Presencia, propiedades de la enzima catalasa y cintica enzimtica

de los alimentos.
Presence catalase properties and food enzyme kinetics.
Sebastin Ramos, Alejandra Fonseca, Marisol Gmez.

Resumen: Se le adiciona Perxido de hidrogeno a las muestras de tomate, papa, y espinaca, para observar la
existencia de la enzima catalasa. La cintica enzimtica se realiz con la muestra de hgado y se observa la actividad
especfica de la catalasa a diferentes concentraciones de H
2
O
2
, manteniendo constante la concentracin de la
enzima. Se realiza las representaciones de Michaeles y Menten y de Lineweaver-Burk para determinar la Vmax y la
Km, siendo muy diferentes los valores obtenidos por cada mtodo.

Abstract: Is added to hydrogen peroxide samples tomatoes, potatoes, and spinach, to observe the existence of the
enzyme catalase. The enzyme kinetics were performed with the sample and the specific activity of liver catalase is
observed at different concentrations of H2O2, keeping constant the concentration of the enzyme. Michaeles
representations Menten and Lineweaver-Burk and is performed to determine the Vmax and Km, with very different
values obtained by each method.
Fecha de entrega del informe: 24 de junio de 2014
Palabras clave: Catalasa, desnaturalizacin, accin enzimtica.

Introduccin

Muchos organismos pueden descomponer el perxido
de hidrgeno (H
2
O
2
) por la accin de las enzimas. Las
enzimas son protenas globulares responsables de la
mayor parte de la actividad qumica de los organismos
vivos. Actan como catalizadores, que son sustancias
que aceleran las reacciones qumicas sin ser
destruidas o alteradas durante el proceso. Las
enzimas son extremadamente eficientes y se pueden
utilizar una y otra vez repetidamente. Una enzima
puede catalizar miles de reacciones en cada segundo.
Tanto los valores de pH como de la temperatura a los
que trabaja la enzima son extraordinariamente
importantes. La mayora de los organismos tienen un
intervalo de temperatura preferente en el cual
sobreviven y sus enzimas funcionan mejor dentro de
dicho intervalo de temperatura. Si el ambiente donde
se encuentra la enzima es demasiado cido o
demasiado bsico, la enzima puede desnaturalizarse
de forma irreversible o transformarse de modo que su
forma no le permita ms realizar su funcionamiento
apropiado.

La catalasa es una enzima que se encuentra en las
clulas de los tejidos animales y vegetales. La funcin
de esta enzima en los tejidos es necesaria porque
durante el metabolismo celular, se forma una molcula
txica que es el perxido de hidrgeno, H
2
O
2
(agua
oxigenada). Esta enzima, la catalasa, lo descompone
en agua y oxgeno, por lo que se soluciona el
problema. La reaccin de la catalasa sobre el H2O2,
es la siguiente:

Reaccin 1

2 H
2
O
2
2 H
2
O + O
2



La existencia de catalasa en los tejidos animales, se
aprovecha para utilizar el agua oxigenada como
desinfectante cuando se echa sobre una herida. Como
muchas de las bacterias patgenas son anaerobias
(no pueden vivir con oxgeno), mueren con el
desprendimiento de oxgeno que se produce cuando
la catalasa de los tejidos acta sobre el agua
oxigenada.

La desnaturalizacin de una protena se refiere a la
ruptura de los enlaces que mantenan sus estructuras
cuaternaria, terciaria y secundaria, conservndose
solamente la primaria. En estos casos las protenas se
transforman en filamentos lineales y delgados que se
entrelazan hasta formar compuestos fibrosos e
insolubles en agua. Los agentes que pueden
desnaturalizar a una protena pueden ser: calor
excesivo; sustancias que modifican el pH; alteraciones
en la concentracin; alta salinidad; agitacin
molecular; etc... El efecto ms visible de ste
fenmeno es que las protenas se hacen menos
solubles o insolubles y que pierden su actividad
biolgica.

Ya que la catalasa qumicamente es una protena,
podemos desnaturalizarla al someterla a altas
temperaturas. Al perder la estructura terciaria, perder
tambin la funcin y como consecuencia su funcin
cataltica, por lo que no podr descomponer el agua
oxigenada y no se observar ningn tipo de reaccin
cuando hagamos la experiencia anterior con muestras
de tejidos hervidos.

Determinando la presencia de enzima, se puede
efectuar la cintica de reaccin enzimtica con
relacin a la concentracin del sustrato. Una forma de
calcular la velocidad de una reaccin enzimtica es
determinando la cantidad de sustrato transformado por
1 ml de enzima en un minuto; esta es una forma de
indicar la actividad especfica de la enzima en donde
catalasa
adems es posible conocer el comportamiento
Micheliano de la reaccin y los valores de Km y Vmax.

Resultados y discusin de resultados

1. Demostracin de la existencia de la enzima

Figura 1: Muestras sin adicionar H
2
O
2



Despus de realizar la adecuacin de las muestras, se
adicion 5 ml de perxido de hidrgeno, formando un
burbujeo y espuma permitiendo observar la presencia
de la enzima catalasa.

Figura 2: Muestras con H
2
O
2.


La interaccin entre los trozos de tomate y el perxido
de hidrgeno produjo pequeas cantidades de
espuma, la reaccin entre la papa y el perxido de
hidrgeno produjo cantidades medias de espuma y la
interaccin entre la espinaca y el perxido de
hidrgeno produjo una mayor cantidad de espuma
respecto a los anteriores.

El orden de actividad lo observamos de acuerdo al
tiempo requerido en la reaccin entre el perxido de
hidrgeno con la enzima catalasa.

Tabla 1: Orden de actividad

Tejido
Orden de
actividad
Tomate Lento
Papa
Medianamente
lento
Espinaca Rpida

La concentracin de la catalasa en distintos tejidos y
organismos es directamente proporcional a la rapidez
e intensidad del burbujeo con perxido de hidrgeno,
por lo que se puede relacionar la cantidad de burbujeo
producido con la concentracin de catalasa presente
en la muestra.

2. Cintica Enzimtica

Para la obtencin de la enzima catalasa tomamos la
muestra que contiene una gran cantidad de esta. En
este caso la muestra de hgado. Y la trituramos con 8
ml de solucin buffer fosfato pH= 7,4, hasta que se
homogenizo la pasta.

Figura 3: Muestra a centrifugar.



Se realiz la centrifugacin y se decant para obtener
la solucin con la que se trabaj posteriormente.

Se preparan 6 tubos con los siguientes reactivos para
observar la actividad y la cintica enzimtica.

Tabla 2. Distribucin de los reactivos en ml.

1 2 3 4 5 6
H2O2
0,1 M
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
Agua
destilada
4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0
Enzima
no
hervida
1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 -
Enzima
hervida
- - - - - 1,0

Posteriormente se realiz la titulacin de las muestras
con permanganato de potasio, en el tubo 6 no se
obtuvo un cambio por la titulacin.

Tabla 3. Volumen de KMNO
4
gastado en la titulacin.

Tubo
ml KMNO
4

gastados
1 1,4
2 1,7
3 2,1
4 2,7
5 3,2
6 11


Al titular con permanganato de potasio se est
determinando la cantidad de H
2
O
2
que no ha sido
descompuesto por la catalasa durante los 5 minutos
de reaccin, esto se ve en la siguiente ecuacin:


El tiempo de la reaccin fue de 5 minutos. Al titular
con permanganato de potasio se est determinando la
cantidad de H
2
O
2
que no ha sido descompuesto por la
catalasa durante los 5 minutos de reaccin, esto se ve
en la siguiente ecuacin:

3 H
2
SO
4
+ 2 KMnO
4
+ 5 H
2
O
2
------> K
2
SO
4
+ 2 MnSO
4
+ 8
H
2
O + 5O
2


Los clculos de la columna 4 son realizados por medio
de una regla de tres para obtener la cantidad de
perxido de hidrgeno descompuesto por 1 ml de
enzima en 1 minuto:

Para convertir el volumen a moles se realizo y hallar
la actividad enzimtica:
(


) (

) (

Tabla 4. Actividad especfica de la enzima catalasa en
cada tubo

Tub
o
H2O2 no
descompues
ta en 5
minutos (ml)
H2O2
descompuesta por
1 ml de enzima en
5 minutos (mL)
H2O2
descompuest
a por 1 ml de
enzima en 1
minuto (mL)

Actividad
especfica de
la catalasa
(umol*10
4
/min)
1 1,4 3,6 0,72 3,069
2 1,7 3,3 0,66 2,813
3 2,1 2,9 0,58 2,472
4 2,7 2,3 0,46 1,960
5 3,9 1,1 0.22 0,937

Para realizar el grfico de Michaelis-Menten se
hallaron las concentraciones iniciales de sustrato
utilizando la ecuacin de dilucin:

V
1
C
1
= V
2
C
2

donde V
1
y C
1
: volumen y concentracin de solucin
concentrada de sustrato respectivamente.

El modelo de clculo utilizado es:

Para el tubo 1

Tabla 5: Concentraciones de sustrato iniciales en
cada tubo


Tubo Concentracin inicial sustrato (M)
1 0.01
2 0.02
3 0.03
4 0.04
5 0.05
Grafica 1. Representacin de Michaeles y Menten
para ver la cintica enzimtica.

En la grfica anterior se realiz sin tener en cuenta el
tubo 6, debido a que en este la enzima estaba
desnaturalizada, por lo tanto no se consumi perxido
de hidrogeno en esta reaccin, todo reacciono con el
permanganato de potasio.
La constante Km se halla diviendo la velocidad
mxima en 2 (50% de actividad enzimtica):

= 1,5345 moles*10
4
/min
ste valor se interpol y se obtuvo un valor proximado
de Km correspondiente a 0.015 M.
Para realizar una determinacin un poco ms precisa
se usa la representacin de Lineweaver-Burk,
representa 1/v frente a 1/[s] y permite determinar a
partir de medidas experimentales parmetros bsicos
de la cintica enzimtica como la constante de
Michaelis y la velocidad mxima de reaccin.
Tabla 6. Datos para la representacin de Lineweaver-
Burk.
1/v 1/[s]
0,326 100,0
0,355 50,0
0,404 33,3
0,510 25,0
1,067 20,0
Grafica 2. Representacin de Lineweaver-Burk

Segn las ecuaciones de ste mtodo:


El punto de corte con ordenada: b

Utilizando la ecuacin de la recta b = 0,104

la pendiente de la recta m:

Entonces:

M
La ecuacin de Michaeles- Menten da como resultado
una grfica hiperblica la cual es una relacin entre la
velocidad de una reaccin catalizada por una enzima
frente a la concentracin de sustrato disponible en el
tiempo, mientras que la representacin de
Lineweaver-Burk es una ecuacin lineal de la
ecuacin de la de Michaeles Menten. Esta tiene una
serie de ventajas cuando se estudia la cintica
enzimtica, ya que la Vmax y Km pueden as
determinarse con ms facilidad. Los efectos
inhibidores pueden analizarse con mayor exactitud.
Conclusiones
De las muestras con las que se trabajo, la espinca fue
la que contenia mayor cantidad de catalasa, ya que
experimentalmente se observo una gran cantidad de
espuma, debido a la reaccion del peroxido catalisado
por la catalasa, la cual produce agua y oxigeno.El
orden de actividad observado fue dado a la cantidad
de catalasa contenida en la muestra.

Para observar la cinetica enzimtica se tom la
muestra de hgado debido a las altas concentraciones
de la enzima catalasa que presentan los tejidos
animales. Se titul con permanganato de potasio ya
que este descompone el peroxido de hidrogeno que
no ha sido descompuesto por la catalasa.Se observa
que la actividad especifica aumenta conforme
aumenta la concentracion de H
2
O
2
.

En el anlisis de la cintica enzimtica no se utiliz los
datos del tubo No 6 ya que en este la catalasa esta
desnaturalizada debido al aumento de la temperatura.
Los datos de Vmax y de Km obtenidos de la
representacin de Michaeles-Menten presentaron
grandes diferencias respecto a los obtenidos en la
representacin de Lineweaver-Burk.
Bibliografa

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Texto y Atlas. Editorial Mdica Panamerica S.A. 3ra edicin.
Germany

y = 0.0094x + 0.104
R = 0.9835
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 50 100 150
A
c
t
i
v
i
d
a
d

e
n
z
i
m

t
i
c
a

c
a
t
a
l
a
s
a

(

m
o
l
e
s
*
1
0
-
4
/
m
i
n
)

Concentracin del sustrato M
-1
Grfica Lineweaver-Burk