Biokataliza

in
pridobivanje sekundarnih
metabolitov

Aleš Berlec
Biokataliza
 Definicija
Biokataliza uporablja naravne katalizatorje,
kot so encimi, za izvedbo kemijskih pretvorb
na organskih spojinah. V ta namen se
uporabljajo encimi, ki so delno ali popolno
izolirani, ali pa se nahajajo v živih celicah.
Nobelova nagrada za kemijo, 2001:
William S. Knowles
St Louis, Missouri, USA, and
Ryoji Noyori
Nagoya University, Chikusa, Nagoya, Japan,
"for their work on chirally catalysed hydrogenation reactions"
and the other half to
K. Barry Sharpless
the Scripps Research Institute, La Jolla, California, USA,
"for his work on chirally catalysed oxidation reactions".
 Prednosti
• Encimska selektivnost:
– Kemijska selektivnost
– Regioslektivnost
– Enantioselektivnost
(rutinsko > 99%)
• Encimska aktivnost v “milih” pogojih (pH, temperatura,
vodni medij) – vidik okoljevarstva in “zelene” kemije.
• Možnost katalize številnih reakcij.
• Možnost kombiniranja s kemijsko katalizo.
• Metabolni inženiring – uporaba reakcijske mreže.
 Slabosti
• Nezadostna stabilnost biokatalizatorjev v
izbranem mediju.
• Omejeno število biokatalizatorjev za
želeno reakcijo.
• Dolgi razvojni cikli za biokatalizni proces.
 Interdisciplinarnost
• Mikrobiologija
• Molekularna biologija
• Encimologija
• Biokemija
• Organska kemija
• Procesna kemija
• Kinetika.
• Inženirstvo reakcij
• Na rtovanje reaktorjev
 Reakcije
• Primeri:
– oksidacije,
– redukcije,
– hidrolize,
– hidroksilacije,
– metilacije,
– tvorba C-C vezi,
– izomerizacije.
 Uporabljeni encimi
Tip encima Tip reakcije
lipaze Hidroliza estrov na lipidnih substratih
esteraze Hidroliza estrov, tvorba estrov
proteaze Cepitev peptidne vezi
nitrilaze Hidroliza nitrilov (CN COOH + NH3)
epoksid hidrolaze Hidroliza epoksidov
glikozidaze Hidroliza glikozidne vezi
dehidrogenaze Redukcija aldehidov, ketonov, dvojnih vezi

enolat reduktaze Redukcija a, b-nenasi enih estrov

monooksigenaze Hidroksilacija, epoksidacija
dioksigenaze Oksidativna cepitev kateholov
peroksidaze Peroksidacija, epoksidacija

aldolaze Aldolna reakcija, cepitev aldola

transketolaze
hidroksinitril liaze
glikozil transferaze
(RC(OH)CH2C(O)R)
Prenos keto skupine
Tvorba cianohidrina
R1R2CO + HCN R1R2C(OH)(NH2)
Tvorba glikozidne vezi, sinteza oligosaharidov
Encimski reaktorji
 Konfiguracije encimskih reaktorjev

a) Šaržni (batch) reaktor: najenostavnejši, najcenejši, kadar ni potrebe po recikliranju biokatalizatorja.

b) Šaržni reaktor z ultrafiltracijo: recikliranje biokatalizatorja z ultrafiltracijo, omogo a ve ponovitev šarž.
c) Reaktor s fiksnimi delci (fixed-bed): imobilizacija biokatalizatorja na sferi ne delce.
d) Reaktor s fluidnimi delci (fluid bed): pove an pretok teko e faze, kar zmanjša lokalne gradiente v pH-ju in
temperaturi.
e) Membranski reaktor z enosmerno flitracijo: membrana prepre uje prehod biokatalizatorja, omogo a pa prehod
substrata in produkta.
f) Reciklirni reaktor ali reaktor z zanko: prehod teko e faze preko fiksnih delcev ali preko tangencialnega
membranskega filtra.
Na ini zadrževanja biokatalizatorja
 Viri biokatalizatorjev
• Mikroorganizmi; živali in rastline le 10%.
• Viri mikroorganizmov: naklju no iskanje,
zbirke kultur (npr. ATCC).
• Ekstremofili:
– Temperatura
– Koncentracija soli
– pH
– pritisk
 Izboljšave biokatalizatorjev
• Mikroorganizmi:
– Izboljšave sevov (spontane in inducirane mutacije).
– In vivo selekcijski pritisk.
– Vpliv na metabolne poti in metabolno neravnovesje.
– Pomen genomike.
– Visoko-zmogljivostno rešetanje (“high-throughput
screening”) – uporaba robotov in ploš s 96 ali 384
reakcijskimi prostori.

• Encimi:
– Proteinski inženiring.
– Uporaba rekombinantne DNA tehnologije – ciljana evolucija.
 Proteinski inženiring
Na rtna racionalna zamenjava
posameznih aminokislin v
encimu.
• Poznavanje nukleotidnega /
aminokislinskega zaporedja.
• Poznavanje 3D strukture.
• Poznavanje mehanizma delovanja.
• Izbira potencialnih AK za
zamenjavo.
• To kovna mutageneza na nivoju
DNA.
• Pridobivanje in testiranje
rekombinantnega proteina.
Usmerjena evolucija

Mutageneza (“error prone PCR”,

premeš anje DNA)
 Uporaba nekonvencionalnih topil
• Encimi so aktivni tudi v nevodnih medijih.
• Aktivnost je lahko celo boljša v hidrofobnih
topilih kot v hidrofilnih.
• Prednosti:
– Ve ja topnost reaktantov.
– Premik reakcijskega ravnotežja.
– Enostavnejše lo evanje organskih topil.
– Boljša stabilnost encimov.
– Spremenjena selektivnost (substratna, enantio-,
kemo-, regio-)
Uporaba biokatalize v farmaciji
 EFEDRIN Efedrin PSEVDOEFEDRIN

• Efedrin je alkaloid, ki ga skupaj z njegovim opti nim izomerom, psevdoefedrinom

najdemo v rastlinah iz rodu Ephedra.
• Deluje simpatikomimeti no. Za razliko od psevdoefedrina mo neje deluje na CŽS.
Uporablja se kot stimulant, zmanjšuje apetit, izboljšuje koncentracijo in deluje kot
dekongestiv.
• Strukturno je soroden sinteti nima derivtoma amfetaminu in metamfetaminu.
• Uporaba piruvat dekarboksilaze (Saccharomyces cerevisiae) pri sintezi iz
benzaldehida in piruvata.
Antihiperholesterolemiki – inhibitorji
HMG-CoA reduktaze
(3R, 5S)-
dihidroksiheksanoat

LOVASTATIN PRAVASTATIN FLUVSTATIN ATORVASTATIN

V celoti produkta fermentacije. Sinteza klju nega intermediata

Alkoholna dehidrogenaza iz Izboljšana sintezna pot z

Lactobacillus brevis nitrilazo.
 Dorzolamid
• Inhibitor karbonske
anhidraze – uporaba proti
glavkomu.
• Stereospecifi na redukcija
intermediata s kvasovkami
Rhodotorula rubra MY2169.
 Sekundarni metaboliti
pridobivanje in pomen v farmaciji
 Delitev metabolitov
• Primarni: nujni za celi no rast, skupni številnim živim
organizmom, nastajajo med normalno rastjo
(aminokisline, proteini, ogljikovi hidrati, vitamini,
polisaharidi, etanol...)
 Delitev metabolitov
• Sekundarni: pogrešljivi, niso vklju eni v celi ni
metabolizem, omejeni na ozko skupino živih organizmov,
nastajajo pod stresnimi pogoji npr. ob pomanjkanju hranil
(antibiotiki, pigmenti, toksini, ekološki efektorji, feromoni,
encimski inhibitorji, pesticidi, protitumorske u inkovine).

• Neustreznost izraza, umetna delitev: združevanje

velikega števila kemijsko heterogenih spojin, meja med
skupina ni lahko dolo iti, nakazuje manjši pomen.
 Izvor
• Rastline farmakognozija
• Bakterije
• Glive
 Pomen v farmaciji
• Antibiotiki
• Steroli
• Vitamini
Biosinteza antibiotikov
 Protibakterijske u inkovine
• Naravne – ve ina iz G+,
filamentoznih bakterij iz rodu
Streptomyces.
• Polsintezne – sintezno
pridobljeni derivati naravnih
spojin
• Sintezne – v celoti pridobljene
z organsko sintezo.
Protibakterijske
u inkovine
 Prodaja antibiotikov v letu 1995,
tipi ne u inkovine in uporaba:

Glavni razredi
antibiotikov
• -laktamski antibiotiki
– Penicilini
– Cefalosporini
• Tetraciklini
• Makrolidni antibiotiki
• Aminoglikozidni antibiotiki
Prodaja antibiotikov v letu 2006:
• Glikopeptidi
• Kinoloni
• Ostali
 Mehanizem delovanja
• Bakteriostati no – mo no
zavira rast bakterij.
• Baktericidno – ubije
bakterije.

• Bakterijske tar e
antibiotikov:
– Sinteza celi ne stene.
– Biosinteza proteinov.
– Podvojevanje in
popravljanje DNA.
– Biosinteza folata.
– Ostalo (npr. tvorba por) SCAN3
• Selektivna toksi nost –
uporabi se razlika med
bakterijsko in sesalsko
celico – zato ni toksi nosti
za loveka.
Sinteza celi ne stene
Biosinteza proteinov
Podvojevanje in popravljanje DNA
Biosinteza folata in ostali
mehanizmi
 Tipi biosinteze antibiotikov
• Poliketidna biosinteza.
• Biosinteza neribosomskih peptidnih
antibiotikov.
• Biosinteza ostalih tipov.
 Poliketidna biosinteza
• Tetraciklini in makrolidni antibiotiki.
• Encimi poliketidne sintaze:
– Tip I: razli ne domene tvorijo velik, multidomenski kompleks
(enoten protein) – eritromicin.
– Tip II: domene (posamezni proteini) so povezane ohlapneje oz.
se prehodno povezujejo pri posameznih katalitskih korakih –
tetraciklin.
• Geni za encime se nahajajo v obliki klastrov pri
evkariontih oz. operonov pri bakterijah.
• Pretvorba kratkoverižnih acil-S-CoA tioestrov v
dolgoverižne produkte v zaporedju ponavljajo ih
korakov.
• “Encimski teko i trak”
Kataliti ne domene
• ACP – acil-nosilni protein
• AT – aciltransferazna domena
• KS – ketosintazna domena
• KR – ketoreduktazna domena
• DH – dehidratazna domena
• ER – enoilreduktazna domena
Biosinteza doksorubicina
Biosinteza 6-deoksieritronolida B
(aglikona eritromicina)
Pretvorba 6-deoksieritronolida B v
eritromicin B
 Neribosomski peptidni antibiotiki
• -laktamski antibiotiki
(penicilini (1), cefalosporini (2))
• Tirocidin in gramicidin S ( -laktamski obro rde e)

• Bacitracin
• Vankomicin (po naknadni
modifikaciji)
Biosinteza neribosomskih peptidnih
antibiotikov
• Neribosomske peptidne sintetaze – analogne
poliketidnim sintazam tipa I
• Multidomenski encimi, organizirani v module, ki tvorijo
eno ali ve proteinskih podenot.
• Primer: ciklosporin sintetaza: 1.5 MDa, 43 domen, 11
modulov (za vsako AK eden)
• Tipi kataliti nih domen:
– PCP: peptidil-nosilni protein
– A: adenilacijska domena – izbor in aktivacija AK
– C: kondenzacijska domena – tvorba peptidne vezi
– TE: tioesterazna domena – zaklju itev verige (molekule) z
deacilacijo
– E: epimerizacijska domena – epimerizacija AK
 Uvedba neproteinogenih
aminokislin
• Posledica široke specifi nosti adenilacijske domene.
• Preko 100 razli nih aminokislin, med njimi tudi -, -, in
-AK.
 Biosinteza penicilinov in
cefalosporinov
• Tripeptidni prekurzor ACV (L-aminoadipil-L-cisteinil-D-valin)
• Izopenicilin N sintaza (Fe2+ encim brez hema)
• Tvorba izopenicilina N in deacetoksicefalosporina C
 Pridobivanje polsinteznih derivatov
penicilinov in cefalosporinov
• Intermediata, pridobljena iz produktov mikrobne fermentacije:
– 6-aminopenicilanska kislina (6-APA)
– 7-aminodeacetilcefalosporanska kislina (7-DACA)
• Encim penicilin amidaza
Pridobivanje polsinteznih derivatov
penicilinov in cefalosporinov
• Pridobivanje ampicilina,
amoksicilina, cefaklora
in ostalih derivatov iz
intermediatov.
• Encim penicilin acilaza.
 Biosinteze ostalih tipov
• Aminoglikozidni antibiotiki (streptomicin,
kanamicin, gentamicin A)
• Produkti sekundarnega metabolizma ogljikovih
hidratov, pogosti pri aktinomicetah.
• Bakteriocini – peptidni antibiotiki
– Lantibiotiki – postranslacijsko modificirani antibakterijski
peptidi:
• tvorba por v celi ni steni
• ribosomsko sintetizirani
• Lantionin: neproteinogena AK
• Nisin: prehranski konzervans

Prekurzor nisina

Nisin
Biosinteza steroidov
 Steroidi
• Steroidi so strukturno
derivati
ciklopentanoperhidrofe-
nantrena (sterana).
• Delovanje:
– Protivnetno
– Imunosupresivno
– Progestacijsko
– Diureti no
– Anaboli no
– Kontraceptivno
– Zdravljenje raka prostate
in raka na prsih
– …
• Mehanizem: vezava na
znotrajceli ne receptorje,
ki delujejo kot
transkripcijski faktorji in
regulirajo izražanje genov.
 Steroidi
• 1950: Odkritje 11 -hidroksilacijskega delovanja pri vrsti
Rhizopus.
• Danes:
– Hidroksilacije (uvedba OH)

– 1-dehidrogenacije (tvorba dvojne vezi 4,5 na obro u A)

– Cepitve na stranski verigi
• Kombiniranje kemijskega in biokataliznega pristopa.
• Slaba topnost steroidov – uporaba nekonvencionalnih
reakcijskih medijev pri biokatalizi – organska topila,
površinsko-aktivne snovi, dodatki.
 Steroidi
• Izhodne spojine:
– Fitosteroli (stigmasterol,
-sitosterol, kampestrol)
– Sapogenini (diosgenin,
hekogenin, solasodin)
– Holesterol iz živalskih
maš ob.
 Steroidi
Splošna shema pretvorb:
------- kemijska pretvorba
–––– biokataliza
6 -metil-prednizolon
Vitamini
 Uvod
• Vitamini so organske
spojine, ki jih organizem
sam ne more tvoriti in jih
mora zato pridobiti iz okolja
s prehrano.
• Vitamini imajo razli ne
biološke funkcije:
– Hormoni (vitamin D)
– Antioksidanti (vitamin E)
– Prekurzorji za kofaktorje
encimov – koencimi (vitamini B
kompleksa).
 Delitev
• Vitamine delimo na vodotopne in topne v maš obah:
– Vodotopni:
• Vitamin B1 (tiamin)
• Vitamin B2 (riboflavin)
• Vitamin B3 (niacin, niacinamid)
• Vitamin B5 (pantotenska kislina)
• Vitamin B6 (piridoksin, piridoksamin, piridoksal)
• Vitamin B7 (biotin)
• Vitamin B9 (folna kislina, folinska kislina)
• Vitamin B12 (cianokobalamin, hidroksikobalamin, metilkobalamin)
• Vitamin C (askorbinska kislina)
– Topni v maš obah:
• Vitamin A (retinoidi - retinol, karotenoidi)
• Vitamin D (ergokalciferol, holekalciferol)
• Vitamin E (tokoferoli, tokotrienoli)
• Vitamin K (filokinon, menakinon)
 Vitamin C
• Pomanjkanje povzro a skorbut.
• Deluje kot antioksidant in zmanjšuje
oksidativni stres.
• Deluje kot elektron-donor za
razli ne encime.
• Sodeluje pri hidroksilaciji kolagena,
sintezi karnitina, pretvorbi dopamina
v noradrenalin, vpliva na stabilnost
peptidnih hormonov in metabolizem
tirozina.
• Sinteza askorbinske kisline je bila
predstavljena l. 1934 in je
vklju evala fermentacijsko stopnjo
za pretvorbo D-sorbitola v L-
sorbozo (“Reichsteinov proces”). Ta
še danes predstavlja osnovo za askorbinska kislina
industrijsko proizvodnjo (80 000
ton/leto).
Biosinteza vitamina C
 Vitamin B2

• Sestavina
kofaktorjev FAD
in FMN. riboflavin

• Pomemben pri
številnih celi nih
procesih, zlasti
energetskem
metabolizmu.
FMN – flavin
mononukleotid –
FAD – flavin adenin
kofaktor
dinukleotid – kofaktor
oksidoreduktaz, npr.
številnih oksidoreduktaz.
NADH dehidrogenaze
 Biosinteza
riboflavina v
bakteriji Bacillus
subtilis in glivi
Ashbya gossypii

Okrajšave:
 Vitamin B12

• Pomanjkanje povzro a
megaloblastno anemijo.
• Kofaktor encimov
metilmalonil koencim A
mutaze (MUT) in 5-
metiltetrahidrofolate
homocistein
metiltransferaze (MTR), ki
sodelujeta pri premestitvah
na ogljikovem skeletu in
prenosu metilne skupine.
 Biosinteza vitamina B-12

• Omejena na mikroorganizme.
• Sodeluje ve kot 30 genov.
• Aerobna in anaerobna biosintezna pot.
• Sinteza tetrapirolnih derivatov iz C-5
skeleta glutamata ali iz C-4 skeleta
sukcinil-CoA in glicina.