Manual de Prácticas de Laboratorio

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MANUAL DE PRCTICAS DE LABORATORIO
BIOQUMICA
UNAM 2013
I. Conceptos tericos iniciales
El mtodo cientfico
El Sistema nternacional de Unidades (S)
Matemticas para el laboratorio
Notacin cientfica o exponencial
El mtodo del factor unitario en los clculos
Logaritmos
Grficas
Algunos mtodos utilizados en bioqumica
Centrifugacin
Potenciometra
Electroforesis
Soluciones
Manejo de material biolgico
Medidas de seguridad
II. Experimentos
Prctica 1. Soluciones.
Prctica 2. Regulacin del equilibrio cido-base despus de ejercicio muscular intenso y de la ingestin de
bicarbonato de sodio.
Prctica 3. Cintica enzimtica. Efecto de la concentracin del sustrato en la velocidad de la reaccin
enzimtica.
Prctica 4. Estudio del bombeo de protones por levaduras; efecto de los inhibidores de la cadena de transporte
de electrones de los desacoplantes.
Prctica 5. Determinacin de glucosa en sangre total.
Prctica 6. Determinacin de lipoprotenas
Prctica 7. ntegracin metablica
Prctica 8. Huella gnica.
III. Casos de correlacin bioqumica y prctica mdica
Caso 1. Clera.
Caso 2. Oclusin intestinal. Acidosis metablica. Deshidratacin grave
Caso 3. Hipoglucemia secundaria a intoxicacin Alcohlica.
Caso 4. Cetosis por inanicin. Obesidad.
Caso 5. Hipercolesterolemia y aterosclerosis.
Caso 6. Gota.
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CONCEPTOS TERICOS INICIALES
EL MTODO CIENTFICO.
La cultura no puede comprenderse sin hacer referencia al mtodo cientfico. La ciencia no es un
sector de la civilizacin que pueda separarse del resto de ella, sino un esfuerzo creativo con su
propio sistema de valores que, poco a poco, ha llegado a formar parte de los valores generales en
la sociedad moderna. La ciencia est basada en el mtodo cientfico; su capacidad y limitaciones
estn definidas por l y dondequiera que el mtodo cientfico sea aplicable, puede haber ciencia.
l origen de la ciencia se pierde en el ms remoto pasado. !ucho antes de que e"istieran los
registros histricos de la humanidad, la magia primitiva dio origen tambin a la religin y, mucho
antes, al arte. #iencia, religin y arte difieren en mtodos, pero coinciden en metas$ comprender e
interpretar al universo y la interaccin de sus partes para promover el progreso material y
espiritual de la humanidad. l ob%etivo de la ciencia es hacer teoras. Las teoras cientficas
e"plican los hechos y predicen con alto grado de probabilidad la ocurrencia de hechos similares.
La secuencia del mtodo cientfico es$ observar, plantear problemas, hacer hiptesis, e"perimentar
y formular teoras. #ada uno de los procesos del mtodo cientfico, tomado aisladamente, forma
parte de la actuacin cotidiana de todos los seres humanos, pero, en su con%unto, utilizados
sistemticamente, constituyen la ms poderosa herramienta que ha dise&ado la humanidad para
conocer y controlar a la naturaleza.
Observacin
l mtodo cientfico se inicia con la observacin. Lo que no puede observarse, directa o
indirectamente por medio de instrumentos o de modificaciones de la conducta, no puede ser
investigado por la ciencia.
La observacin debe ser repetida en forma independiente por observadores diversos. Las
observaciones 'nicas, que no se repiten ni actual ni potencialmente, no pueden ser ob%eto de
estudio cientfico.
Problea
(espus de que una observacin se hace y se repite, el segundo tiempo del mtodo cientfico es
plantear un problema; en otras palabras, se hacen preguntas sobre la observacin$ )#mo es que
los hechos ocurren de esta manera* )+u es lo que determina su desarrollo, evolucin y trmino*
s en este punto donde el cientfico difiere del hombre com'n; ambos hacen observaciones pero
slo el primero muestra curiosidad cientfica sobre ellas. ,lantear un problema es hacer preguntas,
pero, hacer
-buenas preguntas. al igual que hacer -buenas observaciones. es un arte muy preciado. ,ara que
tengan valor cientfico los problemas deben ser significativos y tener respuestas comprobables por
tcnicas apropiadas. Las preguntas que se inician por )cmo* o )qu* /e resuelven me%or,
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cientficamente, que las que comienzan con )por qu*, pero los investigadores pueden formular
los problemas para que adopten la forma adecuada.
!i"#esis.
0na vez planteado un problema adecuado, el cientfico procede al tercer tiempo del mtodo$
formular una e"plicacin o hiptesis. ,or supuesto que un problema puede tener varias
e"plicaciones posibles, pero slo una de ellas es la verdadera. Las respuestas casuales a un
problema son generalmente errneas; pero el cientfico con su intuicin, su e"periencia y, a veces
por incidentes afortunados, acierta en la hiptesis. sto se sabe al emplear el cuarto tiempo del
mtodo cientfico.
E$"erien#acin.
l ob%etivo de la e"perimentacin es comprobar la validez de la hiptesis. /i los e"perimentos
demuestran que la hiptesis es errnea, se hace una nueva y se la su%eta a comprobacin. l
procedimiento puede prolongarse por mucho tiempo al formular nuevas hiptesis y tratar de
comprobarlas e"perimentalmente. La situacin ideal en la e"perimentacin consiste en reducir el
problema a dos alternativas posibles que puedan contestarse con claridad, afirmativa o
negativamente; pero en muchas ocasiones los resultados del e"perimento slo conducen a
soluciones parciales. La e"perimentacin es la parte ms ardua del mtodo cientfico. #ada
e"perimento es un caso en s mismo; el conocimiento anterior y la e"periencia ayudan
tcnicamente para decidir la forma en que una hiptesis puede ser comprobada
e"perimentalmente. La eleccin correcta del e"perimento y su interpretacin es lo que separa al
genio del aficionado a la investigacin.
Teor%a.
Las pruebas e"perimentales son la base del quinto pelda&o, final del mtodo cientfico$ la
formulacin de una teora. #uando una hiptesis se ha sostenido por pruebas convincentes,
obtenidas por muchos laboratorios e investigadores independientes, se propone una teora que
consiste en una afirmacin con lmites mucho ms amplios que los e"perimentos en que se basa y
que e"presa la creencia o probabilidad de que sea valedera en cualquier combinacin de su%eto,
tiempo y lugar en donde se
re'nan condiciones similares. (esde este punto de vista una buena teora permite hacer
-predicciones.. Las predicciones cientficas tienen siempre un soporte e"perimental muy slido y
aun cuando no afirman que un hecho ocurrir con certidumbre, s plantean que tiene una gran
probabilidad de ocurrir. 0nas pocas teoras han probado su validez tan universalmente, y e"presan
tan alto grado de probabilidad, que se las conoce con el nombre de leyes naturales. ,or e%emplo,
ninguna e"cepcin se conoce al hecho de que una manzana desprendida de su rbol caer al suelo
si no es sostenida de alguna manera. La ley de gravitacin se basa en esta observacin. Las leyes
naturales orientan la investigacin cientfica. /i en el anlisis de un hecho se elimina lo imposible,
aquello que es contrario a las leyes naturales, lo que resta, aunque sea muy raro y poco probable,
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debe ser la verdad. La verdad son los hechos que nos rodean. 1unque acontecen sin cesar a
nuestro alrededor, muy pocas personas y muy pocas veces se hace un anlisis cientfico de ellas. /i
se emplean las leyes naturales para marcar lo
imposible, con el resto posible se hacen nuevas hiptesis, se comprueban por e"perimentos, se
formulan nuevas teoras y se acumula el conocimiento cientfico que ha permitido al hombre
situarse en un 0niverso observable que tiene un radio 2r3 de millares de millones de a&os luz y que
incluye un microcosmos tan peque&o que se e"presa en rdenes de magnitud menores de 45 675
m y adquirir un dominio incuestionable sobre su ambiente.
SISTEMA INTERNACIONAL DE &NIDADES 'SI(
Los resultados de todos los e"perimentos en que se basan las teoras cientficas y las leyes
naturales derivan de las mediciones de ob%etos o de sus propiedades. !edir es comparar
magnitudes; toda medicin comprende un n'mero y una unidad. La unidad identifica la clase de
dimensin y el n'mero e"presa las veces que la unidad est contenida en el ob%eto o la propiedad
medida. La medicin es un
arte muy refinado; en la actualidad emplea instrumentos muy comple%os y alcanza una precisin
e"traordinaria. 0n sistema de medidas preciso requiere unidades bien definidas. La 8ficina
9nternacional de ,esas y !edidas revisa peridicamente el sistema para incorporar los adelantos
tecnolgicos y me%orar la e"actitud y precisin de las medidas. /e han hecho muchos esfuerzos
para desarrollar un
sistema de unidades universalmente aceptable. l producto de estos esfuerzos es el /istema
9nternacional de 0nidades 2cuya abreviatura es SI en todos los idiomas3. 1 partir del creciente
intercambio de informacin cientfica este sistema ha sido aceptado por toda la comunidad y en
especial en medicina. l /9 es esencialmente una versin ampliada del sistema mtrico decimal.
l /9 comprende tres tipos de unidades$ las unidades de base, las unidades derivadas, las unidades
suplementarias y una serie de prefi%os que permiten tomar m'ltiplos y subm'ltiplos decimales de
las unidades utilizadas.
&ni)a)es )e base
l /9 consta de siete unidades bsicas que son dimensionalmente independientes. Las unidades
bsicas estn anotadas en el cuadro 9.4, %unto con los smbolos que hay que utilizar para indicar
estas cantidades.
&ni)a)es SI )eriva)as
1l multiplicar una unidad de base por s misma o al asociar dos o ms unidades de base por una
simple multiplicacin o divisin, se puede formar un amplio grupo de unidades llamadas /9
derivadas 2cuadro 9.73. %emplo$ la unidad derivada de volumen es el metro elevado al cubo, o
metro c'bico. La combinacin de unidades de base para formar las unidades derivadas es una de
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las grandes venta%as del /9. n el /9 no es preciso memorizar factores de conversin; el factor a
que se recurre para formar las unidades derivadas es 4 2unidad3, cualidad que hace al /9 coherente.
#uadro 4.4 &ni)a)es *+sicas )el SI.
Magnitud Nombre Smbol
o
Longitud metro !
!asa :ilogramo :g
;iempo segundos /
#antidad de sustancia mol mol
;emperatura termodinmica. <elvin :
9ntensidad luminosa candela cd
9ntensidad de corriente elctrica ampere 1
#uadro 4.7. Al,-nas -ni)a)es )eriva)as si"les.
o
/uperficie metro cuadrado m7
=olumen metro c'bico m>
#oncentracin de sustancia mol?metro c'bico mol?m>
=elocidad metro por segundo m?s
1 cierto n'mero de unidades /9 derivadas se les ha dado nombres especiales, en su mayor parte
tomados de los hombres de ciencia que han hecho contribuciones notables al conocimiento del
tema de estudio correspondiente 2cuadro 9.>3.
Pre.i/os SI
#uando las unidades /9 derivadas resultan demasiado grandes o demasiado peque&as para
determinados fines 2sera desproporcionado, por e%emplo, utilizar el metro c'bico para e"presar el
volumen de sangre del cuerpo humano3, el /9 contiene una serie de prefi%os que permiten formar
m'ltiplos y subm'ltiplos decimales de las unidades /9 2cuadro 9.@3.
Los prefi%os /9 se anteponen directamente al nombre de la unidad, sin signo de puntuacin alguno
2e%emplo$ nanmetro y no nanoAmetro3. l smbolo del prefi%o se antepone tambin directamente
al smbolo de la unidad, sin espacios intermedios ni signos de puntuacin 2e%emplo$ mm,
milmetros; nmol, nanomol que equivale 45 6B moles3.
#uadro 4.>. &ni)a)es SI )eriva)as con nobres es"eciales.
o
Definici
n
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Cuerza. DeEton Dm <gm?s7
,resin ,ascal ,a D?m7
;raba%o; energa; cantidad de calor Foule F Dm
#arga elctrica; cantidad de electricidad #oulomb # 1.s
,otencia; flu%o energtico Gatt G F?s
;ensin elctrica; potencial elctrico =olt = G?1
;emperatura #elsius Hrado #elsius I# :67J>,4K
#uadro 4.@. Pre.i/os SI.
Facto
r
Prefij
o
Smbol
o
45
4L
e"a
45
4M
peta ,
45
47
;era ;
45
B
Higa H
45
K
!ega !
45
>
:ilo <
45
6>
!ili m
45
6K
!icro N
45
6B
Dano n
45
647
,ico p
45
64M
Cemo C
45
64L
ato q
&ni)a)es no "er#enecien#es al SI
#iertas unidades a%enas al /9 son de uso tan frecuente que en cierto modo forman parte de nuestra
vida cotidiana y se acord utilizarlas %untamente con el /9 2cuadro 9.M3. 1lgunas de estas unidades,
en especial el litro y las unidades de tiempo, son de gran importancia en las profesiones de la
salud. #onviene se&alar que el litro es un nombre especial que se da al subm'ltiplo, decmetro
c'bico, de la unidad /9 de volumen.
#uadro 4.M. Al,-nas -ni)a)es no "er#enecien#es al SI.
Magnitu
d
Unida
d
Smbol
o
Valor en SI
;iempo !inuto min K5 s
Oora O > K55 s
(a ( LK @55 s
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=olumen Litro L o l 45A
>
m
>
nerga #alora cal @.4LM F
Re,las )e escri#-ra )e s%bolos 0 ci.ras.
Los smbolos de las unidades no toman la terminacin del plural 2e%emplo$ dos mililitros se escribe
7 ml, y no 7 mls3. Los smbolos de las unidades %ams van seguidos de un punto, salvo si estn al
final de una frase 2e%emplo$ M ml y no M ml.3. #uando se escriben cifras, la coma slo se puede
utilizar para indicar los decimales; las cifras deben agruparse en tros, dispuestos a la derecha y a
la izquierda de la coma, y separados entre s por un peque&o espacio. %emplo$
Corma correcta$ 4 555 555
5,55> 7JL
5.55> 7JL
Corma incorrecta$ 4,555,555
5.55>,7JL
La multiplicacin de las unidades se indica con un punto a nivel o elevado 2neEton. metroPD.m3 o
un espacio 2D m3. La divisin se puede indicar mediante una barra oblicua o por e"ponentes
negativos$
4?s P s
64
mol por metro c'bico puede e"presarse por$ mol?m
>
o mol.m
6>
.

l /9 tiene muchas venta%as y algunas desventa%as, pero se reconoce la realidad del esfuerzo para
implantarlo como una forma de e"presar los datos cientficos, comprensible para todos.
/e recomienda desechar las unidades que no pertenecen al /9 a la mayor brevedad posible, pero la
realidad del uso de otras unidades en te"tos y comunicaciones cientficas no se puede negar. n
este Manual las unidades /9 se anotarn entre parntesis cuando se %uzgue conveniente.
AL1&NAS RECOMENDACIONES PARA &TILI2AR EL 3SI4 EN *IO5&IMICA.
,1Q1 R,Q/1Q #8D#D;Q1#98D/.
La concentracin de sustancias cuya masa molecular se conoce se e"presa en forma de cantidad de
sustancia, es decir, en moles 2o en subm'ltiplos como el milimol o el nanomol3 por litro.
%emplo$
cido rico en el suero o plasma:
=arones$ 5.4L a 5.M> mmol?l.
!u%eres$ 5.4M a 5.@M mmol?l.
olesterol en el suero o plasma: >.B a J.7 mmol?l.
!lucosa en el suero o plasma: >.K a K.4 mmol?l.
Vitamina " en el suero: 5.M> a 7.4 Nmol?l.
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La concentracin en forma de cantidad de sustancia no debe ser denominada -concentracin
molar. o molaridad, ni utilizar el smbolo ! en vez de mol?l 2como tampoco m!, n!, etctera, en
vez de mmol?l, nmol?l, etctera3. La concentracin de sustancias cuya masa molecular se
desconoce o es dudosa se e"presa en <g?l, g?l, mg?l, etctera.
%emplo$
Protena s#rica total: K5 a L5 g?l.
"lbmina s#rica: >> a MM g?l.
!lobulina s#rica: 75 a >K g?l.
Fibrin$geno en el plasma: 7 a K g?l.
%ormona antidiur#tica en plasma: 7 a 47 pg?ml
oncentraci$n de sustancias en tejidos. /e e"presa en unidades de masa 2si no se conoce la masa
molecular3 o en moles 2si se conoce la masa molecular3 por <ilogramo de te%ido seco o h'medo.
%emplo$ g?<g, mg?<g o mol?<g, mmol?<g, etctera.
Do se recomienda e"presarla en unidades de volumen, es decir en mg?ml, g?l, etctera.
oncentraci$n de iones &idr$geno' La concentracin de hidrogeniones en los lquidos biolgicos
se e"presa en nmol?l, as como en unidades de pO. l valor del pO se define como el
logaritmo negativo de la actividad de los iones hidrgeno 2pO P A log OS3, esta actividad puede
determinarse potenciomtricamente con la ayuda de un pOAmetro.
"cti(idad en)im*tica. La unidad /9 de actividad cataltica es mol por segundo$ mol?s 2tambin
llamado <atal, smbolo$ <at3 y corresponde a la cantidad de sustrato transformado por segundo
como resultado de la catlisis. La velocidad medida es proporcional a la cantidad de enzima
presente. La actividad tambin puede ser e"presada en trminos de unidades 2smbolo$ 03. ,or
definicin, una unidad es igual a la concentracin de enzima necesaria para la formacin de un
micromol de producto por minuto 2Nmol?min3. La actividad especfica de una enzima se define
como la concentracin de producto que se forma por 4 miligramo de enzima por minuto.
MATEM6TICAS PARA EL LA*ORATORIO
No#acin cien#%.ica o e$"onencial.
#uando se e"presan cantidades muy grandes o muy peque&as, como es el caso frecuente en
bioqumica, la dificultad de escribir y manipular muchos ceros se evita con el uso de la notacin
e"ponencial o cientfica. n la notacin e"ponencial todo n'mero puede e"presarse como una
potencia entera de 45, o como un producto de dos n'meros, uno de los cuales es una potencia
entera de 45.
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%emplo$ el n'mero de 1vogadro seiscientos dos se"tillones se escribe$
K57 555 555 555 555 555 555 555 y en la notacin e"ponencial como una cantidad decimal
multiplicada por 45 elevada a la potencia apropiada P K.57 " 45
7>
.
#omo e%ercicio, e"amine las cantidades siguientes$
755 P 7 " 45 " 45 P 7 " 45
7
75M P 7.5M " 45
7
75M 555 P 7.5M " 45
M
5.75M P 7.5M " 45
64
5.555 75M P 7.5M " 45
6@
5.555 555 4P 4?45 555 555 P 4 " 45
6J
l e"ponente de la base 45 para n'meros mayores de la unidad es el n'mero de lugares desde la
coma o punto decimal separada de la primera cifra significativa$ 75M P 7.5M " 45
7
P 7 lugares.
,ara fracciones decimales menores de la unidad se separa la primera cifra distinta de cero despus
de la coma decimal y se cuentan los lugares hacia la izquierda hasta la coma decimal, incluso la
cifra separada y el n'mero es el e"ponente negativo$ 5.555 75M P 5.555 -7.5M del 7 a la coma
decimal son @ lugares; por lo tanto, es 7.5M " 45
6@
.
+as operaciones de multiplicar , di(idir, elevar a potencias o e"traer races se facilitan
manipulando los e"ponentes seg'n reglas muy sencillas. La porcin decimal no e"ponencial se
opera en forma ordinaria, lo que reduce el mane%o a tres cifras significativas como m"imo; los
e"ponentes se suman algebraicamente para multiplicar, se restan para dividir, se multiplican por
una potencia deseada para tener el e"ponente de la misma y para encontrar races se divide el
e"ponente entre el ndice de la raz. %emplos$
K " 45
K
por > " 45
>
P 4L " 45
B
P 4.L " 45
45
ya que K " > P 4L y 45
K
S>P 45
B
K " 45
K
entre > " 45
>
P 7 " 45
>
ya que K?> P 7 y 45
K
6>P 45
>
.
Para la adici$n , la sustracci$n usando notacin cientfica, primero se escribe cada cantidad con
el mismo e"ponente n. Luego se realiza la operacin deseada entre los valores N- y N./donde N-
y N. son los n'meros obtenidos con el mismo e"ponente; estos 'ltimos permanecen iguales.
%emplo$
2M.4 " 45
7
3 S 2>.@ " 45
>
3 P 25.M4 " 45
>
3 S 2>.@ " 45
>
3 P >.B4 " 45
>
El 7#o)o )el .ac#or -ni#ario en los C+lc-los.
l procedimiento que se utilizar para resolver problemas que incluyan conversin de unidades se
denomina mtodo del factor unitario. sta tcnica se basa en las propiedades del n'mero 4, es
decir$
T #ualquier n'mero al ser multiplicado por uno, sigue siendo el mismo n'mero 24 " M P M3.
T l n'mero 4 puede ser escrito como el cociente de cualquier n'mero dividido por si mismo 2>?>
K?K3.
T /e puede tomar cualquier ecuacin y dividirla por uno de los miembros para obtener una razn
igual al n'mero 4. ,or e%emplo, dada la ecuacin$
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5 minuto P K5 segundos, obtener la razn igual al n'mero 4.
4 minuto P K5 segundos
4 minuto 4 minuto
4P K5 segundos 4P 4 minuto
4 minuto K5 segundos
stas razones o factores que son equivalentes al n'mero 4 se conocen como factores unitarios,
factores de conversin o coeficientes de conversin. l recproco de cualquier factor unitario es
tambin un
factor unitario. n ambos casos el numerador y el denominador describen la misma cantidad, por
lo que se puede efectuar conversiones entre diferentes unidades que miden la misma cantidad. l
mtodo del factor unitario consiste en$
4. ;omar una relacin entre unidades y e"presarla en forma de una ecuacin.
7. Luego e"presar la relacin en forma de una fraccin 2llamada factor de conversin3.
>. !ultiplicar la cantidad dada por ese factor. n esta multiplicacin, las unidades idnticas se
multiplican o cancelan como si fueran n'meros.
%emplo$ )#untos Nl hay en 5.5555M L 2M " 45AML3*
43 4 Nl P 45
AK
L 4 L P 45
K
Nl
73 45
K
Nl ?l L
>3 M " 45
AM
L "P M " 45
UAMS KV
P M " 45
4
Nl P M5Nl.
n este mtodo las unidades se acarrean en todo el proceso del clculo, por lo tanto si la ecuacin
se establece en forma correcta, todas las unidades se cancelan e"cepto la deseada.
Lo,ari#os
l logaritmo de un n'mero es el e"ponente o potencia de una base determinada que se requiere
para obtener el n'mero. /i el n'mero -a. elevado a la potencia -n. 2an3 es igual al n'mero -D.,
entonces -n. es el logaritmo de base -a. del n'mero -D.. s decir$ si an P D entonces n P loga de
D La base -a. puede ser cualquier n'mero; en la prctica mdica se usa como base el n'mero 45 y
los logaritmos resultantes se conocen como logaritmos -comunes. o de Wriggs. /u smbolo es$ log
o log.45
Los logaritmos son indispensables para mane%ar los datos bioqumicos; constan de dos partes que
se separan por una coma o punto decimal; a la izquierda, la caracterstica corresponde al orden de
magnitud y puede ser positiva o negativa seg'n sea la cantidad mayor o menor de la unidad. l
e"ponente de la base 45 para n'meros mayores de la unidad es siempre positivo. #uando es
negativo se indica con el signo menos arriba del n'mero que la representa$
5.554 P 45
A>
caracterstica >
4 555 P 45
A>
caracterstica >
1
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1 la derecha, la mantisa es la fraccin decimal de e"ponente que corresponde a los dgitos que
ocupan el orden de magnitud; se obtiene de tablas o de calculadoras electrnicas y siempre tiene
valor positivo$ log 7 P 5,>545 esto es 45
5.>545
P 7.
#uando la caracterstica y la mantisa son de diferente signo 2S o 63 se opera con el cologaritmo
que se obtiene por la suma algebraica de la mantisa positiva con la caracterstica negativa es un
n'mero todo negativo, ver el siguiente e%emplo$
Log 5.557 P >.>545 P A7.KBB5
>.555
S5.>545
A7.KBB5 cologaritmo
La caracterstica indica la posicin del punto decimal en la cifra representada por la mantisa y se
determina por inspeccin del n'mero. ,ara un n'mero mayor que 4, la caracterstica es uno
menos que el n'mero de cifras antes del punto decimal; as$ la caracterstica de 455 es 7 porque el
n'mero cien tiene > dgitos a la izquierda del punto decimal. ,ara un n'mero menor que 4, la
caracterstica es numricamente uno ms que el n'mero de ceros que siguen al punto decimal; as$
la caracterstica de 5.555 555 4 es J con signo negativo.
,ara encontrar el logaritmo de un n'mero, por e%emplo$ 5.555 L5B, se busca en la tabla las dos
primeras cifras distintas de cero de izquierda a derecha 2L53 en la primera columna vertical de las
tablas se sigue la horizontal correspondiente hasta la columna B, que es el otro n'mero, en donde
se lee B 5JB, que es la mantisa requerida. La mantisa para L5B, L.5B, 5.5L5B, etctera; es la misma
2B 5JB3, pero difiere la caracterstica. 1s$ Log 5.555 L5B P @.B5JB P A>.5B74 /i el n'mero del cual
se requiere el logaritmo tiene cuatro cifras, la cuarta se busca en la misma columna horizontal en
la parte de la tabla que dice -partes proporcionales. y debe agregarse a la mantisa como diez
milsimos. ,or e%emplo, para el n'mero L 5B4$ !antisa para L5B P B 5JB parte proporcional para
4 P 4 5.B5JB S 5.5554 5.B5L5; log L5B4 P >.B5L5.
l antilogaritmo es el n'mero que corresponde a un logaritmo dado. ,ara encontrarlo se busca la
mantisa en la tabla de antilogaritmos, se determina el n'mero a que corresponde y se fi%a la
posicin del punto decimal seg'n la caracterstica. ,or e%emplo el antilogaritmo de 4.KJ@J es
@J.7B$ la caracterstica es 4 2hay dos dgitos a la izquierda del punto decimal3 y la mantisa es
5.KJ@J, que se buscara en la tabla de logaritmos donde se hallara que corresponde a @ J7B. 4@
Los estudiantes deben familiarizarse con el uso de logaritmos en las operaciones comunes. l
logaritmo del producto de dos n'meros es igual a la suma de sus logaritmos$ log a " b P log a S
log b.
l logaritmo del cociente de dos n'meros es igual al logaritmo del dividendo menos el logaritmo
del divisor$ log a?b P log a 6 log b.
l logaritmo de la potencia -n. de un n'mero es igual a XnX veces el logaritmo del n'mero$ log a >
P > " log a.
1r+.icas
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X0na figura equivale a mil datos en una tabla numricaX y as como se construye un modelo para
visualizar un con%unto comple%o de hechos, se utiliza una grfica para presentar los datos
e"perimentales en tal forma que fcilmente se asimilen y aprecien sus relaciones cuantitativas. /e
llama grfica a la representacin esquemtica de las variaciones que sufren las distintas
magnitudes que intervienen en los fenmenos fsicos, qumicos, biolgicos, sociales o de cualquier
otra ndole. ;iene por ob%eto mostrar rpida e intuitivamente la relacin que guardan las
magnitudes comparadas.
ntre las diferentes clases de grficas que e"isten las ms importantes son$
!r*fica poligonal' #onsiste en e"presar las variaciones de un fenmeno continuo por medio de
puntos y de representar la marcha de dicho fenmeno por medio de una lnea que une esos puntos.
,ara elaborar una grfica poligonal se trazan en un papel, de preferencia milimtrico, dos rectas
perpendiculares entre s que se corten en cero. n cada una de ellas se representar una de las
magnitudes que se van a relacionar. l punto cero 253 se llama origen y la rectas son los e%es; 5R
es el e%e R y 5Y es el e%e Y. ,ara referirse al e%e R generalmente se dice$ e%e horizontal o e%e de las
abscisas 2variable independiente3 y para el e%e Y$ e%e vertical o e%e de las ordenadas 2variable
dependiente3.
Los e%es dividen su propio plano en cuatro regiones llamadas cuadrantes que se numeran 9, 99, 999 y
9=. n el laboratorio utilizamos habitualmente slo el primer cuadrante 2figura 9.43. Las distancias
a la derecha de 5, a lo largo del e%e R, se consideran como positivas y las de la izquierda como
negativas. /imilarmente, hacia arriba de 5, a lo largo del e%e Y, se miden las distancias positivas y
hacia aba%o de 5 las negativas. (espus se trazan los puntos cuyas distancias a uno de los e%es sean
proporcionales a la magnitud que se va a representar y, finalmente, al unir estos puntos por medio
de segmentos de recta, se tiene la grfica poligonal.
Nota: por lo general, es me%or que la curva llene una parte considerable de la pgina. !uy bien
puede usarse la misma unidad de medida sobre los dos e%es, pero a menudo los valores tienen un
campo de variabilidad muy amplio, lo cual hace necesario usar diferente escala para cada uno de
los e%es.
0iagrama en barras. #uando se quieren e"presar simples comparaciones de medidas entre s o
para representar un 4M fenmeno discontinuo se emplean las barras, que pueden ser horizontales o
verticales.
1arras (erticales. Las magnitudes se representan por medio de rectngulos, barras de base igual
que descansan en el e%e de las abscisas y cuya altura es proporcional a la intensidad del fenmeno
y se mide en el e%e de las ordenadas.
1arras &ori)ontales. Las barras descansan sus bases en el e%e de las ordenadas y el fenmeno se
mide en el e%e de las abscisas.
!r*fica de sectores circulares. ,ara hacer una grfica de este tipo hay que tener en cuenta que el
crculo debe tener el total de las magnitudes que se van a representar. Los sectores circulares son
proporcionales a las magnitudes que representan; magnitud que se mide en grados de
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circunferencia. ,ara determinar el n'mero de grados que deben tener dichas partes se plantearn
una serie de reglas de tres para cada una de ellas en las cuales se consideran$ como 455Z a la
suma total de las magnitudes que se quieren graficar, para obtener en cada caso el porcenta%e
correspondiente; una vez obtenido ste, se pasar a grados, considerando >K5o como 455Z y
procediendo entonces a hacer la grfica.
AL1&NOS MTODOS &TILI2ADOS EN *IO5&MICA
Cen#ri.-,acin
0n mtodo muy 'til en el laboratorio para separar sustancias de diferente densidad suspendidas en
un lquido es la centrifugacin; en ella, la accin de la fuerza centrfuga 2fuerza necesaria para
desplazar hacia afuera un determinado peso en direccin radial3 da como resultado que las
partculas ms pesadas se sedimenten ms rpido que las partculas ligeras. La fuerza centrfuga
depende de la cantidad de materia 2m3 que se desplaza hacia afuera cuando est rotando a una 4K
velocidad por minuto de 2n3 veces a una distancia radial 2r3 y se e"presa por la frmula$ f 2en
dinas3 P 5.545BK n
7
m r
n el sistema mtrico decimal, la unidad de f es la dina, la de m es el gramo y la de r es el
centmetro. %emplo$ si se coloca un gramo de agua en un tubo de centrfuga y se rota a 7 555 rpm
2revoluciones por minuto3 a una distancia radial de 4K cm, la fuerza es$ f P 5.545BK " 7555
7
" 4 "
4K P J54 @@5 dinas
/i transformamos las dinas a peso, entonces el gramo de agua tiene peso porque es atrado al
centro de la ;ierra de acuerdo con la ley de la gravitacin y es atrado en estado normal, con BL5
dinas de fuerza. /i usamos, por lo tanto, peso en vez de dinas como la unidad de nuestro problema
tendremos$
f P 5.545BK " n7mr P J4J g BL5 o sea, interpretando la frmula, la fuerza de contencin para
sostener la unidad masa 2el gramo3 e impedir que se vaya del centro de rotacin es la fuerza que la
gravedad e%erca sobre J4K g o, dicho de otra manera, el gramo a esa velocidad pesa en el fondo
del tubo de la centrfuga J4K gramos comparado con el tubo en reposo o J4K veces la fuerza de la
gravedad 2g3.
La centrifugacin y ultracentrifugacin son operaciones que se basan en el principio anterior y que
permiten separar los componentes de una mezcla. Las centrfugas ordinarias operan a rotaciones
menores de 45 555 revoluciones por minuto 2rpm3. Las condiciones que limitan esta velocidad son
la resistencia de la parte de la centrfuga que sostiene el rotor 2brazo3, la friccin con el aire y el
calentamiento. Las ultracentrfugas operan en cmaras refrigeradas, evacuadas de aire, y el rotor
no gira sostenido por un -brazo. sino impulsado por chorros de aceite o aire comprimido que se
aplica a una porcin e"terna del rotor sostenido por una pared muy gruesa de una cmara
cilndrica de rotacin. /e alcanzan velocidades de 75 555 a J5 555 rpm. La sedimentacin en la
ultracentrfuga se e"presa en unidades /vedberg 2smbolo$ /3 y se aplica a la comparacin prctica
de tama&os moleculares que no slo dependen de la masa de las molculas implicadas sino
tambin de su forma. s importante considerar que los valores de /vedberg no son aditivos, es
decir, dos partculas M/ no crean una partcula 45/. /in embargo, hay una correspondencia tosca
que para las protenas esfricas es de$
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7 / P 45 <dal
@ / P M5 <dal
L / P 4K5 <dal
4K / P @55 <dal
La unidad /vedberg es igual a 45
64>
segundos; no pertenece al /9 y puede suplirse por 5,4
picosegundo 2ps3 o 455 femtosegundo 2fs3. n las molculas menos densas que el medio de
suspensin, como las lipoprotenas, el desplazamiento es hacia la superficie y se e"presa en
/vedberg de flotacin 2/f3 y 4J permite la clasificacin en$ L(L, O(L y =O(L 2lo2 densit,,
&ig&densit, y (er, &ig& densit,3 con /f de 5 a 45, 45 a @55 y las muy densas que no flotan y tienen
una densidad mayor de 4. l peligro del mal uso de la centrfuga deriva de la enorme fuerza que
alcanza en el radio de rotacin y el -peso. de las sustancias colocadas en el campo gravitacional
del aparato. /e debe tener cuidado con los siguientes puntos$
4. Los tubos en las centrfugas debern colocarse por pares para que no haya diferencia de peso en
un lado de la centrfuga. nfrente de un tubo de un peso determinado debe estar otro, en la misma
posicin, con el mismo peso. l descuido de esta regla implica un desnivel que, a las velocidades
y fuerzas se&aladas, puede romper los tubos y da&ar el aparato. ,ara balancear por pares los tubos
lo me%or es usar una balanza de dos brazos y a%ustar el peso hasta que sea idntico.
7. ,ara no forzar el motor arrnquese gradualmente la centrfuga hasta alcanzar la velocidad
requerida.
>. Dunca se frene una centrfuga; d%ese parar por su propia inercia; el no hacer esto conduce a que
se agite el contenido de los tubos y se eche a perder el traba%o.
@. Do alzar las tapas de la centrfuga cuando est en movimiento.
M. 1nte cualquier dificultad o duda consulte al profesor.
Po#encioe#r%a.
!uchas de las reacciones que se realizan en las clulas son reacciones de o"idacin y de
reduccin, es decir, en las que se transfieren electrones. La electroqumica estudia las reacciones
qumicas en las que hay transferencia de uno o ms electrones. La o"idacin es la prdida o
liberacin de electrones y la molcula que los cede se denomina agente reductor. La reduccin es
la ganancia de electrones y la molcula que los acepta se denomina agente o"idante. #uando se
o"ida un agente reductor, se transforma en su forma o"idada y como la reaccin es reversible las
formas o"idada y reducida del compuesto constituyen un par con%ugado llamado par redo" o par
de o"idorreduccin. l proceso de o"idacin siempre va acompa&ado del proceso de reduccin ya
que los electrones que cede una molcula reductora son aceptados por una molcula o"idante, lo
cual constituye las reacciones de o"idorreduccin o reacciones redo". La determinacin
cuantitativa de la concentracin de las molculas o"idantes y reductoras en una solucin es el
ob%eto de estudio de la potenciometra. n esta tcnica se determina el potencial elctrico generado
por la transferencia de electrones en una reaccin redo" en la cual estn involucradas las
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molculas a estudiar. ste potencial se mide en una celda electroqumica. La celda ms com'n es
la de (aniell 2Cig. 9.73, en la que en dos compartimientos separados que contienen [n/8@ y
#u/8@ se colocan cinc y cobre metlico, respectivamente; las dos soluciones se conectan por un
puente salino 2un tubo que contiene agar embebido en una solucin de un electrolito como el
:#l3. #uando los dos electrolitos se conectan por un alambre metlico, ocurre un flu%o de
electrones del electrodo de cinc al electrodo de cobre, el cual puede ser medido por medio de un
voltmetro. #uando el cinc cede los electrones se convierte en ion soluble, mientras que el cobre
disuelto, al aceptar los electrones, se convierte en cobre metlico que se deposita en el electrodo.
l puente salino cierra el circuito elctrico entre las dos soluciones. l hecho de que fluya una
corriente elctrica del polo positivo 2nodo, que en este caso es el electrodo de cinc3 al polo
negativo 2ctodo, que en este caso es el electrodo de cobre3, significa que hay una diferencia de
potencial entre los electrodos denominada fuerza electromotriz 2fem3 de la celda. (ado que el
potencial de un electrodo est relacionado con la magnitud de cargas positivas e"istentes, la
diferencia de compara las cargas relativas e"istentes en dos puntos. /e denomina de electrodo 233
a la diferencia de potencial respecto a un electrodo de referencia arbitrario y depende de la
concentracin de las molculas en la solucin y de la temperatura. n general, el potencial de los
electrodos se mide con referencia al electrodo de hidrgeno al que se le ha asignado n general, el
potencial de los electrodos se mide con referencia al electrodo de hidrgeno al que se le ha
asignado arbitrariamente un potencial de cero a 7M
o
# a una concentracin de 4 mmol?L y una
presin del gas de una atmsfera. /in embargo, en la prctica es inconveniente porque se trata de
un electrodo gaseoso.
(entro del electrodo de vidrio hay un alambre de plata con un e"tremo sumergido en una solucin
de O#l 5.4!. l bulbo de la parte inferior es de un vidrio especial, permeable a los iones O
S
. La
superficie interior de esta membrana de vidrio est en contacto con la solucin de O#l y la e"terior
con la solucin cuyo pO se quiere determinar. n las dos superficies la membrana de vidrio
absorbe agua y forma una capa de gel a travs de la cual difunden los iones hidrgeno y desplazan
a otros iones de la estructura del vidrio 2como sodio3 y esto provoca el establecimiento de un
potencial. n una solucin amortiguadora que contenga #l
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se sumerge un electrodo de 1g?1g#l.
#uando el electrodo se coloca en una solucin cuyo pO es diferente al de la solucin
amortiguadora, aparece una diferencia de potencial entre los dos e"tremos, lo cual es una medida
de la diferencia de los dos valores de pO. La determinacin ms precisa del pO se realiza en un
pOmetro que consiste, fundamentalmente, en un potencimetro dise&ado para emplearse con un
sistema de electrodo de vidrio. #omo una unidad de pO corresponde a MB milivoltios a 7M\ #, el
mismo medidor se puede usar con dos escalas para hacer lecturas en mv o en pO. l electrodo de
vidrio consiste en una membrana de vidrio situada al final de un tubo de vidrio o plstico de
paredes ms gruesas. n el tubo se encuentra cido clorhdrico diluido saturado de cloruro de plata
y un hilo de plata que conecta a la terminal del voltmetro con un electrodo de referencia. l pO se
determina midiendo la diferencia de potencial a travs de la membrana de vidrio que separa la
solucin a la cual se quiere determinar el pO, de la solucin de referencia cuya concentracin de
hidrogeniones se conoce. l esquema del circuito de un potencimetro tpico se encuentra en la
figura 9.>. La sensibilidad del medidor se puede a%ustar para cambios de acuerdo a la temperatura
2botn de control de temperatura3. #on el botn de calibracin a cero se introduce un volta%e
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lateral en el circuito que permite que la lectura corresponda al pO de la solucin reguladora tipo.
Los medidores de pO se construyen de tal manera que el cero de la escala del potencimetro
corresponda a un pO de J. l medidor se calibra antes de usarlo, primero con una solucin
reguladora de pO J, a%ustando el cero para que d la lectura e"acta; se lava el electrodo con agua
destilada o desionizada y se calibra con una segunda solucin reguladora de pO @ 45; se a%usta
nuevamente el medidor, ahora con el control de temperatura, para que d la lectura e"acta; luego
se determina el pO de la solucin problema.
Elec#ro.oresis.
0na partcula coloidal o un ion provistos de carga elctrica emigran hacia el nodo o el ctodo
ba%o la influencia de un campo elctrico e"terno. /i las partculas de una mezcla tienen diferentes
velocidades de desplazamiento, puede aprovecharse esta propiedad para separarlas. l empleo de
fuerzas elctricas para lograr esta separacin se llama electroforesis y depende fundamentalmente
de la carga y no de la masa molar de las partculas cargadas. sta tcnica se ha empleado en la
separacin de protenas, pptidos, nucletidos, cidos orgnicos y porfirinas, entre otros
compuestos. s importante considerar que en el caso de una protena su carga depende del pO del
medio, por lo que es posible emplear la tcnica para determinar el punto isoelctrico de la misma.
/i se aplica un campo elctrico a travs de una solucin, la fuerza que act'a sobre las molculas
cargadas de soluto depende de la carga elctrica 2e3; del n'mero de cargas en la molcula 2)3, y de
la fuerza del campo elctrico 233. 9nmediatamente despus de poner a funcionar el campo, las
partculas cargadas se aceleran hasta que alcanzan un equilibrio, o sea, cuando la carga
electrosttica queda equilibrada por la fuerza de friccin que e%erce el medio disolvente; entonces,
se mueven a una velocidad constante. La velocidad por unidad de campo elctrico se denomina
movilidad electrofortica. (ado que la friccin depende del tama&o de la partcula y de la
viscosidad del medio en que se mueve, la facilidad con la que se mueve una partcula cargada
depende directamente de su carga e inversamente de su tama&o y de la viscosidad del medio.
"isten dos tipos de electroforesis$ la frontal y la )onal.
3lectroforesis frontal o en medio l4uido. s el mtodo clsico de ;iselius en el que la separacin
de los componentes de una mezcla se realiza en varios frentes o lmites que se traslapan a lo largo
del procedimiento. l movimiento de los frentes se realiza en un canal vertical y la densidad de la
solucin por deba%o del frente debe ser mayor que la de arriba, ya que en caso contrario el sistema
de frentes se destruira. n el mtodo, la solucin a separar se coloca encima del medio
amortiguador conductor. La tcnica es difcil y costosa, aunque puede presentar la venta%a de que
se evitan las interacciones de los solutos con cualquier superficie y se eliminan as los efectos
adsorbentes y desnaturalizantes. 1dems, puede operarse en medios acuosos, a ba%a temperatura y
ba%o condiciones favorables de pO y fuerza inica.
3lectroforesis )onal. 0no de los problemas que presenta la tcnica anterior es la necesidad de
estabilizar las zonas de soluto contra la conveccin gravitacional y la difusin. sto origin el
empleo de otra tcnica de electroforesis$ la electroforesis zonal. n ella, el empleo de gradientes
de densidad, slidos porosos o fibrosos y geles permite resolver el problema de la difusin y de la
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conveccin gravitacional. n este tipo de electroforesis la mezcla de solutos a separar se aplica
como una mancha o una banda delgada en un punto del canal electrofortico. Los solutos migran
con distintas velocidades 2de acuerdo a su movilidad3 y se separan en zonas discretas. La distancia
de migracin es directamente proporcional al volta%e aplicado y al tiempo. Los solutos migran a
travs del solvente que ba&a un soporte slido. ste soporte puede ser de diversa naturaleza y cada
uno presenta algunas venta%as y desventa%as en su uso. Los soportes ms comunes son papel,
acetato de celulosa, almidn, agar, agarosa y poliacrilamida. (ado que en el caso de los geles es
posible un mane%o del tama&o del tamizado para lograr una m"ima eficiencia en la separacin,
este mtodo es el ms usado en bioqumica. n la tcnica hay que cuidar algunos aspectos que
pueden afectar la separacin como$ la seleccin adecuada del soporte, del amortiguador, vigilar la
temperatura de la cmara, la intensidad del campo elctrico, el tiempo, etctera.
3lectroforesis en papel , en acetato de celulosa. La electroforesis en papel fue el primer mtodo
de separacin en zonas en un campo elctrico. s una tcnica sencilla y rpida, que requiere
peque&as cantidades de muestra y que es especialmente 'til en las electroforesis de alto volta%e
para separar molculas de ba%o peso molecular como aminocidos, pptidos, oligonucletidos y
otros compuestos orgnicos con grupos cargados. Oa sido muy utilizada en el mapeo
bidimensional de protenas 2huella gnica3, para identificar diferencias entre protenas similares,
probar que una protena es producto de otra de mayor tama&o, etctera.
(ado que el papel tiene una alta actividad endosmtica], lo que causa algunos problemas en la
electroforesis, ha sido sustituido por el acetato de celulosa, que tiene una estructura microporosa
uniforme, actividad endosmtica ba%a y en el que la adsorcin de las protenas ha sido eliminada.
n los aparatos en que se realizan estas tcnicas el soporte se humedece al sumergirlo en el
amortiguador y colocarlo de tal manera que se establezca el contacto con las soluciones en que
estn los electrodos. Los aparatos se tapan para evitar la evaporacin y para mantener una
atmsfera h'meda dentro del aparato.
3lectroforesis en geles de agar , agarosa. l agar es una mezcla de polisacridos que se obtiene
de ciertas especies de algas marinas. st constituido de dos componentes principales$ uno lineal o
agarosa y uno ramificado y muy cido llamado agar o pectina. l agar y la agarosa son solubles en
soluciones acuosas a 455o# y solidifican a temperatura ambiente; forman geles de buena firmeza
cuando se usan a una concentracin de 5.M a 7Z. /u estructura se mantiene por numerosos puentes
de hidrgeno entre cadenas adyacentes de polisacridos. l gel de agarosa ofrece ciertas venta%as
sobre otros soportes; posee una porosidad elevada y uniforme, lo que favorece la migracin
regular de las sustancias cargadas, lo cual se traduce en una mayor resolucin. ,ara realizar la
electroforesis en estos medios se prepara el gel sobre una superficie de vidrio. 0na vez
solidificado el gel, se hacen pocillos en l para aplicar en ellos la muestra. /e lleva a cabo, o se
XcorreX, la electroforesis y, al final, se fi%a la preparacin, se ti&e y se seca. La tcnica se ha usado
en combinacin con la inmunodifusin en el anlisis inmunolgico de protenas y en la
cuantificacin de protenas inmunoprecipitables. La electroforesis en agarosa ha permitido el
estudio de las molculas del (D1, cuyo tama&o impide que puedan penetrar en los geles de
poliacrilamida, pero que penetran fcilmente en geles de agarosa a 5.7Z, si tienen un peso hasta
de 4M5 " 45
K
o a 5.LZ si pesan hasta M5 " 45
K
. s posible separar molculas de (D1 que difieren
slo 4Z de peso molecular seg'n sea la concentracin de la agarosa.
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,ara detectar las bandas, se sumerge el gel en una solucin de bromuro de etilo el cual se pega al
(D1 y fluoresce cuando se e"cita con luz ultravioleta. l peso molecular se determina por la
distancia de migracin. ;ambin se han usado estos geles de 77 agarosa para la obtencin de
mapas de restriccin, los que permiten ver diferencias entre dos molculas de (D1, localizar
mutaciones, detectar recombinaciones de fagos, aislar fragmentos de (D1 deseados, distinguir
entre el (D1 lineal, circular o s'per enrollado.
3lectroforesis en geles de poliacrilamida. Los geles de poliacrilamida son geles totalmente
sintticos que han sustituido a los geles de almidn en el estudio rutinario de protenas por
mtodos electroforticos. sto ha sido posible gracias a la gran facilidad con que puede variarse
seg'n el contenido total del monmero y su grado de entrecruzamiento. (ada su capacidad de
filtrador molecular, se ha empleado para separar compuestos con base en su peso molecular para
lo que se usa lauril sulfato de sodio 2/(/3 con el ob%eto de evitar las diferencias individuales en
las cargas de las protenas. Los amortiguadores que se usan pueden ser continuos 2en los que se
utiliza el mismo amortiguador en los tanques de los electrodos y los sistemas electroforticos3 y
discontinuos, en los que hay dos tipos de geles$ el de separacin, o de poro cerrado, en el cual se
resuelven los componentes de una mezcla 2aqu es importante el uso del amortiguador adecuado3 y
el gel concentrador, o de poro abierto, que sirve para concentrar la muestra. 1 los geles se les
puede incorporar sustancias disociantes como la urea y el /(/ sin que sean afectados. ;ambin
pueden emplearse agentes reductores como el 7 mercaptoetanol o ditiotreitol para romper los
puentes disulfuro de las protenas. Las dos aplicaciones principales de la electroforesis discontinua
son la determinacin de la pureza de protenas y el anlisis de los componentes de una mezcla. La
electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de /(/ tambin se ha empleado en la
determinacin de los pesos moleculares de protenas.
3lectroenfo4ue. /i se coloca una protena en un gradiente de pO su%eto a un campo elctrico, se
mover hasta alcanzar su punto isoelctrico, donde permanecer sin moverse. sta tcnica es lo
que se conoce como electroenfoque. ,ara formar un gradiente estable y continuo de pO se usan
anfolitos sintticos de una gran variedad de pesos moleculares y rangos de pO. #uando se
establece el campo elctrico, los anfolitos migran y generan el gradiente de pO seg'n sus propios
puntos isoelctricos. sta tcnica ha sido utilizada en combinacin con la separacin por pesos
moleculares en la electroforesis bidimensional como mtodo de anlisis de protenas.
]Dota$ #uando se aplica un potencial elctrico a un lquido contenido en un soporte no conductor
el lquido se mover hacia uno u otro electrodo, en favor o en contra del movimiento
electrofortico, alterando la movilidad electrofortica de las partculas cargadas. ste fenmeno se
conoce como endosmosis. /i el soporte est cargado, induce la orientacin de las cargas con signo
opuesto en el lquido, lo que ocasionar al aplicar la corriente elctrica que ocurra un flu%o del
lquido dentro del canal electrofortico. ste fenmeno es lo que se conoce como actividad
endosmtica y puede causar problemas en las separaciones electroforticas.
SOL&CIONES
0na solucin es una mezcla homognea de por lo menos dos componentes$ una fase dispersa, que
es el soluto 2sustancia que se disuelve3, y una dispersora que constituye el sol(ente o disolvente 2la
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sustancia que disuelve al soluto3 y que, generalmente, se encuentra en mayor proporcin. Las
soluciones
ms utilizadas en bioqumica son las que tienen agua como solvente. La solubilidad de un soluto
en un solvente depende de la naturaleza de stos, de la temperatura y, en el caso de un gas, de la
presin. La solubilidad generalmente est dada en gramos de soluto por 455 g de solvente. /e
llaman soluciones diluidas las que contienen una proporcin relativamente peque&a de soluto; se
llaman soluciones concentradas las que contienen una gran cantidad de soluto. /lo son posibles
soluciones concentradas cuando el soluto es muy soluble. 0na soluci$n saturada contiene la
cantidad de soluto disuelto necesaria para la e"istencia de un equilibrio entre las molculas
disueltas y las molculas en e"ceso que no estn disueltas. sta solucin se forma por medio de
una vigorosa agitacin con e"ceso de soluto. "iste una soluci$n sobresaturada cuando en la
solucin hay presente ms soluto que en una solucin saturada. ,ara prepararla se forma una
solucin saturada a temperatura elevada y se enfra cuidadosamente para evitar la cristalizacin.
Las soluciones sobresaturadas son inestables y con facilidad se convierten en soluciones saturadas.
Las mencionadas soluciones son poco precisas y no indican, de manera cuantitativa, el soluto ni el
solvente; los mtodos cuantitativos ms comunes, que sirven para e"presar la concentracin 2la
medida numrica de la cantidad relativa de soluto en la solucin3 de las soluciones, son las
porcentuales, las molares y las normales.
Sol-ciones "orcen#-ales
n las soluciones porcentuales no se toma en cuenta el peso frmula del soluto. n este tipo de
soluciones se debe especificar si la relacin es peso a peso 2p?p3, peso a volumen 2p?v3 o volumen
a volumen 2v?v3. %emplos$
Soluci$n porcentual p5p. /olucin al 45Z de Da#l contiene 45 g de la sal por 455 g de solucin.
l peso?peso porcentual e"presa el n'mero de gramos del soluto en 455 gramos de la solucin
final.
Zp?p P g de soluto " 455
455g de solucin.
Soluci$n porcentual p5(. /olucin de Da#l a 45Z p?v$ 45 g de Da#l en 455 ml de solucin. sto
e"presa el n'mero de gramos de soluto en 455 ml de la solucin final. n bioqumica, si no se
especifica otra situacin, las soluciones porcentuales deben entenderse como p?v.
Zp?v P g de soluto " 455
455 ml de solucin.
Soluci$n porcentual (5(. /e utiliza cuando el soluto y el solvente son lquidos. l v?v indica el
n'mero de vol'menes de soluto por 455 vol'menes de solucin. /olucin de etanol a >5Z v?v$ >5
ml de ste en 455 ml de solucin. sto quiere decir que por cada 455 ml de solucin, >5 ml
corresponden al soluto y el resto, hasta completar 455 ml, al agua destilada o al solvente
empleado.
Zv?v P volumen de soluto " 455
455 vol'menes de solucin
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s importante insistir que los trminos porcentuales e"presan siempre una relacin, es decir,
podemos variar los vol'menes siempre y cuando no perdamos dicha relacin. ,or e%emplo, si nos
pidieran preparar M5 ml de una solucin de alcohol etlico a 75Z, seguiramos el siguiente
planteamiento$
455 ml de sol. tienen 75 ml de alcohol puro
M5 ml de sol. tienen " ml de alcohol puro
R P 75 " M5 " 45
455
Qesultado$ necesitamos 45 ml de alcohol puro y completar un volumen de M5 ml. l alcohol etlico
com'n es de BKZ de pureza 2v?v3. ,or lo tanto, si no contamos con alcohol puro y quisiramos
preparar una solucin de alcohol a 75Z, seguiramos el siguiente planteamiento$
455 ml de sol. tienen BK ml de alcohol puro
R ml de sol. tienen 75 ml de alcohol puro
RP 75 " 455 P ml de solucin
BK
Qesultado$ necesitamos 75.L> ml de solucin de alcohol a BKZ y completar un volumen de 455
ml. /i tan slo queremos M5 ml de esta nueva solucin, entonces$ 455 ml de sol. de alcohol a 75Z
tienen 75.L> ml de alcohol a BKZ M5 ml de sol. de alcohol a 75Z tienen R ml de alcohol a BKZ
RP M5 " 75.L> P 45.@4ml
455
Qesultado$ necesitamos 45.@4 ml de alcohol de BKZ y completar con agua destilada hasta un
volumen final de M5 ml.
Sol-ciones olares
0na solucin molar se define como el n'mero de moles de soluto en un litro de solucin$
!P Do. de moles
litro de solucin
donde un mol es igual al peso atmico o molecular e"presado en gramos 2tomo gramo o
molcula gramo3. 0n mol contiene el n'mero de 1vogadro 2K.57>"45
7>
3 de partculas, tomos o
molculas.
/i un mol de una sustancia se disuelve en agua hasta un volumen de un litro, se obtiene una
solucin 4 molar 24!3. ,or e%emplo, si quisiramos preparar una solucin 4 molar de Da#l,
tendramos que considerar, primero, su peso molecular 2Da$ 7> S #l$ >M.M P ML.M3 y este valor en
gramos disolverlo en agua, hasta completar un litro. 1hora bien, si nos piden preparar @55 ml de
una solucin 5.M ! de Da#l$ )cuntos gramos de Da#l deben pesarse*
4. /abemos que un mol de Da#l es de ML.M g.
7. Oaremos el siguiente planteamiento$
0na sol. 4! tiene ML.Mg de Da#l.
0na sol. 5.M! tiene R g de Da#l.
1
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RP 5.M " ML.M P 7B.7M g de Da#l
455
>. (e acuerdo con la definicin de solucin molar, los 7B.7M g de Da#l los consideramos en un
litro de solucin, pero como nos piden preparar @55 ml haremos el siguiente planteamiento$
n 4555 ml de sol. hay$ 7B.7Mg de Da#l
n @55 ml de sol. hay$ R g de Da#l
RP @55 " 7B.7M P 44.J g de Da#l
4555
Qesultado$ necesitamos 44.J g de Da#l y disolverlo hasta completar un volumen de @55 ml. n
este e%emplo, cmo podemos ver, hemos multiplicado la molaridad del problema 25.M mol?L3 por
el peso molecular de Da#l 2ML.M g3 y por el volumen del problema 2@55 ml3. ,osteriormente
dividiremos entre 4 litro 24 555 ml3. ,ara simplificar el procedimiento podemos aplicar la
siguiente frmula$
= " ,! " ! P gramos de la sustancia
4555
n donde$
= P =olumen del problema en ml.
,! P ,eso molecular de la sustancia en g.
! P !olaridad del problema.
Sol-ciones norales
/on las que contienen el peso equivalente de una sustancia en gramos por litro de solucin$
D P peso equivalente
litro de solucin
donde el peso equivalente de una sustancia es el n'mero de unidades de esta sustancia que puede
combinarse con una unidad de hidrgeno$
,eso equivalente P peso molecular
n
n P n'mero de hidrgenos sustituibles.
%emplo$ el peso e4ui(alente de un *cido se calcula dividiendo el peso molecular entre el n'mero
de tomos de hidrgeno sustituibles en la molcula. l cido sulf'rico 2O7/8@3, de peso molecular
BL, tiene dos tomos de hidrgeno sustituibles en cada molcula; por lo tanto, su peso equivalente
es$ BL?7 P @B.
l peso e4ui(alente de un &idr$6ido se calcula dividiendo el peso molecular entre el n'mero de
grupos hidro"ilo 28O
6
3 de la molcula. l hidr"ido de aluminio 1l 28O3> contiene tres grupos
8O
6
por molcula; su peso molecular es de JL; por lo tanto, su peso equivalente es JL?> P 7K.
l peso e4ui(alente de una sal se calcula dividiendo el peso molecular entre la valencia total de
los cationes 2cargas positivas3 que contenga la frmula. La valencia del sodio es 4, y el sulfato de
sodio Da7/8@ 2peso molecular 4@@3 tiene dos iones de sodio en cada molcula; por lo tanto, el
peso equivalente del sulfato de sodio ser 4@@?7 P J7.
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l peso e4ui(alente de un o6idante 7reductor8 se calcula dividiendo el peso molecular entre el
n'mero de electrones ganados 2o perdidos3 que puedan aportar por molcula. Qecordemos la
frmula utilizada para calcular la cantidad de sustancia necesaria para preparar cualquier cantidad
de una solucin determinada$ ,ara calcular la cantidad de una sustancia que se necesita pesar para
preparar un volumen determinado de una solucin de cualquier normalidad, se aplica una frmula
seme%ante$
= " q " D P gramos de la sustancia
4555
%emplo$ preparar una solucin 5.4 D de cloruro de calcio 2#a#l73 para obtener un volumen de
>55ml$
= P >55 ml
D P 5.4
q P peso molecular del #a#l7 444?7 P MM.M
/ustituyendoP>55 ml " MM.M g " 5.54 DP 4.KJ
4555
Qesultado$ necesitamos 4.KJ g de #a#l7 para preparar >55 ml de una solucin 5.4 D.
Sol-ciones osolares
l fenmeno de la smosis se presenta cuando una solucin est separada de su solvente por una
membrana semipermeable. La smosis es la difusin de solvente a travs de la membrana desde la
parte de menor a la de mayor concentracin. La presin osmtica es la presin que debe aplicarse
sobre la solucin de mayor concentracin a fin de impedir el paso del solvente 2smosis3 a travs
de la membrana. Las membranas biolgicas tienen permeabilidades distintas y se dice que son
semipermeables, es decir, que son permeables de forma selectiva para las molculas del solvente o
peque&as molculas, pero no permiten el paso libre de todas las molculas disueltas. Las
mediciones cuantitativas demuestran que la presin osmtica es proporcional a la concentracin
molar 2para sustancias no disociables3 del soluto, por lo que una solucin osmolar es aquella que
contiene un mol de la sustancia en gramos en un litro de solucin; el osmol es una medida del
n'mero total de partculas en solucin. La concentracin e"presada en osmol por litro se llama
osmolaridad; el osmol por <ilogramo de disolvente se denomina osmolalidad; en las soluciones
muy diluidas, como son las del cuerpo humano, las dos medidas son tan cercanas que con gran
frecuencia se utilizan indistintamente. La presin osmtica depende del n'mero de partculas y no
de su carga, ni de su masa; la misma fuerza osmtica es e%ercida por una molcula grande, como
una protena, con peso 7J molecular de varios miles y muchas cargas, como por una molcula de
glucosa o un ion de Da
S
o de #l
6
. 1s para determinar el efecto osmtico de una solucin hay que
sumar los efectos de todas las partculas incapaces de atravesar la membrana independientemente
de su peso molecular. ,or e%emplo$ el cloruro de sodio en solucin acuosa se disocia casi
completamente en iones sodio 2Da
S
3 y cloruro 2#l
6
3. ,or lo tanto, cada molcula da origen a dos
partculas osmticamente activas, y una solucin osmolar contiene media molcula gramo 2peso
molecular e"presado en gramos3 por litro, o sea$
4 osm?l P ML.M?7 P 7B.7M g?l tambin
4 mol de Da#l P 7 osm?l
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n cambio, la glucosa en solucin no se disocia y para esta sustancia la solucin osmolar contiene
un mol en gramos por litro$
4 mol de glucosa P 4L5 g?l P 4 osm?l.
La mayora de los lquidos corporales tiene una presin osmtica que concuerda con la de una
solucin de cloruro de sodio a 5.B Z y se dice que esta solucin es isosmtica con los lquidos
fisiolgicos.
Sol-ciones iso#nicas
Las soluciones isotnicas con respecto unas a otras e%ercen la misma presin osmtica; es decir,
contienen la misma concentracin de partculas osmticamente activas. #uando se habla de
soluciones isotnicas en el laboratorio, suele tratarse de las que tienen la misma presin osmtica
que el plasma sanguneo, que es apro"imadamente de 5.> osmolar 2>55 miliosmoles3. Las
soluciones fisiolgicas de concentracin menor a >55 mosm?l se llaman hipotnicas; cuando su
concentracin es mayor de >55 mosm?l se denominan hipertnicas. 0na solucin es isotnica con
respecto a una clula viva cuando no ocurre ganancia ni prdida neta de agua en la clula, ni se
produce ning'n otro cambio en sta cuando entra en contacto con la solucin. l trmino
isotnico, que significa$ igualdad de tono, se emplea en medicina como sinnimo de isosmtico;
pero los trminos isotnico y tonicidad slo deben emplearse en relacin con un lquido
fisiolgico. ,or e%emplo, una solucin de cido brico que es isosmtica con la sangre y el lquido
lagrimal, slo es isotnica con el lquido lagrimal, ya que esta solucin ocasiona hemlisis de los
eritrocitos porque las molculas de cido brico atraviesan libremente la membrana eritrocitaria a
cualquier concentracin. n consecuencia, isotonicidad connota compatibilidad fisiolgica,
mientras que isoosmoticidad, no necesariamente. n otras palabras, la tonicidad es una fraccin de
la presin osmtica total de la solucin; por tanto, la tonicidad de una solucin no se puede
predecir 'nicamente por su composicin ya que intervienen tambin las propiedades distintivas de
la membrana limitante.
C+lc-lo 0 e$"resin )e )il-ciones
La dilucin consiste en preparar una solucin menos concentrada a partir de una solucin inicial
ms concentrada. Las diluciones se e"presan usualmente como una razn matemtica, como 4$45.
sto significa una unidad de solucin original diluida a un volumen final de 45, esto es, 4 volumen
de solucin original con B vol'menes de solvente 2volumen final P 453. ,ara calcular la
concentracin de la solucin diluida se multiplica la concentracin de la solucin original por la
dilucin e"presada como fraccin.
%emplo$ una solucin de >55 mg?455 ml se diluye en la razn 4$45. La concentracin de la
solucin final es$ >55 " 4?45 P >5 mg ?455 ml.
/i se hace ms de una dilucin, a partir de una misma solucin, la concentracin de la solucin
final se obtiene al multiplicar la concentracin original por el producto de las diluciones. %emplo$
la solucin anterior se diluye a su vez en la razn 4$455. La concentracin de la solucin ser$ >55
" 4?45 " 4?455 P 5.> mg?455 ml. La dilucin y redilucin sistemticas de una solucin se llaman
diluciones seriadas. ,ara encontrar la concentracin en un tubo dado de la serie, se multiplica la
dilucin en ese tubo por cada una de las diluciones precedentes, incluida la del tubo original.
%emplo$ hacer una dilucin seriada 4$7, 4$@, 4$L, etctera, a un volumen final de 4 ml.
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,aso 4$ a 5.M ml de la solucin a diluir, a&adirle 5.M ml del diluyente y etiquetarlo como tubo 4
2dilucin 4$7, volumen 4 ml3.
,aso 7$ transferir a otro tubo 5.M ml de la dilucin anterior y agregarle 5.M ml de diluyente
2dilucin 4$73. La dilucin final obtenida se calcula al multiplicar la dilucin del tubo 4 2o
anterior3 con la nueva dilucin 24?7 " 4?73, igual a 4$@. Los pasos siguientes se hacen igual que
para el paso 7. n el siguiente cuadro se muestra un resumen de lo anterior.
243 =olumen de la solucin original a diluir.
273 =olumen del agua necesaria para la dilucin.
2>3 =olumen final.
2@3 (ilucin obtenida.
2M3 =olumen de la solucin diluida 4$7 2o anterior3.
MANE9O DE MATERIAL *IOL1ICO
/e le llama material biolgico al con%unto de seres vivos o sus productos utilizado en el desarrollo
del traba%o en el laboratorio. La utilidad e importancia de este material es muy grande ya que
muchos fenmenos de los seres vivos slo pueden estudiarse en ellos mismos, por e%emplo, la
e"perimentacin de nuevos frmacos o los mecanismos que se presentan en entidades patolgicas
y la produccin de las mismas en forma e"perimental. (el correcto mane%o depender en gran
parte el "ito de la e"perimentacin y la veracidad de los resultados obtenidos. 1 continuacin se
darn algunas generalidades sobre el mane%o del material biolgico utilizado en las prcticas de
este Manual.
Aniales
l animal utilizado ms com'nmente en el laboratorio de bioqumica es la rata. ,ara su correcto
mane%o es importante la forma cmo se su%eta, lo cual se har con firmeza, pero a la vez, en forma
suave para no lesionarla; no debe demostrrsele miedo o repugnancia para evitar que se ponga
nerviosa e intranquila, lo que puede ocasionar que muerda. La palma de la mano se coloca sobre el
dorso del animal; la cabeza de ste entre el dedo pulgar y el dedo ndice; de esta manera se logra
su inmovilidad y es posible levantar el animal y moverlo de lugar. !uchas veces es necesaria la
inyeccin intraperitoneal de alguna sustancia, para lo cual se sostendr al animal con una mano,
como se indic antes, mientras con la otra se introduce la agu%a de la %eringa formando un ngulo
de 45\ con la pared abdominal en el cuadrante inferior izquierdo, ligeramente a la izquierda de la
lnea media; es importante mantener el ngulo de la agu%a porque, si ste se abre, la agu%a puede
llegar a la ve%iga o al intestino. ,ara tener la seguridad de estar en la cavidad peritoneal, hay que
%alar el mbolo de la %eringa para que se haga el vaco; si el vaco no se hace y, por el contrario, se
e"trae lquido, es probable que se haya puncionado la ve%iga. ,ara la e"traccin de vsceras, como
el hgado, es necesario sacrificar al animal, lo cual se logra fcilmente y con menor sufrimiento
para la rata anestesindola o descerebrndola, o sea, seccionando la mdula espinal a nivel del
cuello mediante un golpe certero en este lugar contra el borde de una mesa. (espus se prosigue a
la e"traccin de la vscera y se abre la pared abdominal con unas ti%eras o bistur.
E$#raccin )e san,re "ara an+lisis
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3l profesor a cargo del grupo deber* estar presente en el
momento de la e6tracci$n9 de lo contrario/ por ningn moti(o/ el
alumno podr* &acerla por su cuenta'
,rocedimiento para obtener una muestra de sangre venosa$
4. ,ara que un alumno sea considerado como voluntario
debern tomarse en cuenta algunos antecedentes como$ no
padecer o haber padecido hepatitis o alguna otra enfermedad
infectocontagiosa; no tener problemas de coagulacin y no ser
muy aprensivo. l donador 2de preferencia con las venas
visibles3, estar sentado con el brazo sobre la mesa.
7. #on una ligadura elstica, aplicar un torniquete en el brazo
por encima del sitio de la puncin 2esto causa congestin
venosa y evita el retorno de la sangre3. l uso prolongado del
torniquete causa estasis de la sangre y hemoconcentracin. /i
las venas no se hacen prominentes, pedir al donador que
cierre y abra la mano varias veces. scoger una vena fi%a y de
buen calibre, localizarla y palparla con el dedo para sentir su
consistencia y trayectoria; antes de puncionar, asegurarse de
que la %eringa no contenga aire y que el mbolo se deslice
suavemente. Las dimensiones de la agu%a y la %eringa
dependen de la cantidad de sangre que se necesita as como
del tama&o e integridad de la vena que se usa. ;ambin se
puede usar el sistema =acutainer que consiste en un tubo al
>5
vaco, un mango y una agu%a recolectora de muestras
m'ltiples.
>. Limpiar minuciosamente la zona con una torunda humedecida
con alcohol de J5\ y de%ar secar espontneamente. /u%etar la
piel con el pulgar izquierdo; puncionar primero la piel y luego
penetrar la vena con el bisel de la agu%a hacia arriba siguiendo
el trayecto de la vena.
@. (espus que se ha entrado a la vena, la sangre llenar los
tubos vacos del sistema vacutainer. /i se usa %eringa, se
necesita una ligera succin con sta para obtener la muestra
2por lo general, aparece una gota de sangre en la base de la
agu%a3. 0na succin e"cesiva puede causar colapso de la
vena. ;irar del mbolo de la %eringa hasta que se haya
e"trado la cantidad de sangre deseada.
M. /oltar la ligadura antes de e"traer la agu%a con un movimiento
rpido y uniforme mientras que se e%erce una presin sobre la
herida con una torunda.
K. !antener la presin por un momento o hasta que se haya
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detenido el sangrado. #ubrir la puncin con una cinta
adhesiva.
J. Qetirar la agu%a de la %eringa en el contenedor de
punzocortantes y vaciar lo ms pronto posible la muestra de
sangre en un tubo de centrfuga procurando deslizar la sangre
suavemente por la pared del tubo 2si es que no se utiliz el
sistema =acutainer3.
Aler#a cl%nica
/i es difcil detener el sangrado de la puncin, elevar la zona y
aplicar una cubierta que presione. Los hematomas se pueden
evitar$
T 0sando una buena tcnica.
T 1flo%ando el torniquete antes de retirar la agu%a.
T 1plicando la presin suficiente sobre el sitio de puncin
despus de completar el procedimiento.
La sangre obtenida puede tratarse de diferentes maneras
seg'n el empleo que se le vaya a dar.
,ara obtener suero. La sangre se recibe en un tubo de
ensayo o de centrfuga seco y se de%a coagular a temperatura
ambiente o en una estufa o ba&o de agua a >J\ #. /i se va a
traba%ar inmediatamente con el suero, separar con un aplicador
de madera el cogulo y centrifugar el resto del tubo. /i se desea
la separacin espontnea del suero, se de%a a temperatura
ambiente por unas horas para que el cogulo se retraiga. (ebe
evitarse que el suero se mezcle con porciones de cogulo; si esto
sucede, es necesario centrifugar y volver a separar el suero con
una pipeta ,asteur.
,ara obtener plasma' Oay que evitar la coagulacin por
medio de un anticoagulante 2heparina, citrato de sodio o (;13
en el tubo que recibe la sangre.
!ezclar suavemente por inversin. #entrifugar a 7 M55
rpm durante M minutos y e"traer enseguida el plasma
sobrenadante con una pipeta ,asteur; pasarlo a otro tubo.
+a sangre/ el plasma o el suero , todos los recipientes
4ue los contengan deben considerarse como material
potencialmente infectante/ por lo 4ue 7torundas/ agujas/ tubos/
etc#tera8 deber*n depositarse/ de acuerdo a su clasificaci$n/ en
en(ases 4ue tengan impreso el smbolo de riesgo biol$gico ,
entregarse a la coordinaci$n del laboratorio para su desinfecci$n
, desec&o'
>4
MEDIDAS DE SE1&RIDAD
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(urante el desarrollo del curso de bioqumica, en el laboratorio se pueden llegar a utilizar
sustancias o muestras biolgicas que, enocasiones representan riesgos potenciales a la salud,
debido a que pueden ser$ corrosivas, reactivas, e"plosivas, t"icas, inflamables o biolgico
infecciosas.
1unque los laboratorios se consideran en general lugares de traba%o seguros, esto es as slo
cuando conocemos y seguimos las normas de seguridad e"istentes en la materia acerca de la
clasificacin, mane%o y disposicin final de estas sustancias, lo cual nos permite identificar los
peligros y disminuir los riesgos.
Mane/o )e a#eriales "eli,rosos 0:o biol,ico in.ecciosos
Precauciones generales$ /e refieren a las medidas para minimizar la difusin de enfermedades
transmisibles, especialmente hepatitis W o /9(1 y para evitar incendios, cortaduras o e"posiciones
simples, de corta duracin o accidentales a sustancias qumicas peligrosas.
4. !ane%ar cualquier lquido corporal, sangre, plasma, suero, orina, te%ido, cadver o cultivo
como potencialmente infeccioso. ;odas las sustancias qumicas proporcionadas, equipos y
materiales del laboratorio debern ser utilizados con el m"imo cuidado, atendiendo a las
indicaciones de peligrosidad y cuidados especficos, seg'n el caso.
7. /e debe conocer los smbolos y los cdigos de color sobre las precauciones y los peligros en
el laboratorio. 1segurarse de conocer la localizacin de e"tinguidores, del botiqun y de las salidas
de emergencia.
>. 0sar bata en el laboratorio, la cual deber estar cerrada durante todo el tiempo que se
permanezca en el laboratorio.

@. Lavar las manos y usar guantes. Los guantes deben usarse para efectuar punciones vasculares y
para manipular sangre, lquidos corporales, cultivos de microorganismos, sustancias o superficies
contaminadas. (espus del uso de cualquier material biolgico, se procede al lavado de manos
con los guantes puestos. (espus de quitarse los guantes debemos lavarnos nuevamente las
manos.
M. ;odos los materiales desechables y no desechables se deben descontaminar en una solucin
4$45 de hipoclorito de sodio de @ a J Z de concentracin, durante ms de 75 minutos antes de ser
desechados.
K. Los elementos punzocortantes deben desecharse en recipientes especiales destinados para ello,
los cuales deben estar etiquetados con la leyenda que indique X,eligro, residuos punzocortantes
biolgicoAinfecciososX y marcados con el smbolo universal de riesgo biolgico. Dunca
reencapuchar las agu%as
J. Limpiar las superficies potencialmente contaminadas con hipoclorito de sodio al 4Z, con
alcohol al J5Z o con agua o"igenada.
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L. :odas las sustancia s 4umicas son potencialmente t$6icas , peligrosas/ por lo que se deber$
a8 #onocer las propiedades 2venenosas, custicas o corrosivas3 y el uso correcto de las mismas.
b8 Dunca probar, as como tampoco inhalar, directamente las sustancias. ,ara determinar el olor se
acerca la tapa del frasco cuidadosamente a la nariz, o bien, si se trata de sustancias voltiles o
vapores acercar stos con la mano a la nariz.
c8 vitar el contacto de sustancias con la piel, especialmente la cara; usar bata y guantes para
proteger la ropa y el cuerpo; nunca dirigir un tubo de ensayo o la boca de un matraz con lquidos
en ebullicin o material de reaccin hacia el vecino, o a s mismo, ya que puede proyectarse el
contenido; para las sustancias que no tienen un efecto pronunciado sobre la piel, pero cuya
ingestin es peligrosa, evitar la contaminacin de alimentos, cigarros o manos que despus se
llevarn a la boca o con las que se tocarn alimentos 2nunca ingerir alimentos en el laboratorio3.
,or 'ltimo, nunca pipetear con la boca, especialmente los cidos fuertes, productos custicos,
o"idantes fuertes y compuestos venenosos.
B. /eguir las indicaciones del profesor y del personal a cargo del rea de prcticas. s una regla de
laboratorio que todos los accidentes personales, por triviales que sean, se comuniquen
inmediatamente al profesor. Dunca realizar actividades e"perimentales sin la supervisin del
responsable del grupo.
45. !ane%ar adecuadamente los residuos peligrosos derivados de las prcticas, identifique su nivel
de riesgo y el mecanismo para su desecho. +ueda prohibido desechar sustancias a la tar%a o por
cualquier otro medio, sin autorizacin del responsable del grupo. Las ho%as de seguridad
correspondientes incluyen qu hacer en caso de accidentes y la forma correcta de desechar los
residuos.
45. 9ndicaciones generales para evitar incendios o e"plosiones al utilizar solventes inflamables.
Los solventes inflamables 2alcohol, ter, cloroformo, acetona, tolueno, "ilol, etctera3 se utilizan
en todos los laboratorios, por lo que se recomiendan las siguientes precauciones$
a8 Do fumar en el interior del laboratorio.
b8 Do utilizar la llama del mechero sin cerciorarse de que no hay cerca lquidos inflamables. Do
mantener el mechero encendido cuando est fuera de uso.
c8 /i se vierten accidentalmente sobre las mesas, secar de inmediato con un trapo h'medo y
en%uagar ste en el chorro de agua, e"primindolo.
d8 Dunca calentar un lquido orgnico sobre una flama. ,ara calentar, usar ba&o de agua o parrilla
elctrica.
n caso de incendio debe hacerse lo siguiente$ para un incendio peque&o en un vaso, un matraz,
etctera, ste se cubrir con un recipiente mayor o se ahogar el fuego con un trapo mo%ado o se
combatir con un e"tinguidor.
#uando el fuego sea de un solvente derramado sobre la mesa o el piso, se utilizar un e"tinguidor
de bi"ido de carbono. /i el fuego no puede vencerse de inmediato, se evacuar el laboratorio y se
avisar al departamento contra incendios de la institucin.
44. Los accidentes ms frecuentes que ocurren en el laboratorio son las lesiones debidas a cortes,
laceraciones, etctera, por cristalera rota.
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n caso de heridas peque&as de%ar que sangre unos segundos; tener cuidado de no de%ar partculas
de vidrio en la herida y aplicar un desinfectante. Las heridas de mayor importancia deben ser
atendidas por un mdico. !ientras tanto, evitar el sangrado aplicando presin en un punto ms
arriba la herida o antes de ella 2no mantener la presin por ms de M minutos3.
47. #asi siempre, los choques elctricos en el laboratorio son de poca importancia; las
precauciones de seguridad se deducen de la naturaleza del peligro. Dunca tocar un aparato
elctrico con las manos h'medas o cuando se est parado sobre un piso h'medo. /iempre apagar y
desconectar los aparatos antes de cualquier manipulacin.
Pic#o,raas )e se,-ri)a)
n las etiquetas de productos qumicos de uso en el laboratorio adems de la identificacin del
contenido, calidad y lmite de pureza de lo que contiene, podemos encontrar pictogramas
2smbolos internacionalmente aceptados y reconocidos3 que indican los riesgos principales. Los
pictogramas de seguridad son$
RIES1O *IOL1ICO
;odo aquello que pueda contener bacterias, virus u otros microorganismos con capacidad de
infeccin o cuando contiene to"inas producidas por microorganismos que causen efectos nocivos
a los seres vivos. %emplo$ %eringas, sangre. !edidas de prevencin$ evitar el contacto con los
o%os, la piel y las vas respiratorias. 0tilizar elementos de proteccin personal.
E ; E<PLOSI=O
s toda sustancia slida o lquida o mezcla de sustancias que pueden desprender gases a una
temperatura, presin y velocidad tales que pueden detonar, producir violentas deflagraciones, o
e"plotar al e"ponerse al calor cuando estn parcialmente confinadas. %emplo$ azida de plomo,
fluoruro de carbono.
!edidas de prevencin$ almacenarlas ale%adas de otros productos, evitar todo choque, friccin y
mantener ale%adas de fuentes de calor, chispas o fuego.
O ; O<IDANTE
/ustancias capaces de aportar o"geno cuando reaccionan con otra sustancia, por lo que cuando
entran en contacto con combustibles o inflamables avivan la reaccin pudiendo desarrollar
reacciones violentas. %emplo$ nitrito de sodio, hiposulfito de sodio.
!edidas de prevencin$ mantener ale%adas de las sustancias combustibles o inflamables, ya que
pueden favorecer los incendios y dificultar su e"tincin.
<n ; NOCI=O
/ustancias de menor to"icidad pero pueden causar da&os a la salud. ;ambin se incluyen aquellas
mezclas o preparados que tienen alguna sustancia que puede ser t"ica pero que se encuentra a
una ba%a concentracin en la mezcla.
<i ; IRRITANTE
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/ustancias que pueden causar irritacin a la piel, mucosas, o los o%os, por contacto inmediato,
prolongado o repetido, pudiendo tambin provocar inflamacin. %emplo$ cloroformo, /(/,
hipoclorito de sodio, aminoantipirina.
!edidas de prevencin$ evitar el contacto con los o%os, la piel y las vas respiratorias. 0tilizar
elementos de proteccin personal.
F> ; E<TREMADAMENTE INFLAMA*LE
/ustancias cuyo punto de ignicin es menor de 5I# y su punto de
ebullicin m"imo de >MI#.
F ; INFLAMA*LE
/ustancias lquidas cuyo punto de ignicin es menor a @5I#. %emplo$ etanol, tolueno, ter
dietlico.
!edidas de prevencin$ mantener ale%ado de fuentes de calor, de ignicin o eventuales chispas, de
materiales combustibles y o"idantes.
N ; NOCI=O PARA EL MEDIO AM*IENTE
1quellas sustancias o preparados que cuando son liberados al medio ambiente pueden presentar un
efecto inmediato o diferido, poniendo en peligro a alguna especie. %emplo$ tiourea, otoluidina.
!edidas de prevencin$ evitar que los derrames alcancen los desagês, tratar los residuos en
condiciones ambientalmente adecuadas.
T> ; ALTAMENTE T<ICO? T T<ICO
/ustancias que pueden causar da&o en forma aguda o crnica a la salud o causar la muerte si son
inhaladas, ingeridas o se absorben por la piel, a'n en peque&as cantidades. %emplo$ azida de
sodio, dinitrofenol, bromuro de etidio.
!edidas de prevencin$ evitar todo contacto directo. 0tilizar elementos de proteccin personal.
mplear estrictas medidas de higiene personal y del ambiente del laboratorio.
C ; CORROSI=O
/ustancias capaces de atacar y destruir los te%idos orgnicos si entran en contacto con ellos o bien
atacar ciertos metales o materiales. %emplo$ hidr"ido de sodio, cido clorhdrico, cido actico.
!edidas de prevencin$ evitar el contacto con los o%os, la piel y las vas respiratorias. 0tilizar
elementos de proteccin personal.
I)en#i.icacin sobre los ries,os es"ec%.icos 0 los conse/os )e "r-)encia.
Crases XQX stas advierten acerca del riesgo ms com'n asignado a esa sustancia qumica, por
medio de la enumeracin de riesgos especficos en frases cortas que son adaptables a las distintas
sustancias. Las frases X/X brindan los conse%os de prudencia o las medidas de prevencin ms
importantes relacionadas con el riesgo asignado a esa sustancia qumica y que permitirn su
manipulacin y almacenamiento en forma segura. n algunos casos se mencionan combinaciones
de frases Q o de frases /, cuando dos o ms riesgos tienen relacin entre s.
1
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BIOQUMICA
UNAM 2013
El s%bolo )e la N.F.P.A. 'Na#ional Fire Pro#ec#ion Associa#ion(
l smbolo de la D.C.,.1. es un sistema de identificacin de riesgos de un producto qumico, en
tres categoras principales$ XsaludX, XinflamabilidadX y XreactividadX indicando el grado de
severidad por medio de una escala numrica desde 2@3 que indica el riesgo mayor, 2>3 riesgo
severo, 273 riesgo moderado, 243 riesgo menor, hasta 253 que representa ausencia de riesgo. ste
smbolo es 'til para alertar acerca del riesgo de ese producto y, a su vez, puede ayudar a
determinar los cuidados a tener en cuenta en el almacenamiento y en caso de emergencias, de
derrames o salpicaduras. La informacin se presenta por medio de una estructura espacial en
forma de rombo principal, dividido a su vez en otros cuatro.
l rombo azul a la izquierda identifica el riesgo para la salud. l rombo ro%o en la parte superior
indica el riesgo por inflamabilidad. l rombo amarillo a la derecha se&ala el riesgo por reactividad
o inestabilidad. l rombo blanco en la parte inferior indica riesgos especiales tales como$ G
reactivo al agua, #8Q corrosivo, 19Q reactivo al aire, 8RY o"idante. %emplo$ _cido clorhdrico
!o/as )e se,-ri)a)
#ada prctica cuenta con las ho%as de seguridad para cada reactivo o sustancia que se utilice en el
laboratorio. Las ho%as de seguridad proveen informacin sobre$
T Los componentes de un producto, su reactividad, las medidas precautorias principales o las
advertencias ms importantes.
T Los elementos de proteccin personal que se recomienda emplear en la manipulacin.
T Las vas de ingreso y los rganos blanco.
T Las medidas por derrame accidental y de primeros au"ilios.
T La informacin to"icolgica.
T Las recomendaciones para su almacenamiento.
T Las condiciones para la disposicin de los residuos.
Clasi.icacin )e los resi)-os
Los residuos que se generan en laboratorios de instituciones de ense&anza o investigacin as
como en hospitales y clnicas contienen residuos no peligrosos o municipales, residuos biolgicos
infecciosos y residuos especiales.
;esiduos peligrosos biol$gico infecciosos 7;P1I8: es todoaquello que ha entrado en contacto con
pacientes o animales, sus muestras biolgicas y?o cepas de microorganismos, se clasifican en$
sangre, cultivos, patolgicos 2te%idos, rganos, partes y fluidos corporales, etctera3, no
anatmicos 2gasas, algodones, %eringas, etctera3 y punzocortantes 2lancetas, agu%as, pipetas
,asteur, etctera3.
;esiduos municipales: son aquellos que no representan peligro para la salud y sus caractersticas
son similares a los residuos domsticos comunes.
1
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BIOQUMICA
UNAM 2013
;esiduos especiales ;3:I$ son aquellos residuos que constituyen un peligro para la salud por sus
caractersticas agresivas tales como$ Corrosividad, Reactividad, E"plosividad, To"icidad e
Inflamabilidad s importante no olvidar que, la mezcla de residuos municipales con residuos
biolgico infecciosos hace que se consideren en su totalidad como biolgico infecciosos, mientras
que la mezcla de residuos biolgico infecciosos con peligrosos #Q;9 se deben consideran como
peligrosos #Q;9.
Envasa)o 0 e#i@-e#a)o )e RP*I "ara s- )esecAo.
Los residuos Q,W9 deben ser envasados de acuerdo con sus caractersticas fsicas y biolgico
infecciosas conforme la norma oficial me"icana 5LJA#8LABM.
s importante destacar que todos los envases tengan impreso el smbolo universal de riesgo
biolgico y leyendas que indiquen la peligrosidad de los residuos y el tipo de residuos que
contienen. Los contenedores para punzocortantes deben de ser$ (e color ro%o.
T (e paredes rgidas.
T (e polipropileno.
T Qesistentes a fracturas y prdida del contenido al caerse.
T (estruibles por mtodos fisicoqumicos.
T sterilizables y con tapa, la que puede tener o no separador de agu%as.
,recauciones$ depositar los Q,W9, de acuerdo a su clasificacin, inmediatamente despus de su
generacin. Do compactar los residuos durante el envasado y no mezclar residuos de diferente
clasificacin. 0na vez identificados, separados y envasados correctamente los residuos peligrosos,
el personal responsable del laboratorio se encargar de su recoleccin, tratamiento y disposicin
final as como de las medidas necesarias para la desinfeccin, esterilizacin y limpieza del
material y equipo utilizado en el laboratorio.
(e manera general, los envases destinados a los residuos #Q;9 deben ser de cristal de color
mbar, con capacidad de uno a cuatro litros, latas de aluminio para solventes 2capacidad m"ima
de 75 litros3 y, en algunos casos recipientes de plstico, siempre y cuando las caractersticas
fisicoqumicas de la sustancia a envasar lo permita. #ada residuo debe envasarse en forma
individual y colocar en el frasco respectivo el pictograma de seguridad correspondiente.
Mane/o )e resi)-os CRETI
l mane%o, consistente en la separacin, envasado y almacenamiento de cada uno de los reactivos
peligrosos #Q;9 utilizados en las prcticas deber realizarse de acuerdo a cada reactivo en
cuestin seg'n lo indicado en las ho%as de seguridad. l mane%o de accidentes, tales como
derrames, ingestin o salpicaduras, as como la aplicacin de primeros au"ilios debern de
realizarse de acuerdo al reactivo en cuestin seg'n lo indicado en la ho%a de seguridad. Las ho%as
de seguridad sern proporcionadas para cada prctica en el laboratorio. (e manera general, los
envases destinados a los residuos #Q;9 deben ser de cristal de color mbar, con capacidad de
uno a cuatro litros, latas de aluminio para solventes 2capacidad m"ima de 75 litros3 y, en algunos
casos recipientes de plstico, siempre y cuando las caractersticas fisicoqumicas de la sustancia a
envasar lo permita. #ada residuo debe envasarse en forma individual y colocar en el frasco
respectivo el pictograma de seguridad correspondiente.
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C-a)ro I.B E/e"los )e .rases S 0 R
Frases R Frases S Cobinacin )e .rases
Q J ,uede provocar incendios / > #onservar en sitio fresco Q 75?74 Docivo por inhalacin y
contacto por la piel
Q 7> ;"ico por inhalacin / 75 Do comer ni beber
durante la manipulacin Q >B?7M
;"ico$ peligro de efectos irreversibles graves por ingestin
Q >K 9rrita los o%os / 7B
Do tirar los residuos por los desagês / >?J
!antenga el contenedor bien cerrado y en un lugar
fresco
Q @M ,uede ser cancergeno / >J
Llevar guantes de
proteccin adecuados
/ >K?>J?>B 0tilice ropa protectora adecuada, guantes y
proteccin facial o gafas
>B
C-a)ro I.C. Oo%a de seguridad para el cido #lorhdrico.
6ci)o clorA%)rico
I)en#i.icacin
Crmula qumica$ O#l
1pariencia y olor$ solucin de color ligeramente amarillo o incolora
con olor caracterstico muy penetrante.
!arca%e liqudo corrosivo
/innimos$ cido muritico, cloruro de hidrgeno.
1enerali)a)es
st presente en el sistema digestivo de muchos mamiferos y una deficiencia
de ste provoca problemas en la digestin; un e"ceso provoca 'lceras
gastricas. La disolucin acuosa grado reactivo contiene apro"imadamente
>LZ de O#l.
Pro"ie)a)es .%sica 0 @-%icas
,!$ >K.@K
/olubilidad$ soluble en agua
pO de disoluciones acuosas$ 5.4 24.5D3, @.525.554D3.
Qeacciona con la mayorà de los metales desprendiendo hidrgeno.
#on agentes o"idantes como per"ido de hidrogeno genera cloro, el cual es
muy peligroso.
Diveles de to"icidad.
(LM5 2oral en cone%os3$ B55 mg?:g, inhalacin en ratas3$ >47@ ppm?4 h.
#L!o 2concentracin letal minima publicada3$ 2inhalacin en humanos3 4>55
ppm?>5 min; >555ppm?M min.
Ries,os
,roduce gas inflamable cuando se encuentra en contacto con metales. /e
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BIOQUMICA
UNAM 2013
generan v apores t"icos e irritantes de cloruro de hidrgeno cuando se
calienta.
9nhalacin$ elgas causa dificultad para respirar, tos, inflamacin y ulceracin
de nariz, trquea y laringe. "posiciones severas causan espasmo de la
laringe y edema en los pulmones.
#ontaco con los o%os y piel$ es un irritante severo de o%os y piel, puede causar
quemaduras serias, dermatitis, reducir la visin o, incluso, la prdida total de
sta.
9ngestin$ produce corrosin de las membranas mucosas de la boca, esfago
y estmago, causa nusea, vmito, disfagia, sed intensa y diarrea
Prieros a-$ilios
8%os$ lavar inmediatamente con agua corriente durante 4M mi nutos.
,iel$ quitar ropa y zapatos contaminados, lavar inmediatamente la zona
da&ada con abundante agua.
9nhalacin$ mover a la persona al aire fresco; si se dificulta la respiracin
proporcionar o"igeno y mantenerlo caliente y en reposo, no dar a ingerir
nada.
9ngestin$ no provocar vmito y dar a beber agua continuamente, por
e%emplo, una cucharada cada 45 minutos o dar a beber leche de
magnesia.
n todos los casos de e"posicin, el afectado debe ser transportado al
hospital tan pronto como sea posible.
Mane/o 0 alacenaien#o
,eligro$ corrosivo y veneno!antngase en envase de vidrio, en lugares
secos, bien ventilados, ale%ados de materiales o"idantes y fuentes de
ignicin o calor.
Tra#aien#o en caso )e acci)en#e
#ontrol de fuegoD en caso de accidente utilizar #87, polvo qumico seco
o arena seca. Los e"tinguidotes de fuego se eligen dependiendo de los
alrededores, ya que el O#l no arde.
Cugas y derrames$ ventilar el rea y protegerse con el equipo de
seguridad necesario. #ubrir el derrame con bicarbonato de sodio o una
mezcla de M5$M5 de hidro"ido de calcio y cal sodada, mezclar
cuidadosamente. !antener el materil le%os de fuentes de agua y drena%es
hasta no ser neutralizado como se indic anteriormente.
DesecAos
Deutralizar las soluciones concentradas de cido clorhdrico con
carbonato de calcio o cal y diluir con agua cuidadosamente. La disolucin
resultante puede verterse al drena%e, con abundante agua. n caso de
soluciones diluidas,
@5
#uadro 9.L Envasa)o 0 e#i@-e#a)o )e RP*I "ara s- )esecAo.
TIPO DE RESID&O ESTADO
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FSICO
EN=ASADO COLOR
San,re Sli)o
L%@-i)o
*olsa )e
"l+s#ico
Reci"ien#e
Aer7#ico
Ro/o
C-l#ivos 0 ce"as )e
a,en#es in.ecciosos
Sli)os
L%@-i)os
*olsa )e
"l+s#ico
Reci"ien#e
Aer7#ico
Ro/o
Resi)-os no ana#icos Sli)os
L%@-i)os
*olsa )e
"l+s#ico
Reci"ien#e
Aer7#ico
Ro/o
Pa#ol,icos Sli)os
L%@-i)os
*olsa )e
"l+s#ico
Reci"ien#e
Aer7#ico
Aarillo
Ob/e#os "-nEocor#an#es
-sa)os 0 sin -sar Sli)os Reci"ien#es
r%,i)os
Ro/o
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MANUA !E "#$C%ICA& !E A'(#A%(#I(

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"rctica )
1
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BIOQUMICA
UNAM 2013
&oluciones
Tiempo de la prctica: 3 horas
Objetivos
Que el alumno:
1. Identifique la eistencia de soluciones en los sistemas
!iol"#icos.
2. $%lique los clculos & %rocedimientos %ara %re%arar
soluciones %orcentuales' molares & normales' as( como las
diferentes diluciones de )stas.
3. Presente e*em%los de soluciones utili+adas en medicina
,soluci"n isot"nica' -in#er' .arro/ & 0artman1.
#esponda a las si*uientes pre*untas+
1.Qu es una solucin?
2.Cuntas clases de soluciones existen?
3.Qu significan los siguientes trminos: mol, solucin
molar y solucin normal?
4.Qu significan: v/v, p/v, p/p y ppm?
5.Cul es la composicin de las siguientes soluciones:
solucin isotnica de cloruro de sodio, suero glucosado al
5%, Ringer-lactato?
6.Cules son los tipos de soluciones que existen in vivo?
Mencionar ejemplos.
7.Qu es una solucin isotnica?
8.Qu es una solucin osmolar?
9.Cmo se calcula la osmolaridad de una solucin?
10.Qu les pasa a los eritrocitos cuando se ponen en
contacto con soluciones salinas de diferente osmolaridad?
11.Qu se entiende por dilucin y dilucin seriada de las
soluciones?
Material
Por equipo:
3 vasos de precipitado de 10 ml
1 pipeta de 1.0 ml
1 pipeta de 5.0 ml
1 pipeta de 10.0 ml
Gradilla con 9 tubos de ensayo
Eritrocitos humanos lavados en solucin salina isotnica
Solucin de azul de metileno al 1.0%
Cloruro de sodio en cristales (NaCl)
Balanza granataria
Por grupo:
1 Microscopio marca Leica.
"rocedimiento
1. Hacer los clculos correspondientes para comprobar que
la solucin a 0.9% de NaCl es isotnica con respecto al
plasma (ver pag. 121). Considerar que:
a1 El cloruro de sodio se disocia en solucin acuosa en los
iones sodio y cloruro, por lo que la concentracin inica se
duplica (1 mmol/l = 2 mosm/l).
1
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BIOQUMICA
UNAM 2013
!1 La presin osmtica normal del plasma es de 290-310
mosm/l.
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2. Preparar 20 ml de una solucin de NaCl a 4.5%
(etiquetar como solucin 1).
3. A partir de la solucin anterior, preparar 25 ml a 0.9%
(solucin 2) y 50 ml a 0.045% (solucin 3).
4. Colocar en tres tubos de ensayo las diferentes
soluciones de cloruro de sodio preparadas en los puntos 2
y 3. Con la ayuda de un gotero (dejando caer lentamente
por las paredes del tubo) 2 gotas de eritrocitos lavados.
Mezclar con cuidado y dejar reposar 5 minutos a
temperatura ambiente. Valorar el grado de hemlisis que
sufren los eritrocitos cuando se ponen en contacto con las
diferentes soluciones.
5. De las 3 soluciones prepradas tomar una gota de cada
una y por separado colocarlas en un porta-objetos, colocar
un cubre-objetos y observarlas al microscopio, para valorar
el efecto de los eritrocitos.
eer las intrucciones para el uso del microscopio
6. Hacer la dilucin y redilucin (dilucin seriada) de la
solucin de azul de metileno como se muestra en el
siguiente cuadro:
!IUCI,N &E#IA!A !E A-U !E ME%IEN(
%ubo ./( 0ml1 &ol de
a2ul de
metileno
3olumen de
trans4erenci
a
1 2 0.5 ml* -
2 2 - 0.5 ml
3 2 - 0.5 ml
4 2 - 0.5 ml
5 2 - 0.5 ml
6 2 - 0.5 ml
*Nota: para mezclar al hacer las diluciones se debe
succionar y soplar con cuidado la pipeta en cada tubo
varias veces antes de transferir la dilucin al siguiente tubo.
#esultados
1. Expresar en forma ordenada los clculos efectuados
para cada uno de los ejercicios.
2. Deducir el movimiento o no del solvente cuando se
ponen en contacto eritrocitos con soluciones hipo, hiper e
isoosmticas.
1. Calcular la dilucin y la concentracin de azul de
metileno en cada uno de los seis tubos de la dilucin
seriada (ver pg. 93). Asegrese que la coloracin obtenida
disminuya gradualmente conforme avanza la dilucin.
1
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BIOQUMICA
UNAM 2013
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"roblemas
1. Hacer los clculos para preparar una solucin de KCl al
3%.
2. Hacer los clculos para prepar una solucin de CaCl2
0.25 M se requieren 15 ml.
3. Calcular el volumen de H2SO4 que se requiere para
preparar una solucin 3N 40 ml volumen final. (densidad=
1.84g/ml).
4.- Prepare 500 ml de una solucin 0.125 M de NaHC03
5.-250 ml de H2SO4 0.1 M
6.-100 ml de glucosa 0.5 M
7.-Cuantos mililitros de HCl 0.1M contiene 0.025 mol de
HCl
8.-Cuantos gramos de soluto se requieren para preparar las
siguientes soluciones:
125 ml de NaCl al 10%
50 ml de Ca(NO3)2 al 3.35 %
750 ml de CaCl2 al1.5%
9.-Cual presenta la osmolaridad ms alta NaCl 0.1M o
Na2SO4 0.08 M
10.-A un enfermo hay que inyectarle 15 g de KCl y 126 g de
glucosa (C6O6H12)
Cunta agua habr que aadirles para que resulte un
suero 0.4 osmolar?
11.- Calcular la osmolaridad a partir de la composicin de
algunas soluciones como Dextrosa a 10 % en solucin
salina a 0.45%.
12.-Calcular la osmolaridad a partir de Dextrosa a 5 % en
solucin salina a 0.2 %.
Buscar las composiciones de las siguientes soluciones.
Hartman, Ringer y Darrow.
#e4erencias
1. Villazn SA, Crdenas CO,Villazn DO, Sierra UA.
Fluidos y electrlitos. Mxico: JGH Editores; 2000.
2. Pea-Daz A, Arroyo BA, Gmez PA, Tapia R, Gmez
EC. Bioqumica. Undcima reimpresin de la 2a. ed.
Mxico: Editorial Limusa; 2004.
3. Laguna J, Pia E. Bioqumica de Laguna. 5a.ed. Mxico:
Editorial El Manual Moderno; 2002: p. 41-56.
4. Holum JR. Fundamentos de qumica general, orgnica y
bioqumica para ciencias de la salud. Mxico: Editorial
Limusa Wiley; 2001.
5. Farias GM. Qumica clnica. Dcima edicin Mxico:
Editorial El Manual Moderno; 1999.
6. Bloomfield MM.Qumica de los organismos vivos.
Mxico: Editorial Limusa; 1997.
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IN&%#UCCI(NE& "A#A E U&( !E
1
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BIOQUMICA
UNAM 2013
MIC#(&C("I( MA#CA EICA
1. Nunca use un adaptador entre el cable y la fuente de
alimentacin.
2. Use siempre el microscopio sobre una superficie dura y
estable.
3. Conecte el cable de alimentacin del microscopio a una
toma de corriente con conexin a tierra. Se suministra un
cable de tres terminales con toma a tierra.
4. Encienda el microscopio girando el interruptor de control
de la iluminacin situado en la parte inferior izquierda del
instrumento.
5. Coloque el interruptor de control de la iluminacin en el
nivel ms bajo. El control de iluminacin le permite ajustar
la intensidad de luz.
6. Abra completamente el diafragma de apertura del
condensador girando el anillo hacia el extremo derecho.
7. Usando el botn de enfoque del condensador, suba el
condensador hasta el extremo superior de su
desplazamiento. luminacin critica nicamente: si el
desplazamiento del condensador es excesivo, limtelo con
el tornillo situado debajo de la platina hasta que la lente
superior del condensador se encuentre debajo de la
superficie de la platina.
8. Coloque la preparacin de la muestra con la muestra en
la platina.
9. Gire el revlver hasta situar el objetivo 45 en la posicin
de trabajo.
10. Suba la platina girando el mando de enfoque
macromtrico hasta que observe la preparacin y,
finalmente, enfoque la muestra con precisin utilizando el
mando de enfoque micromtrico.
11. Ajuste los tubos oculares a la distancia de los ojos.
12. Al trmino del uso del microscopio retirar la muestra de
la platina.
13. Bajar la platina hasta el tope y regresarla a su posicin
original si es necesario.
14. Colocar el revolver de los objetivos de manera que el
objetivo de 45 sea el que quede en direccin de la lmpara.
15. Desconectar el equipo y enrollar el cable.
16. Limpiar la platina y oculares con un pao humedecido
con metanol o con un limpia cristal comercial.
17. Colocar al microscopio la funda contra el polvo para
mantenerlo en buenas condiciones fsicas y mecnicas.
46
"artes del microscopio+
1) Oculares.
2) Revolver con 4 objetivos 4X, 10X, 40X y 100X.
3) Platina.
4) Diafragma.
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BIOQUMICA
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5) Lmpara.
Tornillo de la platina para desplazar la muestra.
nterruptor de control de la iluminacin.
Tornillo macromtrico.
Tornillo micromtrico.
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"rctica /
#e*ulacin del equilibrio cido6base
despus del e7ercicio muscular intenso
y de la in*estin de bicarbonato de sodio
Tiempo de prctica: 3 horas
(b7eti8os
1. 2l finali+ar la %rctica' el alumno constatar las
acti3idades re#uladoras del %ulm"n & el ri4"n %ara
mantener el equili!rio cido5!ase en condiciones que
tienden a rom%erlo.
2. 6ediante la determinaci"n del %0 o!ser3ar la 3ariaci"n
de la concentraci"n de 7idro#eniones en la orina de un
indi3iduo que 7a reali+ado e*ercicio muscular intenso.
3. -elacionar los resultados o!tenidos con los cam!ios
meta!"licos ori#inados %or el e*ercicio muscular intenso.
Conteste las siguientes preguntas:
1. Por qu es importante que se mantenga constante,
dentro de ciertos lmites, el pH en el organismo?
2. Cules son las fuentes de iones H+ en el organismo?
3. Cules son los sistemas reguladores que facilitan la
eliminacin del H+ producido en el organismo con el fin de
mantener constante el pH sanguneo?
4. Cules son las reacciones de formacin del cido
carbnico (H2CO3) a partir de CO2 y H2O, y de su
disociacin para formar el ion bicarbonato? Escrbalas.
5. Qu sistemas amortiguadores participan directamente
en la regulacin del pH sanguneo?
6. Cules son los sistemas extrasanguneos que tienden a
mantener el pH extracelular?
Escriba la ecuacin de Henderson y Hasselbalch aplicada
al sistema HCO3
/H2CO3 y, con base en ella, conteste la
siguiente pregunta:
a).Cmo participan el aparato respiratorio y el rin en el
control del pH sanguneo?
1
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BIOQUMICA
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IN%#(!UCCI,N
Dentro de los mecanismos de regulacin de que dispone el
organismo para mantener la integridad fisiolgica, aquellos
involucrados en la homeostasis del pH en los fluidos
extracelulares desempean un papel crucial para la
supervivencia del individuo. En este sentido cabe sealar
que, como resultado de la oxidacin de los alimentos, un
humano adulto promedio produce alrededor de 20 moles de
48
CO2 al da, Al difundir a la sangre, gran parte de dicho gas
se combina con al agua en el interior de los eritrocitos,
produciendo cido carbnico (H2CO3), reaccin que es
seguida por la disociacin del H2CO3 para producir el anin
bicarbonato HCO3
- y un in hidrgeno (H+). Dado el carcter
de cido dbil del H2CO3, la fraccin disociada del mismo
es pequea; sin embargo, considerando la gran cantidad de
CO2 que produce el organismo, la acidificacin de los
fluidos extracelulares sera importante en ausencia de
mecanismos reguladores. En el hombre, la intervencin de
los pulmones y los riones evita que ocurra tal acidificacin
manteniendo en un nivel constante la concentracin de H+
y, por consiguiente, del pH.
Para entender el papel que juegan ambos rganos
en la homeostasis del equilibrio cido-base, debe tenerse
presente que el sistema del cido carbnico implica la
participacin de un componente gaseoso o voltil (el CO2) y
dos componentes no voltiles (el HCO3
- y el H+). En la
sangre, el equilibrio entre dichos componentes determina el
valor del pH sanguneo, que puede evaluarse mediante la
bien conocida ecuacin de Henderson-Hasselbach. En el
individuo normal, dicho valor fluctua en un promedio 7.4,
siendo la sangre venosa enriquecida en CO2 ligeramente
ms cida en relacin con la sangre arterial. Ahora bien, ya
que a temperatura ambiente el CO2 existe en estado
gaseoso, la cantidad de CO2 disuelto en la sangre
depender de la presin parcial (PCO2) ejercida por el
mismo a nivel de los alvolos pulmonares. En el humano, la
magnitud de dicha PCO2 es de aproximadamente 40 mmHg
lo que se traduce en una concentracin de CO2 sanguneo
de aproximadamente 25 mM; este ltimo valor incluye no
solo el CO2 como tal, sino tambin el bicarbonato y el cido
carbnico. Considerando el pH sanguneo normal y el pKa
del sistema bicarbonato-cido carbnico, la relacin [HCO3
-]
/ [H2CO3 + CO2] es de aproximadamente 20. Es
precisamente la PCO2 la que es controlada por los
pulmones, ya que durante el proceso de la exhalacin se
1
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BIOQUMICA
UNAM 2013
elimina CO2, manteniendo constante la PCO2 en los alvolos
y evitando as que que aumente el nivel de CO2, disuelto en
la sangre. Todo proceso o patologa que se manifieste en
una alteracin en la frecuencia y/o profundidad del proceso
de inhalacin-exhalacin, dar como resultado una
alteracin de la PCO2 alveolar aumentandola o
disminuyndola, -con la siguiente modificacin del nivel de
CO2 disuelto en sangre y, por consiguiente, del pH.
Por lo que respecta a los riones, su participacin
en el mantenimiento de un pH extracelular constante se da
a travs de dos mecanismos: la excrecin de equivalentes
cidos (H+) hacia la orina y la regulacin de la cantidad de
HCO3
- reabsorbido hacia la sangre desde el filtrado
glomerular. A diferencia del intercambio gaseoso en los
pulmones, los mecanismos de regulacin renal son de largo
plazo, por lo que su efecto ser manifiesto en cuestin de
horas. Su importancia se enfatiza en situaciones
patolgicas donde se altera el intercambio de gases
pulmonar (es decir, en la acidosis y alcalosis respiratorias),
en cuyo caso es necesario aumentar o disminuir la tasa de
reabsorcin del HCO3
- , o bien en estados fisiolgicos que
producen cantidades importantes de cidos orgnicos (por
ejemplo, en la diabetes no controlada o durante el ejercicio
intenso) donde se incrementa la excrecin de H+ Gran
parte de este ltimo aparece en la orina acomplejado con el
amoniaco en forma de in amonio (NH4
+) o asociado con el
fosfato en forma de fosfato monobsico de sodio
(NaH2PO4), representando este ltimo la llamada acidez
titulable. En general, el pH de la orina ser un reflejo de la
produccin de cidos no voltiles por el organismo.
El resultado final de los mecanismos fisiolgicos que
participan en el mantenimiento del equilibrio cido-base es
el de mantener el pH extracelular en un rango compatible
con el funcionamiento adecuado del organismo.
Material
49
Diez probetas o vasos de precipitado.
Orina.
Solucin de bicarbonato de sodio a 3%.
Potencimetro.
Mtodo
Un alumno por equipo desayunar o comer normalmente
(evitar ingestin de jugos cidos); despus har lo que se
indica a continuacin.
1. Tomar 250 ml de agua una hora antes de la clase
prctica. Vaciar la vejiga y descartar esa orina.
1
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BIOQUMICA
UNAM 2013
2. Tomar 250 ml de agua inmediatamente antes de la clase
prctica.
3. Orinar en un vaso de precipitado de 100 ml. Anotar el
volumen de la muestra.
4. ngerir 250 ml de agua.
5. Realizar ejercicio muscular intenso, como subir y bajar
varias veces las escaleras de tres o cuatro pisos u otro
ejercicio sugerido por el profesor.
6. Obtener muestras de orina cada 15 minutos, como en el
inciso 3, hasta completar por lo menos cinco muestras.
7. A cada muestra se le determinar el pH inmediatamente
despus de haber sido obtenida ya que con el tiempo el pH
tiende a aumentar debido a la prdida de dixido de
carbono y a que el crecimiento bacteriano produce
amoniaco a partir de la urea.
Anlisis de resultados
Una vez obtenido el valor del pH para cada una de las 5
muestras de orina, trazar una grfica de pH contra tiempo;
interpretar los resultados y discutirlos en grupo.
(b7eti8os 0&e*unda parte1
1. $l alumno constatar el %a%el del ri4"n en el
mantenimiento del equili!rio cido5!ase en una situaci"n de
alcalosis meta!"lica %ro3ocada %or la in#esti"n de
!icar!onato de sodio.
2. 6ediante la medici"n del %0' o!ser3ar la 3ariaci"n de la
concentraci"n de 7idro#eniones en la orina de un indi3iduo
que 7a in#erido una car#a de !icar!onato de sodio.
.iptesis
Elabore la hiptesis apropiada.
Material
Orina
Solucin de bicarbonato de sodio al 3%
Potencimetro
Mtodo
1. Tomar 250 ml de agua una hora antes de la clase
prctica. Vaciar la vejiga y descartar esa orina.
2. Tomar 250 ml de agua inmediatamente antes de la clase
prctica.
3. Orinar en un vaso de precipitado de 100 ml. Anotar el
volumen de la muestra.
4. ngerir 250 ml de agua con 7.5 g de bicarbonato de
sodio.
5. Obtener muestras de orina cada 15 minutos, hasta
completar por lo menos 5 muestras.
50
6. A cada muestra se le determinar el pH inmediatamente
despus de haber sido obtenida.
1
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BIOQUMICA
UNAM 2013
Una vez obtenido el valor del pH para cada una de las
cinco muestras de orina, trazar una grfica de pH contra
tiempo; interpretar los resultados y discutirlos en grupo.
#e4erencias
1. Devlin TM. Bioqumica. Libro de texto con aplicaciones
clnicas. 4a. ed. Barcelona: Editorial Reverte; 2004.
2. Montgomery R. Bioqumica: casos y texto. 6a. ed.
Editorial Harcourt-Brace; 1998: cap.4.
3. Villazn SA, Crdenas CO, Villazn.
51
"rctica 9
Cintica en2imtica.
E4ecto de la concentracin del sustrato
sobre la 8elocidad de reaccin en2imtica
Objetivo
$l alumno:
1. $%licar el efecto de la concentraci"n de sustrato so!re
la 3elocidad de una reacci"n en+imtica.
2. Calcular %or m)todos #rficos la 3elocidad mima & la
constante de 6ic7aelis de una reacci"n en+imtica.
3. Conocer los diferentes ti%os de in7i!idores que eisten &
estudiar su efecto so!re la 8m & 9 m.
4. Conocer as%ectos !sicos de fotocolorimetr(a ,3er %#'
1151.
Para lo#rar los o!*eti3os de esta %rctica contestar las
si#uientes %re#untas:
1. :Qu) es la 3elocidad de una reacci"n en+imtica;
2. :C"mo se define la constante de 6ic7aelis ,8m1 de una
reacci"n en+imtica;
3. :C"mo se define la 3elocidad mima ,9 m1 de una
reacci"n;
4. :Para qu) le sir3e a un m)dico la determinaci"n de la
acti3idad de al#unas en+imas;
5. :Cules son las en+imas cu&a determinaci"n tiene 3alor
dia#n"stico;
.iptesis
Si la velocidad de una reaccin enzimtica es proporcional a
la concentracin del sustrato; cuando la concentracin del
sustrato es muy alta, por lo tanto la enzima se satura y
alcanza su velocidad mxima.
La enzima que sirve de modelo en esta prctica es la
glucosa oxidasa acoplada a la peroxidasa.
IN%#(!UCCI,N
Las enzimas son las protenas ms notables de la
naturaleza; sin ellas, la vida como la conocemos no sera
posible. Las enzimas son catalizadores, esto es, aceleran la
1
8
BIOQUMICA
UNAM 2013
velocidad de las reacciones sobre las que actan sin
consumirse en el proceso. El poder cataltico de las enzimas
es mucho mayor que el de los catalizadores inorgnicos,
algunas de ellas estn limitadas solo por la velocidad con
que colisionan con sus sustratos; son catalizadores
perfectos.
Aunque las reacciones que ocurren en la clula son
termodinmicamente favorables, la velocidad a la cual
transcurren la mayora de ellas es extremadamente lenta; sin
la presencia de las enzimas, las reacciones necesarias para
52
sostener la vida ocurriran a una velocidad incompatible con
sta. Adems de su enorme poder cataltico, las enzimas son
altamente especficas por sus sustratos y tienen la capacidad
de regular su velocidad en respuesta a las concentraciones
de sustrato y la presencia de inhibidores, activadores,
reguladores alostricos, etc. As pues, las enzimas
desempean un papel central en los procesos biolgicos,
son las responsables de degradar y sintetizar las molculas
que nos forman y de extraer, transformar y utilizar toda la
energa relacionada con estos procesos. Por ltimo, las
enzimas son las responsables de regular y coordinar todas
las reacciones que ocurren en un organismo para lograr el
delicado balance que representa la vida.
El primer modelo matemtico que explic de manera
general la cintica de las enzimas no alostricas, donde la
velocidad de la reaccin se incrementa hiperblicamente
conforme aumenta la concentracin de sustrato, fue
propuesto en 1913 por Leonor Michaelis y Maud Menten a
partir de los trabajos previos de Victor Henri y Archibald Hill.
Este modelo postula la idea central de que la enzima y el
sustrato libres establecen un equilibrio rpido con el complejo
enzima-sustrato; en un segundo paso ms lento, este
complejo se rompe liberando el producto y regenerando la
enzima libre. La ecuacin de Michelis-Menten explica la
relacin entre la velocidad de la reaccin catalizada por una
enzima y la concentracin de sustrato a travs de los dos
parmetros de la ecuacin, 9ma & 8m. La ecuacin de
Michaelis-Menten puede ser re-arreglada matemticamente
para obtener su forma lineal, permitiendo determinar de
manera sencilla los parmetros cinticos de una enzima a
travs del grafico de Lineweaver-Burk. Este mismo grfico
permite inspeccionar rpida y visualmente las diferentes
formas de inhibicin enzimtica.
El estudio de las enzimas es de suma importancia
dentro de las ciencias mdicas; las enzimas estn implicadas
en el origen, diagnostico y tratamiento de una gran cantidad
de patologas y es claro que en el futuro, su preponderancia
ser cada vez mayor. Por ejemplo, la deficiencia de algunas
1
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BIOQUMICA
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enzimas, como las proteasas de la coagulacin en la
hemofilia, es causa de enfermedades hereditarias. La
presencia anormal de algunas enzimas en el torrente
sanguneo ayuda a diagnosticar el dao especfico de
tejidos, este es el caso de la amilasa y lipasa en las
patologas pancreticas y las transaminasas en las
enfermedades hepticas. Las enzimas son tambin el blanco
de varios frmacos: la aspirina inhibe a la ciclooxigenasa, el
omeprazol a la ATPasa de protones y el captopril a la enzima
convertidora de angiotensina; estas inhibiciones redundan en
un efecto teraputico. La capacidad de producir enzimas
recombinantes abri la posibilidad de utilizarlas
rutinariamente con fines teraputicos, tal es el caso de la
estreptocinasa para la terapia fibrinoltica en el infarto agudo
al miocardio. Es claro que todas estas aplicaciones no serian
posibles sin la previa y profunda comprensin de la
estructura y funcin de estas fascinantes molculas.
:undamento
El mtodo se basa en el hecho de que la glucosa, en
presencia del oxgeno del aire y con la participacin de la
glucosa oxidasa, se oxida hasta cido glucnico. El perxido
de hidrgeno que se forma en el curso del proceso se
descompone mediante la peroxidasa. El oxgeno atmico
que se desprende en esta ltima reaccin se combina con un
cromgeno que se colorea al oxidarse. La intensidad de la
coloracin del cromgeno oxidado es proporcional a la
concentracin de glucosa.
La glucosa oxidasa (-D-glucosa: oxgeno xidorreductasa,
EC1.1.2.4) tiene un peso molecular de 160 000. Existe en
forma dimrica y contiene dos moles de FAD como grupo
prosttico por mol de enzima. La glucosa oxidasa es
53
altamente especfica, hecho que ha permitido su empleo
para el anlisis cuantitativo de glucosa. La reaccin consiste
de dos pasos:
1. Glucosa + glucosa oxidasa-FAD -
gluconolactona + glucosa oxidasa-FADH2
2. Glucosa oxidasa-FADH2 + O2 glucosa oxidasa-FAD +
H2O2
La 4-gluconolactona se hidrata espontneamente dando
cido glucnico. La reaccin global se expresa:
Glucosa oxidasa
Glucosa + O2 Acido glucnico + H2O2
La peroxidasa cataliza la transferencia de oxgeno del
perxido a un aceptor que es cromgeno como la
ortotoluidina, la ortodianisidina, la 2,2-azino-bis (3-
etilbencentiazolin-6-sulfnico) o la 4-amino-antipirina (y fenol)
que se colorean al oxidarse. La reaccin se expresa:
E ; & E& E ; "
1
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Material y reacti8os
2 Gradillas con 8 tubos de ensaye cada una.
1 Pipeta de 5 ml.
2 Pipetas de 5 ml.
1 Matraz Erlemeyer de 100 ml.
Fotocolormetro con filtro azul.
Solucin estndar de glucosa 40 mmol/l y una dilucin 1:10
de sta para los tubos 2, 3 y 4.
2 frascos con solucin de enzimas: 41.6 Uml1 de glucosa
oxidasa, 4.6 Uml1 de peroxidasa, ortodianisidina 0.21
mmol/l.
Solucin de azida de sodio 400 mmol/l como inhibidor.
Gotero con HCl.
Mtodo I 0con a2ida de sodio1
1. En un matraz Erlenmeyer de 100 ml preincubar 20
minutos la solucin de enzimas con 0.3 ml del inhibidor.
2. Preparar la siguiente serie de tubos (tabla 1).
3.- Considerar un intervalo de 30 segundos para cada tubo al
agregar la enzima.
4.- Agitar cada tubo e incubar 5 minutos temperatura
ambiente y de inmediato detener la reaccin agregando 3
gotas de HCl concentrado. Considerar un intervalo de
30 segundos para cada tubo al agregar el HCl.
Mtodo II 0sin in<ibidor1
1.- Preparar nuevamente una serie de tubos como lo indica
la tabla 1.
2.- Repetir los pasos 3 y 4 del Mtodo I
Leer ambas series de tubos en el fotocolormetro; utilizar
como blanco el tubo 1
54
#esultados (cuadro 5.2)
1. Clculo de la concentracin inicial de sustrato en cada
tubo; tomar en cuenta que la solucin de glucosa contiene 40
molas ml1.
2. La velocidad ser igual a las unidades Klett por .5 min-1
de incubacin.
3. Con los datos obtenidos completar el cuadro 5.2 y hacer
las dos grficas en papel milimtrico.
4. Hacer una segunda grfica con los valores de 1/v vs 1/[S].
5. Calcular el valor de la velocidad mxima (Vmx) y de la
constante de Michaelis (Km) con y sin inhibidor.
6. Determinar el tipo de inhibidor de acuerdo con las grficas
del punto anterior.
7. Analizar si los resultados obtenidos estn de acuerdo con
la hiptesis planteada.
Instrucciones para la operacin del 4otocolormetro =lett6
&ummerson
1. Antes de encender el fotocolormetro cercirese que el
filtro (F) est en su sitio. La luz sin el filtro puede daar la
1
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BIOQUMICA
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fotocelda.
2. Asegrese que la aguja indicadora (C) est en cero. En
caso contrario, ajstese a cero con la perilla (D) que s"lo
de!e usarse cuando la lm%ara del color(metro est)
a%a#ada.
3. Encienda el foco con el interruptor de la derecha y deje
que el instrumento se caliente hasta que se equilibre su
operacin. Cinco minutos son suficientes.
4. Ajuste la escala del potencimetro (B) a cero usando la
perilla (A).
5. Ponga una cubeta limpia llena con el blanco de reactivos
en el hueco del instrumento en tal forma que la marca del
tubo (ej. Pyrex) se site directamente al frente. Es una
buena prctica limpiar la superficie externa de la cubeta
con un pauelo desechable antes de cada lectura. Slo
deben usarse tubos seleccionados como "cubetas" para
las determinaciones.
6. Por medio de la perilla (G) ajuste la lectura del
galvanmetro a cero; esto es, la aguja (C) debe coincidir
con el trazo central y, al mismo tiempo, con la escala (B)
en cero.
7. Para leer las soluciones problema retire el "blanco y
ponga en el hueco del instrumento la cubeta con la
solucin problema. La aguja (C) se desviar de su
posicin en la lnea de cero; por medio de la perilla (A)
grese la escala (B) hasta que la aguja (C) sea llevada
exactamente a cero. La lectura de la escala (B) se anota y
corresponde a la lectura del problema; lase nicamente
Tubo
No.
Solucin de
glucosa (ml)
H2O
(ml)
Soucin
de
enzimas
(ml)
1 0.0 1.0 3
2 dil 1:10 0.1 0.9 3
3 dil 1:10 0.25 0.75 3
4 dil 1:10 0.5 0.5 3
5 0.1 0.9 3
6 0.25 0.75 3
7 05. 0.5 3
8 1.0 0.0 3
55
hasta la marca ms prxima. Cualquier intento de
apreciar mayor exactitud es innecesario, pues la
1
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construccin del instrumento no proporciona una precisin
mayor.
8. Contine con la lectura de otros problemas y, de vez en
cuando, compruebe el cero con el "blanco.
#e4erencias
clnicas. 4a. ed. Barcelona: Editorial Revert; 2004.
2. Lehninger AL, Nelson, DL. Principios de bioqumica. 4a.
ed. Barcelona: Ediciones Omega; 2005.
3. Mathews CK, van Holde KE. Bioqumica. 3a. ed. Espaa:
McGraw-Hill nteramericana; 2003.
4. Voet D, Voet JG, Pratt C. Fundamentals of biochemistry.
USA: John Wiley and Sons; 1999.
56
Cuadro >./ #esultados
Cuadro >.9 #esultados 0in8erso1
Tubo
No.
Concentracin de
sustrato molas
de glucosa inicial
ml-1
ABCSAS (X)
Velocidad de la
reaccin unidades
Klett 5 min-1 1/V
ORDENADAS (Y)
Velocidad de la
reaccin con
NHBDOR 1/V
Unidades Klett
5 min1 (Y)
1
2
3
4
5
6
7
8
Tubo
No.
Concentracin de
sustrato molas
de glucosa inicial
ml-1
ABCSAS (1/X)
Velocidad de la
reaccin unidades
Klett 5 min-1
ORDENADAS (1/Y)
Velocidad de la
reaccin con
NHBDOR
Unidades Klett
5 min -1
1
1
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2
3
4
5
6
7
8
57
"rctica ?
Estudio del bombeo de protones por le8aduras@
e4ecto de los
in<ibidores de la cadena de transporte de
electrones y de los
desacoplantes.
Objetivos
1. Que el alumno relacione el consumo de #lucosa con los
cam!ios de %0 %roducidos %or las le3aduras.
2. Que el alumno descri!a las 3(as %or las cuales la #lucosa
#enera los cam!ios de %0.
3. Que el alumno inter%rete el efecto de los in7i!idores & los
desaco%lantes so!re la salida de %rotones.
Responda a las siguientes preguntas:
1. Cules son las fuentes de carbono que usa la levadura?
2. Cules son las vas metablicas que catabolizan a los
carbohidratos?
3. En qu consisten la gluclisis y la fosforilacin oxidativa?
4. Cules son los productos finales del catabolismo de los
carbohidratos en las levaduras?
5. Cules son los inhibidores de la cadena respiratoria de
los sitios , y ? Describa su efecto sobre el consumo de
O2 y la sntesis del ATP.
6. Cul es el mecanismo por medio del cual los
protonforos desacoplan la fosforilacin oxidativa? Describa
su efecto sobre el consumo de O2 y la sntesis del ATP.
Las levaduras <acc7arom&ces cere3isiae son organismos
unicelulares que se dividen por gemacin. En comn con
otras clulas eucariontes, las levaduras tienen un ncleoen
donde reside la informacin gentica de la clula,
mitocondrias en donde se lleva a cabo la sntesis de ATP y
un retculo endoplsmico y aparato de Golgi que se encargan
de la sntesis de protenas cuya localizacin final es la
membrana plasmtica o el exterior.
A nivel de la membrana plasmtica, las levaduras tienen una
ATPasa de H+ que acopla la hidrlisis del ATP con el
1
8
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bombeo de protones hacia afuera de la clula. Esta protena
es semejante desde un punto de vista estructural y funcional
a la ATPasa de Na+/K+ de las clulas animales y, al igual que
la bomba de sodio/potasio, se inhibe con concentraciones
micromolares de vanadato. Como resultado de la actividad
de la ATPasa de H+ en la levadura, se genera un gradiente
electroqumico de protones que se utiliza para impulsar el
transporte de nutrientes al interior de la clula, proceso
58
catalizado por sistemas de transporte llamados
simportadores o uniportadores. Para darse una idea de la
importancia de esta enzima en la economa celular y en la
energizacin de la membrana celular, basta decir que la
ATPasa de H+ consume hasta un 25 % del ATP que se
sintetiza en la clula.
Adems de esta ATPasa de H+ de la
membrana plasmtica, las levaduras tienen otra bomba de
protones en la membrana interna de las mitocondrias, la ATP
sintasa, que se encarga de la sntesis del ATP. En contraste
con la enzima de membrana plasmtica, el flujo de protones
a travs de la ATP sintasa induce la sntesis de ATP. Uno de
los inhibidores ms efectivos de esta enzima es la
oligomicina.
As, se puede proponer uno de los muchos ciclos en los que
interviene el ATP en la levadura: por un lado, el ATP se
sintetiza en la mitocondria por medio de la ATP sintasa, y a
nivel de la membrana plasmtica, la ATPasa de H+ lo
hidroliza para bombear protones al exterior de la clula. El
factor comn en ambos casos es un flujo de protones a
travs de la membrana.
.iptesis
Si las levaduras consumen glucosa, se observar una
disminucin progresiva de su concentracin en el medio de
cultivo con el tiempo y cambios en el pH extracelular.
Material
Tres vasos de precipitado de 100 ml.
Pipetas de 5 y 10 ml.
Potencimetro.
Piceta para enjuagar el electrodo del potencimetro.
Levadura (<acc7arom&ces cere3isiae) 200 mg/ml.
Solucin de glucosa (10%) para una concentracin final de
1%.
Solucin de dinitrofenol 40 mmol/l en etanol.
Solucin de azida de sodio 400 mmol/l.
Agua destilada.
Mtodo
Experimento 1 (control)
1 .Diluir 5 ml de la levadura con 40 ml de agua destilada.
2. Determinar el pH de la solucin y repetir la medicin dos
1
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veces ms con intervalos de 3 minutos para obtener la lnea
basal.
3. Adicionar 5 ml de glucosa a 10 %, agitar y medir el pH.
4. Determinar el pH de la solucin cada 5 minutos 4 veces, y
luego cada 10 minutos 2 veces ms.
E5"E#IMEN%( / 0!INI%#(:EN(1
1. Diluir 5 ml de la levadura con 40 ml de agua destilada.
2. Aadir por decantacin (no pipetear) 0.2 ml de la solucin
de dinitrofenol 40 mmol/l, concentracin final de 200 mol/l.
basal.
4. Esperar 5 minutos.
5. Repetir los pasos 3 y 4 del experimento control.
59
E5"E#IMEN%( 9 0A-I!A1
1. Diluir 5 ml de la levadura con 40 ml de agua destilada.
2. Aadir por decantacin (no pipetear) 0.5 ml de la solucin
de azida de sodio 400 mmol/l, concentracin final de 5
mmol/l. Agitar con cuidado.
basal.
4. Esperar 5 minutos.
5. Repetir los pasos 3 y 4 del experimento control.
6. Registrar sus datos en la siguiente tabla.
p.
%iempo
0min1
Alucosa
!initro4e
nol
A2ida de
sodio
B
>
)B
)>
/B
9B
?B
1. Hacer una grfica de cada uno de los experimentos;
utilizar los valores de las lecturas de pH contra tiempo.
2. Analizar el significado de los cambios de pH en el
experimento control, con dinitrofenol como desacoplante y
con azida de sodio.
3. Hacer una relacin de las vas que producen estos
cambios; tomar en cuenta que las levaduras poseen una
1
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ATPasa de protones en la membrana mitocondrial que se
encarga de sintetizar ATP y que tienen otra ATPasa de
protones en la membrana plasmtica cuya funcin es similar
a la bomba de Na
+
/K
+
en las clulas de los mamferos (ver
fig. 7.1).
#e4erencias
1. Pea A. Studies on the mechanism of K+ transport in
yeast. Arch Biochem Biophys. 1975; 167:397-409.
2. Pardo JP. La ATPasa de H+ de la membrana plasmtica
de los hongos. Mensaje Bioqumico. 1990; 13: 119-172.
60
Alucosa
Alucosa
A%" A!"
NA! NA!.
Acetalde<do
.; .;.;
Etanol
A!" ; "i
A%"
.;
A!"
A%"
A!" ; "i
.; .;
Mitocondria
A!"
61
"rctica >
!eterminacin de *lucosa en san*re total
Tiempo de la prctica: 3 horas
(b7eti8os
1. Que el estudiante comprenda el metabolismo de la glucosa
en sujetos sanos en diferentes condiciones.
2. Que el estudiante corrobore los cambios de glucosa e
insulina durante la ingesta de alimentos.
3. Que el alumno sea capaz de interpretar y relacionar los
valores de glicemia obtenidos en diferentes condiciones.
4. Que el alumno sea capaz de ver las curvas de absorcin de
diferentes monosacridos.
Introduccin
En el estado de postabsorcin (ayuno) de los individuos
normales, la relacin insulina/glucagn sangunea es baja,
haciendo que el glucgeno muscular y heptico sea
degradado como una fuente de glucosa. Un ayuno adicional
resulta en la degradacin de las protenas a aminocidos en el
msculo esqueltico, y en la liplisis de los triglicridos a
cidos grasos en el tejido adiposo. El aminocido alanina y el
glicerol son usados para sintetizar glucosa por medio de la
1
8
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gluconeognesis estimulada por glucagn. Adems, los cidos
grasos libres pueden ser usados como combustible por el
corazn, los msculos esquelticos y el hgado.
Algunos minutos despus de la ingesta de una comida, los
niveles de insulina sangunea aumentan. La glucosa y los
aminocidos de la dieta tales como la leucina, isoleucina y
lisina, son estimulantes potentes de las clulas beta del
pncreas haciendo que stas segreguen insulina. La mayor
parte de las clulas perifricas responden al aumento de la
glucosa sangunea con un aumento rpido del transporte de la
glucosa dentro de las clulas. De esta manera, los niveles de
glucosa sangunea aumentan solamente de un 20% a un 40%
en los individuos no-diabticos. Sin embargo,
aproximadamente el 80% de la entrada de glucosa no es
insulino dependiente, ya que el cerebro, los glbulos rojos, el
hgado y los intestinos no requieren de insulina para la entrada
creciente de glucosa cuando est presente glucosa sangunea
elevada. El msculo es el tejido dependiente de insulina ms
importante. Los niveles crecientes de insulina y glucosa
sanguneas inhiben la liplisis as como a aproximadamente el
60% de la liberacin normal de glucosa heptica.
Las concentraciones de glucosa en los nios menores de 5
aos de edad son aproximadamente del 10 al 15% ms baja
que los niveles encontrados en los adultos. Los recin nacidos
muestran concentraciones de glucosa desde 200 a 800 mg/l
(1.11 a 4.44 mmol/l), aun cuando las concentraciones de
62
glucosa sangunea en los infantes prematuros son menores.
Las concentraciones de glucosa en los adultos saludables
varan entre 700 a 1050 mg/l (3.9 a 5.8 mmol/l). Las
concentraciones de glucosa del lquido cefalorraqudeo son
aproximadamente del 40% al 80% de aquellos valores
encontrados en el suero o en el plasma. Las concentraciones
de glucosa en el suero son aproximadamente 15% ms altas
que las concentraciones de glucosa en la sangre total. Debe
tomarse en cuenta que las concentraciones totales en la
sangre varan con el hematocrito. La glucosa sangunea total
se aproxima muy marcadamente a la glucosa plasmtica
cuando el hematocrito es bajo. La diferencia del 15% entre la
glucosa sangunea total y la glucosa plasmtica descrita arriba
es para un valor del hematocrito de aproximadamente el 45%.
En esta prctica podemos verla parte de los transportadores y
que transportadores estn involucrados en la absorcin de
carbohidratos.
#e4erencias
1.-Kaplan LA, Pesce AJ. (2002). Qumica Clnica. Teora,
anlisis y correlacin. 3 Edicin. Ed. Pesce Kaplan
Publicaciones, Captulos: 32.
2.-NORMA OFCAL MEXCANA, NOM-015-SSA2-1994, "Para
1
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la prevencin, tratamiento y control de la diabetes mellitus en
la atencin primaria. Listado de Normas Oficiales Mexicanas
de la Secretara de Salud.
3.-MODFCACN a la Norma Oficial Mexicana NOM-015-
SSA2-1994, Para la prevencin, tratamiento y control de la
diabetes. Listado de Normas Oficiales Mexicanas de la
Secretara de Salud.
4.-Manual para el manejo de las insulinas 2001. 2 Edicin.
Subsecretara de Prevencin y Proteccin de la Salud. Centro
Nacional de Vigilancia Epidemiolgica. SSA. Mxico.
!eterminacin de *lucosa.
#equisito para la prctica+ ayuno de C <oras
Glucmetros One Touch Ultra.
Tiras reactivas One Touch Ultra [Glucosa Oxidasa (2s%er#illus
n(#er)].
Lancetas estriles.
Recipiente para material punzo cortante.
Recipiente para material biolgico infeccioso
Jabn para manos.
Torundas de algodn con alcohol.
Sujetos con diferentes ingesta de carbohidratos:
a).-15 gramos de glucosa.
b).-15 gramos de sacarosa.
c).-15 gramos de cereal.
Mtodo.
!eterminacin de *lucosa.
1.-A cada uno de los sujetos se les determinar la
concentracin de glucosa en sangre total por medio de un
glucmetro en los siguientes tiempos:
0 minutos (antes de ingerir la carga de los diferentes
monosacridos).
30 minutos, 60 minutos y 90 minutos, despus de de ingerir
los alimentos.
Para realizar la determinacin de glucosa en sangre total
seguir los siguientes pasos:
1.-Lave sus manos y limpie con una torunda de
algodn con alcohol la zona donde se realizar
la puncin.
63
2.-Aplique un suave masaje a la punta de su
dedo que le ayudar a obtener una gota de
sangre adecuada. No exprima en exceso el
rea de puncin.
3.- Acerque y mantenga la gota de sangre
en el canal estrecho del borde superior de
la tira reactiva.
4.- a) Muestra adecuada
b).Muestra insuficiente
5.- nserte la tira reactiva en el puerto de
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anlisis, con el extremo de las barras de
contacto de primero y mirando hacia
arriba. Empjela hasta que no avance
ms.
6.- Hasta que la ventana de confirmacin
este completamente llena de sangre, antes
que el medidor comience la cuenta
regresiva.
7.-Lectura: el resultado de la prueba de glucosa de su sangre
aparecer despus de que el medidor cuente en forma
regresiva a 5 a 1.
Anotar el resultado en la tabla correspondiente
Tabla 5.1.
8.-Es importante desechar con mucho cuidado la lanceta
usada luego de cada uso, con el fin de evitar que se
produzcan lesiones accidentales con las puntas de la lancetas.
Para el desecho de las lancetas siga los siguientes pasos:
9.-Deposite la lanceta en un recipiente para material punzo
cortante.
10.-Deseche las tiras reactivas en una bolsa para material
biolgico-infeccioso junto con las torundas de algodn
empleadas en la prctica.
11.-Con los datos obtenidos completar el cuadro 9.1 y hacer
una grfica de todas las variantes en papel milimtrico.
Cuadro 5.1 Resultados
Fecha:________________________
Nombre:
Edad: Sexo:
Tiempo en (min.) [Glucosa mg/dl]
0
30
60
90
a b
64
"rctica D
!eterminacin de lpidos y lipoprotenas
plasmticas
Objetivos
1.Recordar la estructura de los diferentes lpidoscirculantes y sus
funciones.
2.Describir las diferentes fuentes de colesterol, su funcin y la dinmica
del colesterol plasmtico.
3.nvestigar el papel del colesterol y otros lpidos en el desarrollo de la
aterosclerosis.
4.Describir la composicin y la funcin de las lipoprotenas.
5.Describir los principios analticos para la determinacin del colesterol
total, colesterol de HDL y de LDL, apolipoprotenas y triacilgliceroles
1
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plasmticos.
6.Calcular la concentracin de colesterol de VLDL y de LDL a partir de
las concentraciones de colesterol total, de colesterol de HDL y
triacilgliceroles.
IN%#(!UCCI,N
Los dos lpidos de la sangre con un mximo inters en el diagnstico
clnico son el colesterol y los triacilgliceroles (TAG);
ambos se transportan en las lipoprotenas, que son partculas globulares
de alto peso molecular con un ncleo formado por lpidos hidrofbicos
TAG y steres de colesterol, los cuales aportan la mayor parte de la
masa de la partcula, y por una sola capa superficial de molculas de
fosfolpidos, colesterol y protenas o polipptidos que rodean al ncleo y
estabilizan la partcula para que permanezca en solucin dentro del
plasma. Las lipoprotenas principales que circulan en el plasma humano
son los quilomicrones, las lipoprotenas de muy baja densidad (VLDL),
las lipoprotenas de baja densidad (LDL) y las lipoprotenas de alta
densidad (HDL).
El colesterol es esencial para el crecimiento y la viabilidad de las
clulas de los organismos superiores; sin embargo, los altos niveles de
colesterol srico son considerados como un importante factor de riesgo
de enfermedad y muerte porque contribuyen a la formacin de placas
aterosclerticas. El colesterol se transporta en la sangre por tres
diferentes lipoprotenas: LDL, HDL y VLDL. Los estudios epidemiolgicos
han establecido con claridad que mientras mayor sea el valor del
colesterol-LDL mayor ser el riesgo de enfermedad cardiaca
aterosclertica; por el contrario, mientras mayor sea la concentracin del
colesterol-HDL menor ser el riesgo de enfermedad cardiaca coronaria.
En otras palabras, las cifras elevadas de LDL son atergenas, en tanto
que las de HDL son protectoras, por lo que el clculo del cociente
colesterol-HDL/colesterol-LDL que es normalmente de 0.34 0.11
constituye un ndice de aterogenicidad.
En general, se cree que las lipoprotenas que contienen apoB 100
son potencialmente atergenas.
65
A%E#ACI(NE& !E A& I"("#(%EENA&
"A&M$%ICA& F A%E#(AGNE&I&
Desde el punto de vista clnico se ha atribuido a determinadas
lipoprotenas el papel de factores esenciales directos en el desarrollo o
en la prevencin de ciertas enfermedades, principalmente de tipo
vascular. Las anomalas en el transporte de lpidos ocurren bsicamente
en los
sitios de produccin o en los de utilizacin de las lipoprotenas del
plasma y provocan varios tipos de hipo e hiperlipoproteinemias
disminucin o elevacin de los niveles plasmticos de lipoprotenas.
El anlisis de las lipoprotenas plasmticas tiene valor
diagnstico, ya que permite el reconocimiento de defectos primarios
hipertrigliceridemia e hipercolesterolemia familiares, deficiencia familiar
de lipoprotena lipasa o apoprotena C, etctera y es de gran valor para
describir la alteracin lipoproteica subyacente a otro trastorno clnico,
como la diabetes, la obesidad, la hepatitis, el hipotiroidismo, el consumo
de alcohol, el uso de anticonceptivos orales.
Cabe destacar que la mayor parte de las hiperlipo-proteinemias,
aquellas que consisten en una elevacin de la concentracin de
colesterol de LDL, de VLDL y de Lp(a), conllevan un alto riesgo de
producir accidentes cardio y cerebrovasculares, necrosis o prdida de la
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funcin en las extremidades, lo cual se debe a que el colesterol es el
agente causal de la aterosclerosis subyacente en dichos padecimientos.
De ah el inters actual por el diagnstico temprano y el tratamiento de
estas hiperlipoproteinemias.
Se desconoce el mecanismo exacto por el cual la
hipercolesterolemia conduce a la aterosclerosis. Sin embargo, se cree
que al alterarse la relacin colesterol/fosfolpido que lleva consigo un
incremento en la viscosidad y maleabilidad de las membranas se
inducen cambios en el endotelio y en los monocitos con un aumento en
su migracin y adherencia probablemente la primera anomala celular de
la aterognesis.
Segn la hiptesis de respuesta a la lesin, la ms aceptada
sobre la patognesis de la aterosclerosis, cualquier lesin en el endotelio
o msculo liso de la pared vascular que puede ser causada por la
hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, el estrs mecnico de la
hipertensin arterial, agresiones qumicas como el tabaquismo, etctera
altera la relacin existente entre el endotelio vascular, las clulas del
msculo liso, los monocitos, los macrfagos, las plaquetas y los
componentes de la sangre circulante, en particular los lpidos, y genera
una respuesta inflamatoria fibroproliferativa, con la participacin de un
gran nmero de factores de crecimiento, citocinas y molculas
vasorreguladoras, que dan origen a las placas aterosclerticas.
Por otro lado, se ha observado que las partculas LDL oxidadas
por los macrfagos lo cual ocurre normalmente causan lesin al
endotelio, lo que puede ser, de manera particular, atergeno. La
formacin de anticuerpos contra LDL oxidadas tambin puede ser
importante en la formacin de la placa. Por tanto, hay un inters clnico
cada vez mayor en la funcin de los antioxidantes, como las vitaminas C,
E y el -caroteno. Los estrgenos tambin pueden actuar como
antioxidantes en la prevencin de aterosclerosis. nclusive, se ha visto
que las lipoprotenas HDL tienen efectos antioxidantes in 3itro.
Tradicionalmente, las anomalas de los lpidos sanguneos se han
valorado con un examen global de colesterol y TAG. En la actualidad
estos datos son insuficientes para valorar correctamente una
hiperlipemia, por lo que se deben investigar tambin las diferentes
fracciones lipoproteicas.
:UN!AMEN%( !E A& !E%E#MINACI(NE&
La evaluacin de pacientes en los que se sospecha alguna alteracin en
los lpidos plasmticos puede incluir la medicin de colesterol total y TAG
66
y de una o ms lipoprotenas. Adems, la cuantificacin de Lp(a), apoA
y apoB, o la actividad de la lipoprotena lipasa u otras enzimas, est
siendo ampliamente valorada para incluirla como procedimiento clnico
de rutina.
Determinacin del colesterol total. El colesterol total es igual a la
suma del colesterol contenido en las tres lipoprotenas que lo
transportan:
Colesterol total = colesterol VLDL + colesterol HDL + colesterol LDL
Adems, el colesterol existe en el organismo en dos fracciones:
una en estado libre y otra esterificado 60 a 75%, por lo que, para la
determinacin del colesterol total, se utiliza una serie de reacciones
enzimticas en donde, en una primera reaccin, los steres se hidrolizan
dejando libre el grupo 3-OH del colesterol. En la segunda reaccin este
grupo se oxida y se obtiene, como
un producto, el perxido de hidrgeno, el cual, por efecto de la
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peroxidasa, transfiere uno de sus oxgenos a un aceptor cromgeno. La
absorbencia del cromgeno 4-benzoquinona-monoimino-fenazona) se
determina a 546 nm y es proporcional a la concentracin de colesterol.
La reaccin global es la siguiente:
Colesterol esterasa
steres de colesterol colesterol + cidos grasos
Colesterol oxidasa
Colesterol + O2 4-colestoma + H2 O2
Peroxidasa
2 H2O2 + 4-aminoantipirina + fenol cromgeno + H2O
Determinacin de triacilgliceroles. El mtodo utilizado se basa en
la hidrlisis de los TAG por una lipasa y la determinacin del glicerol
liberado en la reaccin. Para ello, el glicerol es fosforilado por la glicerol
cinasa formando glicerol-3-fosfato, el cual se oxida por la glicerolfosfato
oxidasa a dihidroxiacetona fosfato generando en la reaccin perxido de
hidrgeno. La peroxidasa cataliza la transferencia de oxgeno del
perxido a un aceptor que es cromgeno, como la 4-aminoantipirina (4-
AAP) y el 3,5-dicloro-2-hidroxibencensulfonato (DHBS), que se colorean
al oxidarse. La absorbencia del cromgeno oxidado a 520 nm es
proporcional a la concentracin de TAG.
La reaccin completa se expresa:
Lipasa
TAG glicerol + cidos grasos
Glicerol cinasa
Glicerol + ATP glicerol-3-fosfato + ADP
Glicerolfosfato oxidasa
Glicerol-3-fosfato + O2 dihidroxiacetona fosfato + H2O2
Peroxidasa
H2O2 + 4-AAP + DHBS cromgeno oxidado + H2O
Determinacin de colesterol-HDL. Por regla general, el anlisis de
las lipoprotenas del plasma requiere, primero, la separacin de las
clases de lipoprotenas y, segundo, la medicin de la lipoprotena o del
componente lipoproteico de inters.
La determinacin es relativamente simple si se precipitan todas
las lipoprotenas que contienen apoB100 VLDL, DL, LDL y Lp(a) a
excepcin de las HDL con un polianin, generalmente
glucosaminoglicanos con carga negativa heparina, dextran o
fosfotungsteno y un catin bivalentepor lo comn, Mn2+ o Mg2+ y se
determina el colesterol-HDL que queda en solucin por el mtodo
descrito para el colesterol total.
La relacin colesterol total/colesterol-HDL se considera como un
indicador de riesgo coronario. Normalmente esta relacin es menor de
67
cinco; mientras menor sea el valor, mejor ser el pronstico para el
paciente.
Determinacin de colesterol-VLDL. En general, la concentracin
de TAG en el plasma sanguneo proporciona un parmetro excelente de
la concentracin de las lipoprotenas ricas en TAG como las VLDL. Esta
apreciacin parte de que en condiciones normales de ayuno no se
encuentran quilomicrones en el plasma y la proporcin TAG/colesterol de
la VLDL es invariable de 5:1 en mg/dl o de 2.2:1 en mmol/l, de tal
modo que la cuan-tificacin de la concentracin de TAG es suficiente
para calcular la concentracin de la VLDL con un porcentaje de error
pequeo en la estimacin. Si la concentracin de colesterol-VLDL es la
quinta parte de la concentracin de TAG cuando sta se expresa en
1
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mg/dl, entonces:
TAG
Colesterol- VLDL = -----------
5
o si las concentraciones se expresan en mmol/l:
TAG
Colesterol- VLDL = -----------
2.2
Esta frmula no es apropiada para muestras con una
concentracin de TAG mayor a 400 mg/dl (10.390 mmol/l) o en muestras
que tengan quilomicrones.
Determinacin del colesterol LDL. Aproximadamente las dos terceras
partes del colesterol plasmtico total son transportadas en las LDL de tal
manera que, la concentracin de este lpido proporciona una medida
bastante precisa del nivel de LDL en la mayora de las personas. Por ello
es posible estimar con bastante exactitud, en casi todos los casos, la
concentracin de LDL sobre la base del conocimiento de la
concentracin de VLDL (estimada por los TAG) y la del colesterol total.
No obstante, para estimar con mayor exactitud la concentracin de LDL
debe cuantificarse la concentracin de colesterol de las HDL, lo cual es
relativamente simple.
Las LDL se estiman como sigue:
Colesterol LDL = colesterol-total (colesterol-HDL
+ colesterol-VLDL)
Si se determina la concentracin de lpidos en moles en lugar de
en peso y se sustituye el valor estimado de VLDL a partir de la
concentracin de TAG, la frmula equivalente se transforma en la
expresin descrita por Fridewald (1972):
Colesterol LDL = colesterol total (colesterol HDL
+ TAG/2.2)
Otra forma sencilla de determinacin indirecta del colesterol-LDL
es el mtodo del polivinilsulfato (PVS). El PVS provoca la precipitacin
de las LDL y deja en el sobrenadante las VLDL y las HDL. El valor del
colesterol-LDL se calcula restando al valor del colesterol total (colesterol
en VLDL, LDL y HDL) el valor del colesterol en el sobrenadante de la
precipitacin (colesterol en VLDL y HDL).
Colesterol LDL = colesterol total colesterol en el sobrenadante
(colesterol-HDL y colesterol-VLDL)
La determinacin de LDL se puede hacer directamente mediante
procesos inmunoqumicos que requieren una especial destreza y un
equipamiento especfico, por lo que resulta de difcil adaptacin a fines
acadmicos. La tcnica consiste en hacer reaccionar esferas de ltex
revestidas con anticuerpos contra apolipoprotenas de las LDL. Estas
partculas se separan del resto y se determina el colesterol.
68
Quilomicrones. Cuando existen quilomicrones pueden ser
detectados si se deja el tubo de ensayo que contiene el plasma
sanguneo en el refrigerador durante una noche. Los quilomicrones de
mayor tamao, pero no las VLDL, se ubicarn en la superficie del tubo
formando una capa cremosa que puede detectarse visualmente. La
presencia de quilomicrones en el plasma en ayunas se considera
anormal.
Determinacin de Lp(a). La Lp(a) se determina directamente por
mtodos inmunoqumicos al igual que las LDL y, como ya se dijo, su
concentracin constituye un factor independiente de riesgo coronario.
1
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Normalmente la Lp(a) se precipita junto con las lipoprotenas que
contienen apoB, por lo que la medicin del colesterol de la LDL incluye la
contribucin de colesterol de la Lp(a).
Determinacin de apoA y apoB. La determinacin de
apolipoprotenas, particularmente la apoA y la apoB, es un dato
complementario para la cuantificacin de otros componentes
lipoproteicos y ayuda a evaluar si un individuo tiene un riesgo aumentado
de cardiopata coronaria, sobre todo en los estados hiperlipidmicos
donde hay un aumento de TAG en los quilomicrones o en las VLDL, y
cuando las LDL y HDL contienen menos cantidad de steres de
colesterol y ms TAG en su ncleo debido al intercambio de los
componentes de stos entre las lipoprotenas. En tales circunstancias, la
cuantificacin de las apoprotenas proporciona clculos ms seguros y
tiles de la concentracin de partculas lipoproteicas.
La mayora de los mtodos de cuantificacin, todos los cuales
requieren un equipamiento especial, se basan en la identificacin
inmunolgica de las apolipoprotenas. La tcnica ms usada es el
inmunoanlisis ligado a enzimas y de fluorescencia (ELSA).
Material
Gradilla con 8 tubos de ensayo.
Pipetas de 5 y 10 ml.
Pipetas automticas
Puntas para pipetas automticas
Solucin de enzimas para colesterol: amortiguador Tris 100 mmol/l, pH
7.7; MgCl2 50 mmol/l, 4-amino-antipirina 1 mmol/l, fenol 6 mmol/l;
colesterol esterasa <160 U/l, colesterol oxidasa < 100 U/l y peroxidasa <
2 000 U/l.
Patrn de colesterol de 170 de 200 mg/dl (5.17 mmol/l) para
colesterol total.
Solucin de enzimas para TAG: amortiguador Tris 100 mmol/l, pH 6.7,
ATP 0.7 mmol/l, MgCl2 4 mmol/l, 4-aminoantipirina 0.4 mmol/l, 3,5-
dicloro-2-hidroxibencen-sulfonato 0.8 mmol/l, lipasa <1 000
U/l; glicerol cinasa < 1000 U/l, glicerol fosfato oxidasa 4000 U/l y
peroxidasa < 2000 U/l.
Patrn de TAG (triolena) de 250 mg/dl (2.8 mmol/l) o de 100 mg/dl.
Reactivo precipitante para HDL: sulfato de dextrn 10g/l, MgCl2 0.5
mol/l.
Espectrofotmetro a 520 y 540 nm.
Jeringa, ligadura y torundas con alcohol.
Gotero con anticoagulante.
Mtodo
1.Obtener plasma de un voluntario. El plasma posprandial contiene
quilomicrones, lo que puede aumentar marcadamente la concentracin
plasmtica de TAG, por ello es importante permanecer en ayunas
durante 12 horas antes de la puncin venosa. La estabilidad del plasma
es de 3 das a 4o C.
69
Proceder a determinar colesterol total, TAG y colesterol-HDL
como se describe a continuacin .
2. A 0.5 ml de plasma agregarle 0.05 ml (50 l) de la solucin
precipitante de VLDL y LDL para determinacin de colesterol-HDL;
mezclar perfectamente y dejar reposar 10 minutos. Centrifugar 10
minutos a
3 000 rpm. El sobrenadante libre de lipoprotenas, excepto HDL que
contina siendo soluble, ser utilizado para determinar el colesterol.
1
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3.Para la determinacin de colesterol total y colesterol-HDL preparar la
siguiente serie de tubos:
"reparacin de los tubos 08olumen en ml1
Tubo 1 2 3
H2O (blanco) - - -
Estndar de
colesterol
10 l - -
Plasma - 10 l -
Sobrenadante
con HDL
- - 20 l
Agregar a todos los tubos 1 ml de solucin de enzimas para colesterol.
Mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
4.Leer la absorbencia (A) en el espectrofotmetro a 520 nm; calibrar a
cero con el blanco.
Para determinar los TAG preparar la siguiente serie de tubos:
"reparacin de los tubos 08olumen en ml1.
Tubo 1 2
Blanco - -
Estndar de TAG 10 l -
Plasma - 10 l
Agregar a todos los tubos 1 ml de solucin de enzimas para TAG.
Mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
4. Leer la absorbencia (A) en el espectrofotmetro a 540 nm; calibrar a
cero con el blanco.
#esultados
1. De acuerdo al estndar de colesterol, calcular la concentracin de
colesterol correspondiente a los tubos 3 y 4 (tubos que contienen el
plasma y el sobrenadante) de la siguiente manera:
Cs
[Colesterol] = ------ X Ap
As
Cs = Concentracin del estndar en mg/dl o mmol/l.
As = Absorbencia del estndar.
Ap = Absorbencia del problema.
2. Calcular la concentracin de TAG de la siguiente manera:
Cs
[Triacilgliceroles] = ------ X Ap
As
Cs = Concentracin del estndar en mg/dl o mmol/l.
As = Absorbencia del estndar.
70
Ap = Absorbencia del problema.
3.Compare sus resultados con los valores normales del colesterol total,
del colesterol-HDL y de los triacilglicridos en el plasma.
4.Calcular la concentracin de colesterol VLDL por la frmula: colesterol-
VLDL= TAG/5.
5.Calcular la concentracin de colesterol LDL a partir de las
concentraciones de colesterol total, HDL y VLDL.
6.Estimar el cociente colesterol-HDL/colesterol-LDL y de colesterol
total/colesterol-HDL (ndices aterognicos).
7. Analizar el significado de los datos obtenidos y hacer un informe de
los resultados y de las conclusiones que de stos se deriven.
8. A continuacin se resumen dos casos clnicos:
1
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En enero de 1997, un hombre de 38 aos asisti a una
evaluacin mdica. Pes 93 kg, tena presin arterial alta 160/108,
realizaba poco ejercicio, tomaba de 5 a 10 cervezas y fumaba 2 a 3
cajetillas de cigarros a la semana. El peso y las concentraciones de los
lpidos durante los meses siguientes estn resumidos en la tabla
siguiente:
Ene 97 Oct 97 Feb 98
Peso (Kg) 93 90 95
Colesterol total mg/dl 275 295 320
TAG mg/dl 490 470 550
HDL mg/dl 35 33 29
LDL directa mg/dl - - 259
Colesterol total/
colsterol-HDL
(ndice atergeno)
- - -
'1 Una mujer de 23 aos de edad solicita una determinacin de lpidos
debido al antecedente familiar importante de cardiopata. La paciente no
fuma y pesa 55 kg. Los resultados de la determinacin de los lpidos
iniciales despus de un ao y tres meses de haber iniciado la
administracin de anticonceptivos orales desogestrel, son los
siguientes:
Ene
97
Ene
98
Abr
98
Peso (kg) 55 56 58
Colesterol total mg/dl 285 263 315
TAG mg/dl 85 90 124
HDL mg/dl 40 37 44
Colesterol-VLDL
LDL mg/dl
Colesterol
total/colesterol-HDL
(indice atergeno)
Completar los datos que hacen falta en los cuadros anteriores (tomar
en cuenta que no puede hacerse el clculo de la concentracin de VLDL
si los TAG son mayores de 400 mg/dl).
Constatar la evolucin temporal de los niveles de colesterol y TAG.
Detectar la presencia de hbitos de alto riesgo y hacer notar la
importancia de las modificaciones en esos hbitos.
Al ser iguales todos los factores de riesgo para ambas personas: cul
tendra mayor riesgo de enfermedad coronaria?
Detectar cmo dos personas con el mismo colesterol total tienen
perfiles lipdicos distintos.
71
%#A'AH(& C(N&U%A!(&
1. Allain CA, Poon LS, Chan CSG, Richmond W, Fu PC. Enzymatic
determination of total serum cholesterol. Clin Chem. 1974; 20: 470-
475.
2. Montgomery R. Bioqumica. Casos y texto. 6a.ed. Barcelona:
Editorial Harcourt-Brace; 1998: 332-389.
3. Pennachio D. Lineamientos para la deteccin de
1
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hipercolesterolemia. Atencin Mdica. 1997; 10/2: 30-43.
4. Alba Zayas EL, Pereira RG, Aguilar BA. Lipoprotena (a):estructura,
metabolismo, gentica y mecanismos patognicos. Rev Cubana
nvest Biomed. 2003; 22(1): 32-40.
5. Masa-aki K, Rader JD. Gene therapy for lipid disorders. Curr
Control Trials Cardiovasc Med. 2000; 1:120-127
6. Russet G.W. Dextran sulfate-Mg2+ precipitation procedure for
quantitation of HDL cholesterol. Clin Chem. 1982; 28(6): 1379-
88.
7. Samaniego V, Lpez D. Lpidos. Sinopsis del informe del panel de
expertos sobre niveles de colesterol sanguneo en nios y
adolescentes. Aterosclerosis. 1999; 2(1): 22-24
8. Vogel AA. Coronary risk factors, endothelial function, and
atherosclerosis. Clin Cardiol. 1997; 20:426-432.
9. Velzquez CA. Papel de las especies reactivas del oxgeno en la
arterioesclerosis. ATREA. 2000; 13 (3) septiembre
10. Mohammed HM, Frohlich J. Effects of dietary phytosterols on
cholesterol metabolism and atherosclerosis: clinical and
experimental evidence. Am J Med. 1999; 107: 588-592
3. .
72
"rctica I
Inte*racin Metablica
Objetivos
1.-Que el alumno pueda integrar las vas metablicas de los
carbohidratos, de los lpidos y protenas en (condiciones
normales) en un paciente sano.
2.-Que el alumno reconozca los sitios denominados
encrucijadas metablicas y las enzimas de las vas
reguladoras.
3.-Que el alumno pueda correlacionar el papel que tienen las
hormonas en la regulacin de las vas.
4.-Que el alumno sea capaz de analizar los datos de las
pruebas clnicas en un sujeto normal.
5.-Que el alumno relacione que vas se encuentran alteradas
en un paciente diabtico.
Los alimentos que ingerimos deben estar constituidos por los
6 componentes bsicos que son protenas, carbohidratos,
lpidos, vitaminas, minerales y agua, la cantidad que se
requiere ingerir de cada uno de los componentes vara de
acuerdo a la constitucin y la actividad fsica que se realiza,
tanto la falta como en el exceso de consumo de alguno de los
componentes bsicos conlleva a diversos trastornos
metablicos.
Aproximadamente del 40 al 45% de nuestra ingesta calrica
proviene del consumo diario de carbohidratos complejos los
cuales al ser digeridos dan lugar a los diferentes
monosacridos entre los que se encuentra la glucosa, la cul
se distribuye por la sangre a las clulas para poder captar la
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glucosa, siendo la principal fuente de energa. Algunos tipos
celulares son dependientes de la liberacin de insulina por el
pncreas como es el caso de las clulas musculares. Si la
insulina no funciona adecuadamente, la glucosa se queda en
el flujo sanguneo causando elevacin de los niveles de
glucosa en la sangre y a esto se le denomina hiperglucemia;
una de las enfermedades que se caracteriza por la
hiperglucemia en sus primeras etapas es la diabetes mellitus.
La diabetes mellitus esta caracterizada por una hiperglucemia
resultante de defectos en la secrecin de insulina, en la accin
de la insulina o en ambas. La hiperglucemia crnica de la
diabetes est asociada a lesiones, disfuncin y fallo de varios
rganos, especialmente de los ojos, los riones, el corazn y
los vasos sanguneos.
Varios procesos patognicos estn implicados en el desarrollo
de la diabetes. Estos van desde una destruccin
autoinmunolgica de las clulas del pncreas, con la
consiguiente deficiencia de insulina, hasta anormalidades, en
las que el pncreas no produce suficiente insulina o la que
produce no es eficiente. La accin deficiente de la insulina en
los tejidos diana es la responsable del metabolismo anmalo
73
de los carbohidratos de carbono, grasas y protenas en la
diabetes.
La accin deficiente de la insulina ocasiona una respuesta
inadecuada en uno o ms puntos de la compleja trama
metablica en la que esta hormona tiene papel regulatorio.
Frecuentemente coexisten en el mismo paciente una
inadecuada secrecin de insulina as como defectos de la
accin de sta, en la actualidad no se sabe si una de estas
anormalidades es la consecuencia o la causa de la otra. En
cualquier caso, el resultado es la hiperglucemia.
La gran mayora de los casos de diabetes pueden incluirse en
dos amplias categoras etiopatognicas. En el primer caso
(diabetes de tipo ) la causa es una deficiencia absoluta en la
secrecin de insulina. Los individuos con alto riesgo de
desarrollar este tipo de diabetes pueden ser a menudo
identificados mediante evidencias serolgicas de un proceso
autoinmune que se produce en los islotes pancreticos y
tambin mediante marcadores genticos. En la segunda
categora (diabetes de tipo ), mucho ms prevalente, la
causa es una combinacin de una resistencia a la accin de la
insulina y de una inadecuada respuesta secretora
compensadora. La diabetes tipo se caracteriza por estar
presente muchos aos antes de ser detectada una
hiperglucemia sin sntomas clnicos (sed, perdida de peso),
pero suficiente para ocasionar cambios patolgicos y
funcionales sobre los rganos blanco. Durante este perodo
asintomtico, es posible demostrar trastornos en el
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metabolismo de los carbohidratos midiendo la glucosa
plasmtica en ayunas o despus de una sobrecarga de
glucosa por va oral.
El exceso en la ingesta de carbohidratos no solamente
mantiene la reserva de energa en forma de glucgeno sino
que tambin el exceso de carbohidratos es convertido en
triacilgliceroles. En el hgado los triacilgliceroles se sintetizan a
partir de acil CoA y glicerol 3-fosfato siendo empaquetados
con apoprotenas y en lipoprotenas de muy baja densidad
(VLDL), secretados al torrente sanguneo siendo almacenados
en tejido adiposo. Para su consumo los triacilgliceroles son
hidrolizados a glicerol y cidos grasos. En la dieta es
importante la presencia de lpidos ya que son precursores de
diferentes componentes de la clula como los fosfolpidos, uno
de los lpidos que tiene una gran importancia en la clula es el
colesterol, ya que proporciona rigidez a las membranas
celulares y es precursor de las sales biliares as como de
hormonas esteroideas. El colesterol se puede obtener por la
alimentacin y por sntesis del propio organismo, siendo las
clulas hepticas y las suprarrenales las de mayor sntesis.
Para llevar a cabo la sntesis de colesterol se requiere la
presencia de acetil-CoA el cual proviene de la degradacin de
glucosa, cidos grasos y aminocidos por lo cual se denomina
a la acetil-CoA la encrucijada metablica.
El colesterol es insoluble en agua por lo que transportado en
la sangre por tres lipoprotenas que son de muy baja densidad
(VLDL), de baja densidad (LDL) y las de alta densidad (HDL).
Los niveles normales de colesterol total en sangre en un
adulto son de < 200 mg/dl y cuando estos valores se ven
aumentados se asocian a la formacin de placas
aterosclerticas que pueden ocluir los vasos sanguneos y
como consecuencia provocar infarto al miocardio y
alteraciones cardiovasculares.
74
La cuantificacin de las LDL representa un papel clave en la
esclerosis coronaria ya que concentraciones elevadas indican
desarrollo de la aterosclerosis.
En el caso de las HDL al disminuir su concentracin aumenta
el riesgo de desarrollar aterosclerosis.
Las protenas constituyen la fuente primaria del metabolismo
del nitrgeno en el organismo,
Los aminocidos producto de la digestin de las protenas que
se consumen en los alimentos, son utilizados para la sntesis
de protenas y de compuestos nitrogenados o se puede oxidar
para producir energa.
El hgado es el rgano principal en donde se realiza la
oxidacin de los aminocidos. El nitrgeno de los aminocidos
forma amoniaco el cual es toxico para el organismo. El
amoniaco y los grupos amino se convierten en urea en el
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hgado, que no es toxica y se elimina fcilmente por la orina ya
que es hidrosoluble.
Otro de los componentes del metabolismo nitrogenado son los
nucleotidos. Las purinas y las pirimidinas, que son esenciales
para la sntesis de nucletidos y cidos nucleicos.
Los nucletidos son precursores del DNA y el RNA, as como
tambin forman parte de la estructura de muchas coenzimas
adems de ser componentes del metabolismo energtico.
La degradacin de las purinas no genera energa y el producto
de la degradacin del anillo purnico es el cido rico, que se
elimina por la orina, tiene una solubilidad limitada por lo que
su exceso da como resultado la formacin de cristales en
regiones del organismo como pueden ser los dedos gordos del
pie, trastorno que se conoce como gota.
Los valores elevados de cido rico se presentan en: ingestin
de alimentos ricos en nucleoprotenas, insuficiencia renal,
azoemias prerrenales.
Otro de los componentes del metabolismo nitrogenado es la
creatinina que en el msculo en su forma fosorilada sirve
como almacn de alta energa y se transforma con facilidad en
ATP por la enzima creatina fosfocinasa. La creatina fosfato es
inestable y se cicla espontneamente forma la creatinina que
se elimina en la orina. La produccin de creatinina es
proporcional a la masa muscular corporal. La cantidad de
creatinina que se elimina diariamente puede utilizarse como
indicador de la normalidad de la funcin renal
!eterminacin de *lucosa
Glucmetros One Touch Ultra.
Tiras reactivas One Touch Ultra [Glucosa oxidasa (2s%er#illus
n(#er)].
Lancetas estriles
Recipiente para material punzo cortante.
Recipiente para material biolgico-infeccioso.
Jabn para manos.
Torundas de algodn con alcohol.
!eterminacin de colesterol y triacil*liceroles.
Accutrend Roche para determinacin de colesterol y
triacilgliceroles.
Tiras reactivas para determinacin de colesterol.
Tiras reactivas para determinacin de triacilgliceroles.
Lancetas estriles.
75
as determinaciones de ureaJ creatinina y cido KricoJ se
reali2aran en orina.
La muestra de orina deber ser del alumno a quien se le haya
determinado glucosa, colesterol y triacilgliceroles para poder
discutir todos los valores en conjunto y poder enlazar en un
mismo individuo el efecto que tiene la dieta sobre el
metabolismo.
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!eterminacin de urea
Pipetas automticas (10 a 200l)
Puntas para micropipetas
Propipetas.
Reactivo para determinacin de urea.
Estndar de urea (50 mg/dl).
Espectrofotmetro.
Celdas.
Agua destilada.
!eterminacin de cido Krico
Pipetas de 5 ml.
Gradilla con 2 tubos de ensaye
Reactivo para cido rico
Estndar de cido rico (6 mg/dl)
!eterminacin de creatinina
Reactivo para determinacin de creatinina
Estndar de creatinina (2 mg/dl).
Espectrofotmetro.
Celdas.
Mtodo
!eterminacin de *lucosa
1.-Dos sujetos con ayuno de 12 hrs, uno de los cuales
consumir una dieta rica en carbohidratos y el otro una dieta
rica en protenas.
2.-A cada uno de los sujetos se les determinar la
concentracin de glucosa en sangre total por medio de un
glucmetro en los siguientes tiempos:
0 minutos (antes de ingerir los alimentos).
30 minutos, 60 minutos y 120 minutos, despus de ingerir los
alimentos.
Para realizar la determinacin de glucosa en sangre total
seguir los siguientes pasos:
1.- Lave sus manos y limpie con una
torunda de algodn con alcohol la zona
donde se realizar la puncin.
2.- Aplique un suave masaje a la punta de
su dedo que le ayudar a obtener una
gota de sangre adecuada No exprima en
exceso el rea de puncin.
3.-Acerque y mantenga la gota de sangre
en el canal estrecho del borde superior de
la tira reactiva.
4 a) Muestra adecuada
b) Muestra insuficiente
a b
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5.- nserte la tira reactiva en el puerto de
anlisis, con el extremo de las barras de
contacto de primero y mirando hacia
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arriba. Empjela hasta que no avance
ms.
6.- Hasta que la ventana de confirmacin
este completamente llena de sangre,
antes que el medidor comience la cuenta
regresiva.
7.-Lectura el resultado de la prueba de
glucosa de su sangre aparecer despus de que el medidor
cuente en forma regresiva de 5 a 1.
Anotar el resultado en la tabla correspondiente
Tabla 7.1
8.-Es importante desechar con mucho cuidado la lanceta
usada luego de cada uso, con el fin de evitar que se
produzcan lesiones accidentales con las puntas de la
lancetas.
Para el desecho de las lancetas siga los siguientes pasos:
9.-Deposite la lanceta en un recipiente
para material punzo cortante.
10- Deseche las tiras reactivas en una
bolsa para material biolgico-infeccioso
junto con las torundas de algodn
empleadas en la prctica.
11.-Con los datos obtenidos completar el cuadro 10.1 y hacer
una grfica de todas las variantes en papel milimtrico.
Cuadro 7.1 Resultados
Fecha:_________________
Nombre:
Edad: Sexo:
Tiempo
(min.)
[Glucosa mg/dl]
0
30
60
120
!eterminacin de colesterol y triacil*liceroles
1.-Lavarse las manos cuidadosamente
esto es con la finalidad de retirar residuos
de crema o grasa en las manos para
evitar determinaciones errneas
principalmente cuando se realiza la
determinacin de triacilgliceroles.
2.- Con la ayuda de unas pinzas extraer una tira reactiva del
envase y taparlo inmediatamente para evitar que las tiras se
sequen.
77
3.-Con la tapa cerrada inserte en la ranura, en la direccin
indicada por la flecha, la tira reactiva con el cuadrado amarillo
hacia arriba hasta que encaje y deje verse la marca TG o
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CHOL impresa en la tira reactiva.
4.-Frote y masajee la yema del dedo para
facilitar la extraccin y aplicacin de la
sangre.
5.-Con la lanceta introduzca para hacer la puncin y realice la
toma de muestra.
6.-Aplicar directamente la gota de sangre
a la tira reactiva
7.-Abrir la tapa y colocar la tira reactiva
con la muestra de sangre
8.-Bajar la tapa
9.-Realice la lectura de la concentracin
de colesterol y triacilgliceroles segn sea
el caso.
N(%A+ %ener cuidado al reali2ar la determinacinJ ya que
solo cuentan con una tira reacti8a para cada prueba.
8.-Anote la lectura.
!eterminacin de urea en orina
La urea presente en la muestra reacciona con el o-ftaldehdo
en medio cido originando un complejo coloreado puede
identificarse espectrofotomtricamente.
Urea + o-ftaldehdo soindolina
La urea es estable 5 das a 2-8 C.
1.-Para la determinacin de urea en orina, tomar la muestra
como se esquematiza en el cuadro.
La determinacin se realiza en tubos de ensaye
Estndar de urea (50 mg/dl).
Celda 1 2
Muestra 10 l --
Estndar -- 10 l
Solucin reactiva
para urea
1 ml 1 ml
H+
78
Mezclar e incubar 15 minutos a temperatura ambiente.
Leer la absorbancia (A) en el espectrofotmetro frente a
blanco de reactivos a 510 mn.
La determinacin se realiza directamente en las celdas con la
finalidad de tomar la lectura de las absorbancias
exactamente al minuto (A1) y a los dos minutos (A2).
Mezclar y poner en marcha el cronmetro, anotar las
absorbancias a los 60 (A1) y 120 (A2) segundos.
Leer frente blanco de reactivos en el espectrofotmetro a 510
nm.
Calcular el incremento de la absorbancia _A = A2 A1.
Con las diferencias de absorbancias anotadas _A, aplicar la
siguiente ecuacin:
_A Muestra X [Estndar] = [Urea]
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_A Estndar
El resultado se obtiene en mg/dl.
!eterminacin de creatinina en orina
1.-Para la determinacin de creatinina en orina, tomar la
muestra como se esquematiza en el cuadro.
Estndar de creatinina (2 mg/dl).
La determinacin se realiza directamente en las celdas con la
finalidad de tomar la lectura de las absorbancias exactamente
a los 30 (A1) y a los 90 (A2) segundos.
Mezclar y poner en marcha el cronmetro, anotar las
absorbancias a los 30 (A1) y a los 90 (A2) segundos.
Leer frente blanco de reactivos en el espectrofotmetro a 492
nm.
Calcular el incremento de la absorbancia _A = A2 A1.
Con las diferencias de absorbancias anotadas _A, aplicar la
siguiente ecuacin:
_A Muestra X [Estndar] = [Creatinina]
_A Estndar
!eterminacin de cido Krico en orina
1.-Para la determinacin de cido rico en orina, tomar la
muestra como se esquematiza en el cuadro.
La determinacin se realiza en tubos de ensaye.
Estndar de cido rico (6 mg/dl)
Celda 1 2
Orina 100 l -
Estndar - 100 l
Solucin reactiva
de creatinina
1 ml 1 ml
Tubo 1 2
Orina 100 l -
Estndar - 100 l
Solucin reactiva
de cido rico
1 ml 1 ml
79
Mezclar e incubar 10 minutos a temperatura ambiente.
Leer la absorbancia (A) en el espectrofotmetro frente a
blanco de reactivos a 520 mn.
Clculo de la concentracin de cido rico.
A Muestra X [Estndar] = [cido rico]
A Estndar
#e4erencias
1.-Koolman J, Roehm KH (2004). Bioqumica =eto & 2tlas: 3
Edicin, Ed. Mdica Panamericana, pp.: 158, 308-310
2.-Smith, C; Marks, A. D. & Lieberman, M. (2005). Marks'
Basic Madical Biochemestry. 2a Edicin. Ed. Lippincott
1
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Williams & Wilkins. Pag. 24-26
3.-Kaplan LA, Pesce AJ. (2002). Qumica Clnica. Teora,
anlisis y correlacin. 3 Edicin. Ed. Pesce Kaplan
Publicaciones, Captulo: 32.
4.- NORMA OFCAL MEXCANA, NOM-015-SSA2-1994,
"Para la prevencin, tratamiento y control de la diabetes
mellitus en la atencin primaria. Listado de Normas Oficiales
Mexicanas de la Secretara de Salud.
5.-MODFCACN a la Norma Oficial Mexicana NOM-015-
SSA2-1994, Para la prevencin, tratamiento y control de la
diabetes. Listado de Normas Oficiales Mexicanas de la
Secretara de Salud.
6.- Manual para el manejo de las insulinas 2001. 2 Edicin.
Subsecretara de Prevencin y Proteccin de la Salud. Centro
Nacional de Vigilancia Epidemiolgica. SSA. Mxico.
7.- NORMA OFCAL MEXCANA NOM-030-SSA2-1999, Para
la prevencin, tratamiento y control de la
hipertensin arterial. Listado de Normas Oficiales Mexicanas
de la Secretara de Salud.
80
"rctica C
.uella *nica
Objetivos
1. Que el estudiante conozca la aplicacin de las tcnicas de
DNA recombinante.
2. Que el estudiante sea capaz de analizar e interpretar los
datos generados a partir de una prueba de huella gnica.
3. El alumno adquirir la capacidad de manejar muestras para
anlisis de cidos nucleicos.
4. El alumno desarrollar destreza en la interpretacin de
resultados de metodologas bsicas de anlisis molecular.
FUNDAMENTO
El DNA es un polmero lineal formado por
desoxirribonucletidos que contienen a las bases nitrogenadas
adenina, guanina, citosina, timidina. La interaccin de las
bases nitrogenadas por puentes de hidrgeno permite la
formacin de la doble cadena de DNA. Cada grupo fosfato
est unido al carbono 5 de una subunidad de azcar y al
carbono 3 de la subunidad de azcar del nucletido contiguo.
Las cadenas se mantienen unidas por puentes de
hidrgeno entre las bases. Las cuales son completamente
lineales.
En la molcula de DNA que reside la informacin
gentica de un organismo, especficamente en la secuencia
de los nucletidos, de tal manera que cada tres bases forman
un codn que corresponde a su vez a uno de los 20
aminocidos, teniendo un total de 64 codones posibles, los
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cuales conforman el cdigo gentico. En el DNA se
encuentran dos tipos de secuencia, la que es capaz de ser
leda para dar origen a una protena lo que permite que una
clula u organismo crezca desarrolle tambin la no codificante
una que codifica para las funciones celulares y otra no
codificante, que participa en la regulacin de su expresin.
Algunas de las secuencias de nucletidos no codificantes se
caracterizan por ser cortas, estn alineadas en tndem y se
repiten miles de veces de manera constante a lo largo del
DNA. Un ejemplo de esta secuencia puede ser la siguiente.
ATTCGGTATTCGGTATTCGGT. A estas secuencias se les
denomina STR por sus siglas en ingls (&hort %andem
#epeat). El genoma eucaritico contiene muchas de estas
secuencias de DNA, y se ha visto que el nmero de unidades
repetidas presenta diferencias de individuo a individuo que con
las huellas digitales. En el caso de gemelos idnticos estas
secuencias son idnticas. Estas regiones pueden ser aisladas
del DNA con enzimas de restriccin apropiadas y separadas
de acuerdo a su longitud mediante electroforesis en gel.
Cuando se completa el proceso de separacin el resultado se
parece a un cdigo de barras de un envase de supermercado.
Este cdigo de barras de DNA ha permitido esclarecer
algunos hechos criminales y pruebas de paternidad, a la cual
se denomina tcnica de "Huella gnica
Es muy frecuente que en la escena de un crimen se
encuentren, en pequeas cantidades muestras de naturaleza
biolgica a partir de las cuales se puede extraer el DNA como
son la sangre, la saliva, la piel, el msculo, el cabello, el
semen, los dientes y el hueso, entre otros.
81
Un mtodo que permite tomar una pequea cantidad
de DNA y en pocas horas sintetizar millones de copias de una
porcin, es el mtodo de amplificacin conocido como PCR
(reaccin en cadena de la polimerasa), el cual se desarrollo
por K. Mullis (1990), En este mtodo se requiere conocer la
secuencia de nucletidos de los extremos del fragmento que
se desea amplificar. Estas secuencias se usan para disear
desoxioligonucletidos sintticos de DNA complementarios a
cada uno de estos extremos de la cadena de la doble hlice.
La muestra de DNA se coloca en una solucin que contiene
una DNA polimerasa, grandes cantidades de
desoxinucletidos y los desoxioligonucletidos sintetizados
previamente. El mtodo se basa en la repeticin cclica de tres
reacciones sucesivas: en la primera reaccin, la solucin se
calienta para que el molde de DNA se separe en sus dos
cadenas. En la segunda reaccin, la temperatura se reduce
para permitir que los desoxioligonucletidos se apareen por
complementariedad de bases con el DNA molde y en la
tercera reaccin, la DNA polimerasa cataliza la sntesis
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simultnea de las dos cadenas a partir de cada
desoxioligonucletido que acta como cebador. Al cabo del
primer ciclo de tres reacciones, el fragmento de DNA elegido
se ha duplicado y por lo tanto, la cantidad de DNA molde
disponible para el segundo ciclo es doble, lo mismo ocurre
cada ciclo de duplicacin.
La obtencin de mltiples copias requiere 20 a 40 veces la
repeticin de los ciclos. El xito de esta tcnica radica en el
uso de una DNA polimerasa termoestable, que no se
desnaturaliza por los repetidos ciclos de calentamiento. Esta
enzima se aisl originalmente de la bacteria termfila =7ermus
aquaticus.
La base de la tcnica conocida como huella gnica se
basa en las diferencias individuales de estas secuencias. Esto,
generalmente se trata de cambios en un solo par de bases
pertenecientes a diferentes individuos, que se presentan una
vez cada 500 a 1,000 pares de bases, como promedio.
#e4erencias
Curtis, H; Barnes, N; Biologa. Sexta edicin. Editorial Mdica
Panamericana.
Lewin, B; Genes V. Editorial Oxford.
Nelson, D; Cox, M; Lehninger. Principios de Bioqumica.
Tercera edicin. Ediciones Omega.
Yuri Sivolap, Ph.D., G. Krivda, Ph.D., N. Kozhuhova., S.
Chebotar., and Mark Benecke, PH.D. A Homicide in the
Ukraine. DNA-based identification of a Boiled, Skeletozined,
and Varnished Human Skull, and of Bone Fragments Found in
a Fireplace. The American journal of Forensic Medicine and
Pathology. 22 (4): 412-414 ,2001.
Lennie Pineda Bernal. El anlisis de DNA para pruebas de
paternidad e identificacin forense. Acta Cientfica
Venezolana. 50: 24-28, 1999.
Andra Carla de Souza Ges, Dayse Aparecida da Silva,
Cristiane Santana Domingues, Joo Marreiro Sobrinho, Elizeu
Fagundes de Carvalho. dentification of a criminal by DNA
typing in a rape case in Rio de Janeiro, Brazil. So Paulo
Medical Journal. Revista Paulista de Medicina. 120 (3): 77-80,
2002.
Centre for Genetics Education. Genetic Testing and
Screening Forensic and Other Applications. Directory of
Genetics Support Groups, Services and nformation. Genetics.
235-239, 2004-2005.
Jeffreys Alec Genetic Fingerprinting Naure Medicine Vol
11(10).1035-1039. 2005.
Mullis K.B the Unusual Origen of the Polymerase Chain
Reaction Science Am. 262 (4) 56-65. 1990.
82
&E&I,N ) !E A'(#A%(#I( "A#A A "#$C%ICA !E
.UEA AGNICA
E&CENA !E C#IMEN
1
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El crimen se lleva a cabo en la calle Lago Manitoba No. 520,
Col. Ampliacin Granada, Delegacin Miguel Hidalgo, en el
sof de la sala se encuentra el cuerpo de la duea de la casa,
una mujer de 42 aos de edad. El cadver presenta signos de
estrangulamiento pero sin marcas de sogas o cinturones;
tampoco se encuentran huellas digitales en su cuello. La
vctima presenta una lesin defensiva en el brazo derecho con
arma punzo cortante. En el sof se observan varias manchas
de sangre, algunas de ellas secas. Las ms abundantes
todava estn frescas. Se ignora si la sangre pertenece a la
vctima o a sus agresores.
El laboratorio forense se encarga de recopilar la informacin
de la escena dando a conocer los siguientes aspectos: el
cuerpo de la vctima se descubri 20 minutos despus del
asesinato. Presentaba con un golpe en la cabeza, presenta
seales de forcejeo en su brazo y debajo de las uas se
encuentran depositados restos de piel, sangre, y de cabellos.
Algunos de ellos presentan folculos. Todo seala que la
vctima forceje con su o sus agresores.
En el lugar tambin se hall un florero con restos de sangre, la
cual no se sabe si corresponde a la de la vctima o a los
agresores. En un extremo del sof se encuentra una pieza
dental y, debido a que la vctima conserva su dentadura
completa, es probable que el diente sea del victimario. En el
brazo izquierdo, la victima presenta varias mordidas, algunas
con sangre coagulada y otras con restos de saliva mezclados
con sangre.
En el interior de la casa faltan algunas piezas de valor, lo que
sugiere que el mvil fu el robo.
La polica cuenta con varios sospechosos, entre los que se
encuentra el esposo, con el cual la vctima tuvo una discusin
la noche anterior. Se desconoce el tema de la discusin y el
paradero el esposo. Otros sospechosos son los dos
repartidores del gas que una hora antes haban
proporcionado el servicio. Uno de ellos tiene problemas con la
dentadura y aclara que se encuentra en tratamiento dental, ya
que ha presentado sangrado y prdida de algunas piezas
dentales. Los otros sospechosos son los dos empleados de la
casa, el jardinero que tiene una antigedad de 4 aos y
presenta una lesin en el brazo que confiesa se hizo
arreglando el jardn y la cocinera quien tiene slo 3 meses
laborando en la casa.
Con esta evidencia se compara el DNA de cada sospechoso
para encontrar al culpable o culpables del crimen, por lo que
debe determinar si las muestras de sangre, cabellos, pieza
dental y saliva sirven para estudiar el DNA y establecer las
caractersticas que permiten utilizar alguna o todas las
muestras para el estudio.
Cada equipo debe escoger alguna de las evidencias
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previamente descritas y justificar su eleccin.
Para realizar la comparacin entre el DNA encontrado en la
escena con el DNA de los sospechosos deben contarse con
muestras proporcionadas por los mismos. Mencione de dnde
obtendra dicho material. En el caso del esposo debe tenerse
en cuenta que no se conoce su paradero, por lo cual la
muestra debe ser extrada de algn objeto de uso personal;
defina cul sera ste y justifique la eleccin del mismo.
83
&E&I(N / !E A'(#A%(#I( "A#A A "#$C%ICA
:INAE#"#IN%INA
MA%E#IA
- DNA de la escena del crimen con amortiguador.
- DNA del sospechoso 1 con amortiguador.
- DNA del sospechoso 4 con Amortiguador.
- Mezcla de enzimas de restriccin $coR/Pstl, 1800 U.
- Agua estril, 2.5 ml.
- Marcador de DNA de fago lambda digerido con Hind
0.2g /l, 100 l.
1.- 23,130 pb
2.- 9,416 pb
3.- 6,557 pb
4.- 4,361 pb
5.- 2,322 pb
6.- 2,027 pb
- Colorante de DNA (Biorad biosafe).
- Microtubos de colores.
- Microtubos blancos.
- Geles de agarosa al 1.0%.
- Amortiguador de electroforesis TAE (Tris-Acetato-EDTA).
Tris-base 39 mM, cido actico glacial 18 mM, EDTA 10 mM.
- Gradillas para microtubos.
- Recipiente para teir geles.
- Pipeta automtica de 10-100 l.
- Puntas para pipetas automticas.
- Marcador indeleble.
- Fuente de poder.
- Cmara horizontal de electroforesis.
- Parrilla para bao mara.
- Vaso de precipitado de 300 ml.
- Recipiente con hielo.
- Microfuga.
"#(CE!IMIEN%(
1.-Marcar los microtubos de la siguiente forma:
a) Tubo verde (muestra de la escena)
b) Tubo azul (sospechoso 1)
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c) Tubo naranja (sospechoso 2)
d) Tubo violeta (sospechoso 3)
e) Tubo rojo (sospechoso 4)
f) Tubo amarillo (sospechoso 5)
2.-Colocar los tubos marcados en la gradilla.
3.-A cada tubo adicionar 10 l de la muestra correspondiente;
utilizar una punta nueva para cada muestra.
4.-Adicionar 10 l de la mezcla de enzimas de restriccin a
cada uno de los tubos que contienen la muestra de DNA. Se
debe tener cuidado de no contaminar la mezcla de enzimas,
por lo cual se sugiere el empleo de una punta nueva por cada
tubo.
5.-Cierre los microtubos y mezcle la muestra golpeando
suavemente los tubos con los dedos. Si se cuenta con una
Muestras
de DNA
Enzimas de
restriccin
$co-I y
PstI
Volumen total
de la
reaccin
Muestra de la
escena
10 l 10 l 20 l
Sospechoso 1
azul
10 l 10 l 20 l
Sospechoso 2
naranja
10 l 10 l 20 l
Sospechoso 3
violeta
10 l 10 l 20 l
Sospechoso 4
rojo
10 l 10 l 20 l
Sospechoso 5
amarillo
10 l 10 l 20 l
84
microfuga aplique un pulso de 2 segundos para asegurarse
que toda la muestra se quede en el fondo del microtubo,
permitiendo que se mezcle adecuadamente y se lleve a cabo
la reaccin.
6.-Coloque los tubos en la gradilla e incbelos a 37C por 45
minutos.
7.-Transcurrido el tiempo de incubacin, adicione 10 l del
amortiguador de carga a cada tubo tpelos y agtelos
suavemente con los dedos.
8.-Coloque en la cmara de electroforesis el gel de agarosa,
1
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BIOQUMICA
UNAM 2013
teniendo cuidado que los pozos se encuentren orientados
hacia el ctodo [polo negativo (terminal negra)].
9.-Adicione 275 ml del amortiguador de corrida o lo que se
requiera para que se cubran los pozos.
10.-Coloque las muestras en el gel empleando una punta
nueva para cada muestra, las cuales se depositan de
izquierda a derecha amortiguador en el siguiente orden:
a) Carril 1: marcador de peso molecular, 0ind,10 l
b) Carril 2: escena del crimen verde, 10 l
c) Carril 3: sospechoso 1 azul, 10 l
d) Carril 4: sospechoso 2 naranja, 10 l
e) Carril 5: sospechoso 3 violeta, 20 l
f) Carril 6: sospechoso 4 rojo, 10 l
g) Carril 7: sospechoso 5 amarillo, 10 l
11-Cierre la cmara de electroforesis y asegrese que
concuerden las terminales rojo con rojo y negro con negro.
Conecte la cmara a la fuente de poder, manteniendo la
orientacin de las terminales.
12.-Encienda la fuente de poder. Ajuste el voltaje a 100 V y
realice la electroforesis por 40 60 minutos.
13.-Detenga la electroforesis cuando la muestra llegue a una
distancia aproximada de 2 cm del final del gel. Apague la
fuente de poder, remueva la tapa y retire cuidadosamente el
gel.
14.-Coloque en una charola 120 ml de la solucin teidora
100X y el gel, asegurndose que se encuentre sumergido en
la solucin. Tia los geles por 2 minutos.
15.- Despus se deben colocar los geles en una charola que
contenga 500 700 ml de agua limpia y caliente (40-55C),
agite suavemente el gel por aproximadamente 10 segundos y
retire el agua, realizar los lavados que sean necesarios con
agua limpia hasta la aparicin de las bandas de DNA y hacer
la comparacin de las muestras.
#e4erencias
1.-Biotechnology Explorer DNA Fingerprinting Kit
nstruction Manual BORAD.
Cortar en pequeas
piezas con enzimas
de restriccin
DNA total
de una
persona
Fragmentos
de DNA en el
gel
Fragmentos separados y
transferidos a membrana
de nylon
-ve
+ve
Ms
grandes
Ms
pequeas
1
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BIOQUMICA
UNAM 2013
85
Casos de correlacin bioqumica y prctica

mdica
86
1
Clera
Un hombre de 38 aos de edad con peso de 71 kg relata que su
padecimiento actual se inici con anorexia, dolor abdominal y
diarrea. Un da despus sigui con nusea intensa, vmito y
diarrea muy abundante y lquida. ngres al hospital con
hipotensin postural y deshidratacin. Se pudo aislar 9i!rio
c7olerae toxgeno de sus heces. El paciente mejor rpidamente
al reponerle agua, electrlitos y administrarle tetraciclina por va
oral.
"re*untas de bioqumica
1. Qu procesos de la membrana resultan afectados por 9i!rio
c7olerae en un caso de clera?
2. Qu valores de laboratorio clnico podran estar alterados en
este paciente?
3. Cules seran los datos de laboratorio que permitiran
precisar el tratamiento hidroelectroltico?
4. Por qu en este caso hay que aadir glucosa al tratamiento
hidroelectroltico por va oral?
5. Cules son los signos de deshidratacin?
6. Cul fue la situacin cido-base del paciente al momento de
su ingreso al hospital?
Conceptos y reas de aprendi2a7e
1. Describir la composicin, las propiedades y las funciones de
las membranas biolgicas.
2. Estudiar la base bioqumica de algunos trastornos que afectan
la funcin de las membranas.
3. Modelos de transporte transepitelial.
4. Describir los mecanismos por los cuales los organismos
enteropatgenos ocasionan prdida intestinal de agua y
electrolitos.
5. Control del agua y de la osmolaridad.
6. Equilibrio cido-base.
7. Deshidratacin y tratamiento de reposicin hidroelectroltica.
#E:E#ENCIA&
1. Villazn SA, Crdenas CO, Villazn DO, Sierra UA. Fluidos y
electrlitos. Mxico: JGH Editores; 2000.
3. Montgomery R. Bioqumica: Casos y texto. 6a. ed. Barcelona:
Editorial Harcourt-Brace; 1998: cap. 4 y 12.
87
Caso 2
1
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BIOQUMICA
UNAM 2013
(clusin intestinal. Acidosis metablica. !es<idratacin *ra8e
Se trata de un paciente masculino de 35 aos de edad quien
acude al servicio de urgencias de un hospital por presentar dolor
abdominal intenso acompaado de vmitos frecuentes y
abundantes de contenido intestinal. El paciente presenta un
cuadro de deshidratacin importante.
A la exploracin fsica se obtuvieron los siguientes datos:
Tensin arterial (TA): 80/50 mmHg
Frecuencia cardiaca (Fc): 120/min
Frecuencia respiratoria (Fr): 32/min
Temperatura (T): 36o C
Los estudios de laboratorio mostraron lo siguiente:
Electrolitos sricos:
Na
;
= 128 mEq/l
K
;
= 2.8 mEq/l
Cl
L
= 100 mEq/l
Gasometra arterial:
CO2t = 12
pH = 7.29
pCO
2
= 24 mmHg
pO
2
= 95 mmHg
HCO
3
- = 11.2 mmol/l
EB (exceso de base) = 20
Qumica sangunea:
Glucosa = 5.2 mmol/l (95 mg/dl)
BUN = 15 mmol/l
El tratamiento consisti, primero, en el restablecimiento del
balance de lquidos
con solucin salina a 0.9%, electrlitos (reposicin de K
+
) y
ciruga.
1. Evaluar el estado cido-base del paciente; tomar en cuenta
los valores de pH y presin parcial de bixido de carbono
(pCO
2
), el valor de bicarbonato plasmtico (HCO
3
), etctera.
2. Es normal el estado cido-base del paciente? Qu tipo de
desequilibrio presenta? Cul podra ser la causa de ese
desequilibrio?
3. Qu relacin existe entre el metabolismo de los electrolitos y
1
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BIOQUMICA
UNAM 2013
el agua y entre los trastornos cido-base y los electrolitos?
4. Qu tipos de alteraciones de lquidos y electrolitos
corporales existen?
5. Calcule la osmolaridad srica (tome en cuenta la
concentracin de las sustancias que mayormente contribuyen
a establecerla) como aparecen en las pags. 98 y 113.
6. Cules son los signos de deshidratacin?
88
7. Qu teraputica recomendara a este paciente para
equilibrar sus lquidos y electrolitos?
1. Propiedades fisicoqumicas del agua.
2. Concepto de pH.
3. Explicar el significado de las variaciones de los valores
normales de pH y de la composicin electroltica de la sangre.
4. Sistemas amortiguadores del plasma, lquido intersticial y
clulas. La aplicacin de la ecuacin de Henderson y
Hasselbalch al clculo del pH y de la concentracin de bixido
de carbono y bicarbonato.
5. Equilibrio cido-base y su mantenimiento.
6. Equilibrio hidroelectroltico y su mantenimiento.
#E:E#ENCIA&
1. Harrison. Principios de medicina interna. 15a. ed. Madrid:
McGraw-Hill nteramericana Editores; 2001; cap: >(quidos &
electr"litos y ?!strucci"n intestinal a#uda. p. 184.
Editorial Harcourt-Brace, 1998; cap. 4.
4. Laguna J, Pia E. Bioqumica de Laguna. 5a.ed. Mxico:
Editorial El Manual Moderno; 2002: 41-76.
5. Villazn SA, Crdenas CO,Villazn DO, Sierra UA. Fluidos y
electrlitos. Mxico: JGH Editores; 2000.
89
Caso 3
.ipo*lucemia secundaria a intoxicacin alco<lica
Se trata de un paciente de 58 aos, alcohlico crnico, cuyos
familiares relatan que ha ingerido una gran cantidad de alcohol en
los dos ltimos das con un consumo muy escaso de alimentos.
nici su padecimiento con nusea, vmito, mareo, sudacin,
cefalea, visin borrosa y confusin; present, en una sola
ocasin, una convulsin, por lo que es llevado al servicio de
urgencias. A la exploracin se encuentra semiconsciente con
aliento alcohlico e hipotermia.
Se procede a un lavado gstrico para remover el alcohol an
no absorbido; se mantienen permeables las vas respiratorias; se
instala oxgenoterapia y se le administra solucin glucosada por
va endovenosa.
Los resultados de laboratorio muestran:
Alcohol 300 mg/dl
Glucosa 2.0 mmol/l
Lactato 9.0 mmol/l
pH 7.2
1
8
BIOQUMICA
UNAM 2013
1. Cules son los sntomas de la hipoglucemia?
2. De qu forma el etanol produce acidosis lctica e hipoglucemia?
Cmo se encuentra la relacin intracelular de NADH/NAD+?
Qu procesos metablicos se favorecen con los niveles altos de
NADH?
3. El alcoholismo es la base de muchas deficiencias vitamnicas.
Qu implicaciones metablicas tienen estas deficiencias
(complejo B)?
1. Hipoglucemia. Regulacin de la glucemia.
2. Acidosis lctica.
3. Metabolismo de carbohidratos.
4. Trastornos del metabolismo de vitaminas.
5. Metabolismo del etanol.
#E:E#ENCIA&
1. Murray KR, Granner DK, Mayes PA, Rodwell VW. Bioqumica de
Harper. 16a. ed. Mxico: Editorial El Manual Moderno; 2004. p.
980-981
2. Devlin TM. Bioqumica. Libro de texto con aplicaciones clnicas.
4a. ed. Barcelona: Editorial Revert; 2004.
McGraw-Hill nteramericana Editores; 2001. Captulos: 2cidosis
lctica, 7i%o#lucemia, alco7ol & alco7olismo, deficiencia & eceso
de 3itaminas.
4. Academia Nacional de Medicina. Tratado de medicina interna. 2a.
ed. Mxico: Editorial El Manual Moderno; 1994. Captulos:
2cidosis lctica e intoicaci"n a#uda %or alco7ol et(lico.
90
91
Caso 4
Cetosis por inanicin.
(besidad
Una mujer de 27 aos llega al servicio de urgencias mdicas
despus de haber sufrido un desmayo. Al interrogarla, relata que
lleva 15 das a dieta de agua, t y verduras cocidas para bajar de
peso, sin ningn control mdico. Se detect aliento con olor a
manzana, cetonuria, cetonemia, cidos grasos libres elevados,
triacilgliceroles elevados, hipoglucemia y presin arterial baja; su
peso al iniciar la dieta era de 78 kg y su estatura de 1.59 m. Se
diagnostica cetoacidosis por inanicin y obesidad exgena.
El estudio de su dieta mostr que gran parte de su ingesta
calrica era en forma de carbohidratos (galletas, chocolates,
pasteles, refrescos, dulces, etctera).
El tratamiento consisti en administrar parenteralmente
solucin glucosada y continuar con una dieta normocalrica.
1. En esta mujer de 27 aos: corresponde el peso a su talla?
Determinar su ndice de masa corporal, grado de obesidad y
el porcentaje de sobrepeso.
2. Cmo es posible que se formen grandes almacenes de
energa en forma de grasas, si la dieta contiene
predominantemente carbohidratos?
1
8
BIOQUMICA
UNAM 2013
3. Cules son las interrelaciones metablicas de los principales
tejidos (hgado, tejido adiposo, cerebro, msculo, etctera) en
la obesidad?
4. Cules son las interrelaciones metablicas de los principales
tejidos en el estado de ayuno temprano y en la inanicin?
5. Cul es el papel de los cuerpos cetnicos en el
metabolismo?
6. Qu rgimen diettico recomendara a esta persona para
bajar de peso?
1. Describir las principales rutas de biosntesis, catabolismo y
almacenamiento de lpidos.
2. Conocer la estructura y funcin de los triacilgliceroles, cidos
grasos y cuerpos cetnicos.
3. Establecer las bases bioqumicas de la cetosis y obesidad
producidas por anomalas en el metabolismo de los lpidos.
4. Describir las alteraciones del equilibrio cido-base que se
producen en la cetosis.
5. Conocer las interrelaciones metablicas de los principales
tejidos corporales en los estados de buena nutricin, de ayuno
temprano, de inanicin, de renutricin, de homeostasis
calrica, etctera.
#E:E#ENCIA&
92
McGraw-Hill nteramericana Editores; 2001.
3. Montgomery R. Bioqumica: Casos y texto. 6a. ed. Harcourt-
Brace; 1998.
4. Casanova E. Nutriologa mdica. Editorial Mdica
Panamericana; 1995.
93
Caso 5
.ipercolesterolemia y aterosclerosis
Un hombre de 56 aos acudi al mdico por presentar dolor
precordial en reposo que se incrementaba con el esfuerzo. Se le
detect hipercolesterolemia que, al anlisis de los lpidos
plasmticos, mostr que la mayora del colesterol plasmtico
elevado se encontraba en la fraccin de lipoprotena de baja
densidad (LDL). Se le realiz una arteriografa coronaria la cual
mostr un estrechamiento de las arterias. La evaluacin de la
dieta indic que consuma gran cantidad de alimentos ricos en
colesterol, aunque en los ltimos meses haba seguido una dieta
baja en grasas.
Fue diagnosticado de aterosclerosis en las arterias coronarias.
El tratamiento consisti en una dieta sin colesterol y en
administrar preparados de lovastatina, un inhibidor de la
HMGCoA reductasa.
Fue tratado tambin con colestiramina, una resina que capta
las sales biliares. La resina no se absorbe y permanece en la luz
intestinal donde se une a las sales y aumenta la cantidad de las
mismas que se excreta con las heces.
1
8
BIOQUMICA
UNAM 2013
1. Cules son algunos alimentos ricos en colesterol?
2. Cul es el destino del colesterol de la dieta?
3. Cul es la funcin de la bilis en la digestin?
4. Qu conexin metablica existe entre el colesterol y las sales
biliares?
5. Cmo disminuye la resina de colestiramina la concentracin
plasmtica de colesterol?
6. Por qu se le ha llamado al colesterol-LDL: "colesterol malo y al
colesterol-HDL: "colesterol bueno?
7. Cmo puede la hipercolesterolemia producir aterosclerosis,
infarto del miocardio, xantomatosis, etctera?
8. Por qu el hecho de disminuir la concentracin plasmtica de
colesterol puede ser til para la salud de este paciente?
9. Qu papel desempea la HMG-CoA reductasa en la biosntesis
del colesterol?
10. Cul es la razn del uso de la lovastatina para el tratamiento del
paciente?
1. Estructura del colesterol y otros esteroles importantes.
2. Biosntesis, metabolismo y excrecin del colesterol y de los
cidos biliares.
3. Describir la funcin de la bilis y su relacin con el colesterol.
4. Considerar el papel del colesterol en el desarrollo de la
aterosclerosis y de la relacin entre hipercolesterolemia e ingesta
diettica de lpidos en esta enfermedad.
5. Comentar los principios del transporte de lpidos en el sistema
circulatorio.
94
6. Describir la composicin, estructura, metabolismo y funcin de los
principales tipos de lipoprotenas plasmticas.
7. Describir los defectos del metabolismo lipdico que tienen
relevancia clnica en relacin con la hipercolesterolemia.
#E:E#ENCIA&
1. PLM. Diccionario de especialidades farmacolgicas. 49 ed. 2004.
2. Montgomery R. Bioqumica. Casos y texto. 6a. ed. Barcelona:
Editorial Harcourt-Brace, 1998: cap. 10 y 11.
McGraw-Hill nteramericana Editores; 2001: Captulos:
2terosclerosis & otras formas de arteriosclerosis e
7i%erli%o%roteinemias & otros trastornos del meta!olismo li%(dico.
4. Pennachio D. Lineamientos para la deteccin de
hipercolesterolemia. Atencin Mdica 1997;10/2:30-43.
5. Vogel RA. Coronary risk factors, endothelial function, and
atherosclerosis. Clin Cardiol 1997; 20:426-432.
6. Goodman & Gilman's. The pharmacological basis of therapeutics.
10th ed. McGraw-Hill nteramericana Editores; 2002.
7. Mecanismo de accin de los hipercolesterolemiantes. Rev
Mdico General. 1997; 2(7): 71-74.
95
Caso 6
A(%A
Un hombre de 53 aos relata que su padecimiento actual se inici
1
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BIOQUMICA
UNAM 2013
con una inflamacin aguda del ortejo mayor del pie derecho e
intenso dolor, el cual se intensificaba con el fro y el movimiento.
Adems, asegura que poco antes de presentar este episodio
agudo el paciente haba incrementado el consumo de carne,
vsceras, leguminosas y vino de mesa en abundancia.
Fue tratado con fenilbutazona, pero present dao gstrico,
por lo que se cambi el medicamento por alopurinol y naproxn.
1. Qu alteraciones metablicas pueden traer como consecuencia
un aumento en los niveles sricos de cido rico?
2. Son necesarias las purinas y las pirimidinas en la dieta?
3. Qu alimentos son ricos en purinas y pirimidinas?
4. Qu valores de laboratorio podran estar alterados en este
paciente?
5. Son importantes los antecedentes familiares de este paciente?
6. Cul es la base bioqumica para sospechar que una dieta rica
en protenas puede provocar ataques de gota en pacientes
susceptibles?
7. Cmo se relaciona la ingestin de etanol con el incremento de la
concentracin plasmtica de cido rico?
8. Qu rgimen diettico le recomendara a esta persona para
mejorar sus niveles de cido rico?
9. Cul es la base bioqumica para la accin de los medicamentos
utilizados en la gota?
1. Caractersticas estructurales de los cidos nucleicos.
2. Biosntesis y catabolismo de purinas y pirimidinas.
3. Explicar cmo interfieren algunos medicamentos utilizados en el
tratamiento de la gota con el metabolismo de los nucletidos.
#E:E#ENCIA&
2. Devlin TM. Bioqumica. Libro de texto con aplicaciones clnicas.
4a. ed. Barcelona: Editorial Revert; 2004.
Editorial Harcourt-Brace; 1998: Cap. 13.
4. Rodrguez Carranza R y col. Vademcum acadmico de
medicamentos. 4a. ed. Mxico: Facultad de Medicina, UNAM y
96
IN%#(!UCCI,N A MANUA !E "#$C%ICA&
!E A'(#A%(#I( F CA&(& !E C(##EACI,N
'I(MUEMICA F "#$C%ICA MG!ICA
2licia Cea @onilla (potenciometra y electroforesis).
-e!eca 6iln C73e+ (gota).
Celia 9ir#inia <nc7e+ 6e+a.
EA'(#ACI,N ( #E3I&I,N !E A& "#$C%ICA&
!E A'(#A%(#I(
1. Soluciones. Celia 9ir#inia <nc7e+ 6e+a y -e!eca 6iln C73e+.
2. Regulacin del equilibrio cido-base despus de ejercicio muscular
intenso y de la ingestin de bicarbonato de sodio. Conce%ci"n
Aon+le+ >"%e+, Celia 9ir#inia <nc7e+ 6e+a & Buan >uis -end"n
A"me+.
3. Cintica enzimtica. Efecto de la concentracin del sustrato en la
velocidad de la reaccin enzimtica. Celia 9ir#inia <nc7e+ 6e+a,
1
8
BIOQUMICA
UNAM 2013
-e!eca 6iln C73e+ & BesCs 2ntonio ?ria 0ernnde+.
4. Estudio del bombeo de protones por levaduras; efecto de los
inhibidores de la cadena de transporte de electrones y de los
desacoplantes. Buan Pa!lo Pardo 9+que+ y Dederico 6art(ne+
6ontes.
5. Determinacin de glucosa en sangre total. -e!eca 6iln C73e+ &
$u#enia Dlores -o!les
6. Determinacin de lpidos y lipoprotenas plasmticas. Celia 9ir#inia
<nc7e+ 6e+a.
7. ntegracin Metablica. -e!eca 6iln C73e+ & $u#enia Dlores
-o!les.
8. Huella gnica. -e!eca 6iln C73e+ & $u#enia Dlores -o!les
Correccin y cuidado de la edicin+ Edgar Zenteno Galindo, Alicia Cea
Bonilla, Rebeca Miln Chvez y Eugenia Flores Robles.

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