Pilus biogenesis at the outer membrane of Gram-negative bacterial

pathogens
Pili pertenecen a una clase amplia de estructuras de superficie bacterianas que juegan un
papel clave en la infeccin y la patogenicidad El sistema de la biognesis de pilus ms
grande y el mejor caracterizado - la va de la chaperona Usher - es particularmente
notable en su capacidad para sintetizar y mostrar estructuras muy organizadas en el
membrana externa y sin participacin alguna de las fuentes de energa endgenas. los
ltimos aos se han anunciado nuevos desarrollos en nuestra comprensin de la biologa
estructural y el mecanismo de ensamblaje de pilus, que se discuten en esta revisin. Tal
conocimiento es particularmente importante en el futuro, como nos acercamos a una era
de amplia resistencia a los antibiticos comunes y requieren nuevos objetivos.
introduccin
. Bacterias Gram-negativas muestran una variedad de estructuras proteinceas en sus
superficies Estos incluyen flagelos, responsable de la motilidad celular; injectosomes,
agujas finas que se inyectan molculas efectoras en clulas husped; curli, implicados en
la adhesin a las superficies y la formacin de biopelculas, y los pili (desde Amrica para
los pelos), una bastante amplia categora que abarca una amplia variedad de diferentes
estructuras y funciones [1-5]. en las especies bacterianas patgenas, pili son a menudo
factores de virulencia importantes, la mediacin y el apego a la infeccin de las clulas
diana, y participa en la evasin de los sistemas inmunes del husped o la formacin de
biopelculas. Debido a esto, se consideran blancos atractivos de la droga, y hay un gran
inters en la comprensin de sus estructuras y el mecanismo de reunin, con el fin de
ayudar en el proceso de descubrimiento de medicamentos [6,7].
Un desafo clave a todos los mecanismos de la secrecin por las bacterias gramnegativas
es la presencia de dos membranas de las clulas , separadas por un espacio periplsmico
carente de fuentes de energa celular clsicos tales como el ATP y la fuerza motriz de
protones . Existen dos mecanismos generales para superar estos obstculos . La primera
, aprobado por pili tipo IV, el (confusamente relacionada) de tipo IV pili secrecin , y el tipo
III injectosome , hace uso de grandes maquinarias de ensamblaje que abarcan ambas
membranas ( ver Figura 1a que proporciona una ilustracin de ensamblaje de pilus de tipo
IV como un ejemplo ) . Tales mecanismos incluyen ATPasas de la membrana interna que
accionan el ensamblaje del pilus . en este caso , las subunidades de pilus a menudo
polimerizan dentro de la maquinaria , el pilus creciente permaneciendo confinado dentro a
medida que pasa a travs del periplasma y la membrana externa . Un enlace directo a la
membrana interna de esta manera es claramente necesario en casos donde se requiere
la motilidad accionado o desmontaje activo , o cuando los sustratos son transferido a
travs de los pili desde el citosol , como en la conjugacin o la inyeccin de los efectores
a travs de la aguja de tipo III ; sin embargo, es relativamente caro y requiere la energa
sntesis de grandes complejos de protenas para la funcin . la alternativa , tal como se
utiliza por la chaperona conservada / ujier ( CU ) y la va para la biognesis de curli , se
apropia de la maquinaria de secrecin general de la clula para exportar subunidades al
periplasma , y cataliza su posterior ensamblaje en la membrana externa sin ningn aporte
adicional de energa ( Figura 1b ) . tales mecanismos de aprovechar la energa intrnseca
de plegado de las protenas de conjunto de la fuente , y en general, requieren factores
extrnsecos tales como chaperonas para evitar la polimerizacin prematura en el
periplasma [ 8 ] .

Esta revisin se centra en la ltima categora: el ensamblaje del pilus en la membrana
externa, y en particular, los recientes avances en nuestra comprensin de la va de CU.

Sistemas biognesis Pilus ensamblan en la membrana interna y externa . ( A) Diagrama esquemtico de la
unin de los pili de tipo IV , que ilustra el montaje ATP impulsada tendr lugar en la membrana interna [ 4 ] . El
sistema de secrecin tipo IV pilus abarca tanto interior como exterior membranas . el complejo de la
membrana exterior se compone de la secretina ( azul) y el Pilotin protenas (marrn) , donde la secretina
formas del poro salida de pilus . el complejo membrana interna implica la protena plataforma ( gris oscuro )
que interacta con una protena citoplasmtica que contiene un - actina como dominio (amarillo) , ATPasas de
trfico ( cian) que proporcionan energa para el montaje o la retraccin del pilus , y uno o ms BIMPs
(protenas de membrana interna bitopic , azul y rojo) . la protena SDA (protena - dinmico asociado
secretina, verde ) ha planteado la hiptesis de vincular los complejos de membrana interior y exterior . una vez
insertada en la membrana interna por la maquinaria Sec , las subunidades de pre - pilina (gris claro) se
procesan por una peptidasa especfica de pre - pilina ( azul oscuro ) antes no covalente polimerizacin en un
pilus . Aunque el mecanismo de ensamblaje todava no est claro , flechas oscuras indican una va hipottica .
( b ) la va - chaperona Usher , que ilustra el montaje autoalimentado a la membrana externa . individuales
subunidades de pilus son transportados al periplasma por la SEC va , donde se estabilizan por un chapern
dedicados y orientados al ujier en la membrana externa para el montaje. Vase el texto principal para obtener
ms detalles.

Pili montado por la va de CU
La va de CU es , posiblemente, el sistema de ensamblaje de pilus bacteriano mejor
caracterizado - , i-simo trabajo en el pasado dos dcadas en el P de pilus arquetpica
(PAP) y (FIM) sistemas de la Escherichia coli uropatgena tipo 1 de pilus produciendo una
comprensin relativamente detallada de su estructura . mecanismo y [ 8-10 ] pili CU son
polmeros no covalentes de las subunidades de pilus , aproximadamente 7-8 nm de ancho
y 2 mm de largo , que se adjunta en la base a los bacterianas de membrana externa de
electrones micrografas de pili tpicamente muestran dos subconjuntos : . un largo derecha
-handed varilla helicoidal hecho de alrededor de mil ejemplares de la subunidad principal
(Papa en el pilus P y FimA en el tipo 1 pilus ) seguido de una punta flexible terminal que
comprende diversas subunidades menores ( PapK / PapE / PapF del pilus P y FIMF / fimg
en el tipo 1 de pilus ) ( Figuras 1b y 2a , b ) [ 11,12,13 ] la punta lleva en su parte superior
la subunidad crtico de unin al receptor , o adhesina , que define el tropismo bacteriana :
. la adhesina PapG ( P pilus ) reconoce los glicolpidos Gala1 - 4Gal de la pielonefritis
rin causando mientras que la adhesina FimH (tipo 1 de pilus ) se une al receptor
manosilado en la superficie del epitelio de la vejiga causando cistitis . trabajos recientes
han demostrado que una vez asociado a la punta , la conformacin adhesina - y por lo
tanto su afinidad para el azcar cognado - . se modifica drsticamente y se convierte
regulada por la fuerza de traccin aplicada a la pilus la variacin en la composicin de
punta podra ser el resultado de una propiedad sensor de fuerza mecnica especfica que
modula y regula la adhesina afinidad [ 14,15 ] .
Cada uno comparte la subunidad de pilina el mismo pliegue, una extensin no
estructurada N-terminal (NTE) de 10 a 20 residuos, seguido de un dominio bsico de seis
hebras topologa b-sndwich (Figura 2c). En la adhesina, la Nte es reemplazado por un
dominio de lectina que contiene el sitio sugarbinding. el dominio de ncleo de todas las
subunidades exhibe una inmunoglobulina (Ig)-como veces pero carece de la sptima
hebra de un cannica de Ig veces, lo que resulta en una ranura hidrfoba expuesta
disolvente. en las clulas, cada subunidad se secreta en el periplasma a travs de la
maquinaria en general Sec, donde se estabiliza en trans por una chaperona periplsmica
dedicado (PapD y FimC en P-pili y pili tipo 1, respectivamente) - una protena de 25 kDa
que consiste en dos dominios similares a Ig dispuestos en una L en forma de [8]. la
chaperona estabiliza la subunidad mediante la insercin de una de sus hebras (la cadena
G1) en la ranura hidrfobo de la subunidad, una interaccin denominada
'complementacin-donante hebra' (DSC) [16?, 17?].

Componentes e interacciones en la va de Cu. ( A ) Diagrama esquemtico de la pili tipo 1. (B) Diagrama
esquemtico de la pilus P. (C) la complementacin de Donantes hebra se muestra esquemticamente tanto
(arriba) y de una estructura cristalina (por debajo; .. AP cdigo 3JWN ) el dominio bsico de cada subunidad
(rojo ) forma una incompleta Ig veces con el b -captulo que falta, dejando un profundo surco hidrofbico en la
superficie de este captulo faltante se proporciona en trans por la chaperona G1 final ( amarillo) , que ocupa
los bolsillos P1- P4 , pero deja el bolsillo P5 libre . ( d ) Donantes intercambio de cadenas , se muestra que
para ( c) ( estructura es de cdigo PDB 3JWN ) . el Nte de la siguiente subunidad ( azul) ensamblado
proporciona la hebra que falta a la Ig - pliegue de la subunidad previamente montado , ocupando bolsillos P2 -
P5 . la estructura intermedia ilustra el mecanismo de cremallera en - cremallera de DSE comenzando con la
insercin del residuo P5 de Nte de la subunidad entrante en el bolsillo de P5 de la ranura de la subunidad
receptora , seguida por la invasin de la ranura de la subunidad receptora y zippering de cadena G1 de la
chaperona .

Esto evita la agregacin no productiva o la degradacin proteoltica de la subunidad en el
periplasma. La hebra chaperona G1 se caracteriza por un motivo conservado de una
pequea hidrfilo (P4) y tres alterna residuos voluminosos hidrfobos (P1-P3), que se
insertan dentro de la correspondiente P1 -P4 bolsillos de ranura de subunidades (Figura
2c).
Subunidades de pilus polimerizan usando la misma ranura de interaccin como DSC .
Durante la polimerizacin, la Nte de la subunidad entrante sustituye la hebra chaperona
G1 por un mecanismo denominado "intercambio de donantes hebra ' ( DSE ) [ 18 ? , 19 ?
] . Como en el caso de la hebra chaperona G1 , la Nte se caracteriza por un motivo
conservado de alternar residuos hidrfobos , denominado P2 - P5 , la interaccin con los
bolsillos de subunidades correspondientes ( Figura 2d) . es importante destacar que , el
bolsillo P5 subunidad no est ocupada en el complejo chaperona - asociado , que resulta
ser obligatorio para el inicio de DSE [ 20 ] . Como se ha demostrado por experimentos de
competicin , en tiempo real, la espectrometra de masas nativas y simulacin dinmica
molecular , la Nte reemplaza progresivamente la cadena G1 de manera concertada , a
travs de una cremallera en - postal Salida mecanismo , a partir de la interaccin de la
subunidad entrante residuo P5 de Nte con P5 bolsillo de la ranura subunidad receptora ,
seguido por la invasin progresiva de la ranura de la subunidad receptora por NTE de la
subunidad entrante y la zippering concomitante de la cadena G1 de la chaperona ( Figura
2c y d ) [ 21-24 ] .
El complejo conjunto de usher: estructura y mecanismo
El ensamblaje del pilus in vivo se cataliza en la membrana externa por el ujier, FimD [25?]
(Figura 3, el sistema de la FIM es el mejor caracterizado estructuralmente, y se utiliza aqu
como un modelo). FimD consiste en cinco campos distintos (Figura 3a): un dominio N-
terminal (NTD) con una alta afinidad por acompaante: complejos de subunidades, que se
cree que su sitio inicial de contratacin; un dominio b-barril que se extiende por la
membrana externa y [26,27, 28,29?] proporciona un poro a travs del cual el pilus
naciente se rosca [30?]; un dominio tapn que bloquea el poro Usher cuando no est en
uso, evitando la fuga de solutos a travs de la membrana externa [30, 31?], y dos C-
terminal de dominios (CTD1 y CTD2), que se ha demostrado recientemente para formar
un segundo sitio de unin para chaperona: complejos de subunidades [32,33, 34??].
Los avances en los ltimos aos han proporcionado un modelo para todo el ciclo de la
biognesis pilus (Figura 3b ) [ 33 ? ] . En 2008, la primera estructura cristalina del dominio
b- barril ujier, bloqueado por el tapn , dio una instantnea de el ujier en su estado
inactivo ( estructura I en la Figura 3b ) [ 30 ? ] . pili se monta una subunidad en un
momento y empujado hacia arriba a travs del poro Usher medida que se forman , por lo
que la primera subunidad para ser incorporado debe ser siempre la adhesina ( . FimH )
con el fin de garantizar la visualizacin del dominio de lectina en la punta del pilus - como
se requiere para la funcin de efecto, micrografas electrnicas de pili Fim revelan FimH
en la punta, como in vitro la unin al pilus ujier catalizada requiere la FimC : [ 13 ?] FimH
complejo para la iniciacin sobre la base de alta afinidad de la DTN para el FimC [ 25 ? ? ]
: . FimH complejo , el primer paso de la biognesis de pilus es probable que sea el
reclutamiento de FimC [ 27 , 35 ? ] : FimH a la NTD (paso 1 , la Estructura II , en la Figura
3b ) en 2011 , una estructura innovadora de FimD activada en complejo con FimC : . FimH
revel que FimC : FimH localiza a las DCA , con el dominio de lectina FimH desplazando
el enchufe de la de poro y la insercin dentro del lumen del barril ( estructura III en la
Figura 3b ) [ 33 ? ? ] . Esta etapa de iniciacin ( paso 2 en la Figura 3b ) debe implicar una
coreografa elaborada de movimientos de dominio que permanecen para ser
caracterizado completamente . Por ejemplo , el mecanismo de desplazamiento enchufe es
desconocido : experimentos de electrofisiologa en el conjunto P de pilus Usher sugieren
que el enchufe voltea transitoriamente fuera del poro incluso en ausencia de sustratos [ 37
] ; por lo que es concebible que el dominio de lectina FimH ( mientras est unido a la
Usher NTD . como se muestra en la estructura II en la Figura 3b ) inserta
espontneamente durante estas ventanas de tiempo breves Alternativamente, la unin de
FimC : FimH para el ujier NTD podra desencadenar el movimiento del tapn .
Otra pregunta abierta relacionada con el mecanismo de activacin FimD ujier por el FimC:
Complejo FimH es que, mientras que el FimC: Complejo FimH es conocido por ser
reclutados para el acomodador en el acomodador NTD, se observa ligado a las DCA ujier
en la FimD : FimC:. estructura FimH Desde ambos sitios (la DTN y el CTD) se confirman
acompaante: [??? 27, 33] subunidad sitios de unin y el sitio NTD se conoce a funcionar
antes del sitio de CTD en el ciclo de incorporacin de la subunidad [33 ??], una pregunta
importante es el mecanismo de FimC: FimH complejo de traspaso desde el NTD a las
DCA [33] Dicho traspaso debe involucrar a la disociacin y la reconsolidacin del
FimC:??. FimH, o un tercero no identificado-de-todava sitio de unin - potencialmente en
el enchufe [31,32,36].
La estructura cristalina de la FimD : FimC : complejo FimH tambin sugiri un mecanismo
de peso para la reaccin subsiguiente polimerizacin subunidad [ 33 ? ? ] Modelizacin de
la estructura de la siguiente chaperona : . Complejo Subunidad ( FimC : fimg ) en su sitio
de unin en el NTD ( estructura iv en la Figura 3b ) muestra fimg perfectamente situado
para someterse DSE , con su Nte situado justo al lado del surco de unin de FimH . es
muy probable , por tanto, que la capacidad del ujier para catalizar DSE reside en la
ubicacin precisa y la orientacin de los dos sustratos : chaperonas : complejos de
subunidades son reclutados por el NTD (paso 3 en la Figura 3b ) , con lo cual se someten
espontneamente DSE , la liberacin de la chaperona previamente consolidado ( paso 4)
y que permite la transferencia de la subunidad de nueva creacin a las DCA (paso 5 ).
Este ltimo paso es anlogo a la entrega de FimC : FimH durante la iniciacin y surgen
las mismas preguntas : mientras que la resonancia paramagntica electrnica (EPR ) y
espectroscopia NTD- bloqueantes experimentos confirman que el traspaso en efecto tener
lugar, la estructura y la cintica de [ 33 ? ] el proceso todava requiere elucidacin .

Despus de la incorporacin FimG , se inserta una sola copia de FIMF en la base de pilus
seguido de aproximadamente 1.000 copias de Fima ( cada nueva incorporacin
subunidad sigue los pasos 3-5 en la Figura 3b ) . Como las subunidades FimA emergen
desde el lado extracelular del poro que se pliegan en una hlice de mano derecha de 3,3
subunidades por vuelta, formando la varilla de pilus rgida y potencialmente proporcionar
una fuerza impulsora para la exportacin de pilus . En algunos sistemas de Cu,
incluyendo Papanicolaou, una subunidad terminador se incorpora una vez pilus alcanza
su longitud final, lo que impide una polimerizacin adicional ya que carece de la bolsa P5
requerida para iniciar la DSE [ 20 ] . Sin embargo, no hay tal subunidad ha sido
identificado en el sistema de la FIM , y no est claro cmo la longitud de los pili de tipo 1
es regulada .
Cintica y energtica del ensamblaje de la membrana externa
Una de las cuestiones pendientes es cmo el acomodador es capaz de catalizar la
ordenacin especfica de subunidades de pilus . Experimentos in vitro han demostrado un
papel clave para el Nte en la determinacin de la especificidad de la asociacin de la
subunidad subunidad , con diferentes NTES reaccionar preferentemente con sus
sustratos afines [ 38,39 ?] . un anlisis ms detallado ha revelado un papel especialmente
relevante para el bolsillo P5 y sus residuos que rodean [ 40,41 ] , en consonancia con su
papel en la iniciacin DSE [ 22 ] . orden Subunidad tambin se rige por la tasa de en el
que el acomodador recluta a los diferentes chapern : .. complejos de subunidades de la
piscina periplsmico mixta Esto a su vez es un producto de la afinidad diferencial de la
NTD ujier para las distintas subunidades y de sus concentraciones relativas en el
periplasma ( 35,42 ] Sin embargo , que an no se ha establecido si el ujier tiene un papel
ms directo en la subunidad de pedido , es decir, si coincide especficamente
subunidades en funcin de su posicin en el pilus final.
Tal vez la caracterstica ms impresionante de la va de CU es su capacidad para dirigir el
montaje de la subunidad de pilus eficiente y bien ordenada y sin aporte de energa
externa aparente. Complejos chaperona subunidad aislado puede polimerizar
espontneamente en fibras in vitro, pero a un ritmo muy lento [ 25 ? ? , 39 ?] . varios
estudios estructurales , termodinmicas y computacionales han llevado a la conclusin de
que la DSE hace que las subunidades a experimentar una transicin conformacional de
alta energa acompaante asociada intermedia a una tremendamente estable, endurecido
y el estado polimerizado ( 18 ? , 19 ? ,20,24,43 - 46 ] . de esta manera , las tiendas de
chaperona el plegado de la energa de la subunidad y lo utiliza para conjunto de la fuente .
Adems , una vez que el pilus ha pasado a travs del poro Usher en el medio extracelular
que hay ya tiene acceso a los chaperones y por lo tanto se evita que someterse a la
reaccin inversa . Este atrapamiento cintica da los pili completamente formado una
durabilidad sorprendente a pesar de su dependencia de las interacciones no covalentes
para la integridad [ 8,43 ] .
Estructura y mecanismo de la va de CU. (A) Componentes estructurales y organizacin del dominio del
sistema de la FIM, incluyendo el ujier (FimD), la chaperona (FimC), y los cuatro componentes de pilus (FimH,
fimg, FIMF y FimA). (. b) el modelo actual para el ensamblaje de pilus CU por el ujier FimD, se muestra el uso
de las estructuras conocidas y con la misma codificacin de colores como en el panel a imgenes fueron
creadas usando las estructuras conocidas de los dominios de can y los plug FimD (estructura i; AP cdigo
3OHN ), la estructura FimD NTD, con reborde FimC: FimH (AP cdigo 1ZE3), y la estructura completa FimD
con FimC: FimH atado (estructura iii; AP cdigo 3RFZ) los pasos son los siguientes: (1) haperone:. adhesina
de unin, (2 ) iniciacin, (3) al lado acompaante: la contratacin de la subunidad en la NTD, (4) donorstrand
intercambio con liberacin concomitante de la chaperona con destino a los TTA y (5) la transferencia a las
DCA Estos pasos se describen con mayor detalle en el texto principal..