I.

Marco terico

1. Enzimoinmunoensayo (ELISA)

1.1 Definicin

El ELISA es una tcnica que se basa en el uso de un antgeno o un
anticuerpo marcado con una enzima; al estar uno estos componentes
marcado y fijado a un soporte, se interrumpe la reaccin antgeno-
anticuerpo, posteriormente se le agrega un sustrato especfico sobre la
enzima que producir un color determinado observable a simple vista o
cuantificable por un espectrofotmetro o analizar la reaccin antgeno
anticuerpo. Existen diversos tipos de ELISA los que se marca el anticuerpo:
directo, indirecto, sndwich: Doble, Heterlogo.

1.1.1 Antgeno

Un antgeno es una molcula capaz de producir una respuesta del sistema
inmune adaptativo mediante la activacin de linfocitos. Esta definicin
ampla el concepto de antgeno ms all del concepto clsico que defina
antgeno como la sustancia que desencadena la produccin de
anticuerpos. As dentro de esta definicin de antgeno se incluyen las
molculas que, previa presentacin antignica, son capaces de
desencadenar la activacin de clulas T citotxicas capaces de destruir las
clulas diana sin la participacin de anticuerpos.

La mayora de los antgenos son de naturaleza peptdica, aunque tambin
pueden actuar como antgenos molculas de distintos tipos como
lipopolisacridos e incluso ADN. Los antgenos pueden ser molculas
enteras pero generalmente son el resultado del procesamiento por clulas
presentadoras de antgenos.

1.1.2 Anticuerpo
Los anticuerpos constituyen glicoprotenas plasmticas globulares,
llamadas Inmunoglobulinas. Son molculas formadas por los linfocitos B
maduros. La funcin del anticuerpo consiste en unirse al antgeno y
presentarlo a clulas efectoras del sistema inmune para su destruccin.
Esta funcin est relacionada con la estructura de los distintos tipos de
inmunoglobulinas, las cuales son: IgA, IgD, IgE, IgG y IgM.
Los ELISA detectan principalmente dos tipos de inmunoglobulinas:
- Inmunoglobulina M (IgM): representa el 6% del total de inmunoglobulina.
Aparece en los linfocitos B unida a su membrana plasmtica. Se manifiesta
en la respuesta primaria activando el sistema del complemento.

- Inmunoglobulina G (IgG): Es la ms abundante (80% del total de
inmunoglobulinas). Se une rpidamente con macrfagos y neutrfilos,
provocando la destruccin del microorganismo. Puede atravesar la barrera
placentaria y se secreta en la leche materna. Por ello, es responsable de la
inmunidad fetal y la del recin nacido. Es la mayoritaria en la respuesta
inmune secundaria.

Asimismo, los anticuerpos que se utilizan en la tcnica de ELISA pueden
ser de origen monoclonal o policlonal, en ocasiones, ambos:

- Anticuerpos de origen monoclonal: anticuerpos homogneos producidos
por una clula hbrida producto de la fusin de un clon de linfocitos B
descendiente de una sola y nica clula madre y una clula plasmtica
tumoral, por lo tanto su especificidad es nica.

- Anticuerpos de origen policlonal: son anticuerpos derivados de
diferentes lneas de clulas B. Los anticuerpos policlonales son una
mezcla de inmunoglobulina, secretados en contra de un antgeno
especfico, cada una reconociendo diferentes eptopes


1.2 Clasificacin de ELISAS

1.2.1 Deteccin

- ELISA directo: deteccin de antgenos
- ELISA indirecto: deteccin de anticuerpos
Si los antgenos estn unidos a la placa, se puede detectar mediante un
anticuerpo anti-antgeno marcado (Elisa directo) o empleando un
anticuerpo primario anti-antgeno y uno secundario anti-primario marcado
(ELISA indirecto), esto permite amplificar la seal pues uno o ms
anticuerpos secundarios pueden unirse a cada anticuerpo primario.
1.2.2 Diseo

- Competitivo: los anticuerpos o los antgenos son inmovilizados sobre la
fase slida y su unin con el conjugado antgeno-enzima o anticuerpo-
enzima, es inhibida por la presencia de analito no marcado en la
muestra. Las incubaciones entre muestras y conjugados pueden ser
simultneas o secuenciales.
- No competitivo: se enfrenta la muestra con el antgeno o anticuerpo que
est en la fase slida. Si se produce la unin antgeno anticuerpo, al
agregar el conjugado reaccionar con el respectivo sustrato
desarrollando color.

1.2.3 ELISA sndwich

Es el ejemplo clsico de mtodos para la deteccin de antgenos, el primer
anticuerpo captura el antgeno de la muestra que es detectado a travs del
conjugado anticuerpo-enzima o amplificado con un conjugado dirigido
contra el segundo anticuerpo (sndwich doble anticuerpo modificado) u
otros procedimientos.

Los ensayos sndwich doble antgeno, son usados para la deteccin de
anticuerpos y sonmuy tiles para la evaluacin de la respuesta inmune
inducida por vacunas; en estos ensayos, al igual que en los indirectos, los
antgenos capturan los anticuerpos, pero en esta ocasin en lugar de un
conjugado anti-inmunoglobulina-enzima, usamos antgeno-enzima, de esta
forma se alcanza la mxima sensibilidad y detectabilidad al no ser
necesario diluir las muestras; sin embargo, detectamos todas las clases de
inmunoglobulinas, lo que en ocasiones no es conveniente.
En general, los ensayos sndwich son ms apropiados para la
automatizacin de los sistemas ELISA, ya que puede disminuirse un paso
de reaccin aadiendo simultneamente muestras y conjugado, aunque
hay que prever las posibles interferencias del conjugado a elevadas
concentraciones de antgenos o anticuerpos en la muestra.