SERVIO NACIONAL DE APRENDIZAGEM INDUSTRIAL

CETEC SENAI DOURADOS

CURSO TCNICO EM ALIMENTOS
COLORAO DE GRAM
MEIOS DE CULTURA PCA E PDA
MICROSCOPIA
MARLIA DA PAIXO VILA NOVA
DOURADOS
2014
MARLIA DA PAIXO VILA NOVA
COLORAO DE GRAM
MEIOS DE CULTURA PCA E PDA
MICROSCOPIA
DOURADOS
2014
Trabalho apresentado
competncia Microio!o"i# $%
A!i%$&'o(, ministrada pela docente
Pro)*+ T#i#&$, do Curso Tcnico em
Alimentos Turma B matutino.
3
1 COLORAO DE GRAM
Desenvolvida em 1! pelo bacteriolo"ista holands #ans Cristian $ram, a
colora%&o de $ram, rotineiramente utili'ada em laborat(rios de microbiolo"ia, consiste em
prepara%)es histol("icas para observa%&o ao microsc(pio (ptico, utili'ada para corar
di*erencialmente micror"anismos com base na composi%&o +u,mica da sua parede celular
sendo +ue a inte"ridade desta tambm inter*ere na colora%&o.
A tcnica de $ram permite dividir as bactrias em dois "randes "rupos- $ram
positivos .ro/o0 e $ram ne"ativas .vermelho0 alm de permitir o estudo da clula bacteriana
+uanto sua mor*olo"ia .cocos ou bacilos0 e arran1o.
2s micror"anismos di*erem +u,mica e *isicamente entre si, rea"indo de modo
di*erente s opera%)es de colora%&o. 3ste o princ,pio b4sico da colora%&o di*erencial.
3nt&o, desi"na5se colora%&o di*erencial o mtodo +ue permite distin"uir tipos de bactrias.
A mor*olo"ia individual e as rea%)es tintoriais constituem, em "eral, os critrios
preliminares para identi*ica%&o das bactrias e sua posterior classi*ica%&o. 2 e/ame
microsc(pico direto de um micror"anismo comumente suplementado com e/ame
microsc(pico ap(s colora%&o +ue, alm de *acilitar sua observa%&o, permite a visuali'a%&o
de determinadas estruturas. 2 mtodo de colora%&o de $ram permite colocar as bactrias
em dois "randes "rupos- as +ue retm o corante Cristal 6ioleta e +ue s&o denominadas
$ram5positivas e as +ue n&o retm este corante e se denominam $ram5ne"ativas. 3sta
caracter,stica um dos pontos de partida para a classi*ica%&o das bactrias.
2 mecanismo da colora%&o de $ram tem sido e/plicado por v4rias teorias. 7abe5se
ho1e +ue ele est4 li"ado permeabilidade da parede celular bacteriana, +ue retm o
comple/o iodopararrosanilina .composto do Cristal 6ioleta 8 9u"ol0 permitindo ou n&o a
descolora%&o pelo 4lcool.
3ssa di*eren%a na permeabilidade destas membranas aos rea"entes +u,micos leva a
di*eren%as de colora%&o. :a tcnica de $ram utili'a5se primeiro um corante b4sico, Cristal
6ioleta, se"uido de um mordente, 9u"ol +ue aumenta a a*inidade da clula para o corante,
um a"ente descolorante, o 4lcool a ;<= +ue remove o corante, e *inalmente um se"undo
corante b4sico, por e/emplo, a >ucsina b4sica. As clulas +ue retm o primeiro corante
chamam5se "ram .80 e as +ue descoram *icar&o coradas pelo se"undo corante e s&o as
"ram .50. :as "ram .50 o solvente 4lcool ou acetona remove a membrana e/terna da parede
destas bactrias, e como a camada de muco comple/o pouco espessa n&o conse"ue reter
o corante Cristal 6ioleta +ue assim retirado da clula por lava"em.
!
As bactrias $ram5positivas apresentam uma parede espessa, homo"nea,
"eralmente n&o estrati*icada e predominantemente constitu,da por peptido"licano. 2
peptido"licano um heteropol,mero r,"ido e insol?vel na 4"ua, constitu,do por cadeias
lineares de dois a%?cares aminados :A$ .4cido n5acetil"lucosamina0 e :A@ .4cido n5
acetilmurAmico0 li"ados entre si por li"a%)es "licos,dicas. As cadeias lineares li"am5se
entre si atravs de cadeias de +uatro amino4cidos. Deste modo, o precipitado insol?vel +ue
se *orma por a%&o do mordente, *ica retido no interior da clula pela camada espessa de
peptido"licano, lo"o, estas clulas n&o s&o descoradas permanecendo com a colora%&o
con*erida pelo corante prim4rio .Cristal 6ioleta0.
,i"-r# 1 . R$/r$($&'#01o 2# /#r$2$ 2#( #c'3ri#( "r#%./o(i'i4o(
As bactrias $ram5ne"ativas apresentam uma parede estrati*icada constitu,da por
uma membrana e/terna e por uma camada mais interna +ue contm peptido"licano e +ue
mais *ina +ue a das $ram5positivas. Deste modo, o precipitado insol?vel, +ue se *orma por
a%&o do mordente, removido .camada de peptido"licano mais *ina +ue a das $ram5
positivas e a membrana e/terna parcial ou totalmente solubili'ada pelo a"ente
descolorante0, pelo +ue as clulas *icam descoloradas, corando de vermelho pelo
contrastante.
<
,i"-r# 2 . R$/r$($&'#01o 2# /#r$2$ 2#( #c'3ri#( "r#%.&$"#'i4o(
A investi"a%&o das atividades metab(licas das bactrias in vitro chamada de
Brovas Bio+u,micas e servem para au/iliar o microbiolo"ista a identi*icar "rupos ou espcies
de bactrias ou leveduras atravs da veri*ica%&o das trans*orma%)es +u,micas, +ue ocorrem
num determinado substrato, pela a%&o das en'imas de um dado micror"anismo. Como
muitas ve'es um determinado micror"anismo possui um sistema en'im4tico espec,*ico,
promovendo trans*orma%&o bio+u,mica espec,*ica, as provas bio+u,micas podem ser
utili'adas na pr4tica para a sua caracteri'a%&o.
Bara a reali'a%&o das provas bio+u,micas necess4rio utili'ar meios de cultivo
especiais contendo o substrato a ser analisado e *ornecer ao micror"anismo as condi%)es
nutritivas e ambientais necess4rias ao seu desenvolvimento.
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2 MEIOS DE CULTURA9 PCA E PDA
2*1 M$io( 2$ C-!'-r#
2 meio de cultura denominado o material nutriente preparado no laborat(rio para o
crescimento de micror"anismo. Al"umas bactrias podem crescer normalmente em +ual+uer
meio de cultura, outras necessitam de meios especiais e e/istem a+uelas +ue n&o s&o
capa'es de crescer em nenhum meio de cultura 14 desenvolvido. 2s micror"anismos +ue
crescem e se multiplicam nos meios de cultura s&o denominados cultura.
2s critrios +ue devem ser considerados para um meio de cultura s&o- conter os
nutrientes corretos para +ue o micror"anismo de interesse possa crescerD conter a
+uantidade de 4"ua necess4riaD o p# a1ustado e a +uantidade espec,*ica de o/i"nio ou
E
mesmo sua ausncia. 2 meio dever4 inicialmente ser estril .n&o conter micror"anismo
vivos0, desta *orma conter4 somente os micror"anismos e sua "era%&o +ue *oram
adicionados ao meio. >inalmente, a cultura dever4 ser incubada na temperatura ade+uada
para seu crescimento.
2s meios dispon,veis em *orma comercial contm todos os componentes dese1ados
sendo necess4rio somente adi%&o de 4"ua para posterior esterili'a%&o. 2s meios de cultura
est&o constantemente sendo desenvolvidos ou mesmo atuali'ados para o isolamento e a
identi*ica%&o de bactrias principalmente nas 4reas de pes+uisa de alimentos, 4"ua e
microbiolo"ia cl,nica.
Fuando dese1ado o crescimento adicionado ao meio da bactria em meio s(lido
um a"ente solidi*icante como o 4"ar. 2 4"ar um polissacar,deo comple/o obtido a partir de
al"as marinhas. Boucos micror"anismos podem de"radar o 4"ar e, portanto, ele permanece
s(lido +uando adicionado ao meio de cultura. At a temperatura de <GHC, o 4"ar n&o causa
danos s bactrias +uando adicionado sobre o inoculo .um meio de cultura no +ual 14 e/iste
o micror"anismo crescendo0.
Im meio contendo 4"ar normalmente utili'ado em tubos de ensaio ou em Blacas
de Betri. 3m um tubo de ensaio o meio de cultura poder4 ser utili'ado de duas maneiras- 2
tubo de ensaio poder4 ser colocado na posi%&o inclinada, em determinado An"ulo,
*avorecendo a *orma%&o de uma re"i&o "rande para o crescimento durante a solidi*ica%&o,
esta *orma denominada 4"ar inclinado. A solidi*ica%&o do meio poder4 ocorrer com o tubo
na posi%&o vertical .4"ar em coluna0 permitindo um crescimento na pro*undidade do meio de
cultura. As placas de Betri s&o placas rasas contendo uma tampa +ue recolhe at o *undo
das placas evitando a contamina%&o. Fuando contm o meio de cultura s&o denominadas
culturas s(lidas em placas de Betri.
A an4lise laboratorial dividida em trs etapas- coleta de micror"anismo .material
biol("ico0 atravs do 7JabD cultivo do material .micror"anismo em cultura mista0D e an4lise
laboratorial em si, onde ocorre a separa%&o dos micror"anismos .reali'ada a partir de um
tubo contendo a cultura mista +ue, por dilui%&o sucessiva pla+ueada e sua colKnia isolada
em cultura pura0.
2*1*1 PCA : P!#'$ Co-&' A"#r
2s meios de cultivo destinam5se a propiciar o crescimento e o estudo das bactrias
de interesse medico. Assim, alm de conterem substAncias essenciais para a reprodu%&o
dessas bactrias, s&o *ormulados para permitir o crescimento seletivo de certos
micror"anismos ou para a demonstra%&o de propriedades biol("icas como a hem(lise,

*orma%&o de esporos, produ%&o de pi"mentos, testes de esterilidade em produtos

*armacuticos, identi*ica%&o ta/onKmica atravs de propriedades bio+u,micas, etc.
2 Blate Count A"ar .BCA0 permite o desenvolvimento de uma variada "ama de
bactrias e leveduras, o +ue permite sua indica%&o para uso principalmente em controle
microbiol("ico de alimentos.
2 meio padr&o de BCA recomendado para a enumera%&o de micror"anismos
vi4veis em leite, 4"ua, alimentos e produtos l4cteos.
7ua *(rmula contm triptona e e/trato de levedura como *ontes de carbono e
nitro"nio, e de/trose como *onte de carboidrato *erment4vel.
>inalidade do produto-
2 meio destina5se a conta"em de micror"anismos em 4"ua, leite, alimentos e
produtos l4cteos.
Composi%&o-
2 produto hidratado contm os se"uintes componentes para 19 de meio- Beptona de
Case,na 5 <", 3/trato de 9evedura 5 L,<", $licose 5 1", M"ar 5 ;" em p# E,G N G,L.
Onstru%&o de uso-
a. Peali'ar a coleta do material a ser testada em recipiente estril e em +uantidade
su*iciente para a reali'a%&o dos testes.
b. Trans*erir 1m9 da amostra a ser analisada, com pipeta estril para as placas de petri
estreis previamente identi*icadas.
c. Trans*erir o meio de Blate Count A"ar .BCA0 *undido e res*riado a cada placa de petri
e misture suavemente por movimentos circulares para homo"enei'ar as amostras.
d. A"uardar a solidi*ica%&o do 4"ar com a tampa entreaberta para a seca"em do 4"ar e
incubar as placas invertidas na estu*a a 3<53EQC por L!5! horas, lo"o ap(s incubar
em temperatura ambiente L<53GQC por mais L!5! horas.
Onterpreta%&o do resultado-
A aprova%&o ou reprova%&o do produto est4 condicionada aos limites estabelecidos
pelo *abricante ou por normas o*iciais por ele se"uida.
Brecau%)es tcnicas-
;
Todo laborat(rio de microbiolo"ia deve *uncionar sob "ide de normas bem
estabelecidas +ue possam prevenir contamina%&o n&o s( aos +ue trabalham nas 4reas de
risco, como tambm a+ueles +ue indiretamente a elas este1am relacionados. Cada 4rea da
microbiolo"ia deve ter o seu manual de boas pr4ticas laboratoriais .BB90.
Descarte-
Autoclavar 1L1HC por 3G minutos todo o material usado no manuseio
microbiol("ico.
2*1*2 PDA : Po'#'o D$6'ro($ A"#r
M"ar Batata De/trose um meio utili'ado para isolamento, cultivo e conta"em
.placa0 de bolores e leveduras. @eio composto por e/trato de batata, "licose e 4"ar +ue
estimula a esporula%&o .prepara%&o em lAminas0. Bode ser utili'ado como meio para
manuten%&o de culturas de dermat(*itos "eo*,licos e como meio di*erencial das variedades
at,picas de dermat(*itos
>inalidade de Iso-
@eio recomendado para o isolamento e enumera%&o de leveduras e bolores de
lactic,nios e outros alimentos.
Composi%&o em "R9-
On*us&o de batatas- 3GG.GG
De/trose- LG.GG
A"ar- 1<.GG
p# >inal .a L<HC0-
<.C N G.L
Brocedimento de Brepara%&o do @eio de Cultura-
Dissolva !1 "ramas em 1GGGml de 4"ua destilada. >erva para dissolver o meio
completamente. 3sterili'ar autoclavando a 1<lbs de press&o a 1L1HC por 1< minutos.
@isture bem antes de dispensar. 3m um trabalho espec,*ico, +uando o p# 3.< *or
necess4rio, acidi*icar o meio com 4cido tart4rico 1G= estril. A +uantidade de 4cido
necess4ria para 1GGml de meio estril e *rio apro/imadamente 1ml. :S2 AFI3TA o meio
ap(s a adi%&o do 4cido.
Avalia%&o de Pesultados
1G
Caracter,sticas da cultura depois de !5< dias a LLHC a L<HC.
Or"#&i(%o( ;AATC< Cr$(ci%$&'o ,or%#01o 2$ A(c7(/oro(
Asper"illus :,"er .1C!G!0 abundante 5
Candida albicans .1GL310 abundante 5
7accharomUces cerevisiae .;EC30 abundante 5
Controle de +ualidade-
Aparncia do p(- Cor creme, homo"neo e sem p( circulante.
7olidi*ica%&o- >irme, compar4vel com "el A"ar 1.<=.
Cor e transparncia- Cor Ambar claro, *orma de "elRsolu%&o em placas de Betri claro
a levemente opalescente.
Pea%&o-
A rea%&o de !.1= de solu%&o a+uosa tem p# *inal de <.C N G.L a L<oC.
Condi%)es de Arma'enamento-
Arma'enar o p( abai/o de 3GHC e o meio preparado de L a HC. Itili'e antes de
e/pirar a data de validade.
6alidade-
< anos.
5 MICROSCOPIA
A microscopia um processo b4sico de toda a biolo"ia moderna, sendo respons4vel
por al"umas das mais importantes descobertas relacionadas com a vida, como o caso da
clula e de toda a sua estrutura e *uncionamento. A hist(ria da microscopia come%a com o
*abrico das primeiras lentes (ticas, atravs do polimento do vidro, pelo *iorentino 7alvino d
VAmato, em 1L<. A ideia de combinar lentes para aumentar o tamanho dos ob1etos
menores data de 1<;G e deve5se a Wacharias Xanssen, sendo, o primeiro microsc(pio por
ele desenvolvido capa' de uma amplia%&o de cerca de 3G/. A capacidade de amplia%&o *oi
evoluindo em conse+uncia do aper*ei%oamento das lentes. :o sc. Y6OO, Antonie 6an
9eeuJenhoeZ .*,sico holands0 desenvolveu o microsc(pio simples capa' de amplia%)es de
at LGG/ e medindo apenas C,E cent,metros, com o +ual o cientista *e' a primeira
observa%&o de bactrias, s +uais na altura deu o nome de proto'o4rios. Durante o sc.
Y6OOO o microsc(pio tornou5se um ob1eto em moda, sendo *abricado por art,*ices com *eitios
11
e decora%)es ao "osto dos clientes, ori"inando autnticas obras de arte e decora%&o. Ainda
neste sculo, o microsc(pio passa a *a'er parte do processo de ensino das classes nobres e
ricas da sociedade. :o entanto, mal "rado os sucessivos aumentos de amplia%&o, as
ima"ens obtidas continuavam a ser de +ualidade in*erior, devido s di*iculdades em eliminar
as aberra%)es crom4ticas e distor%)es resultantes de imper*ei%)es das lentes. Apenas no
sculo YOY, com o aper*ei%oamento dos sistemas de *abrico de lentes, se conse"uiu atin"ir o
limite de resolu%&o m4/imo poss,vel utili'ando lu' vis,vel. 7ur"em tambm neste sculo os
primeiros microsc(pios binoculares .duas oculares em ve' de uma s(0. Bara a melhoria das
ima"ens obtidas com o microsc(pio (tico, *oram tambm *ulcrais os desenvolvimentos
veri*icados no campo da prepara%&o do material biol("ico para observa%&o, nomeadamente,
as tcnicas de colora%&o espec,*ica de or"anelos e estruturas celulares, de *i/a%&o, de
inclus&o e de corte. 2s primeiros ateliers especiali'ados no *abrico e comrcio dos
microsc(pios sur"em em meados do sculo YOY, sendo de destacar o de Camille57bastien
:achet, inau"urado em Baris em 13<, e o de [arl Weiss, inau"urado na Alemanha em
1!C.3m conse+uncia do desenvolvimento da microscopia, *oi poss,vel a observa%&o e
descoberta de in?meras estruturas e seres vivos microsc(picos at a+ui desconhecidos,
como bactrias, proto'o4rios e leveduras. Tambm "ra%as ao desenvolvimento da
microscopia, em 13<, 7chleiden e 7chJann, prop)em as bases da teoria celular, primeiro
"rande princ,pio uni*icador da biolo"ia, o +ual postula +ue todos os or"anismos vivos s&o
constitu,dos por clulas, sendo estas as unidades estruturais e *uncionais dos mesmos.
X4 no sculo YY, sur"em novas variantes do microsc(pio (tico, sendo de destacar a
inven%&o do microsc(pio de contraste de *ases .WernicZe, 1;!10 e o de contraste di*erencial
.:ormansZi, 1;<L0.
2 aper*ei%oamento do microsc(pio (tico *oi condu'ido at um ponto tal +ue, a ?nica
limita%&o era o "rande comprimento de onda da radia%&o .lu' vis,vel0 utili'ada para
ilumina%&o, este obst4culo impedia a obten%&o de um maior poder de resolu%&o. 3sta
di*iculdade levou os cientistas a procurarem um modelo de microsc(pio +ue usando outro
tipo de radia%&o para ilumina%&o .com menor comprimento de onda +ue a lu' vis,vel0
permitisse aumentar ainda mais a resolu%&o. 3m 1;L!, o *,sico 9ouis de Bro"lie, constata
+ue um *ei/e de eltrons apresenta um comportamento idntico aos raios luminosos, mas
com um comprimento de onda 1G.GGG/ menor, o +ue lan%a, os *undamentos da microscopia
eletrKnica, con1untamente com a teoria do e*eito de *oco de um campo ma"ntico ou
eletrost4tico sobre um *ei/e de eltrons, desenvolvida em 1;LC por #ans Bush, investi"ador
da Iniversidade de Xena, a +ual prova +ue poss,vel *ocar um *ei/e de eltrons com lentes
ma"nticas cil,ndricas. 3stavam assim elaboradas as bases te(ricas do microsc(pio
eletrKnico, sendo o primeiro aparelho constru,do em 1;31R1;3L por 3rnst PusZa .Brmio
1L
:obel da >,sica em 1;C0 e por @a/ [noll. 3m 1;33 o microsc(pio eletrKnico ultrapassava
14 o limite de resolu%&o do microsc(pio (tico. :o entanto, s( ap(s a 7e"unda $uerra
@undial o microsc(pio eletrKnico se desenvolve em pleno, constituindo5se o 3lmsZop O,
desenvolvido por 3rnst PusZa e Bodo 6an Bonier nos laborat(rios da 7iemens, como o mais
*amoso dos primeiros microsc(pios eletrKnicos. A microscopia eletrKnica teve um r4pido
desenvolvimento em pouco anos, "ra%as a "randes aper*ei%oamentos tcnicos +ue
permitiram n&o apenas maiores valores de amplia%&o, mas tambm aumentos sucessivos
da capacidade de resolu%&o e da +ualidade das ima"ens obtidas. 3stes pro"ressos *oram
tambm tornados poss,veis "ra%as ao aper*ei%oamento dos mtodos de prepara%&o do
material biol("ico para observa%&o, sendo desenvolvidas v4rias tcnicas, como a de
obten%&o de cortes ultra*inos e a de *i/a%&o de estruturas celulares atravs do uso de
resinas sintticas, entre outras. Ima variante do microsc(pio eletrKnico com "rande
interesse para a biolo"ia, 14 +ue permite a obten%&o de ima"ens de material n&o
seccionado, o microsc(pio eletrKnico de varrimento ou scannin" desenvolvido pela
primeira ve' em 1;C< pela empresa Cambrid"e Onstruments.