Universidad Nacional Autnoma de Mxico

Facultad de Qumica
Laboratorio Inmunologa General
Cervantes Mendoza Antonio Artemio
Ramrez Rodrguez Abraham
Schmolka Cmara Ana
Grupo: 1 !uipo: "
PRCTICA 9: Anlisis de inmunoabsorcin en!imtica "#LI$A%&
I'TR()*CCI+'
#a t$cnica inmunoenzimtica #%SA &nz'me(#linked %mmunosorbent Assa') *orma parte de
a!uellas reacciones serol+gicas !ue utilizan con,ugados para poder visualizar la reacci+n
antgeno(anticuerpo-
l #%SA se basa en el uso de antgenos o anticuerpos marcados con una enzima. de *orma
!ue los con,ugados resultantes tengan actividad tanto inmunol+gica como enzimtica- Al estar
uno de los componentes &antgeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado
sobre un soporte &inmunoadsorbente) la reacci+n antgeno(anticuerpo !uedar inmovilizada '.
por tanto. ser *cilmente revelada mediante la adici+n de un substrato especi*ico !ue al actuar
la enzima producir un color observable a simple vista o cuanti*icable mediante el uso de un
espectro*ot+metro o un colormetro-
n la actualidad el #%SA es uno de los m$todos ms utilizados para el diagn+stico serol+gico
de distintas en*ermedades in*ecciosas. ' es la t$cnica ms recomendada para el estudio de
poblaciones- Se han adaptado di*erentes tipos de #%SA tanto para la detecci+n de antgenos
como de anticuerpos-
#os di*erentes tipos de #%SA son los !ue se enumeran a continuaci+n:
/ Anticuerpos marcados:
#%SA 0irecto
#%SA %ndirecto
#%SA snd1ich:
( 0oble &0AS)
( 2eter+logo &2A0AS)
/ Antgeno marcado
#%SA competitivo
#LI$A Indirecto&
Consiste en la adsorci+n pasiva de un Ag sobre la placa ' luego la adici+n del suero donde se
buscan los Ac3s espec*icos. posteriormente a4adir un segundo Ac anti(%gG !ue lleva con,ugada
la enzima-
1
Consta de las siguientes etapas:
/ 5i,aci+n al soporte insoluble de antgenos espec*icos para los anticuerpos ob,eto de estudio-
#avado para eliminar los antgenos *i,ados de*icientemente o no *i,ados-
/ Adici+n del suero problema. de tal *orma !ue sus anticuerpos reaccionarn espec*icamente
con los antgenos *i,ados al soporte- #avado para eliminar los anticuerpos marcados !ue no
ha'an reaccionado-
/ Adici+n de anti(anticuerpos con,ugados con una enzima. los cuales reaccionan con los
anticuerpos espec*icos a4adidos en el paso anterior ' !ue se encuentran *i,ados a los
antgenos- #avado para eliminar los anti(anticuerpos marcados !ue no ha'an reaccionado-
/ Adici+n de un substrato sobre el !ue sea capaz de actuar la enzima marcadora- Se puede
parar la reacci+n si se desea-
/ #ectura visual o colorim$trica del producto *inal coloreado-

2

(,-#TI.(
%denti*icar el tipo de anticuerpo presente en el suero problema obtenido previamente del
cone,o inmunizado-
/AT#RIAL 0 #Q*IP(
/aterial:
Gradilla
6 tubos de ensa'e 17 8 69
Micropipetas de 1:: ' 1::: ;#
<untas para micropipetas de 1:: ' 1::: ;#
<laca de #%SA
#1ui2o:
spectro*ot+metro
Reacti3os:
Suero problema
=lo!ueador &leche entera)
Agua t1een 7: :-:1>
Sustrato orto*enilendiamina &?0<)
nzima pero@idasa
PR(C#)I/I#'T(
3
1-( 5i,ar los antgenos espec*icos &humano(9. caballo(A. bovino(6) en los pozos de la placa de
#%SA-
7-( Realizar diluciones del suero rpoblema &1:1: tubo A. 1:7: tubo =. 1:B: tubo C. 1:C: tubo 0.
1:A: tubo . 1:D7: tubo 5. 1:AB: tubo G):
<rimera diluci+n &tubo A) 6: ;# de suero ms AD: ;# de blo!ueo-
n tubo = poner D9: ;# de tubo A ms D9: de blo!ueo-
n tubo C poner D9: ;# de tubo = ms D9: de blo!ueo- E as sucesivamente hasta tubo
G-
B-( ti!uetar placa de acuerdo al antgeno adherido &antgeno de humano. antgeno de caballo
' de bovino) ' al tubo de diluci+n-
A-( Agregar a cada pozo 1:: ;# de blo!ueador ' esperar B9 minutos-
6-( #avar con agua F1een D veces-
9-( #lenar pozos con 1:: ;# de cada diluci+n &A. =. C. 0. 5. G)- Al pozo 2 solo se agrega
blo!ueador e incubar D: minutos-
1:-( #avar D veces con agua F1een-
11-( Agregar anticuerpo secundario e incubar D: minutos-
17-( #avar D veces con agua F1een-
1D-( Agregar sustrato &?<0) ms cido sul*Grico e incubar 1: minutos-
1B-( 0eterminar absorbancia-
R#$*LTA)($
Tabla 4& Absorbancias

$*#R(
5*/A'(
$*#R(
CA,ALL(
$*#R(
,(.I'(
)IL*CI('#$ 6 7 8
A :-17D :-1"D :-:"6
, :-1:1 :-161 :-:69
C :-:9C :-17B :-:BA
) :-::" :-:CA :-:7A
# :-:1C :-:CB :-:97
F :-:B9 :-:A6 :-:BA
G :-:A7 :-:69 :-:B"
5 "blo1ueo% :-:BA :-:6C :-:B6
4

n las diluciones A. = C. 0 ' se obtuvieron valores de absorbancia ma'ores !ue el control
&pozo 2). pues el color es ms intenso debido a !ue se lograron *i,ar los comple,os con la
enzima. la cual pudo reaccionar con el sustrato- <or otro lado se observaron absorbancias
menores al control en los pozos 5 ' G pues a!u la cantidad de anticuerpo al ser menor. no
logr+ adherirse al antgeno del pozo. ' al no agregarse el anticuerpo tampoco la enzima. por lo
!ue no reaccion+ con el sustrato-
C('CL*$I('#$
Se logr+ con*irmar lo !ue en teora se saba del suero obtenido a partir de nuestro cone,o
inmunizado. al cual se le administr+ suero de caballo generando as anticuerpos anti(caballo-
n la columna nGmero A. donde se *i,+ el antgeno espec*ico para el anticuerpo anti(caballo se
observ+ un color ms intenso respecto a las columnas donde contenan el antgeno espec*ico
para anticuerpos anti( humano ' anti(bovino- <or lo tanto. el suero contiene en ma'or
proporci+n anticuerpos anti(caballo-
l anlisis revela !ue el suero obtenido tiene anticuerpos anti(caballo. 'a !ue en el pozo A. el
cual contiene antgenos espec*icos para el anticuerpo anteriormente mencionado. se observ+
color amarillo. debido a !ue el comple,o anticuerpo secundario &%gG) H enzima &pero@idasa)
!ued+ adherido al anticuerpo primario &anti(caballo) ' este a su vez al antgeno- Al reaccionar el
sustrato &orto*enilendiamina) se obtuvo un producto !ue emite color amarillo-
,ibliogra9a:
- Ro,as spinosa ?scar- %nmunologa &de memoria)- 7::A- DI edici+n- M$@ico- <ginas consultadas: 77C H
7D:-
- (Jindt K- F-. Goldsb' R- A- ?sborne =- A- %nmunologa de Jub'- Mc Gra12ill. AI edici+n- 7::6- spa4a-
<gs- consultadas: 7D: H 7B9-
- (Rodak 5-=- 2ematologa: *undamentos ' aplicaciones clnicas- M$dica <anamericana. 7L edici+n- =uenos
aires. 7::9- <gs- Consultadas: 199 H 1A:. 1AD H 1A6-
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