enterobacteriaceaeas
Produto Antibitico
Urina Ampicilina, Cefalotina, Gentamicina 10g, Nitrofurantoina, Cotrimoxazol,
Amoxicilina+Ac. Clavulmico, Cefuroxime, Levofloxacina/Ciprofloxacina,
Cefotaxime, Ceftazidime, Amicacina e Ofloxacina
Pus, Expetorao
ou Hemocultura
Ampicilina, Cefalotina, Gentamicina, Amoxicilina+Ac. Clavulmico, Co-
trimoxazol, Amicacina, Cefuroxime, Cefotaxime, Aztreonam,
Imipenem/Meropenem, Piperacilina+Tazobactam, Tobramicina, Ceftazidime e
Levofloxacina/Ciprofloxacina
LCR Ampicilina, Gentamicina, Cefotaxime, Amicacina, Meropenem, Co-trimoxazol
e Ceftazidima
Fezes Ampicilina, Ciprofloxacina e Co-trimoxazol

Se o microrganismo isolado for Salmonella typhi, utilizar os seguintes
antibiticos: ampicilina, ciprofloxacina, cotrimoxazol e cefotaxime.
Se o microrganismo isolado for Listeria, utilizar os seguintes antibiticos:
ampicilina, co-trimoxazol e gentamicina. Nas Pseudomonas, utilizar os seguintes
antibiticos: piperacilina+tazobactam, ceftazidime, amicacina, gentamicina,
imipenem/meropenem, tobramicina, aztreonam e ciprofloxacina.




57

Tabela III: Seleo de antibiticos em cada produto biolgico, na presena de
Sthaphilococcus.
Sthaphilococcus
Produto Antibitico
Urina Penicilina, Oxacilina, Novobiocina, Nitrofurantoina, Gentamicina,
Levofloxacina/Ciprofloxacina, Vancomicina, Co-trimoxazol, Teicoplanina
Pus, Expetorao
ou Hemocultura
Penincilina, Oxacilina, Co-trimoxazol, Cefalotina, Teicoplanina, Clindamicina,
Eritromicina, Rifampicina, Vancomicina, Amicacina, Gentamicina,
Levofloxacina/Ciprofloxacina, Tetraciclina, Amoxicilina+Ac. Clavulmico
LCR Penicilina, Oxacilina, Clindamicina, Co-trimoxazol, Vancomicina,
Teicoplanina, Amicacina, Rifampicina, Cloranfenicol, Gentamicina,
Eritromicina, Levofloxacina/Ciprofloxacina.
Exsudado nasal Penincilina, Oxacilina, Vancomicina, Eritromicina, Amoxicilina+Ac.
Clavulmico, Gentamicina e Teicoplanina

Tabela IV: Seleo de antibiticos consoante a espcie aquando do isolamento de
Neisseria.
Neisseria
Espcie Antibitico
Meningococcus Penicilina, Cefotaxime, Cloranfenicol, Ampicilina
Gonococcus Penincilina, Tetraciclina, Spectinomicina, Cefalotina, Cefuroxime, Cefas de 3
gerao, Ciprofloxacina e pesquisa da -lactamase (nitrocefina).
Moraxella
catarrhalis
Penicilina, Amoxicilina+Ac.Clavulmico, Cefuroxime, Cefotaxime,
Levofloxacina/Ciprofloxacina e pesquisa da -lactamase (nitrocefina).

Tabela V: Seleo de antibiticos em cada produto biolgico, na presena de
Haemophilus.
Haemophilus
Produto Antibitico
Hemocultura e
LCR
Ampicilina, Cefotaxime, Cloranfenicol e pesquisa da -lactamase (nitrocefina).
Expetorao, Ex.
nasal e pus
Ampicilina, Co-Trimoxazol, Eritromicina, Amoxicilina+Ac.Clavulmico,
Levofloxacina/Ciprofloxacina, Cefuroxime, Tetraciclina e pesquisa da -
lactamase (nitrocefina).

Tabela VI: Seleo de antibiticos em cada produto biolgico e espcie, na presena de
Streptococcus.
Streptococcus
Espcie Antibitico
Pneumococcus Expetorao e
Exsudados
Penicilina, Ampicilina, Optoquina
LCR e
Hemocultura
Penicilina, Oxacilina, Cefotaxime, Cloranfenicol,
Optoquina, Ampicilina, Vancomicina, Eritromicina
Streptococcus
diversos
Penicilina, Tetraciclina, Ampicilina, Cefalotina, Clindamicina, Gentamicina,
Vancomicina, Teicoplanina, Ciprofloxacina, Eritromicina
Streptococcus A Penicilina, Ampicilina, Eritromicina, Clindamicina


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Tabela VII: Seleo de antibiticos em cada produto biolgico, na presena de
Enterococcus.
Enterococcus
Produto Antibitico
Urina Penicilina, Ampicilina, Nitrofurantoina, Co-Trimoxazol, Eritromicina,
Gentamicina HC, Estreptomicina HC, Levofloxacina/Ciprofloxacina e pesquisa
da -lactamase (nitrocefina).
Pus Penicilina, Ampicilina, Gentamicina HC, Eritromicina, Vancomicina,
Teicoplanina, Levofloxacina/Ciprofloxacina e pesquisa da -lactamase
(nitrocefina)
LCR e Hemocultura Ampicilina, Estreptomicina HC, Teicoplanina, Gentamicina HC, Vancomicina e
pesquisa da -lactamase (nitrocefina).

Tabela VIII: Seleo de antibiticos usados no exsudado ocular consoante o
microrganismo isolado.
Exsudado ocular
Microrganismo Antibitico
Pneumococcus Cloranfenicol, Tetraciclina
Staphilococcus
aureus
Cloranfenicol, Ac. Fusidico, Gentamicina, Tetraciclina, Ofloxacina
Haemophilus Cloranfenicol, Tetraciclina
Enterobacteriaceaes Cloranfenicol, Tetraciclina, Colistina, Gentamicina
Pesudomonas Colistina, Gentamicina, Ofloxacina

psilon test (E-test)
O E-test permite determinar quantitativamente a suscetibilidade de determinado
microrganismo. Consiste na aplicao de uma tira impregnada com um gradiente
de antibitico, tornando possvel determinar o CMI pela linha de interseco do
crescimento bacteriano com a respetiva tira.
Neste teste, a CMI lida diretamente na escala da tira, no ponto onde a elipse de
inibio do crescimento intercepta a tira. Usou-se o E-test da vancomicina e o da
penicilina.

E-test vancomicina
Procedimento laboratorial:
- efetuou-se uma suspeno de 0,5 de Mcfarland;
- numa placa de Muller-Hinton, efetuou-se estrias apertadas em 3 direes;
- colocou-se a tira E-test e incubou-se a 37C durante 24h ao ar.

59

E-test penicilina
Procedimento laboratorial:
- efetuou-se uma suspeno de 0,5 de Mcfarland;
- numa placa de gelose de sangue, efetuou-se estrias apertadas em 3 direes;
- colocou-se a tira E-test;
- incubou-se a 37C durante 24h em CO
2
.
I- 4.2- Mtodos automatizados-VITEK
Na seco de Bacteriologia existe o sistema automatizado denominado VITEK 2
da bioMrieux, o qual permite a identificao do microrganismo isolado, assim
como, a determinao tambm da sua suscetibilidade aos antimicrobianos.
O sistema VITEK automatiza todas as etapas necessrias para a realizao dos
testes de identificao, usando as cartas VITEK para Gram-positivos,
estreptococos e estafilococos, para os Gram-negativos, para as Pseudomonas
spp., para fungos e para anaerbios.
O teste de identificao pelas cartas do VITEK consiste numa combinao de
acares e substratos bioqumicos desidratados, os quais vo ser digeridos e
provocar uma reao, em que o VITEK, com uma memria implementada dos
vrios microrganismos existentes industrializados, identifica o microrganismo
em estudo.
O TSA umas das tcnicas que se baseia na determinao da capacidade que um
microrganismo tem de se multiplicar in vitro na presena de diferentes frmacos.
O TSA nas cartas do VITEK consiste numa combinao de frmacos para
determinados microrganismos (e.g. gram-positivos ou gram-negativos) em que o
resultado dado como sensvel, resistente e intermdio, ao antibitico.
de salientar, que para a leitura das cartas de identificao e das cartas de TSA
necessrio fazer suspenses padronizadas das colnias (Mac Farland) para que o
teste seja bem-sucedido quer na identificao acertada do microrganismo quer no
TSA na sensibilidade e resistncias reais dos microrganismos.
60

O aparelho VITEK 2 executa as anlises de identificao e sensibilidade, atravs
da monitorizao contnua do crescimento e da atividade dos microrganismos no
interior das cartas. Existem 2 sistemas ticos que executam esta funo:

Sistema tico de fluorescncia
Deteta indiretamente o crescimento e a atividade dos microrganismos, usando um
derivado qumico do seu crescimento, em vez dos prprios microrganismos. Esta
substncia qumica, denominado fluorforo, absorve a luz num comprimento de
onda de 365nm, reemitindo imediatamente a luz num comprimento de onda de
445nm.
So utilizados tubos de luz xnon e filtros ticos para criar o comprimento de
onda especfico da luz. Posteriormente, um detetor de fluorescncia captura a luz
reemitida pelo fluorforo. O sistema bioqumico nestes poos foi concebido para
produzir esta substncia em proporo direta ao crescimento e atividade dos
microrganismos. A quantidade de luz reemitida que produzida, fornece um
excelente indicador do crescimento e da atividade dos microrganismos,
utilizando uma referncia interna.

Sistema tico de transmitncia
Utiliza luz visvel para medir diretamente o crescimento dos microrganismos.
Este sistema baseia-se numa leitura de luz inicial do poo, antes do incio de
crescimento microbiano significativo. Amostragens de transmitncia de luz do
mesmo poo, com intervalos de 15 minutos, medem o crescimento de
microrganismos, atravs da quantidade de luz que impedida de atravessar o
poo.
O sistema tico utiliza dodos emissores de luz (LED) que produzem luz nos
comprimentos de onda apropriados e fotodetetores de silicone para capturar a luz
transmitida. O sistema efetua autocalibrao.
A identificao VITEK cobre mais de 300 espcies encontradas em clnica e na
rea industrial.

61

Galerias de antibiograma
A seco de Bacteriologia possui algumas galerias de ATB para algumas
estirpes, nomeadamente as enterobactrias, as pseudomonas e outros bacilos
gram-negativos no fermentadores, os haemophillus e as neisserias.
Estas diferentes galerias de ATB comportam 16 pares de cpulas. O primeiro
par, sem antibitico, que vai servir de controlo de crescimento. Os 14 pares
seguintes contm antibiticos com uma ou duas concentraes. O ltimo par, no
tem antibitico, permitindo a adio de um antibitico suplementar, caso seja
necessrio.
A bactria a analisar foi colocada em suspenso. Depois transferida para o meio
de cultura e inoculada na galeria. Aps 18 a 24h de incubao, a leitura de
crescimento, por vezes, fez-se visualmente, ou no aparelho Vitek systems-ATB
expression. O resultado obtido permitiu classificar a estirpe como sensvel,
intermdia ou resistente












62

I- 5- Teste de despiste de resistncia meticilina do
Staphylococcus em meio de cultura slido
Os Staphylococcus aureus resistentes meticilina, normalmente designados por
MRSA, so comuns em ambientes hospitalares e pouco comuns em indivduos
provenientes da comunidade.
A resistncia oxacilina utilizada para detetar a presena de estafilococcus
resistentes meticilina. A maioria destes microrganismos so geralmente
resistentes tambm a mltiplos antibiticos, incluindo outros -lactmicos,
aminoglicosdeos, macrlidos, clindamicina e tetraciclina.

Realizou-se o seguinte procedimento laboratorial:
1- Fazer uma suspenso de densidade de 0,5 da escala de Mac-Farland;
2- A partir desta suspenso fazer uma diluio de 1:2;
3- Numa placa de Mueller-Hinton suplementado com 4% de cloreto de sdio
efetuar estrias apertadas em 3 direes;
4- Colocar o disco de oxacilina;
5- Incubar durante 24h, temperatura 35-37C;
Nota: A ausncia de um halo de inibio, sinnimo de resistncia.

Pesquisa de - lactamases
As -lactamases (penicilinases) so enzimas bacterianas heterogneas que clivam
o anel -lactmico das penicilinas e cefalosporinas para inativar o
antimicrobiano.
As -lactamases conferem, s bactrias que as contm, resistncia s
cefalosporinas de amplo espectro de ao (3 gerao) como a ceftazidima,
cefotaxima e ceftriaxone (oximino-cefalosporinas) e aos monobactmicos, como
o aztreonam.
Dos vrios processos usados na Bacteriologia para a pesquisa das -lactamases,
utlizou-se o mtodo da cefalosporina cromognica.

63

Princpio
O disco de cefinase est impregnado com cefalosporina cromognica
(nitrocefina). O teste baseado na liberao de um radical cromogneo, que ir
ocasionar uma mudana rpida de cor (de amarelo para vermelho) quando a
ligao amido no anel -lactmico hidrolisado pela ao da -lactamase.
O teste para a deteo de -lactamase deve ser realizado em todas as amostras de
Haemophillus spp.. Quando o resultado for positivo para produo de -
lactamase, reportar resistncia ampicilina e amoxicilina. O resultado negativo
no garante sensibilidade ampicilina e um outro teste dever ser realizado.
O teste da nitrocefina apresenta resultados fidedignos para a deteo da produo
de -lactamases em isolados de Haemophillus spp., Neisseria gonorrhoeae,
Moraxella catarrhalis, Staphylococcus spp. e Enterococcus spp..

Procedimento laboratorial:
1- Humedecer com gua destilada e esterilizada o disco de nitrocefina
previamente colocado na lmina de vidro;
2- Utilizando uma ansa, remover 4 a 5 colnias morfologicamente
semelhantes da cultura e depositar na superfcie do disco;
3- Verificar se h modificao da cor: resultados positivos aparecem 15
segundos a 5 minutos. Se no houver alterao da cor, o teste negativo.







64

I- 6- Controlo de qualidade interno e externo na Bacteriologia
O controlo de qualidade interno um controlo que assegura a qualidade dos
resultados diariamente. Atravs do controlo interno, pode-se avaliar o
funcionamento confivel e eficiente dos procedimentos laboratoriais, fornecendo
resultados vlidos, que possam contribuir de forma eficaz no estabelecimento do
diagnstico pelo clnico.
Na seco, fez-se diariamente a monitorizao da temperatura das estufas,
mensalmente a temperatura dos frigorficos e de acordo com o aparecimento dos
erros detetados, fez-se a monitorizao dos reagentes, meios de cultura e
tcnicas. Procedeu-se tambm manuteno e controlo dos equipamentos.
Usou-se na seco de Bacteriologia o controlo de qualidade interno
quinzenalmente, as estirpes american tipe culture collection (ATCC): S. aureus
ATCC, E.fecalis ATCC, E.coli ATCC, K. pneumoniae ATCC, P. aeruginosa
ATCC.
Realizou-se o controlo de qualidade externo, o UK national external quality
assessment service (UK NEQAS) for Microbiology, numa periocidade mensal.
Este controlo externo consiste em amostras desconhecidas, testadas como
amostras biolgicas e cujos resultados so enviados ao laboratrio de referncia
(Londres) dentro do prazo solicitado por esta entidade. Os resultados so
pontuados e comparados com outros laboratrios participantes.
A seco recebe mensalmente o controlo de qualidade externo-NEQAS, que
consiste em 5 amostras:
- 1 amostra de fezes que tem como objetivo, a identificao de bactrias
patognicas;
- 2 amostras variveis, que tem como objetivo, a identificao de bactrias
patognicas;
- 2 amostras variveis para, a identificao de microrganismos e TSA.
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II- Serologia
A seco de Serologia do SPC consiste no diagnstico laboratorial atravs de
tcnicas imunolgicas, que detetam a resposta imune especfica do hospedeiro
infetado, contra o microrganismo causador da infeo, sejam eles, vrus,
bactrias, fungos e parasitas.
O diagnstico serolgico baseia-se na resposta imune humoral dependendo da
atividade dos linfcitos B, na presena de microrganismos (antignios (Ag))
estranhos ao indivduo infetado, pela produo de anticorpos (Ac) e por uma
reao Ag-Ac. A produo de Ac quantificada e, a partir dessa quantificao
dos Acs, podemos obter o diagnstico, se bem que a sua presena nem sempre
confirma o diagnstico e podem permanecer para sempre, ou seja, um resultado
positivo nem sempre sinal de doena contrada recentemente.
II- 1- Colheita e amostra
Os Ac so pesquisados no soro, plasma e lquidos biolgicos (LCR, urina e
outros).
Colheita
A colheita muito importante tal como a sua manipulao. Deve evitar-se
sempre a contaminao, porque se trata de uma colheita estril.
A refrigerao deve ser feita entre as temperaturas de 2 a 8 C nos 7 dias
posteriores colheita. Em caso de perodos mais prolongados conservar a uma
temperatura de -20C.
As amostras devem ser colhidas em tempos especficos, em que o 1 soro dever
ser na fase aguda da doena e um 2 soro colhido na fase de convalescena (pelo
menos com 15 dias de intervalo).
Amostra
No usar soros lipmicos, hemolisados ou contaminados, e em caso de soros com
partculas, deve-se proceder a uma centrifugao.
Sempre que possvel evitar congelamentos e descongelamentos da amostra,
porque pode levar a alteraes no doseamento das Imunoglobulinas.
66

II- 2- Metodologia
Os mtodos utilizados em diagnstico serolgico so ensaios com grande
afinidade entre o Ac e o Ag, sendo uns mais sensveis que outros.
As reaes antignio Ag-Ac podem ser detetadas num nvel primrio pela
marcao de um Ag com uma enzima ou com uma substncia fluorescente,
ensaios imunoenzimticos e de imunofluorescncia, ou, secundariamente, pelo
reconhecimento de alteraes fsicas (precipitao e aglutinao) resultantes
destas reaes.
II- 2.1- Metodologia automatizada
Utilizou-se vrios mtodos de ensaio nesta seco, nomeadamente por, enzyme-
linked immunosorbent assay (ELISA), Imunofluorescncia, enzyme linked
fluorescent assay (ELFA) e quimioluminescncia.
A seco possui um equipamento, o Ap 22, que executa mtodos de ELISA e de
imunofluorescncia.

ELISA
Consiste na reao dos Ac presentes na amostra, com o Ag fixo superfcie de
poliestireno da microplaca, onde num primeiro passo h uma reao Ag-Ac e um
tempo de incubao. As imunoglobulinas no ligadas nesta reao so eliminadas
durante um processo de lavagens, onde, posteriormente, aps a adio do
conjugado, h novamente um tempo de incubao. A globulina anti-humana
conjugada com uma enzima vai reagir com o complexo Ag-Ac formado
anteriormente. Procede-se novamente s lavagens e a globulina que no se fixou
ao complexo eliminada nesta etapa. H a adio do substrato, mais tempo de
incubao, e o conjugado que contm a enzima, reage originando uma reao de
cor azul. adicionado uma soluo de paragem e a reao de cor azul altera-se
para amarelo quando positivo. Quando no h reao Ag-Ac (no primeiro
passo) a amostra negativa e no h cor no poo. Por fim, feita a leitura por um
espetrofotmetro a um comprimento de onda de 450/620 nm.

67

Imunofluorescncia
A Imunofluorescncia aplicada tambm para a deteo de Ac e/ou Ag. Na
seco de Serologia utilizou-se dois tipos de imunofluorescncia:
Imunofluorescncia indireta: consiste na pesquisa de Ac marcados em que
a reao imunolgica baseia-se em duas etapas;
Imunofluorescncia direta: consiste na pesquisa de Ag por uma s reao
imunolgica (1 s Ac) que habitualmente a lmina visualizada num
microscpio de fluorescncia.
Os Ac so marcados com fluorescena, quer na imunofluorescncia direta, quer
na indireta, que, sob uma radiao ultravioleta, emitem uma luz verde (cor de
ma). A imunofluorescncia direta a mais utilizada na seco, pelo
equipamento Ap 22.

ELFA
Ainda nos mtodos serolgicos automatizados, usado tambm um equipamento
VIDAS, baseado na Tcnica ELFA, a qual associa o mtodo imunoenzimtico
sanduche em duas etapas, com uma deteo final em fluorescncia. Esta tcnica
realizada no VIDAS (testes de rubola e de Citomegalovrus).

Quimioluminescncia
Tambm utilizado o equipamento LIAISON que usa a tecnologia de
quimioluminescncia:
Principio:
Consiste numa fase slida, composto por partculas magnticas, onde fixam-se os
Ag. Numa primeira etapa d-se a reao Ac-Ag, numa segunda fase junta-se o
conjugado (Ac monoclonais de ratinho anti-IgG humana conjugado com um
derivado do isoluminol). O reagente iniciador induz uma reao de
quimioluminescncia (emisso dum sinal luminoso), em que o sinal luminoso e
por conseguinte a quantidade de conjugado anticorpo-isoluminol e medido por
um fotomultiplicador em unidades relativas de luz (RLU).
68

Nota: Todos estes reagentes e procedimentos so fornecidos pelas casas
comerciais que obedecem a protocolos de validao e controlos de qualidade
interno. So fornecidos controlos positivos, negativos e, para cada reagente
utilizado, so fornecidos valores de cut-off para interpretao dos resultados.
A execuo das tcnicas tem de ser feitas de forma rigorosa (os critrios e
normas propostas para execuo dos testes, manuteno, conservao dos
reagentes) para uma boa e correta interpretao dos resultados.
II- 2.2- Metodologia manual
No diagnstico serolgico, para alm dos ensaios mencionados anteriormente,
utilizou-se as tcnicas manuais (as reaes de aglutinao e as reaes de
hemaglutinao).

Reaes de aglutinao
Baseiam-se na agregao de partculas (latex, eritrcitos, bactrias) que tm na
sua superfcie o Ag, quando em contacto com os Acs especficos presentes no
soro do doente. Estas provas de aglutinao so usadas na deteo de Ag em
soro, LCR, urina, LBA (por ex. na pesquisa do Cryptococcus neoformans).
Outro exemplo de reao de aglutinao o teste de Rosa Bengala (Brucella) que
consiste num teste rpido para a deteo de Ac aglutinantes anti-brucella no soro
(teste de despiste). O mtodo consiste num mtodo em carto que deteta Ac
aglutinantes, utilizando clulas de Brucella inativada, coradas com rosa bengala e
suspensa num tampo cido. O pH cido da suspenso impede a aglutinao no
especfica das bactrias. Nesta reao so detetados Ac aglutinantes das classes
IgA, IgM e IgG. A suspenso bacteriana (suspenso antignica) vem corada para
facilitar a interpretao dos resultados.

Reaes de hemaglutinao
Utilizou-se por e.g. no serodiagnstico da distomatose (fascola heptica) e
treponema pallidum hemaglutination assay (TPHA). Esta reao opera-se em
microplacas (poos com fundo em U). So utilizadas hemcias de carneiro
69

sensibilizadas, cobertas com o Ag da fascola e no TPHA- hemcias de galinha
sensibilizadas e estabilizadas com Ags solveis de Treponema pallidum. A
presena de anticorpos faz com que haja uma aglutinao de hemcias, que tem
um aspeto de vu uniforme (acastanhado ou avermelhado) que cobre o poo. A
ausncia de Acs especficos faz com que as hemcias se sedimentem no fundo do
poo, assumindo a forma de boto compacto. Usa-se um controlo do soro num
dos poos, com hemcias no sensibilizadas (excluir interferncias de outras
aglutininas assegurando a especificidade da reao).
Utilizaram-se tambm as tcnicas do ttulo de Antiestreptolisina O (ATPO -
Estreptococcus A), para a sfilis os testes rapid plasma reagin (RPR) e venereal
disease research laboratory (VDRL) (teste de screening) e o TPHA para o teste
confirmatrio, a reao de Paul Bunnel para o vrus Epstein Barr (mononucleose
infeciosa) e a reao de Waller Rose para a artrite reumatoide.
II- 3- Testes serolgicos realizados na Serologia
Os testes analticos realizados com mais frequncia na seco so demostradas na
tabela IX.

Tabela IX: Testes realizados na seco de Serologia com a respetiva metodologia.
Mtodo Testes

ELISA
Enterovrus; Adenovrus; Vrus Influenza A e B; Parainfluenza 1,2 e 3;
Vrus Sincicial Respiratrio; Parvovrus B19; Vrus Epstein Barr (anti-
VCA e anti-EBNA); Mycoplasma pneumoniae; Clamydia trachomatis;
Aspergillus spp.; Helicobacter pylori e Leptospira spp.
ELFA Toxoplasma, Toxoplasma, Rubola, Citomegalovrus e Herpes Simplex 1 e
2.

Aglutinao
Reao de Paul- Bunnell (anticorpos heterfilos do vrus EBV); Anti-
estreptolisina O (TASO) do Strepto -hemoltico do grupo A; Reao de
Rosa Bengala (pesquisa de Ac anti-Brucella); Treponema pallidum pelo
teste no treponmico RPR.
Hemaglutinao Treponema pallidum pelo teste treponmico (TPHA); Aspergillus
fumigatus; Fascola heptica e o Echinococcus.
Pesquisa de Antignios Strepto -hemoltico do grupo B (soro e urina); Cryptococcus neoformans.

70

II- 4- Interpretao e validao das provas serolgicas
Os resultados destes testes, tais como outros realizados em outras valncias do
SPC, devero ser valorizados em conjunto com a informao clnica e com o
resultado de outros meios complementares de diagnstico.
Em geral, so tidas em conta as principais imunoglobulinas, a IgG e a IgM. As
IgM surgem logo no incio da resposta humoral, podem persistir aps a doena
aguda (de 2 meses at um ano) e com o passar da infeo so substitudas pelas
IgG. A imunoglobulina IgA surge muito cedo na fase aguda da doena. Esta
imunoglobulina tem aplicao no diagnstico de algumas infees o que permite
fazer diagnstico serolgico mais precoce.
Estes anticorpos especficos surgem na 1 a 2 semana, aps o contato com os
antignios do agente infecioso, atingindo e evoluindo para um valor mximo, que
depois desce para valores basais, nem sempre detetveis.
Na interpretao e na validao dos resultados serolgicos, necessrio
distinguir uma infeo antiga de uma infeo primria. Os critrios de infeo
primria consistem num aumento de 2 vezes ou mais de ttulo de IgG, h
presena de IgM (podem persistir at um ano) possvel visualizar a
seroconverso (inexistncia de Ac na amostra anterior). Na infeo antiga, a
quantidade de Ac residuais no se altera ao longo do tempo, e na reinfeo
normalmente s h um aumento acentuado das IgGs.
Na interpretao da evoluo do ttulo de Acs:
Se as duas colheitas apresentam uma subida exponencial, significa que a
infeo muito recente (titulo ainda a subir). Caso o ttulo seja igual ao
anterior doseado (1 soro) ou apresente uma descida significa, indica uma
infeo antiga, ou seja, houve contacto com o agente infecioso em estudo,
mas no h relao com a situao presente.
A ausncia de um aumento significativo do nvel de Ac no exclui a
possibilidade de infeo. As amostras colhidas numa fase precoce no
decurso duma infeo podem no apresentar nveis de IgG detetveis.
Nestes casos, recomenda-se a realizao de teste para IgM ou obteno de
71

uma 2 amostra decorridos 14 a 21 dias que dever ser testada em paralelo
com a amostra original.
No recm-nascido tambm poder haver dificuldade na interpretao dos
testes serolgicos, devido presena da IgG da me e da imaturidade do
sistema imune. Neste caso se dever pesquisar os Ac nucleicos para o
diagnstico correto.

Consideraes
- A evoluo do ttulo de Ac entre duas colheitas espaadas no tempo pode
avaliar a sua possvel relao com a doena aguda que queremos diagnosticar.
- Os Ag utilizados no teste podem ser comuns a outros organismos e que por isso
podemos ter resultados falsos positivos por reaes cruzadas.
- As reaes cruzadas surgem quando os testes so muito sensveis mas pouco
especficos. Devem ser confirmados por outros mais especficos.
- A 1 colheita pode ser muito precoce levando a falsos negativos. importante
considerar os imunocomprometidos que no respondem s infees com nveis
de Ac detetveis.

Em suma, a altura da colheita, a evoluo da doena, a especificidade e classe
das imunoglobulinas e a avaliao da evoluo dos ttulos de Ac ao longo do
tempo so consideraes importantes a reter aquando na validao e
interpretao dos resultados.
II- 5- Controlo de qualidade interno e externo na Serologia
O controlo de qualidade interno na Serologia feito a partir dos controlos das
casas comerciais, seguindo rigorosamente o recomendado.
No controlo de qualidade externo realizou-se o Programa Nacional de Avaliao
Externa de Qualidade do Instituto Nacional Ricardo Jorge (PNAEQ-INSA).
72

III- Parasitologia e Urinas tipo II
A seco de Parasitologia e Urinas do SPC completamente automatizada, com
a exceo da pesquisa de parasitas nas fezes, que feita por microscopia tica.
Nesta seco executou-se as seguintes anlises: pesquisa de sangue oculto nas
fezes, a anlise sumria da urina (Urianlise), pesquisa de parasitas nas fezes
(pesquisa de Giardia lamblia) e na urina.
III- 1- Pesquisa de sangue oculto
A quantidade de hemoglobina presente nas fezes aumenta com alguns tipos de
patologias que vm associadas a leses hemorrgicas no intestino. A
determinao da quantidade de hemoglobina nas fezes um mtodo eficaz para
analisar precocemente o diagnstico e tratamento em patologias como o cancro
do clon.
A amostra de fezes dever ser colhida durante os 3 dias consecutivos e anteriores
anlise (so 3 amostras por paciente para aumentar a probabilidade de encontrar
sangue, caso exista).
A pesquisa de sangue oculto nas fezes feita por um equipamento OC-Sensor em
que o princpio do mtodo baseia-se numa reao de aglutinao-ltex:

Princpio
Um reativo ao ltex prepara-se sensibilizando partculas de ltex de poliestireno
com anticorpos anti-HbA
o
humana. Quando este reativo se mistura com a
amostra, os anticorpos anti-HbAo humana ligadas as partculas do ltex reagem
com a hemoglobina da amostra. A mudana na absorvncia por unidade de
tempo resultante da reao de aglutinao-ltex proporcional concentrao
da hemoglobina na amostra. Os resultados obtidos so analisados por uma curva
de calibrao dose-resposta da unidade de absorvncia frente concentrao. A
concentrao de hemoglobina na amostra do paciente determina-se a partir desta
curva dose-resposta.
So cerca de 3000 amostras por ms, em que so pedidas a anlise de pesquisa de
sangue oculto nesta seco.
73

III- 2- Exame parasitolgico nas fezes
Na pesquisa de parasitas nas fezes, que so cerca de 220 amostras por ms,
utilizado um mtodo de concentrao, o Easy-Copros

, de modo a facilitar a
pesquisa. Esta tcnica aumenta o nmero de cistos, trofozotos, ovos ou larvas na
preparao, elimina a maior parte do material orgnico fecal (resduos) e
apresenta o organismo inalterado, de forma a serem facilmente identificados.
Princpio
As tcnicas de concentrao esto divididas em dois tipos principais, a flutuao
e sedimentao. As tcnicas de flutuao usam solues de densidades
especficas superiores s dos ovos e cistos (normalmente sulfato de zinco ou
acar de Sheather) separando-os dos resduos fecais, permitindo que os ovos e
os cistos se concentrem superfcie do tubo e a maior parte dos resduos
depositados no fundo do tubo. As tcnicas de sedimentao usam uma ao
reserva, fazendo com que os ovos e os cistos concentrem-se no fundo do tubo e a
maior parte dos resduos fecais no topo, de forma a serem removidos. As tcnicas
de sedimentao so as recomendadas para diagnstico laboratorial porque so
fceis de executar e menos sujeitas a erros tcnicos.
A Easy-Copros um dispositivo que tem por base o mtodo de sedimentao por
centrifugao de Ritchie (mtodo de sedimentao), simplificado, com a
finalidade de concentrar ovos e cistos de parasitas das amostras fecais para
posteriormente identificar.
No decorrer do estgio, observou-se os seguintes parasitas: Trichuris trichiura,
Taenia spp., Entamoeba coli e a Giardia intestinalis nas fezes e o Oxyorus na
urina (contaminao fecal). A maior parte destes parasitas transmitida por m
higienizao das mos, contaminadas com ovos do solo e so acidentalmente
ingeridos em alimentos mal confecionados (carne crua- Taenia spp.).
A Giardia intestinalis ou Giardia lamblia um protozoria flagelado patognico
encontrado no duodeno e no jejuno dos seres humanos. H indivduos totalmente
assintomticos que possuem este parasita (cistos) em grande nmero nas fezes
mas em contrapartida existem outros indivduos cuja presena deste parasita
74

fixado parede intestinal pode causar irritao e infeo da mucosa do duodeno
ou do jejuno que consequentemente ir provocar diarreia, aguda ou crnica,
associada a hipertrofia das criptas, atrofia das vilosidades e leso nas clulas.

Pesquisa da Giardia lamblia
A Giardia lamblia pode ser pesquisada por uma tcnica rpida, que consiste na
utilizao de tecnologia de membrana com ouro coloidal.
Princpio da tcnica:
Uma membrana de nitrocelulose sensibilizada com um Ac dirigido contra os
quistos da Giardia lamblia. A especificidade garantida por um anticorpo
especfico aos antignios da membrana do quisto da Giardia lamblia e que se
conjuga com o ouro coloidal. Este conjugado seco numa membrana. A amostra
por sua vez tem que ser diluda no tampo de diluio fornecido com o teste.
Quando a fase lquida da suspenso fecal entra em contato com a tira, o
conjugado solubilizado migra com a amostra por difuso passiva e o conjugado e
amostra entra em contacto com o Ac anti-Giardia adsorvido na nitrocelulose. Se
a amostra contiver quistos de Giardia lamblia, o complexo conjugado-quisto
permanece ligado ao reagente anti-Giardia e aparece uma linha vermelha. A
soluo continua a migrar at encontrar um controlo que confirma o correto
funcionamento do teste.
III- 3- Urianlise (Urinas Tipo II)
A urianlise o estudo da urina no assptica, que consiste num estudo
bioqumico por tiras reativas, e no estudo citolgico pelo sedimento urinrio.
Consiste numa anlise de screening de doena renal para os utentes no geral.
feito uma primeira avaliao macroscpica, que inclui a avaliao do parmetro
da cor, a avaliao bioqumica, com o estudo de alguns parmetros bioqumicos,
(e.g. glucose) por fim, a observao do sedimento urinrio ao microscpio para a
visualizao dos elementos figurados.
um teste rotineiro, simples e barato. Nesta seco, a urianlise encontra-se
completamente automatizada, o equipamento SediMax, desde a anlise
75

bioqumica, centrifugao e a visualizao do sedimento por fotografias de
imagens do sedimento (cmara digital incorporada que tira 15 fotografias por
cada urina que possvel visualizar como se fossem 10 campos visuais do
microscpio).
III- 3.1- Anlise bioqumica
A anlise bioqumica consiste em tiras reativas, que esto impregnadas por
reagentes bioqumicos. A tira reativa ao entrar em contato com a urina vai fazer
com que haja reaes e envolvimento de cor, que depois so avaliados numa
escala.
So analisados os seguintes parmetros: a glicose; as protenas; a bilirrubina; o
urobilinognio; o pH; o sangue; os corpos cetnicos; os nitritos; leuccitos.
necessrio ter em conta a idade do doente, o sexo, dieta e exerccio fsico. A
presena de glicose na urina denomina-se glicosria, que poder tratar-se de
diabetes mellitus ou no, no caso das grvidas.
A bilirrubina existe sob duas formas, conjugada e no conjugada, mas apenas a
conjugada solvel em gua, logo a bilirrubinria significa a presena de
bilirrubina conjugada na urina. Isto acontece quando a circulao enteroheptica
interrompida por mecanismos de obstruo o que resulta em elevados nveis de
conjugada na circulao sistmica e que, por sua vez, excretada.
O urobilinognio avaliado juntamente com a bilirrubina (produtos de excreo).
O pH varia consoante a dieta, a ingesto de frmacos. A presena de cristais
surge na variao do pH.
As cetonas so produtos dos cidos gordos. O aparecimento das cetonas pode
indicar uma diabetes descontrolada (cetoacidose), no alcoolismo, em jejum
prolongado e vmitos.
As protenas elevadas so indicadores de uma m excreo por parte do rim, leva
ao aumento da produo e pode aparecer em situaes no patolgicas, como o
excesso de exerccio fsico ou em situaes patolgicas, como por exemplo, no
mieloma mltiplo.
76

O sangue na urina (hematria) pode ocorrer em situaes como na ITU,
contaminao menstrual no caso das mulheres ou em casos neoplsicos, bexiga/
prstata. No caso da tira positiva ser forte e no for visualizado eritrcitos no
sedimento porque se trada de mioglobina e no de hemoglobina.
Os nitritos dependem da converso de nitratos (da dieta) para nitritos pela ao
redutora das bactrias (caso estejam presentes) na urina. Um resultado positivo
indica a presena de bactrias, logo uma possvel infeo.
Os leuccitos na urina sugerem a presena de uma ITU.
Estas tiras reativas (URIFLET S

) no tm o parmetro da densidade, que


consiste num parmetro que permite avaliar, por exemplo, se o individuo colheu
a 1 urina da manh, ou se o indivduo em estado de desidratao ou no.
Os parmetros bioqumicos tm que coincidir com o sedimento urinrio, nos
leuccitos, nos eritrcitos, nas protenas (visualizao ou no de cilindros ou
muco), nitritos (presena ou no de bactrias). A anlise bioqumica de certo
modo desperta, o que encontrar posteriormente no sedimento urinrio.
III- 3.2- Sedimento urinrio
No sedimento urinrio realizou-se a observao e semi-quantificao (raros,
alguns ou frequentes) dos elementos celulares:
- clulas epiteliais, clulas do epitlio de transio e clulas tubulares;
- leuccitos, eritrcitos, cilindros hialinos, cilindros eritrocitrios e leucocitrios
(patolgicos);
- elementos leveduriformes (estudados na Bacteriologia)
- cristais mais comuns: cido rico; oxalato de clcio; fosfatos (fosfato, amnio e
magnesiano) e menos comuns e patolgicos os cristais de leucina, tirosina e
cistina.
Os cilindros so formados pela protena de Tamm-horsfall nos tbulos renais, a
forma em cilindro a do tbulo que serviu de molde. So de formao
exclusivamente renal, portanto aquando da sua presena em excesso, sugestivo
de doena renal, embora um cilindro hialino at 1 a cada 2 campos pode ser
normal. A presena de cilindros eritrocitrios (contm eritrcitos no seu interior)
77

sugestiva de leso dos tbulos renais ou capilares renais, aquando dos cilindros
leucocitrios (contm leuccitos no seu interior), significa infeo e/ou
inflamao no interior do nefrnio.
Os cristais so formados por precipitaes dos sais da urina por alteraes na
concentrao, na temperatura e no pH da urina, tambm podem formar clculos
renais. Os cristais so classificados na diferena do pH:
Cristais cidos: cido rico ( o mais comum) os uratos amorfos, os
cristais de oxalato de clcio (vitamina C), os cristais de cistina, os cristais
de leucina (doena heptica), os de tirosina e os de colesterol;
Cristais alcalinos: fosfato triplo (fosfato, amnio e magnesiano), os
fosfatos amorfos e por fim os cristais de bilirrubina.
III- 4- Controlo de qualidade interno e externo na seco de
Parasitologia e Urinas
O controlo de qualidade interno fornecido pelas casas comerciais dos
equipamentos.
O controlo externo da qualidade na pesquisa parasitolgica e pesquisa de sangue
oculto nas fezes e na urianlise realizou-se o PNAEQ-INSA.






78

IV- Hematologia
A Hematologia uma especialidade biomdica, que estuda o sangue e os rgos
hematopoiticos em situaes fisiolgicas e patolgicas, bem como os
mecanismos de hemostase (primria e secundria).
O sangue um tecido altamente especializado e em permanente renovao que,
conjuntamente com o sistema circulatrio, tem como funes abastecer as
necessidades dos tecidos, rgos e sistemas do organismo. Tambm tem como
funo transporte de gases e nutrientes, manuteno da temperatura corporal e
equilbrio hdrico e eletroltico, proteo contra infees e excreo de produtos.
O sangue composto por duas fases, a fase lquida, que corresponde ao plasma, e
a fase slida que corresponde aos elementos figurados do sangue. O plasma
constitudo essencialmente por gua (91%), protenas (7%) como a albumina,
globulinas (1, 2, 1, 2 e ), fibrinognio e solutos (2%), ies, nutrientes,
hormonas e produtos residuais.
Em relao s protenas do sangue, a albumina fornece a presso osmtica
necessria para bombear gua do fluido intersticial para os capilares mantendo
tambm a presso sangunea estvel; as globulinas e so responsveis pelo
transporte de lpidos e vitaminas lipossolveis; as globulinas que so sobretudo
anticorpos e o fibrinognio, que esto envolvidos nos processos de coagulao.
Os elementos figurados do sangue: os eritrcitos so clulas bicncavas e
anucleadas (fig.3) com funo de transportar o oxignio no sangue
(hemoglobina). Tm uma durao mdia de vida de 120 dias. So formados
novos eritrcitos atravs da eritropoiese (fig.4).


Fig.3: Eritrcitos

79



Fig.4: Processo de maturao dos eritrcitos

Este processo estimulado por uma hormona, a eritropoetina, que segregada
nos rins. So necessrios os seguintes elementos, o ferro, a vitamina B 12 e o
cido flico para que ocorra este processo.
Os leuccitos so clulas de defesa que se encontram livres no plasma com
possibilidade de movimento ameboide com funes de defesa. Dividem-se em
dois grupos de acordo com os grnulos e linhagens: leuccitos granulares ou
granulcitos (origem mielide) que inclui os neutrfilos, os eosinfilos e os
basfilos. Os leuccitos agranulares ou agranulcitos (origem linfoide) que inclui
os linfcitos e os moncitos.
Os neutrfilos so clulas polimorfonuclerares, responsveis por fagocitose de
bactrias e fungos e, na maioria das vezes, so a primeira resposta a uma infeo;
Os eosinfilos so vesculas repletas de enzimas digestivas com defesa contra
vermes e parasitas, tambm esto envolvidas em reaes alrgicas (fagocitam os
complexos Ag - Ac); Os basfilos libertam histamina (vasodilatador) e heparina
(anticoagulante) e esto envolvidos nas reaes alrgicas.
Em relao aos leuccitos agranulares, os moncitos so clulas fagocticas que
por vezes se tornam macrfagos. Os linfcitos participam nas defesas imunitrias
e subdividem-se em linfcitos B e T.
O processo de maturao destas clulas processa-se da seguinte forma (fig.5).
80



Fig.5: Leucopoiese

Estas clulas tm em comum a clula primordial, com origem na medula ssea
onde se diferencia a via mieloide e a via linfoide. Na via mielide vo-se
diferenciar, os eosinfilos, os neutrfilos, os basfilos e os moncitos e pela via
linfoide, os linfcitos B e T.
As plaquetas (fig.6) so fragmentos citoplasmticos celulares provenientes dos
megacaricitos, produzidos tambm na medula ssea. So importantes na
coagulao participando na formao do tampo plaquetrio e promove-se a
formao e endurecimento dos cogulos.



Fig.6: Agregado plaquetrio


Os elementos figurados do sangue sofrem um processo de maturao at
chegarem propriamente a clulas maduras.
81

Neste estgio, na seco de Hematologia, realizou-se, em sangue perifrico, a
anlise das sries: leucocitria, plaquetria e eritrocitria. Na srie eritrocitria,
efetuou-se a contagem total dos eritrcitos e a determinao de parmetros
hematolgicos como o da hemoglobina, do hematcrito e os ndices eritrocitrios
ou globulares, o volume globular mdio (VGM), a hemoglobina globular mdia
(HGM), a concentrao de hemoglobina globular mdia (CHGM), o coeficiente
de disperso eritrocitria (CDE) e os reticulcitos.
Na linhagem plaquetria, realizou-se a contagem total de plaquetas e a
determinao de alguns parmetros associados a esta linhagem, tais como, o
volume plaquetar mdio.
No estudo da srie leucocitria, efetuou-se a contagem total dos leuccitos, no
sangue perifrico, e a respetiva frmula leucocitria das cinco populaes, os
neutrfilos, os eosinfilos, os basfilos, os linfcitos e os moncitos. Executou-
se tambm a velocidade de sedimentao (VS), a hemoglobina glicada (HbA1C)
e a separao das hemoglobinas, e por fim, o estudo da hemostase secundria
(Coagulao).
Nesta seco, tambm realizou-se o mielograma, que consiste no estudo de
avaliao da celularidade da medula ssea, assim como, das caractersticas
maturativas e morfolgicas das linhagens hematopoiticas, e a contagem
diferencial destas clulas.
IV- 1- Amostra
A amostra utilizada no hemograma, na VS, na HbA1C e na separao de
hemoglobinas, sangue total com anticoagulante, o EDTA, em concentrao de
1,50 +/- 0,25 mg/ml de sangue total. Este anticoagulante um quelante do clcio
e forma sais de clcio insolveis impedindo a coagulao do sangue.
Na coagulao utilizado plasma, no qual aplicado o anticoagulante citrato de
sdio, na proporo 9:1, para a obteno de amostra de plasma.
82

IV- 2- Metodologia
Esta seco encontra-se praticamente automatizada, com a exceo, da execuo
dos esfregaos perifricos e a colorao dos aspirados de medulas sseas. O
hemograma efetuou-se no analisador automtico Coulter LH 750 Hematology
Analyser da Beckman Coulter (Citometria de Fluxo) Beckman Coulter. Os
esfregaos de sangue perifrico realizaram-se manualmente e corados pelo
equipamento automtico, o Aerospray 7120 Hematology Slide Stainer.
Os analisadores em que se determinou a VS foram da Menarini, baseados num
mtodo derivado ao mtodo de Westergren.
O equipamento onde se efetuou a separao das hemoglobinas (A
2
, F e A
1c)
foi o
BioRad Variant II, que utiliza os princpios de high-performance liquid
chromatography (HPLC) na permuta de ies para efetuar a separao automtica
das hemoglobinas normais e anormais e tambm na quantificao da
hemoglobina A
2,
F e A
1c,
em amostras de sangue total.
A Coagulao realizou-se no equipamento da Werfen Group - Izasa, o ACL
TOP, que consiste em trs mtodos, dependendo da anlise: coagulimtrico,
cromognico e imunolgico.
IV- 3- Hemograma
O hemograma um dos exames complementares de diagnstico mais
frequentemente requisitados na seco de Hematologia, permite a avaliao e
quantificao dos elementos celulares do sangue: eritrcitos, leuccitos e
plaquetas.
Na realidade, o exame de primeira linha no estudo da funo hematolgica,
contudo, uma anlise atenta e cuidada dos elementos celulares implica, para alm
da quantificao de cada um dos tipos de clulas sanguneas, o estudo da sua
morfologia a partir dos ndices eritrocitrios, leucocitrios e plaquetrios, e da
visualizao do esfregao de sangue perifrico.



83

Eritrcitos
O estudo da srie eritrocitria inclui a contagem do nmero total de glbulos
vermelhos, a determinao da hemoglobina, do hematcrito e dos ndices
eritrocitrios ou globulares (tabela X).

Tabela X: ndices Globulares
ndices eritrocitrios

Definio
Hemoglobina (g/dL)


Protena nos eritrcitos que transporta O
2
para os rgos vitais e todo o
sistema vascularizado.
Hematcrito (L/L)

Volume mdio do volume dos glbulos vermelhos.
Volume globular mdio
(VGM) (fl)

Valor mdio do volume do glbulo vermelho.
Hemoglobina globular mdia
(HGM) (pg)

Indica o peso da hemoglobina contida num glbulo vermelho mdio
Concentrao da hemoglobina
globular mdia (HGM) (g/dL)

Indica a concentrao mdia de Hemoglobina por unidade de volume
de glbulos vermelhos

Os mtodos e interesse destes ndices esto demonstrados na tabela seguinte
(tabela XI).

Tabela XI: Mtodo e anlise dos ndices eritrocitrios
ndices eritrocitrios do hemograma no Coulter LH750
Parmetro Mtodo Anlise
Hemoglobina
(Hb)
Cianohematohemoglobina Detetar, avaliar e monitorizar (no tratamento) as
anemias

Hematcrito (Ht)



Calculado (Coulter) Deteo de anemias e poliglobulias; Informao
sobre o aspecto do plasma; Determinao dos
ndices globulares (VGM, CHGM).
VGM

VGM(fl)= Ht(L/L)/GV(x10
12
/L) Microcitose; Macrocitose; Anisocitose
(Macrocitose + Microcitose).
CHGM

CHGM(g/dL)=
Hb(g/dL)/Ht(L/L)
Hipocromia, Normocromia e Esferocitose.
Coeficiente de
disperso
eritrocitria CDE
(%)

Analisador automtico atravs
do histograma da disperso do
VGM
Disperso do volume dos eritrcitos, ou seja
para identificar uma possvel anisocitose.

84

O VGM, a HGM, a CHGM e o CDE, para alm de serem determinados pelo
analisador automtico, podem ser visualizados num esfregao de sangue
perifrico. Podem apresentar varias formas e tamanhos, como demonstrados na
figura 7.



Fig.7: As variaes do tamanho e forma mais frequentes nos glbulos vermelhos, onde
podero ser encontradas em algumas anemias.


Com a anlise destes parmetros, nomeadamente o VGM e o CHGM, possvel
classificar algumas anemias (anemia microctica hipocrmica, normoctica
normocrmica, macroctica), demonstrados na figura 8.
85



Fig.8: Classificao das anemias com base no volume globular mdio.

Leuccitos
Na srie leucocitria realizou-se o nmero total de leuccitos no sangue
perifrico e a respetiva frmula. A metodologia da citometria de fluxo classifica
o maior nmero de clulas, tendo, portanto uma maior preciso.
O analisador da Beckman-Coulter, o contador fornece os cinco elementos
diferenciais de leuccitos atravs da tecnologia VCS (volume, condutividade e
disperso da luz laser (scatter)). medida que as clulas passam na clula de
fluxo, so realizadas 3 medies: a impedncia, a frequncia baixa determina o
volume celular; a condutividade, a frequncia alta permite avaliar a
condutividade interna da clula e, portanto, a sua complexidade em termos de
organelos celulares; e, por fim, a disperso da luz d informao acerca da forma
e estrutura celular.
Os valores de referncia da linhagem leucocitria e das restantes linhagens
hematopoiticas esto representados na figura 9.
Os valores de referncia variam consoante o sexo e a idade.

86


Fig.9: Valores de referncia do hemograma.

Reticulcitos
O nmero total de reticulcitos contabilizou-se tambm no analisador Beckman-
Coulter, onde se utiliza tambm a tecnologia VCS, referida anteriormente, aps
colorao dos reticulcitos com azul de metileno (que vai ligar-se ao RNA dos
reticulcitos). O interesse na contagem dos reticulcitos sobretudo:
- Avaliar a atividade da linhagem eritropoitica da medula, diagnosticar se uma
anemia regenerativa () ou arregenerativa (N ou);
- Aquando de um tratamento de anemias (ferropnica, perniciosa ou deficincia
em cido flico);
- Monitorizao de doentes renais em tratamentos com eritropoetina;
- Avaliar se h regenerao sangunea aps uma grande perda de sangue.
IV- 4- Esfregao de sangue perifrico
O esfregao sanguneo permite realizar:
o estudo morfolgico e dos eritrcitos, plaquetas e leuccitos;
a frmula leucocitria;
a confirmao dos parmetros obtidos nos auto-analisadores.

87

Na tcnica para execuo do esfregao utilizou-se lmina com lmina. Deve
limpar-se sempre a lmina antes de realizar o esfregao, para evitar que a gordura
(por vezes existente) interfira no esfregao.
Colocou-se uma gota de sangue prxima de uma das extremidades da lmina.
Procedeu-se sua extenso, com uma lmina com uma inclinao de 45.
Retrocedeu-se um pouco a lamela, havendo o contato com a gota de sangue e
esta espalha-se por capilaridade ao longo da linha de contato. De seguida fez-se
deslizar a lmina sobre a lmina, com movimento firme e delicado e deixou-se
secar ao ar, posteriormente, corou-se pela colorao de May-Grnwald-Giemsa
(sendo esta colorao utilizada tambm na colorao dos aspirados de medula
ssea).
IV- 4.1- Colorao de May-Grnwald-Giemsa
A colorao de May-Grnwald-Giemsa fundamenta-se em fixar o esfregao pelo
metanol presente na soluo de May-Grnwald (soluo metanlica de eosinato
de azul de metileno). A dissociao do corante de May-Grnwald efetuada pelo
tampo de fosfatos (o eosinato de azul de metileno, ao pH conferido pelo
tampo eosina + azul de metileno). Vai dar-se a ao individual dos corantes,
eosina (corante cido que vai corar os componentes citoplasmticos da clula
(eosinfilos ou acidfilos) de rosa-alaranjado e o azul de metileno corante bsico
que vai corar o ncleo e os componentes citoplasmticos cidos (basfilos) de
azul-arroxeado. A eosina em conjunto com o azul de metileno vo corar as
granulaes (neutrfilas) de cor rosa. A ao da soluo de Giemsa diluda
fazer com que os corantes presentes no Giemsa, o eosinato de azul de metileno e
o esoinato de azur de metileno sejam dissociados pelo tampo de fosfatos, assim
os corantes individuais eosina + azul de metileno + azur de metileno (cora as
granulaes azurfilas de vermelho-prpura) vo exercer a sua ao. Esta
colorao May-Grnwald-Giemsa uma colorao pantica que combina as
vantagens na utilizao de vrios corantes, corando elementos acidfilos,
granulaes azurfilos e granulaes neutrfilos.
88

O esfregao de sangue perifrico, do lado anterior para o lado posterior da lmina
constitudo por trs zonas, cabea, corpo e franja/cauda. na zona da franja,
onde as clulas se apresentam constantes e uniformes com as caractersticas e
tamanho adequados, que se deve proceder contagem leucocitria e anlise
morfolgica dos eritrcitos, leuccitos e plaquetas.
A visualizao do esfregao de sangue perifrico, no microscpio tico, inicia-se
com a objetiva de 10x para avaliar se a colorao e o esfregao, se estiverem
adequados, segue-se para a observao com a objetiva de 40x para contagem
celular e, por fim, a observao com a objetiva de 100x, para avaliao
morfolgica.
IV- 5- Separao de hemoglobinas
Este um parmetro que habitualmente no avaliado na seco de
Hematologia, mas sim na seco de Bioqumica. Por uma questo de espao
fsico, realizado e validado na seco de Hematologia.
O analisador o VARIANT II HbA
2
/ HbA
1c
destina-se determinao da
hemoglobina A2, F e A1C no sangue total, utilizando o mtodo de HPLC, por
permuta de ies.
IV- 5.1- HbA1C
A diabetes mellitus (doena que afeta mais de 5% da populao) foi definida do
ponto de vista clnico como sendo uma deficincia absoluta ou relativa da
insulina que pode progredir para uma hiperglicmia e que est muitas vezes
associada a complicaes micro e macrovasculares especficas.
O objetivo do tratamento da diabetes manter um nvel constante e normal de
glicose no sangue. medida que o nvel de glicose no sangue sobe, o aumento
da glicao no enzimtica das protenas proporcional, tanto ao nvel de
glicose, como ao tempo de vida da protena na circulao ou nos tecidos. Uma
vez que a vida mdia de um eritrcito de 120 dias, a HbA1C tem sido aceite
como uma medio que reflete melhor as concentraes em jejum de glicose no
89

sangue, a concentrao de glicose no sangue diria mdia e o grau de
desequilbrio de carbohidratos durante os quatro meses anteriores.
A HbA1C forma-se lentamente em dois passos, atravs da glicao no
enzimtica da HbA. Primeiro forma-se uma aldimina lbil (base de Schiff)
atravs da condensao reversvel do grupo carbonilo (C=O) da glicose e do
grupo amina (NH) da valina do terminal N da cadeia de Hb-. A quantidade da
aldimina formada depende da concentrao de glicose no sangue.
Enquanto os eritrcitos circulam, uma parte da aldimina sujeita a um processo
de converso lenta (rearranjo Amadori) para formar uma cetoamina estvel
(HbA1C), uma vez que a concentrao da base de Schiff (aldimina) muda de
forma, com as flutuaes da concentrao de glicose no sangue e, uma vez que
nem toda a aldimina convertida em HbA1C estvel, essencial fazer a
distino entre HbA1C estvel e lbil. O nvel de HbA1C proporcional
concentrao mdia de glicose como ao tempo de vida da Hb em circulao.
Os mtodos para a determinao da HbA1C incluem a electroforese, a focagem
isoeltrica, mtodos colorimtricos, ensaios imunolgicos e cromatografia em
coluna. Se bem que cada tcnica possa ter uma vantagem sobre as outras, pode
igualmente ter desvantagens (ex: usando mtodos electroforticos, as Hb S e C
no interferem, mas nveis elevados de HbF interferem nas medies da HbA1C.
O programa do Variant baseia-se na separao cromatogrfica das hemoglobinas
num contexto de permuta de ies. A separao otimizada para minimizar as
interferncias das variantes de hemoglobina, base de Schiff e da hemoglobina
carbamilada.
IV- 5.2- HbA2 e HbF
O sangue em indivduos adultos contm principalmente HbA, uma pequena
percentagem de HbA
2
e vestgios de hemoglobina fetal, HbF.
As hemoglobinas variantes fazem parte de um grupo de distrbios herdados, as
hemoglobinopatias, que so o resultado de uma sntese defeituosa das cadeias de
globina, formam a molcula de hemoglobina, podendo ocorrer um defeito de
duas formas: enquanto as hemoglobinas anormais resultam da produo de uma
90

cadeia de globinas estruturalmente diferentes, as hemoglobinopatias tambm
podem ser criadas por uma diminuio na produo de uma cadeia de globinas,
estruturalmente normal. Nesta situao, as cadeias de globina e so
sintetizadas em quantidades desiguais. A produo desequilibrada de cadeias,
que da resulta, d origem a uma produo inadequada de hemoglobina normal e
cria um excesso da cadeia de globina normalmente produzida, originando um
tetrmero instvel. Os estados que resultam de tal produo desequilibrada de
cadeias denominam-se de talassmias. Os portadores da -talassmia tm nveis
de HbA2 e F que podem ser superiores a 3,5% e a 2% da Hb total,
respetivamente. A determinao de nveis simultaneamente elevados de HbA2 e
F tornou-se o meio mais prtico para diagnosticar -talassmia. Os mtodos para
a quantificao da HbA
2
incluem a electroforese e a cromatografia em colunas de
permuta de anies. Os mtodos para a quantificao da HbF incluem a
electroforese, a desnaturao alcalina e a imunodifuso radial (RID).
IV- 6- Teste da fragilidade osmtica
Este teste consiste em detetar problemas de membrana nos eritrcitos. Este teste
um meio simplificado de estimar a razo superfcie/rea/volume dos eritrcitos.
A sua utilidade no diagnstico de esferocitose hereditria (CHGM), mas pode
tambm ser utilizado na triagem para a -talassmia. O princpio do teste: os
glbulos vermelhos so colocados numa soluo hipotnica, a gua desloca-se
por osmose para o interior do eritrcito. Isto resulta na turgescncia da clula,
que forma toma uma forma esfrica. Aps o volume crtico ser atingido, a
membrana primeiro cede e depois rompe-se (usando vrias concentraes
salinas), libertando a hemoglobina e todo o seu contedo. A quantidade de
hemoglobina no sobrenadante medida colorimetricamente e comparada com
uma amostra de clulas completamente em lise.
A fragilidade osmtica aumentada ocorre na esferocitose hereditria, na anemia
hemoltica autoimune. O aumento da resistncia hemlise caracterstica da -
talassmia, em ambas as formas, homozigtica e heterozigtica, na deficincia de
ferro, ou seja em qualquer outra condio em que o aumento da
91

superfcie/rea/volume dos glbulos vermelhos esteja presente (tambm em
alguns casos de doena heptica).
IV- 7- Velocidade de sedimentao
A VS consiste na queda espontnea dos elementos figurados do sangue (os
eritrcitos so os que existem em maior nmero) em suspenso no plasma. O
analisador da Menarini baseia-se de um mtodo equivalente ao de Westergren em
que numa primeira fase h uma agregao e depois ocorre a sedimentao dos
eritrcitos.
Os valores de VS aumentados ocorrem em vrias situaes: infees agudas e
crnicas (tuberculose, sfilis) processos inflamatrios agudos (apendicite);
doenas reumticas (febre, artrite); necrose tecidular; doenas neoplsicas
(leucemias, mielomas, plasmocitomas) e em anemias. Quando a VS se encontra
diminuda poder tratar-se de poliglobulias, hipofibrinogenmia e situaes
associadas a alterao da forma dos glbulos vermelhos (valores de referncia da
VS: homem at 13mm e mulher at 10 mm). H dados fisiolgicos que vo
alterar estes valores de referncia, como a idade, o sexo, a gravidez e o perodo
menstrual. Alm dos fatores fisiolgicos existem outros fatores que vo
influenciar na anlise, como por e.g. a formao de rouleaux, a viscosidade do
sangue e a proporo do sangue/anticoagulante.
IV- 8- Coagulao
A coagulao no sangue envolve um sistema de amplificador biolgico em que
algumas substncias ativam por protelise, a cascata de protenas (figura 10)
circulantes e percursoras da coagulao.

Plaquetas
As plaquetas derivam do citoplasma dos megacaricitos aps um tempo de
maturao de aproximadamente de 4 dias, cada megacaricito origina cerca de
1000 plaquetas. O tempo de sobrevivncia destas clulas na circulao de 7 a
92

10 dias. A contagem normal destas clulas varia entre os 150-400 10
9
/ml nos
indivduos.
As plaquetas funcionam como a base celular para a hemostase primria, os
recetores da membrana plaquetria so os mediadores primrios da hemostase e
permitem que as plaquetas se liguem diretamente ao endotlio e subendotlio nos
locais de leso. A adeso plaquetria provoca uma sinalizao transmembranar,
atravs dos seus recetores de superfcie, induzindo a ativao plaquetria e
posterior funo pr-coagulante atravs de translocao de recetores para a
superfcie da membrana celular, alterao conformacional dos recetores,
libertao do contedo dos grnulos e exposio dos fosfolpidos membranares.



Fig.10: Via extrnseca e via intrnseca da cascata da coagulao.


A superfcie da plaqueta serve como plataforma para a montagem da cascata da
coagulao e formao de trombina, que amplifica a resposta pr-coagulante e
produz a fibrina, permitindo a hemostase secundria.
Por fim as plaquetas ajudam na consolidao do trombo atravs do fator XIII e
proteo contra a fibrinlise atravs do fator 4 plaquetrio.
A sntese da maioria dos fatores de coagulao ocorre no fgado, de modo que,
nas doenas hepticas graves, os nveis de todos esses fatores esto diminudos,
exceto o fator VIII, que tambm produzido pelas clulas endoteliais e as clulas
do sistema reticuloendotelial. A protrombina (fator II) e fatores VII, IX e X so
93

dependentes da Vitamina K para se tornarem ativos, assim como os
anticoagulantes naturais as Protena C e S. O fator tecidular (FT) o iniciador
fisiolgico da coagulao e expresso nos fibroblastos subendoteliais e clulas
musculares lisas, sendo tambm expresso pelos moncitos perifricos e clulas
endoteliais vasculares aps exposio de estmulos ativadores ou inflamatrios
como as endotoxinas.

Cascata da coagulao
A cascata da coagulao (hemostase secundria) in vivo propagada por
complexos enzimticos que apenas funcionam eficazmente nas superfcies
membranares de fosfolpidos, fornecidos pelas plaquetas ativadas e clulas
endoteliais (figura 11).
O FT, expresso aps leso endotelial, liga-se ao fator VIIa circulante e o
complexo FT-VIIa liga-se aos seus substratos, fatores IX e X, na superfcie
plaquetria, formando o complexo tenase, dependente de FT.
As plaquetas fornecem ainda recetores especficos para os fatores de Xa, IXa e
Va. O fator V secretado pelos grnulos e principalmente, fornecido pelo pool
citoplasmtico. A fosfatidilserina expressa pelas plaquetas acelera as rees
enzimticas pr-coagulantes e protege os fatores ativados dos inibidores
circulantes, culminando este processo com a formao acelerada de trombina, do
seguinte modo:
1- o complexo fator Xa-Va, juntamente com clcio livre e fosfatidilserina
plaquetria, liga-se ao fator II (pr-trombina) formando o complexo
protombinase que gera trombina em pequenas quantidades;

2- a trombina formada inicialmente no forma fibrina em quantidades
significativas mas pode ativar os fatores VIII, V e XI;

3- a trombina exerce feedback positivo amplificando a cascata da coagulao,
aumentando exponencialmente a formao do fator Xa e trombina;

94

4- com este rpido aumento na formao de trombina, o fibrinognio degradado
em monmeros de fibrina que formam uma matriz integrada no cogulo de
plaquetas;

5- o fator XIII converte a fibrina solvel num polmero insolvel e liga a 2-
antiplasmina fibrina, protegendo o cogulo da dissoluo pela plasmina.



Fig.11: Cascata da coagulao

A avaliao laboratorial da coagulao inclui a avaliao da via extrnseca e da
via intrnseca, atravs do tempo de protrombina (TP) e o tempo de
tromboplastina parcial (TTP), respetivamente. O TP monitoriza primariamente a
atividade do fator VII e o TTP o parmetro que analisa os fatores hemoflicos,
VII, IX e XI. Ambos (TP e o TTP) detetam a deficincia dos fatores comuns s
duas vias (II, V e X).
IV- 8.1- Avaliao laboratorial
A avaliao de uma discrasia hemorrgica requer uma histria clnica bem
organizada, o exame fsico e laboratorial. Os exames laboratoriais, o tempo de
95

tromboplastina parcial ativada (PTTA), o TP so geralmente teis na avaliao
inicial do doente com hemorragia (fig.12).

PTTA
Monitoriza a via intrnseca, consiste no tempo de coagulao aps estimulao
plasmtica com um composto de carga negativa, sendo o seu valor normal de
27s. O TTP sensvel deficincia de fatores de contato e dos fatores de
coagulao, VIII, IX e XI. O TTP usado tambm na monitorizao rpida da
teraputica com Heparina no fracionada.

TP
Monitoriza a via extrnseca, em que mede a interao entre o fator VIIa
circulante e FT-tromboplastina exgeno adicionado. O TP altamente sensvel a
deficincias dos fatores II (pr-trombina) V, VII e X. Como os fatores II, VII e X
so dependentes da Vitamina K. O TP o mais sensvel a medir a eficcia da
teraputica da Varfarina. O TP nunca afetado pela deficincia dos fatores VIII,
IX, XI e XII. O valor normal do TP volta dos 12s.
As anomalias do fatores II, V e X causam o prolongamento do TP e do APTT.


Fig.12: Testes usados no screening da coagulao.

96

O RNI (razo normalizada internacional) importante na monitorizao de
doentes hipocoagulados.
Foi criado para normalizar as variaes do TP
induzido pela Varfarina e para permitir a
aplicao global de recomendaes
anticoagulantes.
O RNI baseia-se no ISI (ndice de
Sensibilidade Internacional (fornecido pelo
fabricante da tromboplastina) de cada
tromboplastina, estandardizado para o FT e
calculado da seguinte forma:

Razo (R) = Tempo formao do cogulo do plasma a testar
Tempo formao do cogulo do plasma normal

RNI=R
ISI























97

A tabela seguinte mostra outros parmetros envolvidos na hemostase secundria
determinados na seco de Hematologia.

Tabela XII: Testes realizados na seco de Hematologia no estudo da hemostase
secundria.
Teste

Definio
ATIII (Antitrombina III) Protease circulante que inibe a atividade da trombina e fatores IXa, Xa e
XIa. A sua ao potenciada pela ligao heparina

D-Dmeros Produtos de degradao de um agregado de fibrina, formados
exclusivamente a partir da degradao de um trombo. O teste indicado
quando h suspeita clnica de trombose venosa profunda ou embolia
pulmonar, um teste de valor preditivo negativo (permite excluso de
diagnstico). Pode tambm ajudar no diagnstico de coagulao
intravascular disseminada, em casos de suspeita.

Protena C ativada (APC) Cliva os fatores Va e VIIIa livres inibindo os respetivos complexos
protombinase e tenase e inibe a formao de trombina

Protena S Cofator da APC. Funciona apenas no estado livre e no quando ligada
protena ligante de C4b. esta ltima pode estar aumentada em doenas
agudas, levando a um estado pr-coagulante

Dfice de atividade da
Protena C ativada ou
Resistncia Protena C
ativada (APCR)
teste de rastreio da resistncia Protena C ativada para a mutao do
fator V Leiden (Biologia Molecular). A maioria dos pacientes com
resistncia funcional APC tem uma nica mutao pontual no gene do
fator V. Esta mutao torna o fator Va incapaz de ser inativado pela APC.
Deste modo o fator Va ativa a cascata da coagulao e h um predomnio
dos fatores pr-trombticos. O padro de hereditariedade do fator V de
Leiden autossmico dominante.
IV- 8.2- Patologias mais comuns na seco de Hematologia
As hemofilias so doenas hereditrias ligadas ao X, afetam a hemostase
secundria e so deficincias de fatores de coagulao mais comuns a seguir da
doena de von Willebrand (vWF) (fig. 13).
A hemofilia A consiste numa deficincia de fator VIII e tem uma maior
prevalncia do que a hemofilia B, que se deve uma deficincia do fator IX. Afeta
essencialmente indivduo do sexo masculino mas pode tambm afetar mulheres
se houver uma inativao extrema do cromossoma X. Clinicamente, os doentes
apresentam hemorragias e o tratamento consiste na administrao de
concentrados de fator VIII ou IX, dependendo do tipo de hemofilia, viralmente
inativados ou recombinantes. Quer em casos mais graves ou ligeiros, estes
doentes necessitam de repor os fatores em falta.
98



Fig.13: Demonstrao de alguns parmetros alterados nas patologias: hemofilia A,
deficincia do fator IX e na doena de von Willebrand.


A doena de vWF uma discrasia hemorrgica do tipo plaquetria e deve-se a
uma alterao gentica ou adquirida do vWF. So os multmeros maiores de
vWF que conferem maior capacidade hemosttica. Em pacientes com pouco
vWF ou em que o vWF anormal, a adeso das plaquetas aos vasos lesados
lenta, o que resulta em hemorragia das mucosas e aumento do tempo de
hemorragia.
O vWF tambm o transportador do fator VIII, de modo que a deficincia de
vWF ou a ligao anormal vWF-fator VIII leva a uma depurao rpida do fator
VIII, diminuio dos nveis de fator VIII e aumento do TTP.
IV- 9- Controlo de qualidade interno e externo em Hematologia
O controlo interno da qualidade na seco de Hematologia provm das casas
comerciais da Bio-rad.
O controlo externo da qualidade realizou-se o PNAEQ-INSA.

99

V- Bioqumica
A bioqumica clnica uma rea laboratorial que se dedica ao estudo analtico de
amostras biolgicas, tendo como objetivo principal dar apoio ao diagnstico e
monitorizao clnica de doentes.
Neste mbito, permite avaliar funes biolgicas; processos metablicos; funo
e/ou leso de rgos mediante, por exemplo, o doseamento de enzimas que so
produzidos /secretados por estes rgos em condies normais ou patolgicas
(por exemplo, doseamento de enzimas cardacas na suspeita de enfarte do
miocrdio), entre outros.
Outras vertentes da bioqumica clnica so: a toxicologia (que se dedica ao
rastreio de drogas de abuso) e a monitorizao de frmacos.
Estruturalmente, a seco de bioqumica clnica situa-se numa das maiores reas
do servio, o LabCore, que inclui tambm as seces de Imunologia e
Hormonologia.
O SPC dispe ainda de uma sala de qumica manual onde so realizados alguns
testes de cromatografia (cobre urinrios, zinco), assim como doseamentos de
frmacos imunossupressores tais como ciclosporina, tacrolimus e sirolimus.
V- 1- Amostra
A maioria dos parmetros bioqumicos determinada em amostra de soro, sendo
tambm utlizadas amostras de plasma, urina 24 h, amostra de urina ocasional,
sangue total e lquidos biolgicos. importante que, tanto o soro como o plasma,
sejam separados da parte slida (elementos celulares) o mais breve possvel aps
a colheita. Este passo previne a troca de substncias entre a poro celular e a
poro lquida, o que pode alterar os resultados dos testes.
O procedimento da colheita do sangue venoso tambm muito importante, visto
que um mau procedimento pode comprometer os resultados de alguns parmetros
analticos, tais como o potssio e as protenas totais.
O transporte da amostra biolgica tambm um fator muito importante, tendo
em conta que a maior parte das amostras provm do exterior do HNM.
100

De entre os fatores que podem afetar a viabilidade das amostras, os mais
relevantes so: sistema de transporte, posicionamento da amostra primria
exposio de luz solar/artificial, temperatura (C: deteriora alguns parmetros,
diminuio da glicose, aumento do fsforo, hemlise; C: hemlise), tempo
(mximo de 2h aps a colheita de sangue venoso no centrifugado, para manter a
estabilidade) e alteraes mecnicas, onde um excesso de agitao leva a
hemlise.
As condies em que a amostra biolgica se encontra, por exemplo, com fibrina,
lipmicas, ictricas, hemolisadas, tm que ser avaliadas e reportadas, podendo
condicionar a alterao de alguns parmetros bioqumicos. As amostras de soro
com fibrina advm do tempo insuficiente para a retrao do cogulo (30 minutos
a temperatura ambiente) e da teraputica com anticoagulantes, levando a
consequncias adversas, como, obstruo das pipetas dos aparelhos o que resulta
na obteno de resultados incorretos. As amostras lipmicas surgem pelo
aumento das lipoprotenas, principalmente dos triglicridos, o que leva a algumas
interferncias no mtodo, como por exemplo, no aumento de cido rico,
protenas totais e glicose e na diminuio por e.g. da creatinina. As amostras
ictricas resultam do aumento da concentrao das bilirrubinas, interferindo em
parmetros como cido rico, colesterol total e triglicridos, diminuindo-os. A
hemlise da amostra interfere no doseamento nomeadamente, bilirrubinas,
marcadores cardacos (Ck e Ck-MB) e analitos intracelulares tais como o
potssio e o lactato desidrogensase (LDH).
As amostras devem ser analisadas no prazo de uma hora, deixando-as
temperatura ambiente. Caso o prazo de anlise seja superior a uma hora,
refrigera-se as amostras a 4C. No caso dos testes que envolvam enzimas, as
amostras devem ser congeladas imediatamente aps a colheita, para evitar a
perda da atividade enzimtica. As amostras para o estudo da bilirrubina devem
ser conservadas num recipiente escuro j que a bilirrubina degradada pela luz.
Alguns parmetros so alterados aps a ingesto de alimentos (glucose,
triglicerdeos, colesterol), da que a colheita tem que ser efetuada ao paciente em
jejum (12h antes da hora da colheita). H outros parmetros que podem sofrer
101

variaes como, a creatinina quinase, ferro e corticoesterides, da que seja
fundamental a indicao da hora da colheita.
V- 2- Metodologia e anlises efetuadas na seco de Bioqumica
O nmero de instrumentos disponveis no mercado, para realizao de anlises
bioqumicas, cresceu rapidamente nos ltimos anos. Muitos desses instrumentos
fornecem uma ampla variedade de tcnicas e metodologias que se encontram
disponveis em simultneo no mesmo equipamento, sendo tambm de fcil
utilizao sob o ponto de vista do operador.
A par dos avanos tecnolgicos dos analisadores de qumica clnica, tambm se
verificou a criao de sistemas automatizados para os processos da fase pr-
analtica com o intuito de atenuar a ocorrncia de erros inerentes a esta fase,
assim como garantir a segurana dos funcionrios e diminuir o tempo de resposta
dado pelo laboratrio.
Neste sentido, e de forma a melhorar a resposta dada pelo SPC, foi implementado
na rea LabCore, um sistema automatizado de pr anlise e uma cadeia robtica,
a qual permite a articulao dos vrios equipamentos de bioqumica e
hormonologia com mdulos de pr-analtica e um armazenador de amostras.
A seco de Bioqumica utiliza os seguintes aparelhos do LabCore da Beckman
coulter

:
AutoMate Sample Processing System
o
Centrifugao; determinao do nvel de soro mnimo para a realizao de
alquotas; mdulo de descapsulao; execuo de alquotas para as
seces de Serologia, Imunologia e Hormonologia e sua etiquetagem;

o Separao de amostras (tubos primrios e alquotas) para as vrias seces
do servio, assim como para o servio de imunohemoterapia;
o Separao das amostras destinadas seco de hematologia de acordo
com os parmetros a analisar (hemograma, VS e hemoglobina glicada).

Cadeia robtica

o Mdulo de entrada
102

Unidade Inlet (entrada de amostras no sistema informtico
do laboratrio)
Unidade Outlet (para separao de amostras rejeitadas);
o Centrfuga;
o Descapsulador;
o Analisador automatic UniCel DxI 800 (Hormonologia);
o Analisador automatic Dxi Au 5400 (Bioqumica analtica);
o Recapsulador;
o Armazenador frigorfico para amostras;
o Mdulo de sada
Unidade outlet (para amostras com parmetros analticos a
determinar fora da cadeia robtica).
Rotina
Quando as amostras chegam seco (aps terem passado pela triagem do SPC),
so colocadas em racks do automate: com centrifugao ou sem centrifugao
(Imunologia, Serologia, Hematologia, Imunohemoterapia) e robtica
(Bioqumica e Hormonologia). Insere-se as duas primeiras no automate e a
ltima na cadeia robtica. Esta ltima colocada na cadeia robtica se as
amostras tiverem somente pedidos de parmetros que se realizem nos aparelhos
da cadeia.
O equipamento automate faz tambm a separao para uma rack especfica de
amostras que no obedeam aos critrios definidos para a sua colocao na
cadeia robtica, tais como tubos peditricos, amostras com quantidade de soro
insuficiente ou alquotas. No final da anlise, os tubos so armazenados no
armazm refrigerado, atravs da seleo automtica da cadeia robtica.
A fase pr-analtica uma das fases suscetvel de maior nmero de erros
analticos na marcha laboratorial.
Esta automatizao (LabCore) do SPC traz muitas vantagens, nomeadamente:
- reduz a exposio do tcnico ao risco biolgico;
- permite padronizar as vrias etapas e atividades da fase pr-analtica;
103

- reduz o tempo de manipulao das amostras (preparao das amostras,
alquotas e etc.);
- diminuio da ocorrncia de erros;
- permite visualizar o trajeto da amostra (rastreabilidade da amostra).
V- 2.1- Equipamento automatizado e mtodo
A tabela seguinte mostra os testes e a respetiva metodologia executadas no
equipamento Dxi Au5400.

Tabela XIII: Testes realizados na seco de Bioqumica .
Testes Metodologia Interesse
Glucose Ensaio enzimtico (mtodo de
hexoquinase)
Diabetes; Defeitos
congnitos enzimticos
Bilirrubina direta

Ensaio colorimtrico

Funo heptica
Bilirrubina total
Albumina Funo heptica e renal;
Perturbaes metablicas e
nutricionais.
Protenas totais

2-microglobulina

Imuno-turbidimtrico
Patologias renais,
oncolgicas, auto-imunes,
infees bacterianas e
vricas
Ck (creatinina quinase) Ensaio enzimtico com imuno-inibio

Funo cardaca
Ck-mb (creatinina quinase
miocrdio)
Teste de imuno-inibio enzimtica
AST (Aspartato
aminotransferase)

Ensaio enzimtico cintico
Funo Heptica e
Cardaca
ALT (Alanina
aminotransferase)
Funo Heptica





104

Testes Metodologia Interesse
ApoB (Apolipoprotena B) Imuno-turbidimtrico
Avaliao cardiovascular

Perfil lipdico
Colesterol Total Ensaio enzimtico colorimtrico
LDL
HDL
Triglicridos Ensaio enzimtico colorimtrico
Ureia Ensaio enzimtico cintico


Funo renal

Creatinina Mtodo de Jaff (cintico colorimtrico)
Microalbumina Ensaio imuno-turbidimtrico
Magnsio Ensaio colorimtrico - mtodo direto no
qual os ies de magnsio formam um
complexo colorido com azul de xilidil
numa soluo fortemente bsica.
cido rico Ensaio enzimtico colorimtrico Doena renal e Gota
Fosfatase alcalina Ensaio cintico
colorimtrico
Funo heptica e
Metabolismo sseo
Amnia Ensaio enzimtico Insuficincia renal;
Acidoses tubulares;
Insuficincia hepatocelular
Ferro
Ensaio colorimtrico
Anemias
Fsforo inorgnico Aporte nutricional
GT (gama-glutamil
transferase)
Ensaio cintico
colorimtrico
Funo heptica
Lactato Ensaio enzimtico colorimtrico Hipoxia e distrbios
metablicos

LDH- Lactato
Desidrogenase


Ensaio enzimtico cintico
Enzima inespecfica
(heptica, msculo
cardaco, sistema msculo-
esqueltico, doenas
Hemato-oncolgicas: e.g.
testculos, linfomas e
leucemias
Protena C-reativa Ensaio de imuno-turbidimtrico Processo inflamatrio
agudo
Transferrina Ensaio de imuno-turbidimtrico Anemias
Sdio
Potssio e Cloro

Potenciometria indireta
Funo Hidro-electroltica
Funo renal
105


V- 2.2- Urina de 24h
A colheita de urina de 24h constitui uma parte importante do exame. Se o
volume de urina colhida muito reduzido, necessrio repetir a colheita.
- O incio da colheita dever dar-se referencialmente pela manh, desprezando-
se a primeira mico;
- A partir da, dever colher a urina de todas as mices que se seguirem
durante as 24 horas, se possvel diretamente para o recipiente, sem perder
qualquer quantidade de urina;
A ltima mico dever ser rigorosamente mesma hora em que iniciou a
recolha no dia anterior, neste exemplo s 8 horas da manh seguinte;
A urina desta ltima mico deve ser, totalmente vertida no recipiente de
colheita;
- Se verificar que o frasco de 2L fornecido no suficiente para guardar toda a
sua urina de 24 horas, pode colocar o excesso de urina numa garrafa de gua
de 1,5 litros, limpa e seca.
- Durante o perodo de colheita da urina de 24 horas, o(s) recipiente(s) devero
Testes Metodologia Interesse
Clcio Ensaio colorimtrico Paratiride; Doenas
sseas; Doena renal
crnica; Urolitase e
Tetania
Adenosina desaminase
(ADA)
Mtodo colorimtrico cintico Diagnstico e
monitorizao de
tuberculose pleural e
peritoneal
Aldolase Ensaio enzimtico Doenas primrias do
sistema msculo-
esqueltico
Enzima conversora
Angiotensina (ECA)
Ensaio cintico Sarcoidose; Doena de
Gaucher; Lepra
Amilase Ensaio enzimtico colorimtrico
Patologia pancretica
Lipase Ensaio cintico colorimtrico
106

ser armazenados no frigorfico ou guardados em local muito fresco.

Interesse
Uma das principais indicaes para a utilizao deste tipo de amostra a
avaliao da diurese e funo renal. Neste sentido so determinados os seguintes
parmetros:
- medio do volume da urina;
- anlise bioqumica (uma amostra representativa): proteinria, microalbuminria
e a creatinria;
- clearance da creatinina.
A urina de 24 horas pode ser tambm utilizada para doseamentos de hormonas,
metabolitos ou outras substncias que so excretados na urina.
V- 2.3- Lquidos biolgicos
Na seco de Bioqumica, faz-se o estudo bioqumico dos lquidos biolgicos:
cefalorraquidiano e lquidos serosos - pleural, peritoneal, sinovial e pericrdico.
Para avaliar a citologia do lquido biolgico, efetuou-se uma contagem celular no
autoanalisador hematolgico COULTER LH 750. Se a contagem celular for
inferior a 300 (limite de deteo do analisador), realizada a contagem celular
manual em cmara de Neubauer. A contagem diferencial de clulas e a sua
avaliao morfolgica so realizados em lmina de citoesfregao corado com
colorao de Wright.
Na avaliao bioqumica so determinados, essencialmente, a glucose e as
protenas, teis no diagnstico diferencial entre exsudados e transudados (nos
lquidos serosos), assim como no diagnstico diferencial de meningite bacteriana
e viral (LCR), entre outras patologias que afetam o sistema nervoso central.
Pode haver interesse em determinar outros parmetros analticos, como por
exemplo: triglicridos (na suspeita de lquido quiloso) e adenosina desaminase
(ADA) (suspeita de tuberculose).
107

V- 2.4- Testes de diagnstico rpido
Para alm dos autoanalisadores, a seco possui testes de diagnstico rpido, o
teste de gravidez e o das drogas de abuso.
V- 2.4.1- Teste imunolgico de gravidez
Este teste consiste num teste de imunoensaio cromatogrfico (Nadal hCG

) que
permite a avaliao qualitativa rpida da hormona gonadotrofina corinica
humana (hCG) na urina.
Na membrana da rea do teste, esto fixados anticorpos ligados cadeia da
hCG; na membrana da zona de controlo esto fixados Acs de cabra anti- rato.
Durante o ensaio, a amostra misturada com partculas de ouro coloidal que
possuem sua superfcie Acs monoclonais com afinidade para a cadeia beta da
hCG. Com o resultado positivo, isto , com a presena de hCG, um conjugado
Ac hCG/ Ac - ouro surge, atravs da presena de uma linha de cor na zona do
teste. Se esta linha de cor no aparece na rea do teste, o resultado negativo.
Em ambos os casos (resultados positivo ou negativo), dever aparecer uma linha
de cor (na zona de controlo). Se esta no aparecer, o teste dado como invlido.
V- 2.4.2- Drogas de abuso
Utilizou-se um teste imunocromatogrfico (Drug-Sreen

) para detetar a presena


de drogas de abuso, na urina. um teste rpido, qualitativo para deteo
simultnea de vrias drogas e seus metabolitos, nomeadamente cocana,
anfetamina, metanfetaminas, canabinides e morfina. O teste baseia-se num
imunoensaio competitivo, sendo composto por um dispositivo com uma
membrana que contem partculas ligadas a anticorpos dirigidos contra as vrias
drogas, assim como conjugados de protena-droga. A amostra colocada num
poo do dispositivo e migra por ao capilar ao longo da membrana. Se a
quantidade de droga na amostra for inferior ao valor de cut-off, as partculas de
Ac ligam-se aos respetivos conjugados protena-droga, fazendo aparecer uma
linha de cor na regio designada para essa droga. Se, por outro lado, a
108

concentrao de droga na amostra for superior ao valor de cut-off, esta vai saturar
os stios de ligao no Ac, e no se forma uma linha visvel.
Porm, um resultado negativo no indica urina livre de droga, mas sim abaixo do
nvel de deteo do teste. O teste invlido se no surgir a linha de controlo.
V- 3- Controlo de qualidade interno e externo em Bioqumica
Consiste essencialmente no controlo dirio (interno) e no controlo mensal
(externo) dos parmetros bioqumicos, feitos a partir das cartas de Levey-
Jennings (cartas de controlo de qualidade com regras padronizadas).
Controlo de qualidade interno
Este realizado com materiais de controlo comerciais disponibilizados,
geralmente, em 2 ou 3 nveis de concentrao, de forma a monitorizar diferentes
nveis de deciso mdica. Nos analisadores automticos utilizam-se, para a
maioria dos parmetros, controlos Bio Rad, tendo alguns parmetros controlos
especficos. Os resultados so avaliados, utilizando o programa informtico
Unity-Real Time.
O controlo interno realizado diariamente e sempre que h necessidade de
avaliar possveis erros nos equipamentos. realizado tambm o controlo de
temperaturas dos frigorficos.

Controlo de qualidade externo
External Quality Assurance Services (EQAS) da Bio-rad





109

VI- Hormonologia
O sistema endcrino consiste em diferentes glndulas que secretam vrias
hormonas diretamente na corrente sangunea. Algumas tm ao reguladora, que
estimula a secreo das hormonas metabolicamente ativas de outras glndulas.
A secreo e a concentrao de cada hormona, est sujeita a um controlo
contnuo por mecanismos de feedback negativo em condies fisiolgicas
normais. Consequentemente, a concentrao de cada hormona na circulao deve
enquadrar-se dentro de valores de referncia normais, em condies normais de
sade. O diagnstico dos distrbios endcrinos possvel principalmente atravs
da quantificao direta das hormonas individuais no soro.
As aes das hormonas podem ser divididas de modo amplo em funes
reguladoras, morfognicas e integrativas.
Funo reguladora
Uma das funes do sistema endcrino a de regular a homeostasia dos lquidos
extra e intracelulares. A homeostasia mantida pela ao das hormonas que
regulam o metabolismo hdrico, glicdico, lipdico e proteico. Outra funo
reguladora importante na resposta s necessidades, na falta do aporte
nutricional do organismo, infees, trauma, stress e reproduo sexual.
Funo morfognica
As hormonas desempenham um papel importante no crescimento e
desenvolvimento do organismo. Os rgos sexuais masculinos e femininos
desenvolvem-se sob a ao de hormonas, a testosterona e o estradiol
respetivamente.
Funo integrativa
As hormonas so produzidas por vrias glndulas endcrinas e atuam
frequentemente em conjunto para regular uma funo especfica. Um exemplo
disso no metabolismo dos glcidos normal, em que necessita de uma ao
conjunta de hormonas produzidas pelo pncreas (insulina e o glucagon), pela
hipfise (hormona de crescimento), pelas glndulas suprarrenais
(glicocorticides, epinefrina), pela tiroide (T4) e pelas gnadas (estrognio).
110

VI- 1- Amostra e metodologia
A amostra utilizada na maioria dos testes nesta seco soro, mas tambm
plasma para a determinao por exemplo do peptdeo natriurtico cerebral para
avaliar patologias como, enfarte agudo do miocrdio e a insuficincia cardaca
congestiva.
Nesta seco, os ensaios imunoqumicos, com reao entre Ag e o Ac, basearam-
se em mtodos de electroquimiolumiscncia e quimioluminescncia, nos
seguintes equipamentos:

UniCel
Tm
DxI 800 da Beckman Coulter
O UniCelTm DxI 800 utiliza a metodologia de quimioluminiscncia (CLIA).
A CLIA consiste numa reao qumica, que envolve a oxidao de um composto
orgnico (normalmente a fosfatase alcalina) na presena de catalisadores. A luz
emitida a partir do produto instvel formado na reao de oxidao. Os eletres
de um tomo recebem energia, saltam para camadas mais externas e depois
voltam para as mesmas camadas mais internas, libertando energia em forma de
luz. A emisso de fotes luz medida com um luminmetro.

Elecsys

2010 e Cobas e 411, da Roche Diagnostics


O Elecsys

2010 utiliza a tecnologia de deteo por electroquimioluminiscncia.


As reaes qumicas geram luminescncia a partir de um estmulo eltrico, no
qual o quelato de rutnio, juntamente com a tripropilamina, forma intermedirios
eletronicamente excitados que emitem fotes. Esta excitao ocorre devido
transferncia de eletres energticos. A emisso de fotes de luz medida com
um fotomultiplicador.
Estes imunoensaios consistem em dois princpios: o sanduche e o competitivo.
o Princpio sandwich
So utilizados 2 anticorpos, um ligado fase slida e outro marcado com uma
substncia geradora de sinal, que se ligam a substncia em estudo.
111

Em ambos a quantidade de luz produzida diretamente proporcional
quantidade de antignio na amostra do paciente.
Electroquimiolumiscncia
A amostra liga-se ao Ac biotinilado, enquanto o Ac marcado com complexo de
rutnio reage com um stio antignico presente na amostra, formando um
complexo sandwich.
So adicionadas micropartculas revestidas de estreptavidina ao complexo,
ligando-se fase slida pela interao da biotina e da estreptavidina.
A mistura da reao aspirada para a clula de leitura, onde as microparticulas
so fixadas magneticamente superfcie do eltrodo. aplicada uma corrente
eltrica ao eltrodo, induzindo uma emisso quimioluminescente que medida
por um fotomultiplicador.
Quimioluminescncia
A amostra liga-se ao Ac imobilizado na fase slida, enquanto o Ac conjugado
fosfatase alcalina (composto orgnico) reage com um stio antignico presente na
amostra, formando um complexo sanduche. adicionado o substrato
quimioluminescente (Dioxetano), que sofre hidrlise na presena da enzima,
produzindo substncias instveis responsveis pela emisso de luz. A luz gerada
medida num luminmetro.

o Princpio competitivo
Todo o procedimento semelhante ao princpio sanduche, com a diferena de
haver competio entre a substncia presente na amostra e outra marcada com
alguma substncia geradora de sinal. Ao contrrio do princpio do sandwich, a
quantidade de luz produzida inversamente proporcional quantidade de
antignio presente na amostra.
Electroquimiolumiscncia
H competio entre o Ag da amostra com os anticorpos marcados com rutnio
pelo Ag biotinilado.


112

Quimioluminescncia
H competio entre o Ag da amostra e o Ag conjugado fosfatase alcalina,
pelos stios de ligao no Ac especfico.
VI- 2- Anlises efetuadas na seco de Hormonologia
Na seco realiza-se o estudo das vrias hormonas e marcadores tumorais (tabela
XIV).
Tabela XIV: Testes realizados na seco de Hormonologia.
Testes Equipamento Interesse
Folato
DxI 800

Anemias Vitamina B12
Ferritina
Eritropoetina
PSA total (PSA-antignio
especfico da prstata)
PSA livre-interesse: Prstata







DxI 800










Marcadores
Tumorais
CEA (antignio
carcinoembrionrio) interesse:
Carcinomas do Clon, Pulmo e
Mama
CA125(antignio carbohidrato)-
interesse: Carcinomas do ovrio
Endomtrio e Mama.
CA 19.9- interesse: Carcinoma do
Pncreas, Estmago, Vias biliares e
colo-retal
CA 15.3- interesse: Carcinoma da
Mama e Ovrio
AFP (alfa-fetoprotena) interesse:
Clulas germinativas, Carcinoma
hepatocelular
NSE (Enolase Neuro-especfica) -
interesse: Neuroblastoma,
Melanoma

Cobas e 411
Cyfra 21.1- interesse: Carcinoma
do pulmo
CA 72.4- interesse: Cancro gstrico

113

Testes Equipamento Interesse
Mioglobina
DxI 800
Funo
Cardaca Troponina I
BNP (Peptdeo Natriurtico tipo B)
Procalcitonina Elecsys 2010 Funo renal
Vitamina D Elecsys 2010
Metabolismo
sseo
Osteocalcina
PTH (Paratormona) DxI 800
hGH (Hormona do crescimento)
TSH (Hormona estimulante da
tiride)

DxI 800





Funo da Tiroide
T3 (Triiodotironina) livre e total
T4 (Tiroxina) livre e total
Tiroglobulina (Tg) (marcador
tumoral)


Cobas e 411 Anti-Tg (Diagnstico auto-imune
da tiride)
Anti-TPO (Diagnstico auto-imune
da tiride)
TRAb (Diagnstico auto-imune da
tiride)
Elecsys 2010
Progesterona



DxI 800




Fertilidade
Testosterona
FSH (Hormona do folculo
estimulante)
LH (Hormona luteinizante)
Prolactina
-HCG (Hormona Gonadotropina
corinica humana) total
Estradiol
DHEA (Dehidroepiandrosterona)
Cortisol DxI 800 Supra-renais (Sndrome de
Cushing) ACTH (Hormona
adrenocorticrpica)
Elecsys 2010
Insulina DxI 800 Diabetes
Pptido C Elecsys 2010
PAPP-A Kryptor Compact Rastreio pr-natal
-HCG livre
114

VI- 3- Controlo de qualidade interno e externo em Hormonologia
Consiste essencialmente no controlo dirio (interno) e no controlo mensal
(externo) das hormonas e dos marcadores tumorais, realizados a partir das cartas
de Levey-Jennings (cartas de controlo de qualidade com regras padronizadas).

Controlo de qualidade interno
semelhana da seco de Bioqumica, esta seco tambm utiliza materiais de
controlo comerciais, a maioria em 2 nveis, sendo os procedimentos para a sua
utilizao sobreponveis aos descritos anteriormente. Os resultados so avaliados,
utilizando o programa informtico Unity-Real Time.
O controlo interno realizado diariamente e sempre que h necessidade de
avaliar possveis erros nos equipamentos. realizado tambm o controlo de
temperaturas dos frigorficos.

Controlo de qualidade externo
- EQAS da Bio-rad










115

VII- Imunologia
A Imunologia clnica consiste no estudo das respostas do organismo que
fornecem imunidade, ou seja, mecanismos que esto envolvidos na proteo
contra organismos estranhos ao organismo. Apesar da complexidade do sistema
imunolgico, possvel detetar, em laboratrio, certos constituintes do sistema
imunitrio, como os Acs.
O sistema imunolgico tem funes mais amplas do que fornecer, somente,
proteo de microrganismos invasores. Um sistema imune saudvel
fundamental para uma boa sade e, no s, envolve a preveno ou o combate
contra as doenas infeciosas, mas tambm, a proteo do organismo contra
toxinas e tumores. Este sistema, fornece mecanismos de defesas especficas
contra uma variedade de substncias estranhas ao organismo (Ags) que podem
ser vrus, clulas ou molculas proteicas. Este sistema uma organizao
complexa que envolve tecidos, clulas, produtos celulares, mediadores qumicos
biologicamente ativos, que se interagem mutuamente para produzir uma resposta
imune.
O sistema imunolgico consiste em dois tipos de imunidade, a imunidade inata e
a imunidade adquirida. A imunidade inata consiste na ao concertada de
variados tipos celulares, recetores, sistemas de sinalizao e mecanismos
efetores, em que as barreiras epiteliais tm um papel fundamental na proteo do
organismo contra a invaso de agentes patognicos externos. Nestas barreiras, o
reconhecimento direto de diferentes agentes agressores induz a imunidade inata,
que constitui a primeira linha de defesa do organismo, com uma especificidade
de largo espectro. A resposta de imunidade adaptativa, aquela que reconhece e
relembra diferentes Ags. A imunidade especfica caracterizada pela capacidade
de reconhecer, pela resposta especfica e pela memria.
Os testes que avaliam a funo imunolgica so realizados em pacientes com
infees recorrentes ou possuem sintomas que indicam um problema provvel
com o seu sistema imunolgico. Devido sua propriedade nica de reconhecer e
distinguir os vrios Ags intimamente relacionados, os Acs so largamente usados
116

em testes laboratoriais. Alguns dos quais incluem: testes de aglutinao; testes de
inibio; testes de precipitao; tcnicas de anticorpos fluorescentes; testes de
imunoensaios entre outros.
Os Acs usados nos testes imunolgicos podem ser monoclonais ou policlonais.
Os primeiros so Acs com uma especificidade e classe e so derivados de um
clone (mono) ou linha celular. Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos
em laboratrio e so usados como reagentes para diversos kits
imunodiagnsticos. No caso dos anticorpos policlonais, so imunoglobulinas
com mais de um eptopo especfico ou so mais derivados de mais do que uma
linha celular. Os Acs que normalmente esto presentes no soro do indivduo
saudvel ou situaes reativas so policlonais.
Nesta seco de Imunologia e no s, devem-se escolher mtodos baseados na
sensibilidade e especificidade dos mesmos. A especificidade refere-se
habilidade de detetar somente o Ac ou Ag para o qual o teste foi desenvolvido. A
deteo de outras substncias (reao cruzada) diminui a especificidade e pode
causar reaes falsamente positivas. O menor limite de deteo ou a mais baixa
concentrao capaz de ser detetada pelo mtodo refere-se sensibilidade.
VII- 1- Amostra
- Sangue total: soro
- Urina de 24h para a pesquisa da protena de Bence-Jones.
VII- 2- Metodologia
Utilizou-se as vrias tcnicas/metodologias no sector de Imunologia.
VII- 2.1- Tcnicas

Aglutinao

a aglomerao ou agregao de clulas ou partculas devido sua reao com
os Acs. Quando clulas ou partculas (ex. partculas de ltex) tm molculas de
Ag na sua superfcie, vo aglutinar ao reagirem com o Ac especfico. A
aglutinao representa um teste positivo. Uma variao do teste de aglutinao
117

a inibio da aglutinao. Nos testes de inibio, um resultado positivo
indicado pela ausncia de aglutinao.

Fixao do complemento

Trata-se de um mtodo sensvel para a deteo da reao Ag-Ac. No laboratrio
este mtodo aplicado para detetar Acs no soro do paciente. O teste de fixao
de complemento baseado na habilidade das protenas do complemento de
interagir com o Ac e o Ag especfico para causar lise. Esse teste feito em duas
partes, o sistema teste e o sistema indicador. No sistema de teste, o soro do
paciente e o Ag (viral, fngico) reage na presena do complemento. Se o Ac
especfico para o Ag estiver presente, ento o complemento fixado na reao
Ag-Ac e torna-se incapaz de reagir na segunda parte do teste. O sistema
indicador adicionado aos tubos, aps o soro, o complemento e o Ag terem
reagido. Um teste negativo indicado pela hemlise, que no pode ocorrer se o
Ac, na amostra, estiver ausente. A ausncia de hemlise um teste positivo,
indicando a presena de Acs no soro do doente.

Tcnica do anticorpo marcado
Os Acs podem ser marcados por molculas (marcadores). Essas molculas so
ligadas (conjugadas) aos Acs, possibilitando a visualizao da reao. Os
marcadores podem ser corantes, enzimas ou radioistopos. A ligao de
marcadores aos Acs no interfere com a capacidade dos Acs de se ligarem aos
Ags.

Ensaio imunoenzimtico
Envolve sempre um Ag, um Ac especfico para um Ag e um segundo Ac
conjugado a uma enzima. O teste permite a deteo de um Ac especial ou um Ag
na amostra do paciente.
Nota: as tcnicas podem ser quantitativas. Nesse caso, requerem diluies
seriadas de tubos para estimar a concentrao de imunoglobulinas para um dado
118

Ag especfico. A concentrao da imunoglobulina expressa em ttulo que o
recproco da ltima diluio que apresentou reao.
VII- 2.2- Equipamentos automatizados
Capillarys 2
O Capillarys 2 um sistema automatizado que consiste numa eletroforese
capilar, usado na electroforese das protenas sricas, utilizando tubos capilares
para mltiplas e simultneas separaes das seis fraes diferentes: albumina;
1-globulinas; 2-globulinas; 1-globulinas; 2-globulinas e as -globulinas.
Este equipamento permite realizar automaticamente todas as sequncias da
eletroforese, desde o tubo de colheita at a obteno do perfil electrofortico:
identificao da amostra; diluio da amostra; lavagem dos capilares; injeo da
amostra nos capilares; migrao; deteo; tratamento dos resultados e a sua
transmisso informtica dos resultados obtidos.
Esta anlise muito til na deteo de anomalias do perfil proteico.

Sebia
A imunofixao destina-se deteo de protenas, quando detetadas na
eletroforese das protenas. Estas apresentam-se sob a forma de bandas anormais
situadas nas zonas de ou globulinas.
A tcnica divide-se em 4 partes: separao; fixao e imunoprecipitao;
lavagem; colorao. As protenas so separadas por eletroforese em meio
alcalino, sendo depois imunoprecipitadas com antissoros monoespecficos. Os
antissoros usados so: anti-cadeias pesadas IgG, IgA e IgM e as anti-cadeias
leves e . Estes antissoros so colocados no gel em poos para a corrida
electrofortica juntamente com o soro a analisar, de modo a identificar de forma
qualitativa a natureza das bandas monoclonais. Em simultneo h uma corrida de
eletroforese srica a fim de orientar/avaliar na interpretao da imunofixao.
Aps a imunoprecipitao, as protenas que no esto ligadas so removidas por
lavagem e as que esto ligadas so coradas.
119

A existncia de gamapatias monoclonais detetada pelo aparecimento de uma
banda monoclonal, revelada por um antissoro de cadeia pesada e de cadeia leve.
Estas duas bandas tm que ser interpretadas em conjunto com a corrida
electrofortica srica na presena da banda monoclonal na zona das -globulinas.
Siemens BN Prospec
A nefelometria utilizada como mtodo, para o doseamento (anlise
quantitativa) de algumas protenas sricas, das imunoglobulinas IgG, IgA, IgM e
das subclasses IgG e das cadeias leves e cadeias leves livres e . Este mtodo
consiste na medio de luz dispersa a partir do feixe principal, por uma
determinada amostra. Esta tcnica baseia-se na reao de Acs especficos.
Forma-se um complexo, por ex. Ac-imunoglobulina, que dispersa a luz do feixe
incidente e a luz dispersa proporcional concentrao de imunoglobulina
presente no soro.

ImmunoCAP 250 da Phadia Sweden Diagnostics
O ImmunoCAP 250 permite efetuar o estudo dos alergnios atravs do
doseamento das IgEs especficas para um vasto painel de alergnios, utilizando
como metodologia o ensaio imunoenzimtico de fluorescncia. A reao produz
fluorescncia diretamente proporcional quantidade de IgE total ou especfica
existente na amostra.

Zenit RA- autoimunidade
Dependendo do tipo de anlise, o equipamento utiliza os princpios de medio,
por luminescncia ou absorvncia.
o Luminescncia
So utilizados subprodutos de steres de acridnio luminescentes como
marcadores de deteo. H uma reao de oxidao para uma forma excitada, em
que o regresso ao estado de estabilidade acompanhado pela emisso de luz, que
medida em unidade de luz relativa (RLU) pelo luminmetro (integrado no
autoanalisador). Os testes so executados usando o mtodo competitivo ou o
mtodo sandwich.
120

o Absorvncia
As amostras e os reagentes so aspirados de acordo com os parmetros validados
para cada teste e so transferidos para uma cuvete onde sero monitorizadas as
alteraes da absorvncia (densidade tica) durante cada reao em progresso.
As medies so executadas a um comprimento de onda especfico para a
anlise.
A pesquisa de Ac anti-dsDNA; Ac antinucleares; Ac anti-citoplasma dos
neutrfilos (MPO e PR3); Ac anti-gliadina IgA e IgG; IgE especficas; citrulina e
transglutaminase IgA so exemplos de alguns testes realizados no estudo da
autoimunidade no sector de Imunologia.
VII- 3- Anlises efetuadas na seco de Imunologia
Realizaram-se vrias anlises nesta seco de demonstradas na tabela seguinte.

Tabela XV: Testes realizados na seco de Imunologia com o respetivo equipamento.
Testes Equipamento Interesse
Proteinograma Capillarys 2 Perfil proteico
IgG, IgA, IgM Siemens BN Prospec Resposta imunitria
Imunofixao
Cadeias Leves Kappa e Lambda Siemens BN Prospec Gamapatias monoclonais
Imunofixao
C3







Siemens BN Prospec
Protenas do complemento
C4
1-antitripsina Enfisema pulmonar; Cirrose
heptica
Haptoglobina Protena de fase aguda
Ceruloplasmina Glicoprotena heptica que
assegura o transporte de cobre
no plasma. Diagnstico na
doena de Wilson.

Cadeias Leves e Cadeias Leves
livres Kappa e Lambda



Gamapatias monoclonais
121

Testes Equipamento Interesse
IgE Total ImmunoCAP Estudo dos alergnios
IgE especfica
ANA/ENA (screen)
Anticorpos anti: mitocrondiais, anticorpos
das clulas parietais gstricas, msculo liso
(e.g. de anticorpos anti-especfico)


Zenit RA


Autoimunidade

Nesta seco, no mbito dos estudos de autoimunidade, tambm se realiza a
pesquisa de auto-Acs por mtodo de imunofluorescncia indireta em clulas
Hep-2 e cortes de tecidos.
VII- 3.1- Teste de diagnstico rpido para a pesquisa da protena de
Bence-Jones
A protena de Bence Jones uma protena de cadeias leves (lambda ou kappa) de
imunoglobulinas, que se pode observar na urina em caso de mieloma mltiplo,
quando a imunoglobulina monoclonal est degradada em cadeias pesadas (que
no passam para a urina) em cadeias leves. Aparece na urina em 60 a 70% dos
casos de mieloma, sendo a sua presena de mau prognstico.
A seco executa um teste imuno-electrofortico rpido, que realizado a partir
de uma amostra de urina de 24 horas.
VII- 4- Controlo de qualidade interno e externo em Imunologia
Consiste essencialmente no controlo dirio (interno) e no controlo mensal
(externo) dos testes imunolgicos, feitos a partir das cartas de Levey-Jennings
(cartas de controlo de qualidade com regras padronizadas).
O controlo de qualidade interno efetuado com controlo das casas comerciais,
disponibilizados geralmente em 2 ou 3 nveis de concentrao. Nos analisadores
automticos utilizam-se, para a maioria dos parmetros, controlos Bio Rad,
tendo alguns parmetros controlos especficos.
No controlo de qualidade externo efetuado, o EQAS da Bio-rad e o NEQAS.
122

VIII- Bibliografia

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