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2
INDICE

Fotometria 03
Componentes Bsicos da Fotometria 04
Fonte de energia Eltrica 04
Fonte de Energia radiante 04
Monocromador 04
Filtros de Vidro 04
Filtros de Interferncia 05
Prismas 05
Grades de Difrao 06
Cubetas 06
Detectores 06
Circuito Medidor 06
Microprocessador 07
Leis da Fotometria 07
Lei de Beer 09
Problemas de Fotometria - Energia Parasita 10
Resoluo e Faixa de Emisso 10
Seleo da rea Espectral 11
Faixa til de Trabalho 12
Uso de Brancos 12

Padronizao
Material Volumtrico 13
Produtos Qumicos 14
Preparo de Solues 15
Expresses de Concentrao 15
Problemas de Diluio 16
Preparo de Padres Clculo de Concentrao 17

Calibrao 19

Validao de Mtodos 22

Comparao de Mtodos 23

Bibliografia 24

FOTOMETRIA
Muitas determinaes realizadas no laboratrio clnico so baseadas em medies de energia
radiante transmitida, absorvida, dispersa ou refletida sob condies controladas. Mostraremos
aqui sucintamente os princpios envolvidos nestas medies.

A fotometria clssica , sem dvida, um dos maiores trunfos de que dispe o laboratrio na
atualidade. Esta tcnica, continuamente aperfeioada, ainda permanecer durante longo perodo
sendo um dos mais teis instrumentos de medida.
Quando usamos a espectrofotometria como processo de medida, basicamente estamos
empregando as propriedades dos tomos e molculas de absorver e emitir energia
eletromagntica em uma das muitas reas do espectro eletromagntico (Tabela 1).


Raios
Gama
Raios X
Ultra
Violeta
Visvel
Infra
Vermelho
Micro
Ondas
Ondas
de Rdio
Angstroms () 1 10 1800 3800 7000 - -
Nanmetros (nm) - - 180 380 700 - -
Micra () - - - - 0,7 400 -
Centmetro (cm) - - - - - 0,04 25
Tabela 1 Caractersticas do espectro eletromagntico radiante (EMR). Os nmeros identificam
o limite inferior dos comprimentos de onda de cada radiao.

Ao falarmos em fotometria pensamos instintivamente em luz. Na realidade a poro visvel do
espectro eletromagntico (EMR) uma pequena poro e aquela que excita a retina produzindo
nosso mais importante sentido, a viso. Esta relao fotometria-luz desvantajosa porque
encaramos o EMR em termos de luz e cor, quando deveria ser considerado em termos de
energia, o que a realidade.
Esta energia propagada sob forma de ondas que poderiam ser esquematicamente
consideradas como uma unio de vales e elevaes que partem do ponto de emisso da
energia. A distncia entre dois pontos mais altos de duas elevaes contnuas denominada
comprimento de onda (Figura 1). Os comprimentos de onda variam de menores que 1 angstrom
ou 0,1 nm (raios gama) a maiores que 25 cm (ondas de rdio).

Comprimento de Onda ()

Figura 1 Representao esquemtica da propagao da energia radiante.

Um nanmetro (nm) igual a 10
-9
metros, sendo a unidade empregada para medida do
comprimento de onda. A quantidade de energia inversamente proporcional ao comprimento de
onda e, portanto os menores comprimentos de onda fornecem os maiores nveis de energia.

Instrumentos modernos isolam uma faixa estreita do comprimento de onda do espectro. Aqueles
que utilizam filtros so denominados fotmetros e aqueles que utilizam prismas ou grades de
difrao so denominados espectrofotmetros.
3

Componentes Bsicos da Fotometria

A Figura 2 esquematiza os componentes bsicos da fotometria.


Figura 2 - Representao esquemtica de um instrumento fotomtrico.

1 Fonte de energia eltrica fornecedora de energia regulada, constante e apropriada para a
operao do instrumento.
2 Fonte de energia radiante capaz de medir uma mistura de comprimentos de onda.
3 Fenda de entrada da luz.
4 Monocromador utilizado para isolamento da poro desejada do espectro.
5 Fenda de sada da luz.
6 Cubeta - recipiente que recebe o lquido da reao a ser medido.
7 Detector utilizado para receber a energia radiante transmitida atravs da soluo e
transform-la em energia eltrica.
8 Circuito medidor recebe a energia eltrica emitida pelo detector apresentando-a ao
operador sob uma forma til de medida: absorbncia ou concentrao.

Fonte de Energia Eltrica
Para que um instrumento fotomtrico opere corretamente necessrio que receba energia
eltrica adequadamente regulada. Esta energia, em muitos casos, necessita ser estabilizada
com uso de equipamentos eletrnicos responsveis por corrigir a tenso da rede eltrica
fornecendo uma alimentao estvel e segura. So os estabilizadores, que protegem os
equipamentos contra sobretenso, subtenso e transientes.

Fonte de Energia Radiante
Tipos de fontes de luz usadas em espectrofotometria incluem lmpadas incandescentes e
lasers.
A lmpada de Tungstnio a mais utilizada fonte de energia radiante para o ultravioleta prximo
e para o visvel.

Monocromador
Um sistema para isolamento da energia radiante de um requerido comprimento de onda,
excluindo a dos outros comprimentos de onda chamado de monocromador. Os
monocromadores podem ser filtros, prismas ou grades de difrao.

Filtros de Vidro:
Podemos considerar dois tipos de filtro de acordo com seu desempenho.
O filtro de corte produz um ntido corte no espectro com transmitncia quase nula de um lado e
grande transmitncia do outro. Este tipo de filtro usado para eliminar energia estranha,
espectros de segunda ordem etc. (Figura 3).

O filtro composto construdo pela associao de dois ou mais filtros de corte e transmite uma
faixa definida do espectro. o tipo mais comumente empregado nos fotocolormetros. Na
realidade o filtro composto no um monocromador porque transmite uma faixa muito ampla de
comprimentos de onda. A capacidade de mono cromatizao de um filtro composto
dependente de sua faixa de emisso, que definida como o intervalo de comprimento de onda
entre os dois lados da curva de transmitncia do filtro a uma transmitncia igual metade do
pico de transmitncia.
4


Figura 3 - Representao esquemtica da caracterstica de transmitncia do filtro de corte (a) e
um filtro composto com ampla faixa de emisso (b). O filtro com faixa de emisso estreito (c)
composto pela associao de dois filtros de corte com caractersticas opostas de Transmitncia
(a e b). A faixa de emisso do filtro c (distncia n-m) definida como a largura em nanmetros
da curva de transmitncia espectral, no ponto igual metade da transmitncia mxima.

Filtros de Interferncia
So filtros de pequena faixa de emisso, transmitindo uma faixa muito estreita de comprimentos
de onda. So constitudos por duas lminas de vidro com os lados internos recobertos
parcialmente por uma camada prateada semitransparente. As duas lminas so separadas por
um dieltrico (fluoreto de magnsio) de espessura controlada (Figura 4).





Dieltrico
5





Prata
Vidro

Figura 4 - Esquema de construo do filtro de interferncia.

A energia radiante penetrando no filtro, perpendicular superfcie prateada, atravessa o
dieltrico, refletida pela camada prateada do lado oposto, retornando primeira camada onde
se reflete outra vez. Finalmente a energia radiante transmitida atravs da camada prateada
saindo do filtro com comprimento de onda selecionado. Ocorre neste processo interferncia
construtiva e destrutiva. A primeira ocorre quando o comprimento de onda igual ou um mltiplo
da espessura do dieltrico. Variaes da espessura do dieltrico permitem a obteno de filtros
com diferentes faixas de emisso espectral. Estes filtros transmitem 40 a 60% de energia no seu
pico de transmitncia.

Podem ser produzidos filtros de muitas camadas atravs da superposio de vrias camadas do
dieltrico, cada uma correspondendo a uma frao do comprimento de onda desejado. Os filtros
multicamada tm pequena faixa de emisso (5 a 10 nm).

Prismas
Produzem refrao de energia radiante separando os vrios componentes da energia composta.
Os pequenos comprimentos de onda so refratados em grau maior, o que produz um espectro
no linear com pequena definio nos grandes comprimentos de onda. Estes problemas
requerem sistemas mecnicos e ticos relativamente complexos para permitirem a seleo de
pores espectrais de pequena faixa de emisso e grande pureza espectral.
O prisma necessita receber energia radiante atravs de uma fenda de entrada e o isolamento
espectral feito por uma fenda de sada. Por razes ticas as fendas devem ser curvas e
teoricamente devem ser infinitamente estreitas, mas praticamente devem ser suficientemente
largas para permitirem passagem de energia radiante suficiente para medies exatas. Este
um dos fatores de limitao porque quanto mais larga a fenda maior a faixa de emisso.
6

A largura da fenda ser tanto menor quanto maior for o comprimento de onda desejado. Os
instrumentos equipados com prismas tm fendas de entrada e sada que podem ser ajustadas
em uma operao concomitante com o ajuste do comprimento de onda.
Os prismas permitem o isolamento de faixas do espectro com diminuta faixa de emisso (0,5 a
1,5 nm).

Grades de Difrao
So produzidas pela evaporao de uma pelcula de um alloy (alumnio-cobre) na superfcie
oticamente lisa de um vidro. So feitos sulcos bastante precisos na superfcie do alloy com um
nmero que pode variar de algumas a vrias centenas por centmetro quadrado. Quanto maior o
nmero de sulcos, maior a capacidade de difrao da grade e menor a faixa de emisso.
Grades com boa capacidade de difrao podem ter de 1000 a 2000 sulcos/mm.
A grade de difrao utiliza o princpio de que os raios de energia radiante sofrem refrao ao
encontrar um ngulo agudo e o comprimento de onda fornecido varia com o grau de difrao. Os
sulcos da grade funcionam como pequenos prismas. A energia refletida ou transmitida de
maneira a fracionar a energia radiante composta em seus vrios comprimentos de onda.
A grade de difrao concorre para fornecer acentuada energia parasita ao sistema, o que
aumenta bastante o erro fotomtrico. Uma maneira de eliminao desta energia parasita
consiste na associao de duas grades ou a introduo de um filtro de corte aps a emisso da
grade.

Cubetas
As cubetas so provavelmente a poro mais negligenciada do sistema fotomtrico, apesar de
serem de grande importncia. Quando no so bem cuidadas contribuem decisivamente para
aumentar o erro fotomtrico.
A cubeta um recipiente pequeno usado para conter o material a ser analisado. Podem ser
quadradas, retangulares ou redondas e so construdas de vidro, de slica (quartzo) ou plsticas.

Cubeta Redonda Esta cubeta no polida, podendo apresentar irregularidades de superfcie.
Est sujeita aos erros de refrao e possui efeito de lente.

Cubeta Quadrada ou Retangular Tm faces planas e paralelas. polida oticamente.
Geralmente tm 1,0 cm de espessura de soluo. Cubetas de vidro (boro silicato) so usadas
nas medies da poro visvel do espectro. Para uso em comprimentos de onda abaixo de 340
nm so usadas cubetas de quartzo.
Em analisadores automticos, so usadas cubetas de plstico, com bom desempenho para uso
tanto no visvel quanto no ultravioleta, requerendo cuidados com manuseio, uso de
determinados produtos de limpeza e temperatura. Estas cubetas geralmente so descartveis,
devendo ser usadas uma nica vez.

Detectores
Fotodetectores so dispositivos que variam sua resposta em funo da intensidade de luz
incidida na superfcie fotossensvel (Ex: foto transistor, fotodiodo, etc.).

O tubo fotomultiplicador o fotodetector mais comum usado para medir a intensidade de luz nas
regies ultravioleta e visvel do espectro. A luz detectada em uma janela ptica, excitando os
eltrons no catodo, sendo os mesmos direcionados para o vcuo e acelerados. Aps atingir o
anodo do fotomultiplicador, o sinal condicionado por um circuito eletrnico externo.

Fotodiodos so componentes semicondutores com juno P-N (diodos) sensveis intensidade
luminosa, variando sua resistncia proporcionalmente intensidade luminosa incidente na sua
janela fotodetectora.

Circuito Medidor
A energia eltrica do detector mostrada em algum tipo de medidor ou sistema de leitura.
No passado dispositivos analgicos foram amplamente utilizados como dispositivos de leitura
em espectrofotmetros. Foram substitudos por dispositivos de leitura digital que mostra display
numrico de absorbncia ou valores convertidos em concentrao. O sinal de sada do detector
(em tenso) condicionado, processado e enviado a um dispositivo de sada para apresentao
do resultado. O valor de absorbncia ou concentrao normalmente mostrado atravs de um
display ou terminal conectado a computador externo com software de gerenciamento.

Microprocessador
Com microprocessadores e software residente, dados do calibrador so armazenados e sinais
digitais do branco so subtrados do calibrador, a concentrao de controles e amostras
automaticamente calculada. Tambm dados de vrios calibradores so armazenados para traar
uma curva de calibrao, mostrar as absorbncias obtidas ou traar a curva para inspeo visual
e calcular os resultados das amostras baseados na curva ou em algum clculo matemtico. O
microprocessador e software residente so usados tambm para converter dados de uma
reao cintica em concentrao ou atividade enzimtica.

Leis da Fotometria
Quando um raio de energia radiante atravessa uma soluo, a energia incidente (I
0
) ser
sempre mais intensa que a energia emergente (I). Esta atenuao da intensidade de energia
pode ser atribuda a: (1) Reflexes nas interfaces entre o ar e a parede da cubeta e entre a
soluo e a parede da cubeta, (2) disperso por partculas presentes na soluo e (3) absoro
da energia pela soluo (Figura 5).


I I
0

Figura 5 - Absoro da energia radiante que atravessa uma soluo. 1 reflexo nas interfaces,
2 disperso por partculas presentes na soluo, 3 absoro prpria da soluo.

Nas aplicaes da fotometria, a absoro da energia o fator primrio na reduo da energia
incidente. Quando se usa energia monocromtica (comprimento de onda simples), a frao da
radiao absorvida pela soluo, ignorando perdas por reflexo e disperso, ser funo da
concentrao da soluo e da espessura da soluo. Matematicamente esta funo pode ser
definida como:

abc
0
e
I
I

=

I =Intensidade de energia emergente
I0 =Intensidade de energia incidente
e =base dos logaritmos neperianos: 2,303
a =absortividade constante que depende do comprimento de onda
b =espessura da soluo atravessada pela radiao
c =concentrao da soluo

Esta frmula estabelece que quando a energia radiante monocromtica atravessa uma soluo,
a quantidade de energia transmitida diminui exponencialmente com: (1): aumento da espessura
da soluo e (2): aumento da concentrao ou intensidade de cor da soluo. O primeiro
conceito deriva da Lei de Lambert e o segundo da Lei de Beer, Estes dois conceitos so
denominados algumas vezes de Lei de Lambert-Beer. Entretanto como as medidas fotomtricas
so realizadas com espessura constante da soluo e somente a concentrao varivel,
usual mencionar s a Lei de Beer.

A relao energia emergente/energia incidente indica a transmitncia da soluo.

0 I
I
T =
7

Se uma determinada soluo no absorve energia, I e I
0
tm o mesmo valor e I/I
0
ser igual a
1. Podemos ento concluir que qualquer soluo que absorva energia ter transmitncia menor
que 1. Para evitar operaes com decimais usou-se o artifcio da multiplicao por 100. Assim
quando I e I
0
so iguais, T =1 =100%.
A absoro de energia radiante funo logartmica e isto pode ser provado atravs do seguinte
exemplo: Consideremos 7 filtros com capacidades iguais de absoro, colocados um aps o
outro, sendo que cada filtro absorve 20% de energia incidente. A energia incidente (I
0
) no
primeiro filtro igual a 100 e logo a emergente (I) ser igual a 80. Esta passar a ser a energia
incidente (I
0
) no segundo filtro e a energia transmitida (I) ser igual a 64. Na continuao do
processo obteremos a seguinte progresso: 100 84 64 51,2 42 33,6 27 e 21,5.
Se plotarmos estes valores em papel linear obteremos uma curva logartmica, mas em papel
mono logartmico obteremos uma curva reta (Figura 6).


Figura 6 - Curvas de Absoro de energia radiante traadas em papel aritmtico e papel mono
logartmico.

Voltando s Leis de Lambert-Beer podemos matematicamente deduzir que:


abc
0
e
I
I

=

abc =B (absorbncia neperiana), portanto:

B
0
e
I
I

= ou log B
I
I0
=

Esta equao pode ser convertida a logaritmos de base 10, assim teremos:

log A
I
I0
= ou A = log I
0
log I

Como I
0
=100 teremos:

A = log 100 log T ou Absorbncia = 2 log T
8

Lei de Beer Relao entre Transmitncia, Absorbncia e Concentrao
A Lei de Beer estabelece que a concentrao de uma substncia seja diretamente
proporcional intensidade de luz absorvida ou inversamente proporcional ao logaritmo
da luz transmitida (Figura 7).

Figura 7 - Relao Absorbncia e % Transmitncia

Matematicamente a Lei de Beer expressa como:

abc A = (1)

A =Absorbncia
a =absortividade constante que depende do comprimento de onda
b =espessura da soluo atravessada pela radiao
c =concentrao da soluo

Esta equao Forma a base da anlise quantitativa da absoro fotomtrica.
Aplicao da Lei de Beer

Na prtica a proporo direta entre absorbncia e concentrao estabelecida
experimentalmente para dado instrumento em condies especficas. Frequentemente existe
uma relao linear at uma determinada concentrao ou absorbncia. Quando esta relao
ocorre, dito que a reao obedece a Lei de Beer at este ponto. Sendo assim, um fator de
calibrao pode ser usado para calcular a concentrao de uma amostra desconhecida pela
comparao com um calibrador.
Rearranjando a equao (1) teremos:

bc
A
a =
2 2
2
1 1
1
c b
A
c b
A
=

Como a espessura da soluo (b) constante no instrumento (b
1
=b
2
), teremos:

u
u
c
c
2
2
1
1
c
A
c
A
c
A
c
A
= =

Onde A
c
e c
c
so absorbncia e concentrao do calibrador e A
u
e c
u
so absorbncia e
concentrao do desconhecido.
Demonstrando a equao para a concentrao do desconhecido:

c
c
u
u c x
A
A
c = ou
c
c
u u
A
c
x A c = como k x A c k
A
c
u u
c
c
= =
O valor de k determinado pela medio da absorbncia do calibrador (A
c
) de valor
conhecido (c
c
).
Denominamos k como sendo o Fator de Calibrao (FC).
O FC somente deve ser utilizado quando a reao obedece Lei de Beer no intervalo
proposto.
9

Problemas de Fotometria
Energia Parasita
um tipo de energia indesejvel, tambm chamada luz adversa ou espria, sendo constituda
por qualquer tipo de energia dentro do instrumento, que chega at a cubeta com comprimento
de onda diferente do indicado na escala do monocromador e promove a obteno de resultados
incorretos. A energia parasita pode ser causada por imperfeies na grade de difrao ou
prisma, defeitos no sistema tico, deposies no vidro da lmpada, orifcios permitindo entrada
de luz externa, etc.
Podemos trabalhar com um instrumento fornecendo altos nveis de energia parasita se estes
nveis forem mantidos constantes e se trabalharmos com curva de calibrao, pois a energia
parasita responsvel por desvios de linearidade. (Figura 8)


Figura 8 - Efeito de vrias porcentagens de energia parasita no seguimento da Lei de Beer.

Os problemas de energia parasita so mais graves nos limites de comprimento de onda.

Resoluo e Faixa de Emisso
Resoluo a capacidade de um instrumento fotomtrico em detectar alteraes na
absorbncia ocorrendo em uma estreita faixa de comprimento de onda (Figura 9). Esta
capacidade depende da faixa de emisso e da porcentagem de energia parasita.


Figura 9 - Curvas de Transmitncia de um filtro de didmio realizada em trs espectrofotmetros
com faixas de emisso de 0,5; 9 e 20 nm.

A faixa de emisso tambm responsvel pela linearidade da resposta em espectrofotmetros
ou colormetros.
10

Seleo da rea Espectral
Quando se realiza uma medida fotomtrica deve-se utilizar uma faixa do espectro na qual a
energia radiante seja absorvida ao mximo ou aproximadamente ao mximo a fim de se obter o
mais alto grau de sensibilidade. Uma soluo azul absorve o vermelho com maior intensidade e,
portanto deve ser escolhida a poro vermelha para medida de soluo azul. Na maioria das
determinaes colorimtricas utiliza-se sempre uma faixa espectral cuja cor complementar
da soluo a ser medida (Tabela 2).


Comprimento de Onda

Cor
Cor Complementar
(Cor da soluo analisada)
380 420 Violeta Verde Amarela
420 440 Violeta Azul Amarela
440 470 Azul Laranja
470 500 Azul Verde Vermelha
500 520 Verde Prpura
520 550 Amarela Verde Violeta
550 580 Amarela Violeta Azul
580 620 Laranja Azul
620 680 Vermelha Azul Verde
680 780 Prpura Verde
Tabela 2 - Espectro visvel e cores complementares

Ocasionalmente uma medida fotomtrica feita em um comprimento de onda diferente daquele
em que h o mximo de absoro. Isto promove uma reduo da sensibilidade, mas um
artifcio usado para obter linearizao, aumento da faixa de trabalho ou eliminao de
interferncia como bilirrubina, hemoglobina, etc.
O melhor processo para avaliar a correta regio espectral para uma medida fotomtrica consiste
no preparo da curva de absoro espectral, relacionando as absorbncias e os respectivos
comprimentos de onda (Figura 10).


Figura 10 - Curva de absoro espectral da determinao de albumina pelo mtodo VBC.
Observar um pico de absorbncia em 450 nm e outro em 620 nm (linha escura). A linha mais
clara representa a curva do branco.

Na curva acima podemos observar que foram obtidos dois picos e ser um destes o escolhido
para as medidas fotomtricas. O primeiro pico com grande absorbncia em torno de 450 nm foi
desprezado porque nesta regio o branco do reagente tem absorbncia maior que a
absorbncia da reao. O segundo pico em torno de 620 nm tem absorbncia elevada, logo com
maior sensibilidade e onde so mnimas as interferncias de bilirrubina e hemoglobina.

Normas para escolha da regio espectral:
a) Escolher o comprimento de onda onde se obtm a maior absorbncia, se possvel evitando
as interferncias fotomtricas de hemoglobina, bilirrubina, turvao etc.;
b) Caso as pores ascendentes e descendentes da curva no sejam linhas retas,
provavelmente o sistema colorimtrico no segue a Lei de Beer;
c) Devem-se usar os picos para a leitura colorimtrica porque pequenas variaes no
comprimento de onda produzem tambm pequenas variaes na absorbncia, enquanto que
nas pores ascendentes e descendentes da curva, s pequenas variaes do comprimento de
onda correspondem grandes variaes de absorbncia.
11

Faixa til de Trabalho
Para obter uma exatido mxima nas leituras fotomtricas necessrio conhecer a faixa til do
colormetro ou espectrofotmetro.
O manual do instrumento orienta quanto faixa til, geralmente acima de 2,000 de absorbncia.

Uso de Brancos
O uso do Branco em fotometria necessrio para estabelecer a absorbncia zero do reagente
utilizado.
necessrio utilizar o Branco de reagentes como referncia sempre que a absorbncia da
mistura de reagentes no comprimento de onda utilizado for diferente da absorbncia da gua.

Exemplo: Reao das Protenas Totais onde o Reagente de Biureto apresenta uma absorbncia
em 545 nm em torno de 0,120. Ao utilizarmos o Reagente como Branco, para zerar o
equipamento, estamos eliminando a contribuio desta absorbncia nos resultados.


Figura 11 - Branco = Absorbncia do Reagente (Branco da Reao) lida contra branco de gua;
Padro - Absorbncia do Padro lida contra branco de gua; Padro corrigido = Absorbncia da
Reao do Padro (usando o Reagente como Branco).

Modo de Leitura
Leitura Monocromtica: A absorbncia utilizada para clculo o resultado da medida realizada
em um nico comprimento de onda.

Leitura Bicromtica: A absorbncia utilizada para clculo o resultado da diferena entre as
medidas realizadas no comprimento de onda primrio e no comprimento de onda secundrio.
Com a leitura Bicromtica, podemos minimizar um erro sistemtico constante no Teste, ou seja,
minimizar interferncias fotomtricas da amostra, principalmente lipemia (Figura 12).


Figura 12 Representao da interferncia de Lipemia, Bilirrubina e Hemoglobina em diferentes
comprimentos de onda.
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PADRONIZAO
Adoo de uma medida, especificao, paradigma ou tipo para uniformizar a produo ou a
avaliao de qualquer coisa (Dicionrio Houaiss).

Material Volumtrico
A maioria dos procedimentos em Qumica Clnica requer medidas de volume. Para um trabalho
exato necessrio ter certeza que o volume contido ou medido por uma pea da vidraria
realmente aquele indicado pela graduao.

Pipetas
Pipeta Volumtrica ou transferidora: planejada para medir um volume fixo de lquido
constituindo-se de um bulbo cilndrico contendo um tubo estreito em cada extremidade (Figura
13).
A exatido da calibrao desta pipeta diretamente proporcional sua capacidade, para micro
anlises devem ser utilizadas pipetas automticas. Estas pipetas so calibradas para utilizao
em medida de amostras no viscosas, filtrados e padres.


Figura 13: A - Pipeta Volumtrica; B: Pipeta Mohr (escoamento parcial); C: Pipeta sorolgica
(escoamento total)

Pipeta graduada ou medidora: Consiste em um tubo de vidro graduado uniformemente em seu
comprimento. Existem 2 tipos;
Pipeta graduada de escoamento parcial: calibrada entre duas marcas;
Pipeta graduada de escoamento total (sorolgica), graduada at a extremidade inferior.

Estas pipetas so planejadas para medidas de volumes pr determinados e no so
consideradas exatas para medir amostras e padres.

Cuidados necessrios para uso correto das pipetas:
Utilizar sempre um dispositivo para a pipetagem (no pipetar com a boca);
Utilizar a pipeta sempre na posio vertical (tanto para aspirar como para desprezar o
lquido);
Utilizar pipetas ntegras;
Utilizar pipetas limpas e secas;
Utilizar pipetas com volume total o mais prximo possvel do volume a ser medido;
Para medidas de solues viscosas, evitar que o lquido ultrapasse muito a marca de medida,
deve-se limpar a parte externa da pipeta e lavar a mesma vrias vezes na soluo ou reagente
que ir receber o material pipetado;
Nas solues incolores coloca-se o menisco inferior na marca de calibrao enquanto que
nas solues coradas o acerto se faz na parte superior do menisco.
13
14

Pipeta Automtica
Pipetas usadas quando h a necessidade de se transferir volumes muito reduzidos
(micropipetas ou pipetas automticas). Permite medir pequenos volumes, da ordem de
microlitros, com preciso e exatido. Este tipo de pipeta utiliza ponteiras plsticas descartveis.

Vidrarias
Outros materiais volumtricos de uso em laboratrios, como bales volumtricos, provetas e
buretas, sendo de boa procedncia tm calibrao aceitvel para a rotina do laboratrio clnico.
Um fator importante a correta manuteno e limpeza desta vidraria. Vidraria corretamente
limpa mantm a integridade das solues utilizadas, permite medidas corretas e no interfere
com as reaes qumicas.
Para verificar a limpeza da vidraria deve-se ench-la de gua, esvaziar e verificar se a gua
forma pequenas gotas na parede. Isto indica presena de impurezas, principalmente gordura. Se
ao contrrio a gua forma uma fina pelcula nas paredes, significa limpeza correta. Este teste
no identifica um enxgue mal feito, como por exemplo, presena de detergente na vidraria.
Outro fator a ser considerado a qualidade da gua deionizada utilizada no enxgue final do
material.

Produtos Qumicos
Substncias qumicas utilizadas no laboratrio so classificadas em diferentes graus de pureza.

Padro Primrio: Substncia qumica de elevada pureza utilizado no preparo de solues
padres. fornecido com anlise de lote e deve ser 99,95% puro. Estes produtos qumicos
devem ser estveis e de composio qumica definida, permitindo secagem em estufa (100
110 C) sem mudanas na composio. No devem ser higroscpicos a fim de que no
absorvam gua durante o manuseio.

Padro Secundrio: So substncias ou solues em que a concentrao no pode ser
determinada por pesagem do soluto. A concentrao avaliada por anlise de uma amostra de
valor conhecido ou utilizando um mtodo de referncia ou um padro primrio.

Reagentes para Anlise: Existem vrias nomenclaturas como: ACS, AR, PA, etc. Neste grau de
pureza se encontram os reagentes que preenchem as especificaes para uso em anlise
qualitativa e quantitativa.
So obtidos em duas formas:
- Lote de reagente analisado: fornecidos em lotes analisados, tendo a quantidade de
impurezas constante no rtulo (ex. Arsnico 0,0005%).
- Limite mximo de impurezas: o rtulo contm uma relao dos limites mximos de
impurezas (ex. metais pesados mximo 0,001%). Neste caso as impurezas podem estar em
limites bem inferiores aos rotulados, mas ao utilizar estes reagentes devemos consider-los
como contendo os limites mximos impressos nos rtulos.
Os reagentes que seguem as especificaes da American Chemical Society (ACS) so de
grande pureza e recomendados para anlise de traos de metais e padronizao de mtodos de
referncia.

Reagente Quimicamente Puro: Esta designao no revela os limites tolerados de impurezas e
as designaes dos fabricantes no so uniformes. Reagentes desta categoria no devem ser
usados na pesquisa e em vrias tcnicas em bioqumica clnica a menos que tenham sido
testados para se assegurar de que as impurezas no causam problemas s reaes qumicas.

USP: So produtos que seguem as especificaes da United States Pharmacopea e contm
impurezas qumicas que no produzem mal sade. Em muitos casos estes produtos so
obtidos em graus de pureza que permitem seu uso em bioqumica clnica. Podem ser usados
tanto para uso externo como para uso interno (podem ser ingeridos).

Cromatograficamente Puros: Destinados a processos analticos altamente sensveis, como a
cromatografia. Indicam teores mximos de impurezas.

Espectrograficamente Puros: Destinados anlise espectroscpica. Possuem grau de pureza
elevado.

Grau Tcnico ou Comercial: Utilizado em indstrias e tem raras aplicaes no laboratrio
clnico devido quantidade de impurezas que apresentam.


Preparo de Solues
Solues so definidas como misturas homogneas de duas ou mais substncias. Elas so
encontradas em qualquer um dos trs estados da matria: slido, lquido e gasoso.
Todas as misturas gasosas so solues porque qualquer mistura de gases homognea.
Solues slidas, como certas ligas metlicas, so comuns. A grande maioria das solues,
entretanto, existe no estado lquido. Solues lquidas so formadas pela dissoluo de um gs,
lquido ou slido em um lquido.
Geralmente uma soluo constituda por um componente em maior quantidade, o solvente e,
um ou mais componentes denominados solutos.

Soluo diluda aquela que contm uma quantidade relativamente pequena de soluto por
volume de soluo.

Soluo concentrada contm grandes propores de soluto. Solues concentradas s so
possveis quando o soluto tem elevado grau de solubilidade.

Uma soluo saturada existe quando molculas do soluto esto em equilbrio com excesso de
molculas no dissolvidas. Como a temperatura afeta a solubilidade deve-se especificar a
temperatura exata para preparo da soluo saturada.
Expresses de Concentrao

A quantidade de soluto dissolvida em uma quantidade de solvente nos d um valor que
chamamos de concentrao da soluo. A concentrao de uma soluo tanto maior quanto
mais soluto estiver dissolvido em uma mesma quantidade de solvente.
A concentrao das solues pode ser expressa de diversas formas. O que se entende
simplesmente por concentrao a quantidade de soluto existente em relao ao volume da
soluo. Matematicamente:

C=m/V onde m a massa de soluto e V o volume da soluo.

A unidade usual para concentrao gramas por litro (g/L).

H outros tipos de clculo para a concentrao em solues:

Unidades Fsicas:
a) Peso do soluto por volume de soluo (P/V). Ex. NaCl 20 g/L
b) Porcentagem de peso na soluo: gramas de soluto por 100 g de soluo 2,0%
c) Peso do soluto por peso de solvente (P/P).
d) Volume de soluto por volume de soluo (V/V). Estas solues so as menos exatas e
usadas quando o soluto lquido.
e) Partes por milho: microgramas de soluto por grama de soluo (PPM). Como 1 mL de gua
pesa 1 grama: PPM igual a g/mL ou mg/L.

Unidades Qumicas:
1- Soluo molar (M): contm 1 mol em 1000 mL de soluo.

2- Soluo Normal (N): contm 1 equivalente grama de soluto em 1000mL de soluo. 1 mol de
HCl, 0,5 mol de H
2
SO
4
e 0,333 mol de H
3
PO
4
por 1000 mL de soluo fornecem solues 1
Normal.

3- Soluo Molal (m): contm 1 mol de soluto em 1000 g de solvente. Comparada com a
soluo molar, que tem volume final de 1000 mL a soluo molal ligeiramente mais diluda.

4- Miligrama equivalente: o equivalente grama (Eq. grama) de um soluto expresso em mg. O
equivalente grama do cido sulfrico 49,04 g e 1 miligrama equivalente igual a 49,04 mg. O
miligrama equivalente corresponde ao mEq (miliequivalente).

1000
grama . Eq
mEq=

mg % podem ser convertidas a mEq/L usando a seguinte frmula:


atmico peso
Valncia x 10 x % mg
L / mEq =

15
As substncias reagem em funo de sua valncia. Um mol de clcio que bivalente tem 2
vezes o poder de combinao de 1 mol de sdio. Portanto 1 mol de clcio igual a 40 g tem o
poder de combinao de 46 g de sdio (2 x 23).
Por este motivo as concentraes dos ons so expressas segundo seu poder de combinao
(equivalente) usando-se ento o miliequivalente por litro (mEq/L).
Problemas de Diluio

As solues de uso em laboratrio so solues volumtricas que contm uma quantidade
definida de soluto em um determinado volume de soluo. Em porcentagem, molar ou molal a
massa do soluto em um dado volume da soluo igual ao produto da quantidade de volume
vezes a concentrao. Quando uma soluo diluda, seu volume aumentado e sua
concentrao diminuda, mas a quantidade total de solutos permanece inalterada. Portanto
solues de diferentes concentraes, mas contendo as mesmas quantidades de soluto podem
ser relacionadas:

quantidade de soluto 1 =volume 1 x concentrao 1
quantidade de soluto 2 =volume 2 x concentrao 2
volume 1 x concentrao 1 =volume 2 x concentrao 2

Os volumes e concentraes nos 2 lados da equao devem ser expressos nas mesmas
unidades:

mL
1
x N
1
=mL
2
x N
2

litros
1
x M
1
=litros
2
x M
2

mL
1
x g%
1
=mL
2
x g%
2


Preparar 500 mL de uma soluo 0,16N de H
2
SO
4
partindo de uma soluo 1N:

mL
1
x N
1
=mL
2
x N
2
X x 1,0 =500 x 0,16

X =(500 x 0,16) / 1,0 X =80

Tomando 80 mL de H
2
SO
4
1N e diluindo a 500 mL obteremos a soluo 1N.

Costuma-se expressar a diluio de uma soluo por uma relao: 1/10. Isto quer dizer que 1
unidade de volume da soluo original diluda a um volume final de 10 unidades.
Exemplificando tomamos 1 mL de soluo a ser diluda e acrescentamos 9 mL de gua (ou
soluo salina ou outro solvente apropriado), obtendo um volume final de 10 mL. Deduzimos
ento que o primeiro nmero da relao representa a quantidade em unidades de volume a ser
tomada da soluo original, enquanto que o segundo nmero significa o volume final da soluo
diluda. Os dois nmeros da relao de diluio podem ser multiplicados ou divididos por um
mesmo algarismo sem alterar a relao: 1/10 =2/20 =10/100 =0,5/5 =0,1/1.

Para preparar solues a partir de lquidos deve-se considerar a densidade e a concentrao da
soluo original.

Exemplo: Preparar 1000 mL de soluo 1N do cido A. So fornecidos os seguintes dados:
Peso molecular =100
Valncia =2
Densidade =1,25 (1L =1250 g)
Concentrao =80% (P/P)

Clculos:
Soluo 1N =1 equivalente grama em 1000 mL

50
2
100
Valncia
molecular Peso
grama . Eq = =


Necessitamos de 50 gramas do cido A para preparar uma soluo 1N. Como a concentrao
80% teremos:

5 , 62
80
50 x 100
x = =

16
Se pesarmos 62,5 g do cido A e diluirmos para 1000 mL com gua deionizada teremos
soluo 1N.

Para evitar pesagem e utilizar medida de volume usamos o seguinte clculo:

1250 g (densidade) =1000 mL
62,5 g =y mL ento 50
1250
1000 x 5 , 62
y = =

Logo se tomarmos 50 mL do cido A e diluirmos para 1000 mL com gua deionizada
obteremos tambm soluo 1N.

Para preparar a soluo de normalidade desejada, dissolver a substncia pesada ou medida,
usando quantidade de solvente pouco menor que o volume requerido. Titular a soluo usando
um padro primrio. Para acertar a soluo normalidade desejada empregar a seguinte
frmula:

Normalidade encontrada Normalidade desejada
x Volume requerido
Normalidade desejada

O valor encontrado igual a mL de solvente a serem adicionados soluo.

Exemplo: deseja-se preparar 1000 mL de soluo de HCl 1N. Adiciona-se 83 mL de HCl 37% a
900 mL de gua. Feita a titulao foi encontrada uma normalidade de 1,01. Empregando a
frmula acima teremos:
mL 10
1000 x 00 , 1
00 , 1 01 , 1
=

Deve-se acrescentar 10 mL de gua deionizada soluo para obter a normalidade desejada.

Preparo de Padres Clculo de Concentrao
O padro (material calibrador) o elemento mais importante na dosagem bioqumica e sua
correta manipulao, bem como estabelecimento de seu valor real na dosagem, a pea
fundamental para a exatido dos resultados. Em muitas dosagens no laboratrio podemos
observar que o padro manipulado ou passa por etapas diferentes da amostra e nestes casos
o valor a ser considerado para o padro no momento de calcular o resultado final de uma
amostra passa a ser diferente de sua concentrao real. Podemos encontrar 4 situaes:

1- O padro passa pelas mesmas etapas da amostra. Neste caso o valor do padro para
efeito de clculo igual sua concentrao.

Exemplo: Na dosagem de Glicose PAP Labtest Ref. 84, o padro passa pelas mesmas etapas
da amostra. Se a concentrao do padro de 100 mg/dL empregamos a seguinte frmula:

100 x
Padro . Abs
Teste . Abs
) dL / mg ( Teste . Conc =
17

2- A amostra submetida a diluies ou desproteinizaes e o padro s participa da
colorimetria.
Empregamos a seguinte frmula:


A
D x CP x V
VP =

VP =valor do padro a ser considerado para calcular a concentrao da amostra;
V =volume do padro utilizado na reao;
CP =Concentrao do padro utilizado na reao
D =diluio da amostra
A =Volume da amostra aps diluio.

Exemplo 1: Na dosagem de Colesterol HDL Labtest Ref. 13 com precipitao a amostra diluda
1:2. Vamos utilizar 0,1 mL do padro com concentrao de 20 mg/dL e 0,1 mL da amostra aps
diluio (precipitao).

40
1 , 0
2 x 20 x 01 , 0
) dL / mg ( VP = =

Exemplo 2: Na dosagem de Mucoprotenas Labtest Ref. 20 com precipitao a amostra diluda
1:7,5. Vamos utilizar 0,05 mL do padro na concentrao de 40 mg/dL e 3,0 mL da amostra
aps diluio.

5
0 , 3
5 , 7 x 40 x 05 , 0
) dL / mg ( VP = =

3- A substncia padro em uma dosagem enzimtica a substncia resultante da
hidrlise enzimtica.

O resultado expresso em unidades internacionais, isto , micromoles/litro/minuto.

T x A
1000 x P
VP=

P =quantidade de substncia padro em micromoles colocada no tubo padro
1000 =converso para 1 litro de soro
A =alquota da amostra
T =tempo de incubao em minutos

Exemplo: na dosagem de fosfatase alcalina usando timolftalena monofosfato como substrato,
incubamos 0,05 mL de soro durante 10 minutos com o substrato. Usamos 0,05 mL de soluo
de timolftalena contendo 450 micromoles/litro (0,05 mL contm 0,0225 micromoles). O resultado
expresso em unidades internacionais.

45
10 x 05 , 0
1000 x 0225 , 0
) L / UI ( VP = =

Consideramos ento 45 como sendo a concentrao efetiva do padro na dosagem de fosfatase
alcalina e empregamos a seguinte frmula:

45 x
Padro . Abs
Teste . Abs
) L / UI ( Teste . Conc =
18
CALIBRAO
Definio: Conjunto de operaes que estabelecem a relao quantitativa entre a resposta de
um sistema analtico e os valores de concentrao ou atividade de um analito.

O procedimento de calibrao deve ser estabelecido considerando as caractersticas de
desempenho inerentes a cada sistema de medio. A quantidade e a concentrao dos
calibradores devem ser definidas visando obteno da calibrao com o menor custo sem
comprometimento da exatido do resultado.

Durante o desenvolvimento de um sistema analtico, a preocupao com a sensibilidade de
importncia fundamental para se determinar com exatido, concentraes do analito na regio
de maior interesse mdico, os chamados nveis de deciso.

O estabelecimento de um intervalo operacional visando minimizar as repeties do teste em
amostras com concentraes acima do limite superior do intervalo de referncia, tambm deve
ser priorizado.
Assim sendo, o sistema analtico deve ter a sensibilidade ajustada convenientemente para
atender a necessidade da aplicao. De um modo geral, a impreciso da medio ao longo do
intervalo operacional varia de maneira inversa a intensidade da resposta do sistema.

Em relao resposta frente concentrao do analito na amostra, os sistemas de medio
quantitativos utilizados no laboratrio clnico so caracterizados durante seu desenvolvimento
como: Lineares e No Lineares (Figura 14).

Sistemas analticos No Lineares so aqueles que, no intervalo operacional especificado, no
respondem de modo proporcional concentrao do analito na amostra, ou seja, no seguem
a Lei de Beer.

So caracterizados como Lineares os sistemas analticos que, no intervalo operacional
especificado, respondem de modo proporcional concentrao do analito na amostra.


Figura 14 - Grfico representativo de resposta linear dentro do intervalo operacional especificado
(linha escura) e de resposta no linear (linha clara).

Caractersticas da calibrao
Para se obter a calibrao, determina-se a resposta do sistema para amostras com
concentraes conhecidas do analito, denominadas padres ou calibradores. O correto nmero
de calibradores definido em funo da resposta do sistema. Em seguida, ao se estabelecer a
relao entre as concentraes do analito nos calibradores e as respectivas respostas, obtm-se
a calibrao (Curva de calibrao, Curva Padro ou Fator de Calibrao).
De maneira inversa, a concentrao do analito em amostras de pacientes determinada atravs
da relao entre a resposta do sistema para estas amostras e a calibrao.
19

Sistema Analtico No Linear
A calibrao em geral obtida atravs da medio das respostas de quatro a seis nveis de
calibradores.

representada graficamente por uma curva e pode ser descrita por equaes que representam
as funes polinomial, logartmica, exponencial, entre outras. A quantidade e concentrao dos
calibradores so definidas de modo a conferir maior exatido dos resultados principalmente nas
faixas de concentraes de maior utilidade mdica. Os pontos de calibrao devem
necessariamente compreender todo o intervalo operacional sendo que de um modo geral, o
limite superior do intervalo operacional do sistema estabelecido pela maior concentrao do
analito utilizada na calibrao.

Devido caracterstica da resposta frente a diferentes concentraes do analito, estes sistemas
analticos so obrigatoriamente calibrados atravs do ensaio de quatro a seis nveis de
calibradores. Portanto, alterar a quantidade ou a concentrao dos calibradores estabelecidos
para o procedimento de calibrao pode comprometer a exatido do sistema.

Sistema Analtico Linear
A calibrao deste sistema frequentemente obtida atravs da medio das respostas de dois
ou mais nveis de calibradores. A calibrao representada graficamente por uma reta descrita
pela equao y = ax + b.

y =concentrao do analito na amostra do paciente;
a =coeficiente angular da equao da regresso (fator de calibrao);
x =absorbncia obtida para a amostra do paciente;
b =coeficiente linear da equao da regresso. O valor de b um valor absoluto expresso em
unidades do analito que est sendo determinado;

Quando o coeficiente linear (b) da equao da regresso da calibrao multiponto de um
sistema analtico no significativamente diferente de zero, o resultado do teste obtido pelo
produto ax (figura 15).


Figura 15 Grfico da curva de calibrao obtida pela medio de quatro calibradores com
diferentes concentraes. O coeficiente linear (b) da equao da regresso da calibrao no
significativamente diferente de zero.
20

Se o coeficiente linear (b) da equao da regresso da calibrao multiponto de um sistema
analtico significativamente diferente de zero, o resultado do teste obtido pela adio do
valor de b ao produto ax (Figura 16).


Figura 16 Grfico da curva de calibrao obtida pela medio de quatro calibradores com
diferentes concentraes. O coeficiente linear (b) da equao da regresso da calibrao
significativamente diferente de zero.

Em ambos os casos, a calibrao poder ser obtida apenas pela associao das medies de
um calibrador com concentrao do analito igual a zero (gua, NaCl 150 mmol/L ou o(s)
reagente(s)) e de um calibrador com concentrao do analito capaz de produzir uma resposta
fotomtrica situada na regio de baixa impreciso do sistema analtico.

Por responderem de modo proporcional concentrao do analito na amostra, as respostas do
sistema para apenas duas diferentes concentraes do analito so suficientes para a obteno
da calibrao. A utilizao de dois calibradores com significativa diferena de concentrao entre
si melhora a exatido e diminui a variabilidade entre calibraes.

Assim sendo, a calibrao pode ser obtida atravs da medio da resposta do sistema para um
calibrador com concentrao do analito igual a zero (gua, NaCl 150 mmol/L ou apenas o(s)
reagente(s)) e outro calibrador com concentrao do analito situada na regio de menor
impreciso do sistema. Considerando que a impreciso do sistema varia de modo inverso a sua
resposta, a concentrao do analito para o calibrador de valor diferente de zero deve se situar
na regio intermediria do sistema operacional.


21
2

VALIDAO DE MTODOS
Um mtodo de dosagem deve ter a capacidade de fornecer resultados de confiana. Um mtodo
que atenda este perfil deve preencher 2 requisitos:

a) PRECISO: capacidade do mtodo de repetir os mesmos valores ou valores mais prximos
nas dosagens em duplicata ou no dia a dia. A preciso medida pelo Coeficiente de Variao
(CV). Quanto menor o CV maior ser a preciso (Figura 17).

b) EXATIDO: capacidade de fornecer resultados que mais se aproximam dos valores reais. Um
mtodo preciso no necessariamente exato. (Figura 17)



Figura 17- Demonstrao esquemtica da obteno de valores e sua disperso em relao
mdia.

Na Figura 17 acima observamos: O grfico A descreve um mtodo com PRECISO inaceitvel,
onde os resultados obtidos esto totalmente dispersos ao redor da mdia.
No grfico B nota-se que existe uma pequena disperso de valores, demonstrando boa
PRECISO, mas devido a um ou mais erros sistemticos, no se consegue obter EXATIDO,
estando a mdia diferente do seu valor verdadeiro.
O grfico C mostra claramente um mtodo que rene as propriedades de PRECISO e
EXATIDO.

Avaliao da Impreciso
Determina-se o coeficiente de variao (CV) em amostras com concentrao do analito
prximas dos nveis de deciso mdica (concentrao de um analito onde a interpretao
mdica crtica para o paciente), analisar as amostras selecionadas, em duplicata, realizando
duas corridas analticas dirias durante 20 dias.

Para se obter o CV devemos calcular primeiramente o desvio padro (DP) utilizando a frmula:

1 N
) X X (
DP
2

=



= X mdia aritmtica dos valores obtidos
= X valor de cada dosagem
N =nmero de dosagens

De posse do DP calculamos o CV:

100 x
mdia
DP
CV=

A finalidade da avaliao da impreciso a verificao da reprodutibilidade no dia a dia porque
podem variar as condies ambientais, os reagentes, o analista, etc.
Para que um mtodo seja aceito como preciso e introduzido no laboratrio, o CV no pode ser
maior que o Erro Total do mtodo.
22
23

COMPARAO DE MTODOS
A Comparao de mtodos tem o objetivo de estimar o erro sistemtico (Bias) presente em um
sistema ou mtodo analtico quando comparado com outro sistema ou mtodo, selecionado
como sistema ou mtodo comparativo.

No estudo de comparao de mtodos, o objetivo estimar a inexatido do mtodo teste ou
verificar se os resultados entre os dois sistemas so concordantes ou equivalentes. O objetivo,
descrito de outra forma, identificar se os resultados do mtodo Teste no se desviam dos
resultados do mtodo Comparativo em mais que a impreciso inerente dos dois mtodos ou que
os resultados do mtodo Teste no se desviam dos resultados do mtodo Comparativo em mais
que as diferenas definidas pelas especificaes da qualidade analtica.
Portanto, na avaliao, a hiptese estatstica : a mdia das diferenas entre os resultados
dos dois mtodos igual a Zero ou o intervalo de confiana da mdia das diferenas
inclui o valor zero. Quando a hiptese estatstica no atendida, pode-se inferir que existe um
erro sistemtico entre o sistema teste e o sistema comparativo, erro este que deve ter sua causa
identificada e removida.
O estudo no tem o objetivo de verificar se os sistemas tm boa correlao porque uma boa
correlao somente indicativa da associao linear, no sendo significativa da equivalncia ou
concordncia dos resultados obtidos.

1. O mtodo selecionado como Comparativo deve reunir as melhores caractersticas de
desempenho e atender aos seguintes requisitos:
Ter impreciso menor que a impreciso do sistema teste; a impreciso deve atender
as especificaes da qualidade analtica;
Ter baixa sensibilidade a interferncias;
Ter erro sistemtico conhecido (rastreabilidade);
Ter mesmas unidades de medida;
Ter metodologia comparvel com a metodologia do mtodo teste;
Ter estabilidade em testes de proficincia, isto , ter resultados adequados em
relao ao grupo pareado em 2 ou mais rodadas;

A seleo do mtodo comparativo uma etapa crtica do processo e responsvel pela qualidade
final dos resultados. Portanto, deve-se selecionar o mtodo comparativo com alto nvel de
exigncia.

2. Devem-se definir os requisitos da qualidade a serem atendidos (impreciso, erro
sistemtico e erro total mximo). Para definir os requisitos da qualidade, utilizar a base de
dados do manual: Especificaes da Qualidade Analtica - Anexo A.

3. O CIQ do mtodo comparativo deve estar estvel, com atendimento aos requisitos dos
itens 1 e 2.

4. O mtodo teste deve tambm ter CIQ estvel e atender aos requisitos de impreciso da
mesma base de dados do item 2.

5. A reduzida impreciso dos mtodos Teste e Comparativo no indicativa de
correlao e/ou equivalncia de resultados porque pode haver uma diferena significativa
entre os resultados, decorrente da presena de erro sistemtico.

O experimento de medio
O experimento de comparao compreende a medio de 20 amostras nativas de pacientes
utilizando o mtodo comparativo e o mtodo teste. Devem-se selecionar amostras que no
contenham os principais interferentes (hemlise, ictercia e lipemia) e que tenham as
concentraes distribudas no intervalo operacional ou linearidade dos mtodos. Quanto maior
for a diferena entre o menor valor e o maior valor ensaiado, maior ser o poder estatstico da
comparao de mtodos.
Pode-se realizar o experimento de comparao medindo, com os dois mtodos, 4 amostras por
dia durante 5 dias ou 7 amostras por dia durante 3 dias. No desejvel medir as 20 amostras
em uma s corrida analtica. O Controle Interno da Qualidade (CIQ) deve ser executado
simultaneamente para os dois sistemas analticos para confirmar a estabilidade estatstica dos
procedimentos, principalmente da calibrao.
Os resultados no so vlidos para comparao se forem observadas mudanas significativas
na impreciso ou na calibrao dos sistemas durante o perodo de avaliao.
No se deve calcular resultados com nmero de pares menor que 12 (doze) porque ocorre
diminuio da robustez estatstica do procedimento de comparao.
24

BIBLIOGRAFIA
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Inc., 2006.
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Biological Fluids: Clin. Chim. Acta, 43: 13-22, 1973.
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8. Comparao e Validao de Mtodos, Labtest Diagnstica SA Laboratrio Clnico n
o
10, ano
15, 1992.
























Labtest Diagnstica SA
Fotometria e Padronizao
Atualizao: Setembro 2010
Frida Wilke Alves Basques