2 http://pt.scribd.

com/doc/62732999/legislacao-leite-Brasil

EXAME BACTERIOLGICO DO LEITE

1. OBJETIVOS
Dominar tcnicas de exames bacteriolgicos de leite;
Avaliar a qualidade microbiolgica do leite pasteurizado tipo C;
Conceito de Unidade Formadora de Colnia (U.F.C.);
Metodologia das diluies seriadas para amostras de alimentos;
Metodologia de contagem em placas para a determinao da concentrao
de microrganismos aerbios e anaerbios facultativos mesfilos em
alimentos.

2. FUNDAMENTOS TERICOS
2.1 O LEITE
O leite est presente na alimentao de um grande nmero de pessoas seja
pelo consumo direto ou como derivados (queijos, iogurtes etc.). um dos
Principais

Composio

Componentes

Mdia (%)

alimentos mais completos, com uma variedade
de nutrientes indispensveis para o crescimento,
desenvolvimento

e

manuteno

de

nosso

gua

87,0

organismo. Entre estes nutrientes, destacam-se

Protena

3,4

as protenas, vitaminas do complexo B e

Minerais

0,8

Gordura

3,9

essenciais so encontrados nas protenas do

Lactose

4,8

leite, o que caracteriza o mesmo como sendo de

minerais, como o clcio, sdio, potssio e
magnsio. Um grande nmero de aminocidos

alto valor biolgico (Tabela).
Antes da comercializao e consumo, necessrio que o leite passe por
tratamentos trmicos especficos, com o objetivo de eliminar contaminaes
por
microrganismos causadores de doenas. Os distintos processos trmicos e os
tipos de embalagens utilizadas que so responsveis pelas diferenas nas
formas de armazenagem e prazos de validade do leite. Quando compramos
leite
para consumo, encontramos o mesmo como pasteurizado (saquinho) ou UHT

3

(caixinha), tambm conhecido como leite longa vida. A pasteurizao pode ser
utilizada para produzir o leite para consumo embalado em saquinhos ou para
sua
industrializao na forma de derivados. Este consiste em elevar sua
temperatura
a 72-75C, por um perodo entre 12 a 15 segundos e depois mantido sob
refrigerao em torno de 4C. Isso minimiza os possveis riscos sade com
mnimas alteraes qumicas e sensoriais, sendo adequado para o consumo
humano. O leite pasteurizado possui trs classificaes, sendo elas A, Be
C.
O leite tipo A caracterizado por um sistema de ordenha mecnica e em
circuito fechado, com salas de ordenha padronizadas. Sua refrigerao
imediata
e o processo de pasteurizao e embalagem ocorre todo na propriedade rural.
Este processo garante um mnimo risco de contato humano dentre os leites
pasteurizados e vivel apenas em grandes produes. O leite tipo B difere do
A,
pois recolhido na propriedade rural em caminhes tanques e ser
pasteurizado
e embalado em uma indstria. As caractersticas de sala de ordenha so as
mesmas que para o leite tipo A. J para o leite tipo C, a ordenha pode ser
manual
ou mecnica. O leite ser armazenado em tanques refrigerados antes de
seguir
para o laticnio onde ser pasteurizado e embalado. Em todos os sistemas de
produo, a inspeo e o controle de qualidade esto presentes, s que o
padro
de qualidade exigido maior para o leite tipo A, seguido pelos leites tipo B e
tipo
C. As diferenas no padro de qualidade so percebidas pelo consumidor
atravs
do preo de venda dos produtos no mercado. Alm da pasteurizao do leite,
a
outra o processo UHT (um tratamento a ultra alta temperatura). Este
processamento submete o leite a uma temperatura em torno de 130C, por um
perodo em torno de 4 segundos, sendo imediatamente resfriado a
temperatura
inferior a 32C. O leite diretamente embalado em um equipamento
automatizado
em embalagens estreis e hermeticamente fechadas, evitando assim contato
externo com o produto e tambm sua contaminao.
A legislao brasileira para o leite na origem (leite cru ou leite in natura) a
mesma, independente se este ser pasteurizado ou passar por processo
UHT.
A diferena entre o leite vendido em sacos plsticos e o vendido em caixas,
conhecidos popularmente como saquinho e caixinha, est basicamente no
processamento. A diferena da temperatura utilizada o que determina um
maior

4

ou menor prazo de validade e tambm interfere em algumas alteraes no
leite.
Muitas literaturas citam que o leite pasteurizado mantm suas caractersticas
originais enquanto o longa vida, devido s altas temperaturas a que
submetido,
pode acabar perdendo ou tendo a disponibilidade de alguns nutrientes
reduzida. A
vantagem do leite longa vida, por outro lado, o prazo de validade maior e o
fato
de no necessitar de refrigerao. Sendo assim, tanto o consumo de leite de
caixinha como o de saquinho, pode trazer grandes benefcios sade e seu
consumo seguro, cabendo ao consumidor escolha do leite mais adequado
s
suas necessidades.
2.2 - TIPOS DE LEITE
Existem no mercado, atualmente, vrios tipos de Leite Longa Vida. As
diferenas so em relao ao teor de gordura ou ingredientes adicionados ao
contedo: diferentes tipos de gordura.
De acordo com o Regulamento Tcnico de Identidade e Qualidade do Leite
UHT, o leite recebe diferentes denominaes conforme o seu teor de gordura.
Teor de

Tipo de Leite

Gordura

Integral

Mnimo de 3%

Semidesnatado

De 2,9 a 0,6%*

Desnatado

Mximo de 0,5%

* dependendo do fabricante

Leite com lactose reduzida
Leite com clcio
Leite com ferro
Leite com vitaminas
Outros leites enriquecidos
Leite esterilizado
Leite pasteurizado

5

2.3 NOVOS PARMETROS DO LEITE (NORMA N62/2011)
A preocupao, no Brasil, com a qualidade dos alimentos de origem
animal, como o leite e seus derivados, tomou forma de lei em 29 de maro de
1952, com a aprovao, pelo ento presidente Getlio Vargas, do decreto n
30.691, sancionando o Regulamento de Inspeo Industrial e Sanitria de
Produtos de Origem Animal (RIISPOA), elaborado em 1950 e em vigor at os
dias
atuais. Esse regulamento sofreu algumas alteraes no decorrer dos anos,
sendo
as mais importantes introduzidas em funo da adeso do Brasil ao Tratado
de
Assuno, que criou o Mercado Comum do Sul MERCOSUL4. Vrios
aperfeioamentos

j

foram

feitos,

por

exemplo,

desde

a

Normativa

n51/2002,passou ser obrigatrio a contagem de clulas somticas (CCS) e a
contagem padro em placas (CCP) no leite cru. Agora a legislao em vigor
a
Normativa N 62 de 29 de dezembro de 2011 realizadas pelo Ministrio da
Agricultura, Pecuria e Abastecimento, aplicvel somente ao leite de vaca. De
acordo com a nova Normativa, o procedimento Especfico para o Controle de
Qualidade da Matria-Prima estabelece os valores da Contagem padro em
placas (UFC/mL) e Nmeros mais provveis (NMP/mL) para coliformes totais
(30/35C) e termotolerantes (45C).
Tabela 1: Leite Cru Refrigerado tipo A Integral:

Tabela 2: Leite Pasteurizado tipo A

6

2.4 - ETAPAS DO PROCESSAMENTO DO LEITE: PASTEURIZAO X UHT
(VANTAGENS E DESVANTAGENS)

Pasteurizao: um tratamento trmico brando. No leite se usa 75 C/15 s.
Modifica pouco o leite, mas como sobrevivem algumas bactrias, tem que ser
refrigerada e dura poucos dias em geladeira. O leite cru A, B e C so
submetidos
a esse tratamento para originar o chamado leite de saquinho. O processo
elimina 99,95% das bactrias. Pode parecer muito. Mas se o leite for muito
contaminado, o que acontece quando o leite cru no refrigerado aps a
ordenha, a populao pode ser to grande que 0,05% ainda muito. Exemplo,
se
o leite cru tiver 10 milhes de bactrias/mL, esses 0,05% de sobreviventes
sero
5 mil bactrias/mL no leite pasteurizado.
Longa Vida: um tratamento trmico muito mais enrgico. O leite aquecido a
130 C-150 C/3 segundos. Esse tratamento to eficiente que mata todas as
bactrias do leite. O leite o de caixinha, e como ele envasado em
ambiente
estril, o leite no estraga. princpio semelhante conservao de
sardinhas,
salsichas, ervilhas em latas. Tambm temos produtos de caixinha como
molhos
de tomates, creme de leite, milho, etc. Como no tem bactrias, o leite se
conserva fechado na temperatura ambiente, s aps a abertura se contamina
pelo ar e deve ser mantido refrigerado.

Processamento do Leite Pasteurizado
H

dois

processos

de

pasteurizao

mais

comumente

usados:

pasteurizao lenta e pasteurizao rpida.

Pasteurizao Lenta
Consiste no aquecimento do leite em tanque cilndrico-vertical, de parede
dupla,
munido de agitador. Aquece-se o leite, com agitao constante, a 65 C e
mantlo nessa temperatura por 30 minutos. O aquecimento feito atravs de
gua

7

quente circulando nas paredes duplas do aparelho. Em seguida resfria-se a 4 -
5
C, atravs da circulao de gua gelada nas paredes duplas do aparelho. Este
tipo de pasteurizao utilizado somente por pequenas indstrias, pois se
trata
de um processo mais demorado.
Pasteurizao Rpida
Consiste no aquecimento do leite em tanque cilndrico-vertical, de parede
dupla,
munido de agitador. O aparelho utilizado consta de um conjunto de placas,
todo
em ao inoxidvel. O leite aquecido e resfriado circulando entre as placas,
em
camadas muito finas, em circuito fechado, ao abrigo de ar e da luz sob a
presso,
temperatura de aquecimento de 71 a 75C, durante 15 segundos e resfriado
com gua gelada a uma temperatura de 2 a 3C.

Processamento de leite UHT
O processamento direto de leite UHT pode ser realizado de dois modos:
Atravs de sistemas de injeo, nos quais o vapor injetado no leite
a altas presses.
Atravs de infuso, no qual o leite pulverizado no vapor.
Em alguns dos processos, importante referir que neste mtodo o
leite entra em contacto direto com a gua, o que caracteriza o
mtodo

direto

ao

invs

do

mtodo

indireto.

ORDENHA
A

ordenha

pode

ser

feita



mo

ou

mecanicamente,

Antes de se iniciar a ordenha deve-se verificar se as tetas e os beres se
encontram limpos e se o leite tem bom aspecto, caso contrrio dever ser
rejeitado.
Uma vez que a ordenha deve ser higinica tambm o ordenhador deve
usar roupas e proteo limpas.

8

Devem ser rejeitados os primeiros jatos de leite, fazendo a ordenha total e
ininterrupta com esgotamento de todas as tetas.
Aps a ordenha o leite deve ser armazenado ou enviado para o local de
processamento em recipientes apropriados e fechados.
RESFRIAMENTO
O leite recm ordenhado deve ser rapidamente resfriado a temperatura na
ordem
dos

6C,

dependendo

do

tempo

de

coleta

(diria

ou

no

diria).

No caso de ser diria pode ser resfriamento a 8C. O resfriamento deve ser
feito
em tanques de ao inox. O perodo de reteno e armazenamento do leite
resfriamento no deve ser superior a 48 horas, para prevenir possveis
degradaes enzimticas e oxidao do leite baixa temperatura.
TRANSPORTE
O transporte do leite pode ser feito em carros-tanques ou em lates, sendo
prefervel que seja realizado em carros-tanque uma vez que se consegue uma
maior manuteno da qualidade da matria-prima.
No transporte o leite deve ser mantido a uma temperatura no superior a
10C, a no ser que tenha sido recolhido nas duas horas seguintes ordenha.
TERMIZAO
Aps ser recebido e medido, o leite resfriamento a temperatura inferior a
4C e armazenado para posteriormente ser processado.
No que diz respeito termizao propriamente dita esta consiste num
tratamento trmico (aquecimento) num permutador de placas a 65C durante
15
segundos.
Deste modo destri-se a maior parte da carga microbiana.
CLARIFICAO/DESNATE
Nesta etapa do processamento, as impurezas do leite so eliminadas
atravs de uma centrifugadora (2000-3000 rpm). Nestas impurezas incluem-se
partculas vegetais, plos, terra e bactrias.

9

Aps uma primeira centrifugao, volta-se a centrifugar o leite (5000-7000
rpm) uma vez que a menor densidade da gordura em relao ao leite
desnatado
permite a separao (em leite e creme).
NORMALIZAO
Aps a separao dos dois componentes (leite e creme) estes voltam a ser
misturados nas propores determinadas de modo a que em funo dos
teores
de gordura pretendidos se separe o leite em 3 tipos.
O leite magro, que tem um teor mximo de gordura de 0,5%.
O leite semidesnatado que tem um teor mnimo de gordura de 0,6 %
a 29%
O leite padronizado tem um teor de gordura de 3,0%.
HOMOGENEIZAO
Processo que consiste na distribuio uniforme da gordura de modo a que
no haja formao de nata, ou seja, vai haver uma desagregao de todos os
glbulos da gordura que foram agrupados no desnate. Para isso utilizam-se
homogeneizadores onde o leite pressurizado por uma bomba de pisto
(100250 bar).
Este processo melhora a estabilidade e consistncia do leite.
ULTRAPASTEURIZAO
este o processo mais importante da produo de leite UHT uma vez que
nesta fase que se consegue ampliar o tempo de prateleira do leite para cerca
de
4/5 meses, ao mesmo tempo que se consegue destruir a maioria das bactrias
que ainda no tinham sido mortas at aqui. E apesar de no haver uma
destruio total, apenas algumas bactrias na forma esporulada conseguem
sobreviver,

no

entanto

estas

no

se

desenvolvem



temperatura

de

armazenamento do leite.
Quanto ultrapasteurizao consiste em aquecer o leite a uma
temperatura de 145 C (Ultra High Temperature) durante 2 a 3 segundos,
seguido

10

de um resfriamento brusco at 20 C. este choque trmico que destri as
bactrias.
RESFRIAMENTO
Aps a ultrapasteurizao o leite rapidamente resfriamento at cerca dos 4
C
em permutadores de placas, sendo o lquido de refrigerao a gua.
importante
saber que a partir deste processo j no pode haver contaminaes sob pena
de
o leite se estragar e provocar danos nos consumidores, ou seja, no fundo todo
o
trabalho anterior seria perdido.
ENVASE ASSPTICO
O sistema de envase assptico pode ser definido como o enchimento a
frio de um alimento comercialmente estril, neste caso o leite numa
embalagem
previamente esterilizada sob condies ambientais tambm estreis.
Este sistema permite a utilizao de embalagens com baixa resistncia
trmica. A principal embalagem para o leite UHT utilizada no sistema Tetra-Pak

constituda por uma chapa com camadas consecutivas de polietileno-
cartopolietileno-alumnio-polietileno. Este material proporciona uma eficaz
barreira
contra a penetrao do oxignio e da luz, alm de ser reciclvel.
atravs de uma sobrepresso de ar estril no ambiente de enchimento,
limitado pelo tubo de embalagem, que se garante a assepsia do processo.

VANTAGENS DO PROCESSO DE PASTEURIZAO:


Evita transmisso de doenas;



Reduz a carga bacteriana do leite;



Elimina bactrias indesejveis;



Prolonga a vida-de-prateleira do leite e derivados;



Beneficia a tecnologia e qualidade dos Laticnios.

11

DESVANTAGENS DO PROCESSO DE PASTEURIZAO:


Reduz/elimina bactrias lcticas benficas (fermentos naturais);



Altera sabor do leite;



Desnaturao das protenas do leite, dificulta certos processos (ex:
queijo).

VANTAGENS DO LONGA VIDA:


Elimina todas as bactrias;



No necessita refrigerao;



Custos menores de transporte e estocagem;



Transporte longas distncias;



Ampliao do mercado de leite;



Permite estocagem:


No mercado;



Domstica.

DESVANTAGENS DO LONGA VIDA:
Alterao do sabor (cozido);


Perdas de nutrientes;



Alterao da frao proteica;



Limitado a leite de beber;



No permite uso para fabricao de derivados de leite.

4.5 - IDENTIFICAO NUMRICA DAS CAIXINHAS DE LEITE
A caixa do leite longa vida possui uma numerao no fundo da caixa e
ocorreu um boato devido esta identificao em sua embalagem.

12

Espalhou-se que esta numerao do leite indicava que por no serem
vendidas at determinado prazo, essas caixinhas voltavam para a fbrica para
que o leite fosse repasteurizado. Isso poderia ocorrer por at 5 vezes, o que
acabaria deixando o leite com um sabor diferente, aumentando a possibilidade
dele coalhar e reduzindo significativamente sua qualidade, j que o teor
nutricional diminui. Porm este boato foi espalhado e no se tem um autor
para
este boato, se tornando uma lenda urbana.
Porm a verdade esclarecida pela diretora de comunicao da Tetra Pak,
Carla Coelho, que informa que "infelizmente se trata de mais uma lenda
urbana
sem fundamento e que acaba afetando as empresas". De acordo com a
diretora a
numerao no fundo de embalagem relativa a uma marcao chamada
nmero
de ordem de produo. "A cada pedido de embalagens feito por uma empresa
produtora de leite gerado um nmero sequncia, que serve para o
rastreamento
da produo", explica. Os nmeros entre um e cinco que aparecem na
embalagem referem-se ao posicionamento da bobina.
O diretor comercial da Leite Shefa, Pedro Ribeiro, nega o que informado no
e-mail que circula na sociedade. Segundo ele, a operao de recolhimento e
repasteurizao do leite longa-vida, alm de proibida pela legislao nacional,
tambm seria invivel para a indstria do setor. "O leite longa-vida tem
validade
de 120 dias fechado e este produto no chega a ficar duas semanas na
prateleira
dos supermercados", garante Ribeiro, que representa a segunda maior
empresa
do segmento em volume.
Segundo o diretor, a notcia no tem o menor fundamento. Ele lembra, ainda,
que todas as embalagens tetra pak utilizadas para sucos, atomatados e outros
produtos saem de fbrica com o nmero impresso.

13

2.6

-

DOENAS

DESENCADEDAS

PELO

CONSUMO

DE

LEITE

CONTAMINADO POR ESTAFILOCOCOS E/OU COLIFORMES
O leite um produto altamente perecvel e com condies ideais para a
multiplicao de microrganismos. Caso o seu processo de produo, transporte
e
comercializao no respeitar normas de higiene e refrigerao o leite pode
sofrer
contaminao por microrganismos patognicos, representando um fator de
risco
para a populao que o consome.
Entre as doenas de origem alimentar transmitidas pelo leite e seus
derivados, podem ser citados: intoxicao alimentar, causada pela ingesto de
produtos que contm toxinas microbianas, produzidas durante a proliferao
de
microrganismos patognicos infeco alimentar, causadas pela ingesto de
alimentos contendo microrganismos patognicos, que invadem a mucosa
intestinal e penetram nos tecidos ou, produzem toxinas que alteram o
funcionamento das clulas do trato gastrointestinal.
1. Intoxicao alimentar estafiloccica.
Geralmente os alimentos so contaminados por pessoas que os manuseiam
e, se forem mantidos por vrias horas temperatura ambiente ou forem
colocados em grandes recipientes, podem favorecer o Staphylococcus Aureus
a
produzir enterotoxinas resistentes ao calor, responsveis pelas intoxicaes
humanas. A enfermidade tem um comeo brusco com nuseas, salivao
excessiva, vmitos, diarria, desidratao, transpirao, debilidade,
prostrao,
ausncia de febre, com durao de 1 a 2 dias. Dos diversos alimentos
apontados
como fontes de enterotoxinas estafiloccicas para humanos, o leite e
derivados
so identificados como causadores de surtos. Da a importncia de seu
armazenamento em temperaturas menores de 10 C. As temperaturas de
pasteurizao causam total eliminao do Staphylococcus Aureus, sendo
considerada a principal forma de controle. Porm as toxinas de S. aureus,
previamente produzidas no leite, no so destrudas por processos trmicos.

14

2. Salmonelose
As salmonelas so motivo de preocupao sade pblica, devido a sua
capacidade de produzir infeces que variam, desde gastrenterites, a
infeces
srias como septicemia, infeces localizadas, febre tifide e paratifide. O
leite
o segundo maior veiculador das febres tifide e paratifide, atrs apenas da
gua.
As Salmonellas typhi e S. paratyphi se multiplicam no leite em temperatura
ambiente. Em crianas, idosos e pessoas imunodeprimidas, a salmonelose
pode
apresentar um quadro grave e, inclusive, levar morte. Entre os alimentos
mais
implicados em surtos de salmonelose em humanos, destacam-se carnes, ovos,
e
leite. A presena desse microrganismo no ambiente e em outros reservatrios
dificulta ainda mais o seu controle. Por isso, a pasteurizao do leite a nica
medida de controle que elimina completamente o problema do leite e
derivados.
3. Campilobacteriose
A campilobacteriose uma importante causa de infeces gstricas crnicas,
enterocolite e septicemia no homem. O leite cru a principal causa associada
a
surtos de campilobacteriose nos homens. Diarria, dor abdominal, febre,
anorexia, mal-estar, cefalalgia, mialgia, nuseas, vmitos e artralgias so os
sinais e sintomas mais comuns, sendo a durao de 1 a 5 dias. A
pasteurizao e
a preveno de contaminao aps esse processo so as principais formas de
controle do problema.
4. Colibacilose
A Escherichia Coli um microrganismo da microbiota normal do trato
gastrintestinal do homem e dos animais. Portanto, quando no ocorre
obteno
higinica do leite este microrganismo pode ser veiculado para o produto
mediante
contaminao por fezes de homens ou bovinos infectados. As crianas so as
mais susceptveis a diarrias por E. coli. Como os animais podem no
apresentar
nenhum sintoma, transformando-se em possvel reservatrio da E. coli , a
nica
medida de controle eficaz a pasteurizao do leite e derivados antes do
consumo, assim como o cuidado para evitar a sua contaminao aps a
pasteurizao.

15

5. Tuberculose
A tuberculose bovina causada pelo Mycobacterium bovis, que pode ser
transmitido ao homem. O leite cru de origem de animais tuberculosos uma
das
possveis fontes de transmisso do Mycobacterium do bovino ao homem. A
nica
medida eficaz para garantir a segurana do leite e derivados a
pasteurizao,
que elimina totalmente o Mycobacterium.
6. Brucelose
As principais fontes de Brucella ao ser humano so placentas, fetos
abortados, secrees vaginais, tecidos, sangue e leite de animais infectados.
Animais portadores da doena sem sintomas aparentes tambm podem
eliminar
Brucella pelo leite. Os sinais e sintomas no homem possuem um incio
insidioso
com febre, calafrios, transpirao, insnia, astenia, mal-estar, cefalalgia,
mialgias
e artralgias, perda de peso e anorexia. As Brucelas apresentam elevada
capacidade de sobrevivncia no leite cru e derivados e s a pasteurizao
destri
completamente os microrganismos.
7. Listeriose
Os principais sinais e sintomas so: febre, cefalalgia, nuseas, vmitos,
monocitose, meningite, septicemia, abortos, leses externas ou internas
localizadas e faringite. Apesar de ser pouco comum, a Listeriose de grande
risco sade pblica devido ao grau de severidade das seqelas e alta taxa
de
percentagem de casos fatais que promove em populaes de risco, como
recmnascidos, gestantes e idosos. A disseminao da Listeria
monocytogenes
determinada principalmente pelo consumo de leite no pasteurizado e
derivados
alm da contaminao de alimentos, decorrente de falhas no processo
higinico
durante a produo.
8. Yersiniose
Dor abdominal severa, febre, diarria, dor de cabea e vmitos, so alguns
dos sintomas principais desta doena nos seres humanos: A principal fonte de
Yersinia enterocolitica no leite e derivados a contaminao ps-
pasteurizao,
j que o microrganismo no sobrevive nas temperaturas de pasteurizao.

16

9. Estreptococoses
O leite cru pode ser uma fonte de infeco de estreptococos para o ser
humano, entre eles S. zooepidemicus A estreptococose pode produzir febre,
calafrios e em alguns casos, pneumonia, endocardite, meningite, pericardite,
dores abdominais e glomerulonefrite em seres humanos.
Portanto, considerando as doenas citadas notamos a necessidade em se
observar a procedncia do produto que consumimos. O leite comercializado
clandestinamente no submetido ao processo de pasteurizao, que garante
que os microrganismos patognicos sejam eliminados. A comercializao
deste
produto realizada em vasilhames inadequados, e sem refrigerao adequada,
o
que influencia decisivamente a proliferao de bactrias tornando este produto
um risco iminente sade da populao que o consome.
2.7 - CARACTERSTICAS DE SELETIVIDADE DO CALDO V.B. E E.C.
Meios de Cultura so frequentemente utilizados em laboratrios. Sua
finalidade fornecer nutrientes para o cultivo de microrganismos. Com o
desenvolvimento da bactria, possvel identific-la atravs do uso de meios
de
cultura seletivos. A utilizao dos meios de cultura bacteriana muito
importante
na identificao de microrganismos que provocam, por exemplo, infeces e
alergias nos seres humanos e contaminaes em alimentos e gua. atravs
deste procedimento, que a bactria causadora identificada. Os meios
seletivos
so aqueles meios de cultura que inibem o desenvolvimento de alguns grupos
de
microrganismos e permite assim, o crescimento de outros, como por exemplo,
o
meio de cultura verde brilhante, que um meio de cultura para coliformes. O
caldo verde brilhante apresenta em sua composio bile bovina e um corante
derivado do trifenilmetano (verde brilhante), responsveis pela inibio dos
microrganismos Gram positivos.

A confirmao da presena de coliformes

termotolerantes feita por meio da inoculao em caldo EC, com incubao
em
temperatura seletiva de 45 0,2C a partir dos tubos positivos obtidos na
prova
presuntiva. A presena de gs nos tubos de Durhan evidencia a fermentao
da
lactose presente no meio, esse caldo EC apresenta em sua composio uma
mistura de fosfatos que lhe confere um poder tamponante, impedindo a sua

17

acidificao, a seletividade deste meio se deve presena de sais biliares,
responsveis pela inibio dos microrganismos Gram positivos.

3. MATERIAIS, VIDRARIAS E UTENSLIOS
01 Erlenmeyer de 250mL;
01 Pipeta graduada de 1mL;
02 Pipeta graduada de 10mL;
05 Placas de Petri;
22 Tubos de ensaio com tampa;
01 Proveta graduada de 250mL;
01 Proveta graduada de 100mL
02 Provetas graduadas de 500mL;
04 Becker de 100mL;
02 Becker de 500mL;
01 Becker de 1000mL;
01 Becker de 250mL
01 Micropipetador de 1000L;
01 Micropipetador de 100L;
01 Micropipetador de 10L;
02 Estantes de madeira para tubos de ensaio;
03 Ponteiras;
18 Tubos de Duhram;
02 Basto de vidro;
Caixa de Fsforo;
Pina metlica;
Repipetador;
Becker de Alumnio;
Caneta esferogrfica;
Tela de amianto;
Trip;

18

Esptula metlica tipo canaleta;
Etiqueta para identificao;
Fita adesiva.

4. EQUIPAMENTOS
Bico de Bunsen;
Balana Semi-analtica de 220V Mettler PC 2000;
Estufa Bacteriolgica de 220V/37 C;
Autoclave;
Contador de colnias CP 600 Plus Phoenix de 110V.
5. REAGENTES USADOS
gua deionizada (H2O);
Soluo salina (NaCl) - 5%m/v;

6. MEIOS DE CULTIVO
Meios slidos:
- Meio de Cultivo APC
Composio (g/L):
Fontes de carboidratos: Glicose - 1g/L
Extrato de levedura - 2,5g/L
Triptona - 5g/L
gar 9g/L
pH = 7
Massa Total = 23,5g

19

Meio Lquido:
- Caldo Verde Brilhante (V.B.)
Composio em g/L:
Digesto peptica de tecido animal: 8.25;
Lactose: 1.90;
Sulfito de sdio: 0.205;
Cloreto frrico: 0.0295;
Fosfato monopotssico: 0.0153;
Erioglaucina: 0.0649;
Fucsina bsica: 0.0776;
Bile de boi: 0.00295;
Verde brilhante: 0.0000295;
Agar: 10.15;

- Caldo E.C.
Composio em g/L:
Peptona de casena: 20;
Lactose: 5;
Bile Bovina: 1,5;
Cloreto de Sdio: 5;
Fosfato de potssio dibsico: 4;
Fosfato de potssio monobsico: 1,5;
pH final: 6,9.

7. AMOSTRAS


Leite Pasteurizado Padronizado Beba Mais Prata.
(com 3% de gordura)
Cooperativa Agropecuria de Itaperuna

20

8. PROCEDIMENTO

CONTAGEM

TOTAL

DE

MICRORGANISMOS

HETEROTRFICOS

AERBIOS ESTRITOS E FACULTATIVOS VIVEIS EM PLACAS

PREPARAO DA SALINA:
Calcular a quantidade necessria de cloreto de sdio (NaCl) para preparar
o volume desejado da soluo salina;
Pesar em Becker a quantidade calculada de NaCl;
Adicionar gua deionizada ao Becker, com o auxlio de uma proveta
graduada de 250mL, at a dissoluo completa do sal;
Transferir 9mL de da soluo salina, com o auxlio de uma pipeta graduada
de 10mL e de um repipetador, para 4 tubos de ensaio e em seguida tamplos;
Preparar para esterilizao, levar a autoclave (121C, 1,1 atm por 15
minutos).

Preparao da amostra
Homogeneizar a amostra antes da retirada da unidade analtica, invertendo
a embalagem 25 vezes. O intervalo entre a mistura da amostra e a retirada
de unidade analtica no deve ultrapassar 5 minutos.

Diluio seriada da amostra
Transferir assepticamente uma poro de 1mL da amostra para 9mL de
gua de diluio (soluo de cloreto de sdio 0,5% m/v ou tampo fosfato
com cloreto de magnsio). As diluies subsequentes so obtidas de
maneira similar transferindo-se 1,0mL da diluio anterior para 9mL de
diluinte.
Obs: O nmero de diluies requeridas depender do nvel de
contaminao esperada, de forma a resultar em placas com 30 a 300
colnias.
Obs: Na transferncia de volumes entre as diluies, usar sempre uma
pipeta diferente para cada diluio.

21

Antes de retirar o volume a ser transferido, agitar vigorosamente o tubo,
invertendo 25 vezes ou sugar e liberar o lquido no tubo de ensaio com a
prpria pipeta, por 5 vezes.
Obs: No flambar pontas de pipetas, ponteiras e nem soprar a gota que
fica no final.

Inoculao para contagem em placa
Distribuir 1,0mL das amostras e de cada diluio em placas de Petri
separadas, estreis e vazias, abrindo as placas apenas o suficiente para
inserir a pipeta, prximo ao bico de Bunsen. Depositar o inoculo fora do
centro da placa, pois facilitar a posterior mistura com o meio de cultura.

Adio do meio de cultura
Verter nas placas inoculadas, 15 a 20mL do meio de cultura previamente
fundido e resfriado a 50-55C. Misturar o inoculo com o meio de cultura
movimentando

suavemente

as

placas,

numa

superfcie

plana,

em

movimentos da forma de oito (4 vezes). A mistura do meio de cultura como
inoculo dever ocorrer imediatamente aps a adio do meio;
Obs: Se os meios foram esfriados submetendo o frasco a lavagem
externa em gua corrente, o mesmo dever ser enxuto para no
respingar gua de resfriamento nas placas.

Incubao
Aguardar a completa solidificao do meio de cultura, inverter as placas e
incubar a 0,5C por 48 horas.
Obs: Recomenda-se que a contagem padro em placas seja efetuada
com utilizao de placas em duplicata, nas vrias diluies.

Obteno dos Resultados
Sero consideradas significativas as contagens das diluies que
apresentarem entre 30 a 300 colnias;
Para calcular o nmero de UFC por grama do produto ou mL, multiplicar o
nmero significativo encontrado pelo fator de diluio correspondente.

22

Observaes:
A. Leitura abaixo de 30 colnias na menor diluio: contar o nmero de
colnias, calcular o nmero de UFC e apresentar o resultado como
contagem estimada (est).
B. Ausncia de crescimento na menor diluio, expressar como abaixo de
1 UFC/mL.
C. Leituras acima de 300 colnias na maior diluio expressar como
maior que 300x10x UFC/mL. X = fator de diluio.
D. Leituras entre 30 e 300 colnias, expressar o resultado multiplicando-se
o valor encontrado, pelo fator de diluio correspondente.
E. Duas diluies consecutivas com 30-300 colnias: calcular o nmero de
UFC de cada diluio. Se um resultado for maior do que o dobro do
outro, considere apenas o menor. Se um dos resultados no ultrapassar
o dobro do outro, ento considere ambos os resultados, apresente a
mdia como resultado final.
Ateno: Para contagens em duplicata, na obteno dos resultados,
utilizar a mdia aritmtica das contagens nas placas que apresentarem
entre 30 a 300 colnias.

23

TCNICA DOS TUBOS MLTIPLOS

PREPARAO DOS MEIOS DE CULTIVO:

Preparao do Caldo Verde Brilhante (V.B.)
Calcular a quantidade necessria para preparar 360mL do caldo verde
brilhante;
Pesar em um Becker a quantidade necessria;
Adicionar gua deionizada ao Becker, com o auxlio de uma proveta
graduada de 500mL, at a dissoluo completa do meio.

Preparao do Caldo E.C.
Calcular a quantidade necessria para preparar 360mL do caldo ec
Pesar em um Becker a quantidade necessria;
Adicionar gua deionizada ao Becker, com o auxlio de uma proveta
graduada de 500mL, at a dissoluo completa do meio.

Preparao do meio de cultivo APC:
Calcular a quantidade necessria de meio de gar para preparar 550mL de
soluo;
Pesar em um Becker a quantidade calculada do meio cultivo APC;
Adicionar gua deionizada, com auxlio de uma proveta graduada cerca de
550Ml e agitar com auxlio a mistura com auxlio de um basto de vidro;
Aquecer o meio de cultivo at a fervura (100C), para que o APC slido
presente fosse completamente dissolvido;
Aps a dissoluo do meio, transferir para um frasco apropriado para
acondicionamento de meio de cultivo;
Enroscar a tampa e dar meia-volta para trs e em seguida enrolar com
papel manilha e amarrar com barbante no final;
Levar a autoclave para esterilizar (121C / 1,1 atm por 15 minutos);

24

ENSAIO CONFIRMATRIO

Preparar 110 mL de Caldo EC (CEC) de concentrao simples e
distribuir:
9,0mL por 3 tubos de ensaio contendo tubos de Durhan.
9,9mL por mais 3 tubos de ensaio contendo tubos de Durhan.
10mL por 3 tubos de ensaio contendo tubos de Durhan.
Colocar tampas de alumnio nos tubos, agrup-los, envolvendo-os e
papel manilha ou alumnio e autoclav-los.

Preparar 110mL de Caldo Verde Brilhante (CVB) de concentrao
simples e distribuir:
9,0mL por 3 tubos de ensaio contendo tubos de Durhan.
9,9mL por mais 3 tubos de ensaio contendo tubos de Durhan.
10mL por 3 tubos de ensaio contendo tubos de Durhan.
Colocar tampas de alumnio nos tubos, agrup-los, envolvendo-os e
papel manilha ou alumnio e autoclav-los.

Inoculao dos meios preparados
Homogeneizar a amostra de leite, Dispondo de pipetas graduadas estreis
ou micropipetas.
Os tubos que contm 9mL de meio, devero receber 1mL de amostras, os
que contm 9,9mL de meio recebero 0,1mL de amostras e os tubos de
10mL devero receber 0,01mL de amostra.

3 tubos de 10mL de CEC CVB

0,01 mL de amostras

3 tubos de 9,0mL de CEC CVB

1 mL de amostras

3 tubos de 9,9mL de CEC CVB

0,1 mL de amostras

Incubar em estufa bacteriolgica previamente regulada para 37C, por 48h,
observando a cada 24 horas para verificar se h produo de gs.

25

RESULTADOS
Caldo Verde Brilhante o aparecimento de gs nos tubos inoculados
fornece o nmero de coliformes fecais no leite.
Caldo EC o aparecimento de gs nos tubos inoculados fornece o nmero
de coliformes termotolerantes no leite.
A densidade de coliformes expressa em NMP por 1mL da amostra.
A estimativa do NMP/1mL feita atravs de consulta tabela de Nmero
Mais Provvel por 1mL (em anexo), computando-se os tubos positivos das
3 diluies consideradas.

26

9. REAES
No houve reaes.

10. CLCULOS E/OU RESULTADOS

Calculando a massa de NaCl:
0,5g
X

100mL
150mL

X = 0,75 g NaCl

Calculando a massa do APC:
23,5g
X

1000mL
550mL

x = 12,925 aproximadamente 13g

Calculando a massa do caldo V.B. :
40g
X

1000mL
360mL

X = 14,4g

Calculando a massa do caldo E.C. :
37g
X
X = 13,32g

1000mL
360mL

27

CONTAGEM POR PLAQUEAMENTO EM PROFUNDIDADE (30 a 300
colnias):
p. 60.

Placa

Resultado
Aps um tempo em estufa, observou-se que

Placa n 0

Amostra original do leite

nesta placa formou um tapete de colnias, no
sendo possvel realizar a contagem.
Nesta placa houve um bom crescimento,

Placa n 1

Continha 1mL do tubo

porm formou-se um tapete de

com diluio de 1:10

microrganismos e algumas isoladas, sendo
assim realizou-se a contagem de 112 UFC.

Placa n 2

Continha 1mL do tubo
com diluio de 1:100

Continham 1mL do tubo
Placa n 3 e

com diluio de 1:1000

Placa n 4

e 1:10000
respectivamente

x UFC
112 colnias
X = 1120 UFC/mL

1mL
0,1

Nesta placa houve grande crescimento,
gerando um tapete de bactrias, o que
impossibilitou a contagem.

Nestas placas ocorreu um erro, porque no
houve crescimento. Provavelmente o APC
estava muito quente e matou as bactrias.

28

TCNICA DE TUBOS MLTIPLOS (NMP/mL): p.62
Caldo V.B. :
Nos tubos que continham 9mL do caldo verificou-se que apenas 2
apresentaram produo de gs no tubo de Durhan.
Nos tubos que continham 9,9mL do caldo verificou-se que apenas 1 tubo
apresentou produo de gs no tubo de Durhan.
Nos tubos que continham 10mL do caldo verificou-se que apenas 1 tubo
apresentou produo de gs no tubo de Durhan.
Quantidade de Volume

Quantidade de tubo

(mL)

com gs

03

9mL

2

03

9,9mL

1

03

10mL

1

Quantidade de tubos

De acordo com a quantidade de tubos que apresentavam gs, verificou-se
na tabela do nmero mais provvel (pgina 64) o resultado da combinao.
Resultado: 2 NMP/ mL.

Caldo E.C.:
Nos tubos que continham 9mL do caldo verificou-se que apenas 1
apresentou produo de gs no tubo de Durhan.
Nos tubos que continham 9,9mL do caldo verificou-se que apenas 1 tubo
apresentou produo de gs no tubo de Durhan.
Nos tubos que continham 10mL do caldo verificou-se que nenhum tubo
apresentou produo de gs no tubo de Durhan.

29

Quantidade de volume

Quantidade de tubos

(mL)

com gs

3

9mL

1

3

9,9mL

1

3

10mL

0

Quantidade de tubos

De acordo com a quantidade de tubos que apresentavam gs, verificou-se
na tabela do nmero mais provvel (pgina 64) o resultado da combinao.
Resultado: 0,7 NMP/mL.

11. ESQUEMAS

30

12. DISCUSSO E/OU CONCLUSO

Na contagem por plaqueamento em profundidade foi possvel concluir que
nas placas 3 e 4 no houve crescimento,gerou um falso negativo, pois
provavelmente na hora da transferncia do APC para a placa de Petri, este se
encontrava quente e matou os microorganismos. E o que deveria ter ocorrido
era
um menor crescimento em relao as outras placas, devido a amostra estar
mais
diluda. Nas outras placas houve grande crescimento pois a amostra estava
mais
concentrada.
Na tcnica de tubos mltiplos,os tubos que continham 9mL do caldo V.B.,
todos os tubos apresentaram pelcula e turvao, sendo que 2 apresentaram
pelcula embaixo tambm.Nos tubos de 9,9mL, os trs tubos apresentaram
pelcula e turvao.Nos tubos de 10mL, 2 tubos tinham turvao e pelcula, e
apenas 1 apresentou somente pelcula na parte superior sem turvao.
J nos tubos que continham o caldo E.C., todos os tubos de 9mL
apresentaram turvao e pelcula embaixo e em cima.Nos tubos de 9,9mL,
todos
apresentaram turvao, sendo um com pelcula em cima e embaixo e os outros
2
apenas em cima.Nos tubos de 10mL, 2 tubos no tinham turvao e nem
pelcula
e apenas um com turvao e pelcula.
Nos tubos que tem o caldo V.B. o aparecimento de gs fornece o nmero de
coliformes totais no leite. Nos tubos com caldo E.C. o aparecimento de gs
nos
tubos inoculados fornece o nmero de coliformes termotolerantes no leite.
Sendo assim, de acordo com os resultados verifica-se que a amostra de leite
do tipo B, baseado na tabela da norma n 51/2002.
A determinao da presena ou ausncia dos coliformes totais se d pela
observncia da formao de gs no interior dos tubos de Durhan. A presena
de
gs nos tubos de Durhan evidencia a fermentao da lactose presente no
meio.
So considerados positivos para coliformes aqueles tubos que contenham em
seu
interior tubos de Durhan com formao de bolha (gs), no perodo de 24 a 48
horas de incubao.

31

13. ATIVIDADES DE VERIFICAO p. 66
1 Por que devemos diluir a amostra de leite ao realizarmos a tcnica da
placa derramada?
Para que o nmero de colnias fique dentro de uma faixa ideal de UFC que
deve se apresentar entre 30 e 300. Estando dentro deste limite, a contagem
pode
ser precisa.
2 Qual deve ser a caracterstica da placa para que ela seja escolhida para
a contagem?
Deve ser a placa em que as Unidades Formadoras de Colnias estejam
entre 30 e 300, podendo cont-las de forma precisa.
3 O que significa U.F.C.?
Unidades Formadores de Colnias por mililitro.
A designao de UFC significa que numa mistura heterognea (suspenso)
de clulas bacterianas, cada mililitro dever conter milhes de clulas
bacterianas. Mas nem todas esto viveis. Ento diz-se que o nmero de
clulas
bacterianas viveis presentes numa mistura heterognea corresponde a UFC
ou
Unidades formadoras de colnias.

4 Por que devemos verificar a presena de coliformes nos leites fluidos?
Porque a presena de coliformes em um fluido indica a existncia de
possveis microrganismos patognicos que so responsveis pela transmisso
de
doenas.

5 Por que o caldo EC no incubado a 37C?
Porque o caldo EC detecta os coliformes termotolerantes/fecais que se
desenvolvem e fermentam a lactose com produo de gs e cido na
temperatura
de 45C.

32

6 O que torna os meios CVB e EC seletivos?
A seletividade do caldo EC se deve a presena de sais biliares,
responsveis pela inibio do microrganismo Gram positivo. O caldo Verde
Brilhante bile 2% lactose apresenta em sua composio bile bovina e um
corante
derivado do trifenilmetalno (verde brilhante), responsveis pela inibio dos
microrganismos Gram positivos.
7 Cite dois fatores que podem levar ao erro na tcnica de contagem das
colnias na placa.
O crescimento excessivo das colnias que consequentemente ficam
sobrepostas umas nas outras
Utilizar o APC estiver ainda muito quente, o que pode levar a morte dos
microrganismos desejados.
8 Como so os processos de pasteurizao e esterilizao do leite?

Pasteurizao
A pasteurizao empregada quando: (a) o alimento a ser conservado
susceptvel exposio a altas temperaturas exemplo: leite e sucos; e
(b) os agentes microbianos indesejveis apresentam baixa resistncia ao
calor. Os agentes indesejveis podem causar doenas, ou ento,
prejudicar a produo de alimentos, como por exemplo, a fabricao de
iogurtes.
Na pasteurizao destruda parte da populao de microrganismos
presentes nos alimentos. Dentre estes microrganismos podem estar os
que causam danos aos alimentos e os que podem causar algum tipo de
doena aos consumidores. O objetivo primeiro eliminar os causadores de
doenas. Aps a aplicao da pasteurizao devem ser aplicados outros
mtodos de conservao, tais como: a refrigerao exemplo: leite
pasteurizado; e a adio de acar - exemplo: doces em massa. Isso
deve-se ao fato que se um alimento, aps a pasteurizao, ficar exposto
temperatura ambiente, a populao de microrganismo presente ir se
multiplicar, danificar e consumir o alimento.

33

Os tipos de pasteurizao empregados so:


Pasteurizao rpida (HTST - high temperature and short time - alta
temperatura em curto espao de tempo) - como exemplo pode ser citado o
beneficiamento de leite. Nesse caso, o produto submetido temperatura
de 72C por 15 segundos, e, em seqncia, refrigerado temperatura
inferior de 5C. Isso possvel pela passagem do lquido por trocadores de
calor do pasteurizador, a uma vazo que permita ao leite ser exposto
temperatura de 72C por 15 segundos.



Pasteurizao lenta (LTLT - low temperature and long time - baixa
temperatura e longo espao de tempo) - para o leite um determinado
volume depositado em um recipiente onde permanece temperatura de
62C por 30 minutos. Esse tipo de tratamento recomendado para
pequenas unidades industriais de fabricao de queijos e iogurtes. Vide a
Figura 2.

Esterilizao - Tratamento UAT - Ultra Alta Temperatura: O tratamento
UAT (Ultra Alta Temperatura) muito utilizado no processamento de creme
de leite, sucos e leite. No caso do leite, a temperatura empregada de
138C, e o tempo de exposio de dois segundos. Em sequencia o
produto tem sua temperatura reduzida para cerca de 32C, e envasado
em embalagem longa vida, a qual impossibilita trocas do alimento com o
meio. Pois, esse tipo de embalagem confeccionado em multicamadas de
filmes de papelo, alumnio, polietileno, polister e polipropileno.

14. REFERNCIAS
Sites:


http://grupo3-12a.blogspot.com.br/2010/01/caracterizacao-de-ufcunidades.html
- acessado em 23/03/2013



http://www.ablv.org.br/ - acessado em 23/03/2013

34



http://www.esalq.usp.br/departamentos/lan/pdf/Pasteurizacao.pdf

-

acessado em 23/03/2013


http://www.bvsam.icict.fiocruz.br/normastecnicas/controlesanitariodolh
o.pdf - acessado em 23/03/2013



http://www.splabor.com.br/meios-de-cultura/meios-para-analise-degua/agar-
bile-verde-brilhante-modelo-m059.html - acessado em
23/03/2013



http://correiogourmand.com.br/info_01_cultura_gastronomica_01_10.h
tm - acessado em 27/03/2013

15. ASSINATURA DOS AUTORES DO RELATRIO

____________________________
ALEX FONTES AGUIAR

____________________________
AMANDA OLIVEIRA

____________________________
LAS SOLIO

____________________________
POLLYANNA CORRA

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16. ANEXOS