Procesado de tejidos y citopreparacin Citopreparacin

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PROCESOS BSICOS EN CITOLOGA- CITOPREPARACIN
1. INTRODUCCIN ..................................................................................................................... 2
2. CITOLOGA EXFOLIATIVA ................................................................................................. 2
3. GENERALIDADES SOBRE LA OBTENCIN DE MUESTRAS CITOLGICAS........... 3
4. CARACTERSTICAS DE UNA BUENA PREPARACIN CITOLGICA .......................... 3
5. FIJACIN Y ENVO DE LAS MUESTRAS ........................................................................ 3
5.1. MTODOS DE FIJACIN ................................................................................................................... 4
5.2. HOJA DE INFORMACIN CLNICA .............................................................................................. 5
5.3. PROCESADO GENERAL DEL MATERIAL CITOPATOLGICO ............................................... 6
5.4. COLORANTES PARA ESTUDIOS CITOLGICOS ................................................................... 10
A. TINCIN DE PAPANICOLAU (PAP O PP) ............................................................................................. 10
B. COLORACIN DE MAY-GRUNWALD-GIEMSA ....................................................................................... 11
C. DIFF-QUIK (DQ) ......................................................................................................................................... 12
D.TINCIN DE SHORR .................................................................................................................................. 12
E. GIEMSA ....................................................................................................................................................... 12
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1. INTRODUCCIN
La Citopatologa es la parte de la A.P que, mediante distintos procedimientos,
estudia las alteraciones morfolgicas de las clulas desprendidas libremente de los
epitelios de revestimiento o extradas de distintas zonas del cuerpo humano mediante
puncin.
2. CITOLOGA EXFOLIATIVA
La citologa exfoliativa tiene como objeto identificar las clulas del cuerpo
humano desprendidas de la epidermis, los epitelios que revisten estructuras orgnicas
abiertas al exterior y el mesotelio que tapiza las cavidades corporales
(pleura, peritoneo, articulaciones.....).
De forma genrica las clulas pueden obtenerse:
a) Por exfoliacin forzada mediante frotamiento o raspado con diversos
instrumentos en la epidermis y los epitelios que son continuacin de la misma.
b) Aprovechando lquidos que transportan elementos descamados de forma
espontnea (esputos, orina...).
c) Mediante instrumentos de exploracin o puncin, que extraen el componente
lquido con clulas en suspensin procedente de zonas orgnicas (tracto respiratorio,
gastrointestinal, cavidades serosas).
De esta manera los territorios orgnicos que con mayor frecuencia estudiamos
son:
Aparato genital femenino
rbol respiratorio
Aparato digestivo
Vas urinarias y prstata
Piel
Cavidades orgnicas: peritoneal, pleural, pericrdica, raqudea y
articular
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3. GENERALIDADES SOBRE LA OBTENCIN DE MUESTRAS CITOLGICAS
La calidad de una preparacin citolgica depende, tanto del proceder clnico
acerca de la obtencin y realizacin del extendido (dependiendo del tipo de muestra), de
la prefijacin, como del envo de las muestras y su posterior procesamiento en el
laboratorio.
Para una correcta obtencin de las muestras se requiere habilidad y experiencia, adems
hay que tener un instrumental adecuado.
Los instrumentos utilizados en citopatologa para la toma de muetra suelen ser
sencillos y consisten en hisopos de algodn, escobillones, pipetas, esptulas de
madera....
El material obtenido puede extenderse directamente en el porta, aunque en
otras ocasiones se requieren tiles algo ms complejos como placas Petri o envases
especiales para recoger esputos.
Tambin se pueden utilizar frascos estriles y sondas para la recogida de orina. Los
endoscopios suelen ir provistos de un mecanismo de lavado, inyeccin y aspiracin de
lquidos.
La extensin de la muestra sobre el porta la realiza el personal que extrae la
muestra en el caso de la citologa por cepillado. Si se trata de orina, esputos, L.C.R, o un
lquido de puncin la extensin la realiza el tcnico especialista en el laboratorio de
citologa.
4. CARACTERSTICAS DE UNA BUENA PREPARACIN CITOLGICA
Existen una serie de caractersticas cualitativas y cuantitativas a tener en cuenta:
a) Las caractersticas cuantitativas son: la muestra debe ser representativa del
conjunto y, muy importante, la distribucin debe ser uniforme, ausencia de
agrupamiento celular y que resulte en una monocapa.
b) Las caractersticas cualitativas son: clulas intactas sin evidencia de distorsin,
que las clulas estn individualmente aplanadas y que estn bien fijadas, que no
haya evidencia de desecacin.
5. FIJACIN Y ENVO DE LAS MUESTRAS
Un fijador celular adecuado debe tener las siguientes caractersticas:
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- Penetrar rpidamente en las clulas
- Minimizar la retraccin celular
- Mantener la integridad morfolgica
- Inactivar las enzimas autolticas
- Permitir la permeabilidad de los colorantes
- Permitir la adhesin celular a una superficie de cristal
- Ser compatible con los medios de tincin empleados posteriormente
- Ser bactericida
- Permitir un archivo celular permanente
5.1. MTODOS DE FIJACIN
Las citologas ginecolgicas y las muestras obtenidas por cepillado se envan
extendidas, mientras que las restantes muestras se suelen transportar en forma de
suspensiones celulares ms o menos densas.
En ambos casos es preciso realizar una rpida fijacin para evitar el deterioro
celular.
Generalmente la confeccin de las extensiones citolgicas la realiza en la
consulta el propio especialista o el personal de enfermera, se suele emplear un citospray.
La disposicin del material en el porta no se realiza al azar. El porta est
marcado en uno de los extremos con el fin de colocar all una etiqueta informadora de
la muestra, esta se dispone de forma que el exudado vaginal sea el ms prximo a la
etiqueta, a continuacin se extiende la muestra del exocervix y por ltimo y en el
extremo ms alejado la del endocrvix. Hay veces que se pueden encontrar otras
disposiciones dependiendo del laboratorio que procesa la muestra o del especialista clnico
que solicita el estudio. Se recomienda que cada laboratorio decida con sus especialistas
clnicos que es lo que prefiere.
Tras la fijacin teiremos con Papanicolau (PP) o bien de dejaremos secar al aire
para teirlas con un May-Grnwald-Giemsa o un Diff-Quick. Tambin se puede teir con la
tincin de Shorr (variante de PP)
Los materiales lquidos (orina, esputos...) debern enviarse en fresco y ser
procesadas en pocas horas, si no es posible se usan lquidos fijadores, generalmente
etanol al 50% contenido en frascos de boca ancha con tapa de rosca. El volumen del
fijador debe ser igual o ligeramente superior al del lquido objeto de estudio. (Con
unos 100ml de lquido hay material suficiente para realizar citodiagnsticos, los frascos
de 250ml son los ms recomendados).
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Las muestras procesadas por puncin deben fijarse en etanol al 96% para su
posterior tincin con Papanicolaou, o bien dejarse secar al aire para teirlas con May-
Grnwald- Giemsa o Diff-Quick.
Como excepciones tenemos:
a) El fijador Saccomanno (alcohol al 50% y Carbowax 1540, aproximadamente al 2%).
Especialmente se usa en citologa de esputo.
b) Los cepillados orofaringeos y bronquiales se fijan en etanol al 96% envindose de
forma parecida a las citologas.
c) Los tubos o jeringas con muestras de punciones de derrames procedentes de
cavidades orgnicas pueden enviarse sin sustancia pre fijadora siempre que el
procesado se realice con rapidez. Y para ello se heparinizan los tubos con dos gotas de
heparina para evitar la coagulacin (actualmente los tubos suelen ir heparinizados).
5.2. HOJA DE INFORMACIN CLNICA
Todo el material que es enviado para estudio citopatolgico debe ir acompaado de
informacin clnica sobre el paciente y la enfermedad que se estudia mediante un
proceso de peticin citolgica.
En la hoja hay que incluir los siguientes datos:
Centro y servicio de procedencia
Mdico que solicita el estudio
Personal auxiliar responsable del envo y que posteriormente recibe el informe.
Nombre, direccin, sexo y edad de la paciente.
Origen del material.
Mtodo de obtencin.
Resumen de la historia clnica.
Sugerencias diagnsticas.
Tratamientos realizados.
Estudios citolgicos o anatomopatolgicos previos.
Tambin hay que comprobar que el nombre del paciente que viene en la hoja de peticin
coincide con el que viene en la muestra. Si hay discordancia se devolver la muestra, con
una nota explicativa.
Se leern los datos clnicos para ver qu tinciones sern necesarias hacer.
Se pondr la fecha en la que se recibe la muestra en el laboratorio (fecha de recepcin)
Se har, cuando sea necesario, una descripcin macroscpica de las muestras, segn el
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protocolo de procesado de cada tipo de muestra.
5.3. PROCESADO GENERAL DEL MATERIAL CITOPATOLGICO
El procesado o preparacin de la muestra para el examen microscpico, comprende
tres fases:
- Extensin
- Fijacin
- Tincin
EXTENSIN
En el laboratorio de citopatologa la realiza el tcnico especialista cuando no ha
sido realizada por el clnico.
MODO DE OPERAR (en el laboratorio)
1- ORINA
Existe una hoja para recogida de orina que el paciente debe conocer.
En el laboratorio, en caso de muestras con escasa celularidad, como es el caso de la
orina, se ha utilizado durante mucho tiempo, la tcnica del Nucleopore:
- Instalar una jeringa sobre el soporte del nucleopore
- Aadir sobre l unas gotas de suero salino o fisiolgico
- Despus colocar una jeringa de 20 mL y aadir por orden:
- 20 mL de orina
- 20 mL de suero
- 20 mL de OH al 50 %
PRECAUCIN: se debe quitar la jeringa completa y extraer fuera el mbolo, para
evitar aspirar clulas
- Desmontar el soporte y colocar el filtro, dndole la vuelta, sobre un porta,
impregnado en polilisina, secndolo suavemente con papel
- Introducir el porta en:
- OH 96 5 minutos
- Cloroformo (triclorometano) 40 minutos, para que se
disuelva el filtro
- OH 96 30 minutos
- Tincin PP
El resultado final, es la obtencin de la extensin de clulas presentes en orina sobre el
porta.
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En muchos laboratorios de Anatoma Patolgica, se est dejando de usar la tcnica del
nucleopore. Otra forma de procesarla sera; utilizar una centrfuga convencional para
obtener un concentrado celular (sedimento) y a continuacin usar la citocentrfuga para
obtener la extensin de clulas y por ltimo teir.
2- ESPUTO
- Existe una hoja de instrucciones para la recogida del esputo
- Recoger tres esputos de tres das consecutivos, en frascos separados,
indicando 1, 2 y 3 esputo
- Guardar en frigorfico y llevar al laboratorio el tercer da
- Descripcin macroscpica
- Interesante observar la presencia y tomar muestras
- reas hemorrgicas
- Fragmentos de tejido
- reas decoloradas
- Se extiende el material seleccionado con otro portaobjetos
- Fijar inmediatamente en OH 96
- Lavar despus con agua destilada durante 20 min
- Secar al aire antes de teir
- Teir con PP
En caso de esputos muy espesos, se utiliza la tcnica del Saccomano para la
fluidificacin de esputos.
- Se utiliza una solucin de Carbowax (PEG). Se hace a partes iguales (esputo y
carbowax), se deja fijndose al menos 1 hora.
- Se quita el fijador sobrenadante, dejando una mnima cantidad.
- Se ponen los tres esputos en el vaso del homgeneizador (se bate la mezcla). El
material aparece homogeneizado en un grumo fino.
- Centrifugando en centrfuga convencional y recogiendo el sedimento que se
extiende en un porta ( se hacen tres extensiones)
- Fijar en OH 95 1 hora
- Sumergir en agua 15 minutos
- Secar al aire
- Teir con PP
3- ASPIRADO BRONQUIAL O BRONCOASPIRADO (BAL)
a) Si el material es mucoide-compacto se procede en su manejo igual que con
un esputo.
b) En caso de que el material se ms lquido: centrifugacin. A continuacin se
realiza la extensin del material precipitado.
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4- LAVADO BRONCOALVEOLAR (BAL)
- Se reciben aproximadamente 20 mL de muestra
- Centrifugar todo el lquido y decantar el sobrenadante
- Citocentrifugar el precipitado o sedimento
5- LQUIDOS
- Descripcin macroscpica de todos los lquidos
- Mtodo de lisar hemates: para lquidos muy hemorrgicos
- Fijar en OH 96 15-20 minutos
- Introducir en fijador de Carnoy
- OH 96 de nuevo
- Tcnica del bloque celular
- Incluir en parafina cualquier cogulo o material slido presente en la
muestra y hacer estudio histolgico posterior
- LCR
- Citocentrfuga durante 20 minutos
- Otros lquidos
- Citocentrfuga
6- CEPILLADOS Y EXUDADOS
Se reciben como extensiones fijadas en OH 96 o con spray, especificando el n de
ellas
Se procesan como las extensiones hmedas de esputo
a. Alcohol de 96
b. Agua destilada 15 20
c. Secar al aire (teir PP)
7- CITOLOGA CERVICO-VAGINAL
- Se reciben como extensiones, habitualmente fijadas con spray especial (citospray)
- Antes de teir, se dejan sumergidas en OH 96, al menos 1 hora
- Tincin PP
FIJACIN
Despus de la prefijacin hay que continuar con el proceso de fijacin
propiamente dicho.
Podemos fijar en:
Solucin ter/alcohol al 96% a partes iguales
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Es un proceso que se utiliza desde los tiempos de Papanicolaou por sus excelentes
resultados, sobre todo tipo de materiales.
En la actualidad est en desuso por las peligrosas caractersticas qumicas del ter.
Alcohol etlico al 96%
Es el ms empleado en los laboratorios de citopatologa, ya que, en general,
produce excelentes resultados. El proceso de fijacin es similar al del ter/alcohol
y consiste en sumergir la extensin en un bao de una sustancia, como mnimo durante
15-20 minutos. El tiempo mximo de permanencia no est definido, ya que las clulas
no se alteran aunque se prolongue durante das o semanas, en caso de periodos
superiores, conviene que los baos con las extensiones permanezcan cerrados y en el
interior del frigorfico.
Otros alcoholes
Pueden utilizarse otros alcoholes de diferente graduacin, los ms
recomendados son:
- Metanol al 100%
- Isopropanol al 80%
Fijacin mediante citospray
Es un fijador en forma de aerosol, que se aplica al material a fijar
inmediatamente despus de extendido sobre el porta.
Es muy utilizado por su simplicidad y buenos resultados.
Se aplica directamente sobre la extensin colocando el aerosol a 25-30 cm de distancia y
dejando secar al aire libre.
Antes de proceder a la tincin debe extraerse el aerosol sumergiendo el porta en
etanol al 96%.
A veces, si el lquido del aerosol es soluble en agua la extensin puede ser teida
inmediatamente, con lo que los tiempos del procesado se acortan.
Otros fijadores de efecto anlogo al citospray
a) Laca del pelo que tenga elevado contenido en alcohol y escaso contenido en
lanolinas o aceites. Sin embargo este tipo de lacas tiene una serie de desventajas ya que
suele tener otros componentes que pueden interferir en la captacin del colorante.
b) Fijadores que pueden ser preparados en el propio laboratorio. ( por ejemplo soluciones
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de polietilenglicol 2% en alcohol de 95).
TINCIN
Consiste en aplicar diversas combinaciones de sustancias colorantes a las extensiones
previamente fijadas.
En citologa exfoliativa el mtodo ms recomendado es el de Papanicolaou, el cual
contiene un colorante que pone de manifiesto la cromatina nuclear y otras sustancias que
tienen afinidad tintorial por los componentes citoplasmticos.
5.4. COLORANTES PARA ESTUDIOS CITOLGICOS
Dentro de la amplia gama de colorantes citolgicos que existen, actualmente se
prefiere como tinciones de rutina las de carcter policromtico, que permiten
diferenciar diversos matices en la estructura celular a teir.
La citologa exfoliativa, y en especial la ginecolgica, recomiendan como mtodo el
Papanicolaou.
A. TINCIN DE PAPANICOLAU (PAP O PP)
Fue introducida en 1925, utiliza hematoxilina (Hx) como colorante nuclear y
diversas mezclas de colorantes citoplamticos como el naranja G, la eosina, el verde luz
SF y el pardo Bismark.
Esto le proporciona una gran cromaticidad y transparencia, permitiendo la
diferenciacin de los detalles citolgicos en los que se basa el diagnstico. Hay muchas
modificaciones en relacin al protocolo de tincin, depende de cada laboratorio.
HEMATOXILINA
La ms utilizada es la Hx de Harris sin acidificar con cido actico. Es el colorante
de la estructura nuclear proporcionando color azul oscuro.
NARANJA G
Junto con la EA, constituye el colorante citoplasmtico. Aunque la preparacin de
la solucin puede realizarse en el laboratorio, se encuentra comercializado bajo el
nombre de OG-6. Los eritrocitos tambin se tien de naranja intenso.
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SOLUCIN DE EOSINA ALCOHLICA (EA)
Adems de este colorante, contienen cantidades variables de verde luz SF y pardo
Bismark.
Se encuentra ya diluido constituyendo las mezclas EA-36, EA-50, EA-65.
Tcnica de PP, segn protocolo de tincin.
Resultado de la tincin:
Ncleos: entre azul y morado
Dependiendo del tipo de clulas. Citoplasmas eosinfilos: rosas y Citoplasmas
basfilos: azul
Hemates: naranjas
Actualmente existen sistemas automticos de tincin que simplifican el mtodo,
aunque los resultados son algo inferiores a los manuales. Pero dado el volumen de
trabajo en los laboratorios este sistema se est imponiendo progresivamente.
B. COLORACIN DE MAY-GRUNWALD-GIEMSA
La utilizan la mayor parte de los citlogos que estudian preparaciones de citologa
por puncin-aspiracin (PAAF).
Consiste en la combinacin de dos coloraciones sucesivas, la de May- Grnwald y la de
Giemsa.
Esta tcnica presenta algunas ventajas con respecto a los mtodos clsicos de PAP y
Hx-eosina para la percepcin de los finos detalles citolgicos sobre los que se sustentan
el diagnstico de la malignidad (Esta tincin resalta detalles del citoplasma como la
mucina y los distintos componentes del fondo, como el colgeno)
Tcnica de May-Grinwald-Giemsa , segn protocolo de tincin.
Resultados de la tincin:
Grnulos neutrfilos: rosa
Grnulos eosinfilos : Marrn rojizo
Grnulos basfilos: prrpura
Nucleolos: rosas
Eritrocitos maduros: naranja, rosado
Ncleos celulares: azul violceo
Citoplasma: azul claro a rosa.
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C. DIFF-QUIK (DQ)
Se trata de una tincin rpida cuyos reactivos estn comercializados, lo que
facilita su empleo.
Secar al aire (El fijador est incluido en kit de tincin). Tcnica de DQ, segn protocolo de
tincin.
Resultados:
Se obtienen las mismas tonalidades cromticas que con la tcnica de May- Grnwald-
Giemsa.
D. TINCIN DE SHORR
Es una tincin til para la evaluacin hormonal de la citologa vaginal. Para la
fijacin se prefiere alcohol 96.
Tcnica de Shorr, segn protocolo de tincin.
Resultados de la tincin:
Citoplasmas: de naranja brillante a azul verdoso
Ncleos: de azul a violeta oscuro
Bacterias: azul oscuro
Ncleos de hongos: violeta
E. GIEMSA
Tambin para la fijacin se prefiere alcohol 96. El colorante Giemsa es una
mezcla de derivados tiacnicos destinados a teir ncleos celulares y de eosina para
colorantes citoplasmticos. El fundamento de la tcnica es igual que el Giemsa que se
utiliza en tinciones histolgica, siendo los resultados los mismos. Tcnica de Giemsa,
segn protocolo de tincin.
Resultados de la tincin:
Ncleos: azul violceos
Citoplasmas y conjuntivo: tonos rosas
Eritrocitos: salmn
Ruickettsias: Violeta
Grnulos de eosinfilos: rojo anaranjado
Procesado de tejidos y citopreparacin Histoqumica
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HISTOQUMICA
1. INTRODUCCIN ...............................................................................................................1
1.1. ASPECTOS TCNICOS ............................................................................................. 2
2. HISTOQUMICA DE HIDRATOS DE CARBONO ...................................................... 3
2.1. TINCIONES PARA HIDRATOS DE CARBONO. ................................................... 5
2.1.1. TINCIN DE PAS .............................................................................................. 5
2.1.2. PLATA METENAMINA ...................................................................................... 6
2.1.3. LA TCNICA DE GOMORI MODIFICADO .................................................... 6
2.1.4. TINCIONES PARA MUCOPOLISACRIDOS CIDOS ( MPSA ). ............. 6
2.1.5. TINCIONES PARA MPSA, MPSN ( NEUTROS ) Y GLUCOPROTENAS. . 7
3. HISTOQUMICA DE PROTENAS Y CIDOS NUCLEICOS. .................................. 7
4. MTODOS DE TINCIN PARA PIGMENTOS E IONES METLICOS .................. 7
4.1. TINCIONES PARA PIGMENTOS HEMOGLOBINBENOS ............................... 8
4.2. TINCIONES PARA PIGMENTOS NO HEMOGLOBINBENOS ...................... 9
1. INTRODUCCIN
Las tcnicas histoqumicas comprenden el conjunto de mtodos empleados para
la demostracin de la naturaleza qumica de los componentes tisulares y celulares.
Se recurre al empleo de estas tinciones histoqumicas cuando se pretende visualizar
especficamente una sustancia determinada.
El objetivo de la histoqumica es
- poner de manifiesto una molcula o familia de molculas presentes en una seccin
histolgica
- y estudiar su distribucin tisular "in situ
Los mtodos histoqumicos se basan, en hacer reaccionar qumicamente
determinados reactivos con los componentes celulares o tisulares que
queremos demostrar para obtener un producto final que es coloreado y
puede verse con el microscopio
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Estas molculas son difcilmente discernibles con colorantes generales
Existen tinciones o mtodos histoqumicos especficos para la demostracin de:
Aminocidos
Protenas
Carbohidratos: glucgeno, mucopolisacridos
Lpidos
Pigmentos y minerales...
Cuando el objeto de estudio es una enzima, se habla de tcnicas histoenzimticas En
este caso en la incubacin ha de emplearse el sustrato sobre el cual acta el enzima.
Durante el procesado del tejido previo a la reaccin histoqumica, hay que evitar
daar a la molcula que queremos detectar, porque de otra manera obtendamos falsos
negativos, es decir, no obtener tincin cuando en realidad la molcula de inters s
est presente en el tejido, aunque deteriorada.
Para llevar a cabo cualquier tcnica histoqumica y en particular las tcnicas
histoenzimticas se requieren una serie de precauciones:
Utilizar material de vidrio extremadamente limpio
Utilizar soluciones frescas (recin preparadas) a menos que se indique lo
contrario
1.1. ASPECTOS TCNICOS
La aplicacin de tcnicas histoqumicas sobre biopsias no ofrece
generalmente problemas
No es as sobre material procedente de necropsias, sobre todo las tcnicas
histoenzimticas que a veces no funcionan correctamente, por haber
comenzado los procesos de degradacin de los tejidos
Hay que tener en cuenta la fijacin que se ha llevado a cabo, algunos
fijadores pueden interferir e impedir que se produzca la reaccin
histoqumica que se pretende
Los tejidos se procesan preferentemente
- por congelacin
- con una fijacin qumica ligera
- o incluso sin fijacin qumica alguna
La inclusin tambin puede presentar problemas, algunas tcnicas
histoqumicas y en particular las histoenzimticas no funcionan sobre
cortes en parafina
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Para las reacciones histoenzimticas es importante adems prestar especial
atencin
- al pH y
- a los tampones utilizados, algunos pueden inhibir la actividad
enzimtica mientras que otros pueden favorecerla
2. HISTOQUMICA DE HIDRATOS DE CARBONO
Los hidratos de carbono ( H d C ) son polialcoholes oxidados entre los que se
encuentran grupos aldehdos y cetonas (polihidroxialdehdos y polihidroxiacetonas)
compuestos por C, H y O.
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En Anatoma Patolgica nos interesan los polisacridos:
Los polisacridos son glcidos de molcula muy voluminosa, formada por la
condensacin de muchas molculas de monosacridos (ms de diez), con la
correspondiente prdida de molculas de agua
Entre ellos, y adems de los polisacridos simples como el glucgeno, destacan los
polisacridos complejos:
- Mucoproteinas
- Mucolpidos
- Mucopolisacridos
MUCOPROTENAS
Son complejos de protenas y polisacridos en los que predomina el primer componente
Son similares a las glucoprotenas, pero se diferencian en su mayor contenido
de hexosaminas, amino azcares formados por la adicin de un grupo amina a una
hexosa (superior al 4%)
Son PAS +
No experimentan metacromasia frente al azul de toluidina
Pueden encontrarse en:
Clulas beta de la hipfisis
Membranas basales de los epitelios
Reticulina y fibras colgenas
MUCOPOLISACRIDOS
Se distinguen en :
- NEUTROS: Son PAS+. Tienen un comportamiento similar a las mucoprotenas
- CIDOS (MPSA):
SULFATADOS O SULFOMUCOPOLISACRIDOS
- EPITELIALES: Son PAS- y Azul Alcin + a pH 1. Se encuentran en las
clulas caliciformes del colon y en glndulas salivares submaxilares.
- DE TEJIDO CONJUNTIVO: Son PAS- y Azul Alcin + a pH=0.5.
Aparecen en cartlago de vlvulas cardiacas, aorta y tambin en piel.Los
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compuestos de este tipo se llaman: condroitinsulfato, heparinsulfato,
queratinsulfato y cido glucurnico sulfatado.
NO SULFATADOS O CARBOXIPOLISACRIDOS
- EPITELIALES: Son PAS+ y Azul Alcin +. ( cido silico o sialomucinas ).
- DE TEJIDO CONJUNTIVO: Son PAS- y Azul Alcin + a pH 2.5. El
compuesto que est en mayor proporcin es el cido hialurnico.
Todos los MPSA presentan metacromasia con el AZUL DE TOLUIDINA.
MUCOLPIDOS
Formados por polisacridos y cidos grasos complejos. Se pueden teir tambin en las
tinciones de grasas. Se encuentran en Sistema Nervioso ( ganglisidos o cerebrsidos)
2.1. TINCIONES PARA HIDRATOS DE CARBONO.
El fundamento es la demostracin de grupos carbonilo (aldehdo y cetona) formados
sobre los grupos alcohol de los hidratos de carbono (HdC) por oxidacin previa.
2.1.1. TINCIN DE PAS
Consiste en oxidar los tejidos mediante el cido peridico, para obtener grupos
carbonilo, que posteriormente se van a demostrar porque se tien con el reactivo de
Schiff. Se dice que es una reaccin estequiomtrica porque a mayor cantidad de HC
mayor formacin de grupos carbonilo y mayor intensidad de color.
Los reactivos que se utilizan en esta tincin son el cido perydico (0.5%), reactivo de
Schiff cuya composicin es fucsina bsica (1 g) + agua destilada (200 mL) y bao
sulfuroso (H Cl + metabisulfito sodico + agua destilada).
La tcnica general ser segn protocolo y los resultados se vern los ncleos en
azul y todo lo que sea PAS+ se ver de color rojo oscuro, magenta.
COMPUESTOS QUE SON PAS+:
- Polisacridos simples (glucgeno, celulosa)
- Mucopolisacridos neutros (en glndulas Brunner del duodeno, epitelio gstrico
y cpsulas bacterianas)
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- Mucoprotenas (mucinas del tubo digestivo, del rbol respiratorio y bronquial,
tiroglobulina, TSH, gonadotrofinas, cuerpos de Russel de las clulas
plasmticas, megacariocitos).
- Glucoprotenas del suero, membrana basal, reticulina.
- Glucolpidos (ganglisidos, cerebrsidos).
- Pigmentos (ceroide y lipofucsina).
Compuestos PAS - que, sin embargo, son hidratos de carbono:
- Mucopolisacridos cidos: que tienen bloqueados los grupos carbonilos y no
pueden ser oxidados por el cido peridico
2.1.2. PLATA METENAMINA
El fundamento de esta tcnica es la oxidacin de los H d C mediante el cido
crmico y el cido perydico. Estos H d C oxidados reducen las sales de Ag que
contiene el reactivo, haciendo precipitar la plata metlica sobre la estructura a teir.
La sal de plata empleada es el complejo metenamina argntica
Es inestable y slo se mantiene como tal a pH alcalino entre 8.3 y 9.2, fuera de
ste se disocia en sus dos componentes
La tcnica debe realizarse con un control continuo de pH, de modo que la
precipitacin de la plata mtalica no ocurra anticipadamente
Por sus caractersticas especiales, esta tcnica se emplea para visualizar
membranas basales
sobre todo en el rin (glomerulonefritis), compuestas en gran medida por
hidratos de carbono del tipo glicoprotenas y que, por tanto, son adems PAS +
2.1.3. LA TCNICA DE GOMORI MODIFICADO
Es una variante de la plata metenamina. Lo que correspondera a PAS+ se teir de
negro: glucgeno, mucina, hongos, membranas basales, reticulina y elastina.
2.1.4. TINCIONES PARA MUCOPOLISACRIDOS CIDOS ( MPSA ).
La tincin que ms se utiliza es el AZUL ALCIAN. Este es la tincin ms
especifica para MPSA y en ella se utilizan colorantes de carcter bsico que se unen a
los grupos cidos de los MPSA dando lugar a la formacin de un compuesto salino,
sobre todo cuando el pH del medio es cido. En general, a pH=2.4 2.6 el azul alcin
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colorea todos los MPS. Si el pH disminuye, por ejemplo pH=1, se colorean los MPS
sulfatados y si se desciende hasta pH=0.5 se incrementa la selectividad de la tincin y
se tien solamente los MPSA ms sulfatados.
El procedimiento se hace segn protocolo del kit y, en general, obtenemos con esta
tincin el color azl dependiendo del pH:
- pH 2.5 casi todos los MPSAAzul
- pH 1, los MPSA sulfatados Azul
- pH 0.5, los MPSA fuertemente sulfatadosAzul
La otra tincin empleada para los MPSA es la METACROMTICA. El colorante ms
usado para esta tincin es el AZUL DE TOLUIDINA, con l los resultados se vern los
ncleos y el fondo azul y todas las estructuras de carcter metacromtico en
distintas tonalidades de rojo.
2.1.5. TINCIONES PARA MPSA, MPSN ( NEUTROS ) Y
GLUCOPROTENAS
Se utiliza la tincin combinada de AZUL ALCIAN-PAS.
Una vez tedos, los MPSA de azul, ya que se tien con el azul alcin y los MPSN y
glucoproteinas se tien de rojo, pues se tien con el PAS.
3. HISTOQUMICA DE PROTENAS Y CIDOS NUCLEICOS.
Actualmente se hace por tcnicas inmunohistoqumicas (IHQ) y solo queda vigente la
tcnica de FEULGEN para ADN. Tcnica que se realiza en 2 fases:
1) consiste en una hidrlisis cida que rompe la estructura del ADN
2) demostracin de los grupos carbonilo que se hace mediante reaccin de Schiff de
forma similar a lo que ocurre en la tcnica de PAS.
Los resultados se ven el ADN en rojo prpura y los citoplasmas en verde.
Es una reaccin estequiomtrica y cuantitativa, es decir, a mayor cantidad de ADN
mayor intensidad de color y esta intensidad se puede medir o cuantificar, mediante un
programa informtico. Es una tcnica que se utiliza para tcnicas de anlisis digital de
imgenes por densitometra.
4. MTODOS DE TINCIN PARA PIGMENTOS E IONES METLICOS
Los pigmentos son sustancias coloreadas que existen de forma natural, es
decir, que por s mismas tienen color.
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A veces es necesario realizar tcnicas especficas para identificar un
determinado pigmento detectado en una preparacin histolgica rutinaria.
El problema que plantean la mayor parte de los pigmentos, a excepcin de la
hemoglobina, es la similitud de su color, normalmente pardo. Esto hace importante su
identificacin mediante diferenciacin histoqumica.
Tipos de pigmentos:
Artefactuales (provocan la aparicin de artefactos en las tinciones)
Pigmentos exgenos
Pigmentos endgenos
ARTEFACTOS: se consideran como tal aquellos que son debidos a sustancias
procedentes de los fijadores que se utilizan en el proceso, sobre todo el pigmento
formlico, aunque tambin pueden aparecer restos de Hg, Ag o plomo pertenecientes
a otros fijadores. Son ajenos a la muestra.
Los pigmentos EXGENOS son aquellos de externo debido a tatuajes, inhalacin del
humo del tabaco, polvo de carbn o slice y que aparecen en la muestra procedente del
propio pacientes, del ambiente o del tcnico.
Los ENDGENOS son los procedentes del interior del organismo. Pueden ser
hemoglobingenos (procedentes de la hemoglobina)
no hemoglobingenos
4.1. TINCIONES PARA PIGMENTOS HEMOGLOBINBENOS
TINCIN BENCIDINA: resultados ncleos en azul y la hemoglobina (Hb) y los
eritrocitos en verde. Se trata de una reaccin tipo peroxidasa. La hemoglobina
acta sobre el H
2
O
2
liberando O
2
; ste, oxida a la bencidina (incolora) produciendo
pigmentacin verdosa
TINCIN PERLS: es una pigmentacin para depsitos de hierro, iones frricos,
tambin conocidos estos depsitos como hemosiderina. Resultados: Fe en azul y los
ncleos en rojo
TINCION DE GMELIN para hematoidina (Hb sin Fe) y bilirrubina.
Tcnica:
- Desparafinar e hidratar
- Colocar un cubre sobre el porta sin montar con medio de montaje
- Poner unas gotas de cido ntrico diluido en el limite entre el cubre y el
porta
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- Por accin del ntrico, la bilirrubina y la hematoidina se van
transformando y cambian de color, de amarillo pardusco a verde, azul y
finalmente, rojo prpura
- Todo el proceso se debe observar inmediatamente al microscopio nada
ms aadir el cido ntrico.
TECNICA DE HALL para la deteccin de bilirrubina:
En esta tcnica, entre otros, se emplea la picrofucsina de Van Gieson, por lo que se
obtienes tonos muy variados
Resultados:
Bilirrubina: verde
Colgena: rojo
Msculo, clulas epiteliales y eritrocitos: amarillo
4.2. TINCIONES PARA PIGMENTOS NO HEMOGLOBINBENOS
Melanina
Lipofucsina
Pigmento ceroide
Determinacin de Ca
Determinacin de Cu
MELANINA:
MASSON FONTANA: grisceo-negruzco.
DECOLORACIN DE LA MELANINA: se hace con permanganato potsico o
H
2
O
2
.
FLUORESCENCIA: que se produce al tratar los tejidos que contienen
depsitos de melanina con paraformaldhedo Esto da lugar a una
autofluorescencia amarilla tpica. Observar con microscopio de fluorescencia.
LIPOFUCSINA Y PIGMENTO CEROIDE:
La lipofucsina es un pigmento amarillo pardo que aparece en las clulas viejas
del Sistema Nervioso, msculo cardaco, hgado y glndulas suprarrenales. El pigmento
ceroide es un producto anterior a la lipofucsina.
Mtodos no especficos que permiten diferenciar ambos pigmentos:
Tcnicas para lpidos, como el Sudn negro: la lipofucsina es + por su alto
contenido en lpidos.
PAS: la lipofucsina es PAS+ debido a que tiene restos de hidratos de carbono
Tcnica de Schmorl: adems de la lipofucsina, tie melanina, pigmento biliar.
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DETERMINACIN DE CALCIO:
Las sales de calcio estn presentes normalmente en huesos y dientes, pero en
ocasiones aparecen reas calcificadas en tejidos que en principio no estn
calcificados.
ROJO ALIZARINA S: especfica para determinar Ca. Es muy importante que
el pH del colorante est entre 4.1-4.3. Para ello se le incorpora un tampn
acetato.
TINCION DE VON KOSSA
- Resultados:
- Hueso y calcificaciones: negro
- Osteoide y ncleos: rojo
DETERMINACIN DE COBRE:
El cobre se encuentra casi exclusivamente en hgado y crnea. Suele unirse al cido
rubenico por lo que se emplea para detectarlo.
TINCIN. CIDO RUBENICO: especfica para hacer un diagnstico de la
enfermedad de Wilson, donde se acumula cobre, sobre todo en hgado y crnea.
Los depsitos de cobre se ven como granulaciones de verdes a negras.