TCNICA HISTOLGICA

MV. MSc. Bernardo Vsquez, Profesor Titular

rea de Anatoma Microscpica y Embriologa Veterinarias. Decanato de Ciencias Veterinarias.
Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado.
Apartado de Correo 400. Barquisimeto, Venezuela


INTRODUCCIN
Todo organismo vivo (animal o vegetal) esta constituido por clulas. Las clulas son la
unidad bsica estructural de todos los seres vivos. Existen individuos formados por una
sola clula (organismo unicelulares, como los protozoarios) o por muchas clulas
(organismos pluricelulares o metazoarios). En cualquiera de los casos, solas o
agrupadas constituyendo tejidos y rganos, las clulas tienen la capacidad de
desarrollar funciones que les permiten vivir de manera independiente.

Anatoma Microscpica vs Anatoma Macroscpica
A diferencia de la Anatoma Macroscpica, en la que el individuo puede ser estudiado
por simple observacin y diseccin de sus tejidos y rganos, para el estudio de la
Anatoma Microscpica se requiere, en primer lugar, la preparacin de las clulas y
tejidos mediante procedimientos que permiten su observacin, y en segundo lugar, del
auxilio de una herramienta, el microscopio, para poder observar la estructura fina de las
clulas, tejidos y rganos.
La observacin al microscopio se hace generalmente por medio de luz transmitida, lo
que significa que la luz debe "atravesar" el tejido a examinar para llegar, despus de
haber pasado por las distintas lentes del aparato, a impresionar al ojo humano. Por esa
causa, debe ser reducido a lminas muy delgadas y transparentes, las cuales se
obtienen despus de realizar una serie de operaciones que sern descritas ms
adelante.
Tcnica Histolgica

Se denomina TCNICA HISTOLGICA al conjunto de procedimientos aplicados a una
muestra biolgica (animal o vegetal) con la finalidad de prepararlo para poder observar,
examinar y analizar sus componentes morfolgicos, por medio de los microscopios
fotnicos y electrnicos. Estos procedimientos se pueden aplicar a un tejido vivo (los
denominados procedimientos inmediatos o vitales), o a un tejido muerto
(procedimientos mediatos o postvitales).

Estudio de las clulas vivas

Mtodo para estudio in vivo: Se realiza a organismos o clulas vivas en su estado
natural.
Los estudios in vivo permiten la observacin de protozoarios, clulas sanguneas,
clulas descamadas o disociadas y suspendidas en los lquidos de su hbitat natural
(agua dulce, agua de mar, suero sanguneo, linfa, etc.)
Para la observacin ptima de clulas vivas se emplean tipos especiales de
microscopios pticos, como el de campo oscuro o el de contraste de fase.

Coloracin vital
Existe una tcnica de coloracin de tejidos y clulas vivas, denominada coloracin
vital, muy til cuando se desea destacar alguna estructura celular o tisular; en la
coloracin vital se emplean sustancias colorantes inocuas, que no modifican la
estructura de las clulas, ni interfieren en sus funciones. Los colorantes vitales de uso
ms frecuente son la tinta china y el azul de metileno.

Existen dos tipos de coloracin vital.

La Coloracin intravital consiste en la administracin de colorantes inocuos al animal
vivo mediante inyecciones, con la finalidad de demostrar la actividad fagoctica de
clulas (macrfagos del pulmn o del tejido subcutneo, clulas de Kupffer o las
clulas dendrticas fagocticas de los rganos linfticos).

Coloracin supravital. En este procedimiento se aplican los colorantes vitales a
clulas o porciones tisulares extradas de organismos vivos.


Aplicaciones de los Estudios de Clulas y Tejidos en estado fresco

Los estudios in vivo se utilizan para examinar:
Seres unicelulares (protozoarios) o metazoarios pequeos o microscpicos.
Clulas descamadas o disociadas.
Estructuras muy delgadas y translucidas (branquias de pequeos peces,
membranas de las alas de murcilagos, o las membranas interdigitales de
anfibios, membrana peritoneal de mamferos pequeos, etc.).


Mtodo para estudio in Vitro: Se realiza en clulas aisladas. El mtodo in vitro
ms comn es el cultivo de clulas. Las clulas se colocan en un sustrato nutritivo
adecuado, que se llama medio de cultivo, en el cual se mantienen con vida mientras
dura el estudio.

Cultivos de Clulas
Es el estudio de clulas vivas colocadas en un medio nutritivo artificial, conocido como
Medio de Cultivo

Condiciones y Requerimientos para el Cultivo de Clulas

1. Asepsia rigurosa
2. pH del medio de cultivo ser similar al de los lquidos corporales
3. Temperatura de cultivo igual a la corporal
4. Control de la concentracin de O
2
y CO
2

Desventajas de los Mtodos para estudio de tejidos Vivos

Los procedimientos vitales tienen limitaciones para el estudio completo y minucioso de
clulas y tejidos. Las preparaciones no son duraderas, los procesos autolticos
aparecen en poco tiempo y algunas preparaciones no son lo suficientemente delgadas
y transparentes como para permitir el uso de microscopios de mayor aumento y alto
poder de resolucin.

Mtodos para Tejidos Muertos (procedimientos mediatos o Postvitales)
Tienen por finalidad preparar clulas, tejidos y rganos procedentes de individuos en
los que los procesos vitales se han detenido.
Con estos mtodos se busca preservar la estructura celular y evitar la
descomposicin postmortem.

La Tcnica para tejidos muertos incluye varios pasos:

1. Toma de la muestra
2. Fijacin
3. Deshidratacin
4. Aclaracin
5. Inclusin en parafina
6. Formacin de los bloques de parafina
7. Microtoma u obtencin de cortes


Tcnica de la parafina. Paso 1: Toma de la muestra

La calidad y la fidelidad con que una clula o un tejido muestren una imagen al
microscopio, con las caractersticas morfolgicas que posean cuando estaban con
vida, dependen esencialmente de la prontitud y el cuidado que se aplic para obtener la
muestra a ser procesada, mediante los pasos mencionados anteriormente.

La muestra de tejido puede ser obtenida por dos procedimientos fundamentales.

1. La biopsia (del griego bios = vida y opsis = visin).
La biopsia consiste en la toma de un fragmento de tejido u rgano de un ser
vivo.

En ciertos casos se requiere el estudio de clulas integrantes de superficies
epiteliales que se renuevan constantemente, como las de superficies mucosas
de las cavidades bucal, gstrica, o vaginal. Al procedimiento de obtener estas
clulas que se desprenden con relativa facilidad y luego extenderlas sobre un
portaobjetos se le denomina Citologa Exfoliativa. En otros casos, las clulas
son obtenidas mediante puncin, como las clulas sanguneas o de la medula
sea, luego se extienden en una lmina portaobjetos para hacer los "frotis",
colorearlas y examinarlas.

2. Mediante la necropsia. Las muestras se obtienen de cadveres. En este caso
es recomendable que los tejidos y rganos se obtengan inmediatamente
despus de producida la muerte.

Recomendaciones para la toma de las muestras

Los tejidos y los rganos obtenidos mediante biopsias y necropsias se deben seccionar
empleando bistur o navajas de afeitar nuevos, sin hacer presin sobre ellos. El filo del
instrumento cortante debe deslizarse suavemente en un movimiento de adelante hacia
atrs y viceversa.

No es recomendable el uso de tijeras para seccionar los tejidos, pues estas ocasionan
compresiones a los tejidos y rganos que distorsionan su estructura microscpica.
Es conveniente que las muestras sean lo suficientemente pequeas (no mayor a 1cm
3

de volumen) para que el fijador acte eficazmente; al mismo tiempo, la muestra debe
ser representativa del tejido u rgano que se desea estudiar.

Tcnica de la Parafina. Paso 2: Fijacin

Es un procedimiento cuya finalidad es detener la vida de las clulas e impedir las
modificaciones postmortem (procesos autolticos), conservando la estructura
morfolgica de clulas y tejidos sin que ocurran cambios notables en ellos. Esto se
consigue inmovilizando (por coagulacin o precipitacin) las molculas proteicas.
Los agentes empleados para la fijacin del tejido son denominados fijadores.

Clasificacin de los Fijadores

Los fijadores por su naturaleza pueden ser fsicos y qumicos.

Fijadores Fsicos:

1. Desecacin
2. Calor seco
3. Calor hmedo
4. Fro
5. Congelacin


Fijadores Qumicos:

Los fijadores qumicos son sustancias que generalmente se emplean diluidas; pueden
ser clasificados de acuerdo con varios criterios.

1. De acuerdo a su composicin: Las soluciones fijadoras se emplean solas,
como fijadores simples, o asocindolas entre si para formar los fijadores
compuestos (mezclas fijadoras).
El fijador simple ms conocido es el Formol o formalina. Est considerado
como la sustancia fijadora de mayor uso en los laboratorios que realizan
tcnica histolgica. El formol comercial consiste en una solucin acuosa del
gas formaldehdo al 39 - 40%.

Se presenta como un lquido claro, incoloro, que emite vapores sumamente
irritantes para la conjuntiva y la mucosa respiratoria. Su accin fijadora se
ejerce coagulando las protenas.

Es un fijador que posee un buen poder de penetracin y difusin. Mantiene
de manera adecuada la estructura y facilita la coloracin posterior de los
componentes celulares y tisulares. Endurece bien las muestras. Conserva
bastante bien las grasas.
Se le emplea en una solucin al 10% (10 partes del formol comercial y 90
partes de agua).

2. De acuerdo a su Accin especfica:

a) Oxidantes, como el tetraxido de osmio (cido smico), el bicromato de
potasio, cido crmico, bicloruro de mercurio, cido pcrico, cido actico.

b) Reductores, como el formaldehdo, el glutaraldehido, el alcohol etlico, el
alcohol metlico.

Cualidades de un buen fijador

Una sustancia fijadora para que ejerza de manera eficiente y adecuada su accin debe
poseer, en la mayora de los casos, las siguientes condiciones:

1. Debe matar inmediatamente a las clulas, impidiendo la aparicin de los
procesos autolticos.
2. Buen poder de penetracin, es decir que se introduzca con rapidez en el
espesor de la muestra. Esto significa que no fije nicamente la porcin
superficial de la muestra sino que alcance las porciones ms profundas de la
misma.
3. Debe de ser de fcil manipulacin.
4. Conferir dureza a los tejidos sin que se provoque excesiva retraccin o hacerlos
quebradizos y friables.
5. Fcil de conseguir y que sea barato.


Fijadores compuestos.
Una sola sustancia fijadora difcilmente rene todas las condiciones de un buen fijador,
por lo tanto, para completar correctamente la accin de la fijacin es aconsejable usar
mezclas fijadoras, a travs de las cuales se acrecientan las cualidades de un fijador y
se atenan sus defectos y desventajas.

Con esta finalidad se usa un nmero variable de fijadores que, mezclados de manera
racional, proporcionan resultados satisfactorios. A pesar de ello es conveniente tener
en cuenta que no existe la solucin fijadora ideal, de all que un fijador compuesto
puede ser til para la demostracin eficaz de una estructura celular o de un tejido, pero
no es el ms recomendable para otros componentes.

Entre los fijadores compuestos o mezclas fijadoras que se emplean con mayor
frecuencia estn el Fijador de Bouin, el Fijador de Zenker, el Fijador de Zenker, el
Fijador de Helly.



CRITERIOS QUE DEBEN TENERSE EN CUENTA PARA OBTENER UNA BUENA
FIJACIN


1. Tamao de las muestras.
Las muestras de los tejidos y rganos rutinariamente deben ser pequeas y delgadas,
lo recomendable es un volumen de 1cm3.

2. Volumen del Fijador. Generalmente la relacin que debe existir entre el volumen
del tejido a fijar y el volumen del fijador, es uno de los criterios que menos se tiene
en cuenta. Muchas de las soluciones fijadoras tienen efectos aditivos. Las
molculas del fijador se ligan qumicamente al tejido y el lquido fijador va perdiendo
sus molculas activas.
Los tejidos tambin contienen agua y sales solubles que se incorporan al fijador,
por lo tanto, la composicin de este se va modificando y, como consecuencia de
ello, disminuye la actividad. Se considera que una proporcin de 1 a 20 (muestra
fijador) es la ms adecuada para garantizar una buena fijacin.

3. Tiempo de fijacin. El tiempo en la fijacin es importante en dos aspectos. El
primero, relacionado con el intervalo que media entre la interrupcin muerte del
animal y la inmersin de las muestras en la solucin fijadora. Lo deseable es que
las muestras se fijen inmediatamente despus de obtenidas. Mientras ms largo es
este lapso, los procesos autolticos que sufran los tejidos sern mas evidentes.
En segundo lugar, debe tenerse en cuenta el tiempo que permanecern las
muestras sumergidas en los fijadores. Este tiempo vara con relacin al tipo de
fijador que se utiliza, al tamao y la naturaleza de la muestra y la temperatura de
fijacin

4. Temperatura de la fijacin. La temperatura influye de manera importante en el
proceso de fijacin. De manera general, un incremento de la temperatura de la
solucin fijadora acelera el proceso de fijacin pero, a su vez, aumenta la velocidad
de presentaci6n de los procesos autolticos. Esto hace recomendable efectuar la
fijacin a bajas temperaturas (4C) dentro de un refrigerador y con la solucin
fijadora enfriada previamente. Este procedimiento retardar el tiempo de fijacin,
pero disminuir de manera notable la autolisis de los tejidos.

Actualmente con el uso del horno de microondas, la fijacin puede llevarse a cabo
en pocos minutos y a temperaturas elevadas. Se ha demostrado que cuando la
temperatura de fijacin se eleva a 45C durante poc os minutos, los cambios
estructurales que sufren los tejidos son mnimos.

Fijacin por Perfusin
Un mtodo de fijacin casi instantneo es aquel en el que se aplica una solucin
fijadora por va endovenosa al animal anestesiado para perfundir los tejidos y rganos.
La perfusin se realiza mediante un sistema especial de inyeccin y drenaje,
reemplazando la sangre con una solucin salina y una vez ocurrido esto, se inyecta el
fijador.


Lavado de las muestras fijadas

AI concluir la fijacin, las muestras se retiran del fijador. El fijador se elimina mediante
el lavado de los tejidos. Se evita, as, que los tejidos se endurezcan demasiado o que
ciertos componentes del fijador introduzcan modificaciones en los tejidos e impidan una
adecuada obtencin de secciones delgadas o la coloracin de sus componentes
celulares. El lavado se efecta utilizando agua.

Tcnica de la parafina. Paso 3: Deshidratacin
Consiste en extraer o remover el agua de los tejidos fijados. Para ello se emplean
alcoholes de graduacin ascendente 70, 80 , 90, 100 (alcohol absoluto).

La deshidratacin debe ser completa para garantizar la accin de las sustancias que
facilitarn, en el paso siguiente de la tcnica, la penetracin de la parafina lquida en el
tejido.

Tcnica de la parafina. Paso 4: Aclaracin (o diafanizacin)
Las muestras deshidratadas se encuentran totalmente embebidas en alcohol absoluto;
pero la parafina tampoco es soluble en alcohol por !o que es necesario remplazarlo por
una sustancia que sea capaz, al mismo tiempo, de mezclarse con el alcohol y disolver
la parafina. Estas sustancias son las denominadas aclarantes. Los de use ms
frecuente son el xilol, el tolueno, el benceno y el cloroformo.

Al colocar la muestra en presencia del solvente, no debe aparecer ninguna turbidez, ya
que de ocurrir esto indicara que la deshidratacin no ha sido completa.
Debido a que las sustancias aclarantes tienen un alto ndice de refraccin, hacen que
los tejidos se vuelvan transparentes, de all el nombre de aclaracin.

Tcnica de la parafina. Paso 5: Infiltracin de la Parafina
Los tejidos fijados adquieren cierta consistencia y dureza, pero no la suficiente para
que se puedan obtener secciones delgadas, que al ser atravesadas por los rayos
luminosos del microscopio, formen la imagen adecuada de sus componentes.
La inclusin en parafina permite que la muestra pueda ser cortada en secciones lo
suficientemente finas para permitir su observacin microscpica.
La parafina es una sustancia que resulta de la mezcla de hidrocarburos saturados
provenientes de la destilacin del petrleo; es una sustancia slida a la temperatura
ambiente; es insoluble en agua, pero se disuelve con facilidad en presencia de
solventes, como el xileno, el benceno y el tolueno.
Existen diferentes tipos de parafina que se diferencian por sus puntos de fusin. Estos
oscilan entre 40C y 60C.

Tcnica de la parafina. Paso 6: Inclusin definitiva en Parafina y formacin
del bloque
Las muestras infiltradas son colocadas en moldes de papel, de plstico o de metal y se
vierte la parafina fundida y se dejan a temperatura ambiente para que solidifique. La
solidificacin puede ser acelerada colocando los bloques en refrigeracin.


Tcnica de la parafina. Paso 7: Microtoma y Obtencin de los Cortes
.El propsito de la inclusin que hemos descrito anteriormente es hacer posible la
reduccin del tejido a cortes lo suficientemente delgados como para permitir el paso de
la luz para examinarlo al microscopio.
Las secciones delgadas o "cortes" se obtienen utilizando instrumentos denominados
"micrtomos; son instrumentos de gran precisin que proporcionan cortes delgados,
parejos y de espesor graduable. Lo comn es cortar las muestras con espesor de 3 - 6
micrmetros.

Los cortes obtenidos a travs de la microtoma, aislados o en forma de cintas,
generalmente se presentan arrugados (muestran una rea menor que la que posee el
bloque), por lo que es necesario extenderlos en agua tibia contenida en un recipiente y
luego adherirlos a las laminas portaobjetos. Los portaobjetos deben ser previamente
desengrasados y cubiertos con una capa de adhesivo de Mayer o albmina de huevo
para garantizar una mayor adhesin de los cortes al portaobjeto.

A continuacin las laminas se apoyan en forma oblicua para que escurra el exceso de
agua y posteriormente se colocan en una estufa (a 50C aproximadamente). Despus
de unas 3 a 4 horas, el agua se habr evaporado totalmente y la parafina se disolver
totalmente.




PROCESO DE COLORACION O TINCIN


El procedimiento de coloracin o tincin consiste en darle color a una clula o tejido
utilizando una sustancia colorante.
Los colorantes son sustancias qumicas que tienen la propiedad de transferir su color
a otro cuerpo.

Bases Tericas de la Coloracin

Existen dos teoras que explican el procedimiento de la coloracin.

1. Teora fsica. Sostiene que la coloracin es un proceso fsico de absorcin. De
acuerdo con esta teora, las partculas de las sustancias colorantes disueltas
penetran en los espacios intra e intercelulares, y se mantienen adheridas debido a
la cohesin molecular. Por ejemplo, la coloracin de las grasas con los colorantes
Sudan III o Sudan IV, es una tincin puramente fsica, pues el colorante es
adsorbido por la facilidad que tiene para disolverse en estas sustancias.

2. Teora qumica
Generalmente, los colorantes usados en Histologa son sales neutras solubles en
agua, que poseen radicales cidos y bsicos, los cuales poseen cargas electricas
diferentes, comportndose el radical cido como anin y el bsico como catin.
Segn la teora qumica, en el proceso de coloracin se produce la unin inica
(electrosttica) entre los radicales aninicos y catinicos del colorante con los
respectivos radicales catinicos y aninicos de las protenas celulares. Los
componentes celulares bsicos reaccionan con los colorantes cidos mediante un
proceso de neutralizacin de las cargas, formndose una sal coloreada.

Clasificacin de los colorantes

Existen varios criterios para clasificar a los colorantes:

A. Por su origen. Pueden ser naturales y artificiales (sintticos).
Colorantes naturales:
1. Animales. Como el carmn (de color rojo intenso), que se extrae de la
cochinilla,

2. Vegetales. Como la hematoxilina, (de color azul), obtenida de la
corteza del campeche (Haematoxilum campechanum); o la orceina
que se obtiene de un liquen.

Colorantes artificiales o sintticos. Son productos derivados de la destilacin de
la hulla o carbn. Genricamente se les conoce como colorantes
derivados de la anilina. Entre estos est la Eosina, un colorante de
color rojo anaranjado muy usado en los laboratorios que realizan
tcnica histolgica.

B. Por el radical coloreado

Segn el radical que exhiba el color, los colorantes son: cidos, bsicos y neutros.

Colorantes cidos: Son sales que poseen color solo en su radical cido. Por ejemplo,
en el colorante eosina o eosinato de sodio, la propiedad colorante se debe al cido
eosnico y no a la base, el sodio.
Los colorantes cidos tienen carga elctrica negativa, por lo tanto son designados
como colorantes aninicos. Tambin se les conoce como colorantes citoplasmticos,

Las sustancias que tienen afinidad por los colorantes cidos, se denominan "acidofilas"
y qumicamente estn constituidas por componentes bsicos o alcalinos.

Son colorantes cidos, la eosina, el amarillo de metanilo, la fucsina cida, el cido
pcrico, el naranja G, la safranina y el azul de anilina.

Colorantes Bsicos. Son sales que poseen color solo en el radical bsico.
Por ejemplo, el azul de metileno o clorhidrato de azul de metileno, debe su propiedad
colorante a la base, azul de metileno, y no al acido clorhdrico, que es incoloro.
Poseen una carga elctrica positiva, por lo tanto son colorantes catinicos. Se les
denomina tambin como colorantes nucleares, pues tienen afinidad por los cidos
nucleicos (ADN y ARN).

Las sustancias que tienen afinidad por los colorantes bsicos, se denominan "basfilas"
y estn constituidas por componentes cidos.

Son colorantes bsicos, la hematoxilina, el azul de metileno, el azul de toluidina y la
fucsina bsica.
Colorantes Neutros. Son sales en las que tanto el radical bsico como el radical cido
proporcionan color. Por ejemplo, el eosinato de azul de metileno o el eosinato de azur
de metileno. Estos colorantes tienen la propiedad de teir de manera simultnea, a los
componentes nucleares y a los citoplasmticos, e incluso pueden proporcionar colores
distintos a determinados componentes citoplasmticos, como las granulaciones
especificas de los granulocitos (un tipo de glbulos blancos o leucocitos).

Tipos de Coloraciones
Existen una serie de procedimientos a travs de los cuales clulas y tejidos son
coloreados por las sustancias colorantes.
Segn el procedimiento empleado en la coloracin y el resultado de la misma, las
coloraciones se clasifican en:

1. Coloracin Ortocromtica. Los tejidos adquieren el mismo color del colorante.
2. Coloracin Metacromtica. En este proceso una sustancia o un componente
celular se tie con un color diferente al del colorante empleado.
La metacromasia es una propiedad inherente del tejido y no del colorante usado.
Los colorantes que se emplean para demostrar la metacromasia son la tionina y el
azul de toluidina.
3. Coloracin progresiva. El tejido va siendo coloreado progresivamente con
soluciones de diferente concentracin del colorante, hasta que se alcanza el punto
ptimo.
4. Coloracin regresiva: El tejido se colorea con una solucin concentrada del
colorante y luego se va eliminando el exceso del colorante por medio de
diferenciadores. A este proceso se lo denomina diferenciacin.
5. Coloracin sucesiva. Esta coloracin consiste en aplicar a los tejidos soluciones
sucesivas de varios colorantes, con la finalidad de colorear diferencialmente varios
componentes del tejido. Por ejemplo, la coloracin con hematoxilina- eosina; en
esta tcnica los ncleos se tien primero con la hematoxilina y despus la eosina se
encarga de colorear al citoplasma.
6. Coloracin pancromtica. Es producida por la actividad tintorial de los colorantes
neutros. En este caso, tanto el radical bsico como el cido de estos colorantes
ejercen su accin tintorial, pero adems, ciertos componentes celulares se tien de
colores diferentes a los originales adquiriendo tonalidades que resultan de la mezcla
de ellos. Este efecto pancromtico se aprecia en los frotis sanguneos teidos con
mezclas tipo Romanovsky.

COLORACIN CON HEMATOXILINA - EOSINA (H - E)

La coloracin con hematoxilina y eosina est considerada como la tcnica de tincin de
rutina en el estudio de clulas y tejidos, a travs del microscopio ptico.

Consiste en la tincin de los ncleos mediante la hematoxilina, previamente oxidada y
transformada en hemateina, a la que se le aade una sustancia mordiente o
intermediaria para garantizar su fijacin al tejido. Los ncleos se colorean de azul,
morado, violeta, pardo oscuro o negro, dependiendo de los agentes oxidantes y
mordientes que se utilizaron.

Seguidamente se colorea el citoplasma y material extracelular utilizando Ia eosina que
los tie de color rosado de diferente intensidad.

Protocolo para la Coloracin H-E
1. Desparafinar los cortes
2. Hidratar los cortes con alcohol en grados decrecientes
3. Colorear con la solucin de hematoxilina.
4. Lavado en agua destilada
5. Diferenciar, para eliminar el exceso de colorante; se emplea el alcohol
cido hasta que los ncleos y los componentes basfilos de las clulas
sean los nicos que permanezcan coloreados.
6. Virar al color azul, empleando soluciones de sustancias alcalinas como
agua amoniacal, solucin de bicarbonato de sodio al 2% o de carbonato de
litio al 1 %.
7. Lavar en agua corriente
8. Colorear con una solucin alcohlica o acuosa de eosina
9. Deshidratar con alcohol en grados crecientes
10. Diafanizar o aclarar empleando xilol

11. Montaje definitivo