Tesis 68

PROPAGACIN in vitro A PARTIR DE MERISTEMOS DE CINCO
VARIEDADES COMERCIALES DE Dianthus caryophyllus L. (clavel)

ANA MARA AFANADOR PREZ

TRABAJ O DE GRADO
Presentado como requisito parcial para obtener el ttulo de

BIOLOGA

DIRECTORA
CLAUDIA RAMIREZ SANDOVAL
Unidad de Biotecnologa Vegetal

PONTIFICIA UNIVERSIDAD J AVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BIOLOGA
BOGOTA, DC.
J unio de 2005
Bogot, Agosto 5 de 2005

Seores
PONTIFICIA UNIVERSIDAD J AVERIANA
Bogot

Estimados Seores:

Yo Ana Mara Afanador, identificada con C.C. No. 52.928.051 de Bogot, autor del trabajo de grado
titulado Propagacin in vitro a partir de meristemos de cinco variedades comerciales de Dianthus
caryophyllus l. (clavel), presentado como requisito para optar al ttulo de Biloga en el ao de 2005;
autoriz a la Universidad J averiana a:

a) Reproducir el trabajo en medio digital o electrnico con el fin de ofrecerlo para la consulta en la
Biblioteca General. Si

b) Poner a disposicin para la consulta con fines acadmicos, en la pgina web de la Facultad, de
la Biblioteca General y en redes de informacin con las cuales tenga convenio la Universidad
J averiana. Si

c) Enviar el trabajo en formato impreso o digital, en caso de que sea seleccionado para participar
en concursos de trabajos de grado. Si

d) Distribuir ejemplares de la obra, para la consulta entre las entidades educativas con las que la
facultad tenga convenio de intercambio de informacin, para que este sea consultado en las
bibliotecas y centros de documentacin de las respectivas entidades. No

e) Todos los usos, que tengan finalidad acadmica. Si

Los derechos morales sobre el trabajo son de los autores de conformidad con lo establecido en el
artculo 30 de la Ley 23 de 1982 y el artculo 11 de la Decisin Andina 351 de 1993, los cuales son
irrenunciables, imprescriptibles, inembargables e inalienables. Atendiendo lo anterior, siempre que
se consulte la obra, mediante cita bibliogrfica se debe dar crdito al trabajo y a su(s) autor(es).
Este documento se firma, sin perjuicio de los acuerdos que el autor(es) pacte con la Unidad
Acadmica referentes al uso de la obra o a los derechos de propiedad industrial que puedan surgir
de la actividad acadmica.

___________________________
Ana Mara Afanador
C.C 52.928.051 de Bogot

FORMATO DESCRIPCIN TRABAJO DE GRADO

Afanador Prez, Ana Mara
AUTOR

Ramrez Sandoval, Claudia
DIRECTORA

TRABAJO PARA OPTAR POR EL TTULO DE: Biloga

TTULO COMPLETO DEL TRABAJO: Propagacin in vitro a partir de meristemos de cinco
variedades comerciales de Dianthus caryophyllus l. (clavel)

FACULTAD DE CIENCIAS

PROGRAMA: Carrera X Especializacin ____ Maestra ____ Doctorado ____

NOMBRE DEL PROGRAMA: Biologa

CIUDAD: BOGOTA, 2005

NMERO DE PGINAS: 137

TIPO DE ILUSTRACIONES:

Tablas, grficos y diagramas
Fotografas

DESCRIPTORES O PALABRAS CLAVES.

CarMV, cultivo in vitro de meristemos, Dianthus caryophyllus, variedades comerciales

RESUMEN DEL CONTENIDO

El presente trabajo tuvo como objetivo desarrollar una metodologa para la micropropagacin de
cinco variedades comerciales de Dianthus caryophyllus L. (clavel), a partir de meristemos apicales.
Adicionalmente se analizaron las concentraciones del virus moteado del clavel (CarMV) en tejido
vegetal de cinco variedades mediante la utilizacin de la prueba de ELISA luego de haber recibido
los mtodos de termoterapia y cultivo in vitro de meristemos y la combinacin de ambos. Se
evaluaron las tasas de prdida y las de velocidad de multiplicacin para cada variedad con el fin de
determinar el comportamiento de cada una en condiciones in vitro. En la fase de establecimiento in
vitro se confirm que la variedad se asocia con la tasa de prdida; y con la presencia de
microorganismos, vitrificacin y oxidacin de los explantes. Durante la fase de multiplicacin in
vitro, la tasa de velocidad de multiplicacin aumento en el segundo 2 ciclo de propagacin,
dejando de manifiesto el aumento de la capacidad morfognetica a travs de los subcultivos.
Durante la etapa de induccin de races se evidenci la capacidad rizognetica de las variedades.
El comportamiento de cada variedad durante las etapas fue diferente por lo que se concluye que la
respuesta es especfica para cada genotipo. Se estableci la presencia del virus en las 5
variedades estudiadas. La concentracin del virus se redujo utilizando el tratamiento combinado de
termoterapia y cultivo in vitro de meristemos.

NOTA DE ADVERTENCIA

Articulo 23 de la resolucin No 13 de J ulio de 1946

La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos tesis. Solo velar por que no se publique nada
contrario al dogma y a la moral catlica y por que las tesis no contengan
ataques personales contra persona alguna, antes se vea en ellas el anhelo
de buscar la verdad y la justicia

2



APROBADO

Claudia Ramrez Sandoval, MSc
Directora

Ivn Cruz Daniel Zapata
Ingeniero Agrnomo Ingeniero Industrial
J urado J urado
3



Angela Umaa, MPhil Carmen Cecilia Espndola, MSc
Decana Acadmica Directora de la Carrera de Biologa
Facultad de Ciencias Facultad de Ciencias

4

A mi Familia y Nicols por todo su amor y comprensin

5

AGRADECIMIENTOS

A Germn Meja por su inters y apoyo y a la empresa Colibr Flowers por el
suministro del material vegetal para el desarrollo del trabajo.
A Claudia Ramrez, MSc, investigadora de la Unidad de Biotecnologa
Vegetal de la Universidad J averiana por la direccin tcnica y cientfica y el
constante apoyo durante la realizacin del trabajo.
A J uan Carlos Vaca, PhD, investigador de la Unidad de Biotecnologa
Vegetal de la Universidad J averiana por la asesora en el rea de virologa
vegetal.
A Dagoberto Castro, PhD, investigador de la Universidad Catlica de Oriente
(Rionegro Antioquia) por la asesora durante la ejecucin del trabajo.
A J hon Alexander Zambrano e Ivn Cruz por el apoyo durante la fase de
laboratorio.
A Nixon y J orge por su colaboracin durante la fase de laboratorio.
A J enny Milena Escobar por su asesora y realizacin del anlisis estadstico.
A mis padres y hermanos por el constante apoyo, nimo, tiempo y
comprensin durante la realizacin del trabajo.
A Nico por la total entrega, dedicacin, comprensin, apoyo y presencia en
todo momento.
A la familia Fernndez por el apoyo y colaboracin a lo largo del trabajo.

J UNIO DE 2005

6
TABLA DE CONTENIDO

RESUMEN...16

ABSTRACT.17

1. INTRODUCCION ............................................................................................ 18
2. MARCO TERICO Y REVISIN DE LITERATURA...................................... 20
2.1 Dianthus caryophyllus l. (Clavel) ............................................................... 20
2.1.1 CLASIFICACIN BOTNICA......................................................................... 20

2.1.2 DESCRIPCIN BOTNICA........................................................................... 20

2.1.3 ORIGEN E HISTORIA.................................................................................. 21

2.1.4 ZONAS DE PRODUCCIN ........................................................................... 22

2.1.5 VARIEDADES ............................................................................................ 22

2.1.6 CULTIVO Y PRODUCCIN........................................................................... 23
2.1.6.1 Factores ambientales que influyen sobre la produccin ................. 24
2.1.6.1.1 Temperatura 24
2.1.6.1.2 Suelo 24
2.1.6.1.3 Riego 24
2.1.6.1.4. Nutrientes 24

2.1.7 PLAGAS Y ENFERMEDADES ....................................................................... 25
2.1.7.1 Plagas.............................................................................................. 25
2.1.7.1.1 caros 25
2.1.7.1.2 fidos 26
2.1.7.1.3 Trips 26
2.1.7.1.5 Nemtodos 26

2.1.7.2 Enfermedades causadas por hongos y bacterias ........................... 27
2.1.7.2.1 Marchitamiento vascular 27
2.1.7.2.2 Botritis 27
2.1.7.2.3 Roya del clavel 27
2.1.7.2.4 Mancha foliar 28

2.1.7.3 Enfermedades causadas por virus .................................................. 28
2.1.7.3.1 Virus del mosaico de las nerviaciones del clavel (CaVM) 28
2.1.7.3.2 Virus del jaspeado del clavel (CaERV) 29
2.1.7.3.3 Virus de la mancha anular del clavel (CaRSV) 29
vii
2.1.7.3.4. Virus del moteado necrtico del clavel (CaNFV) 29
2.1.7.3.5 Virus moteado del clavel (CarMV) 30
2.1.7.3.5.1 Clasificacin....................................................................... 30
2.1.7.3.5.2 Historia y distribucin......................................................... 30
2.1.7.3.5.3 Transmisin....................................................................... 30
2.1.7.3.5.4 Citopatologa...................................................................... 30
2.1.7.3.5.5 Sintomatologa del clavel................................................... 31
2.1.7.3.5.6 Rango natural de hospederos ........................................... 31

2.1.7.4 Tcnicas para la deteccin de virus 31
2.1.7.4.1 Pruebas biolgicas ............................................................... 32
2.1.7.4.2 Citopatologa......................................................................... 32
2.1.7.4.3 Inmunoabsorbancia en microscopio electrnico (ISEM) ...... 32
2.1.7.4.4 Prueba inmunoenzimtica (ELISA)....................................... 33
2.1.7.4.5 Hibridacin molecular........................................................... 34
2.1.7.4.6 Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)....................... 34
2.1.7.5 Control de virus ........................................................................... 35
2.1.7.5.1 Quimioterapia ....................................................................... 36
2.1.7.5.2 Termoterapia ........................................................................ 36

2.2 CRECIMIENTO Y DESARROLLO................................................................ 37
2.2.2 ZONAS DE CRECIMIENTO MERISTEMOS ................................................. 38
2.2.3 REGULADORES DE CRECIMIENTO .............................................................. 40
2.2.2.1 Auxinas............................................................................................ 40
2.2.2.2 Citoquininas..................................................................................... 41

2.3 CULTIVO IN VITRO DE MERISTEMOS....................................................... 43
2.3.1 ETAPAS DEL CULTIVO DE MERISTEMOS IN VITRO......................................... 46
2.3.1.1 Etapa 0: Etapa preparativa.............................................................. 46
2.3.1.2 Etapa I: Establecimiento del explante ............................................. 46
2.3.1.3 Etapa II: Multiplicacin y elongacin de brotes ............................... 47
2.3.1.4 Etapa Enraizamiento in vitro............................................................ 47
2.3.1.5 Etapa IV: Aclimatacin del material obtenido in vitro ...................... 48

2.3.2 PROBLEMAS ASOCIADOS AL CULTIVO IN VITRO........................................... 48
2.3.2.1 Contaminacin................................................................................. 48
2.3.2.2 Oxidacin......................................................................................... 49
2.3.3.2 Vitrificacin hiperhidratacin......................................................... 50
2.3.3.2.1 Posibles causas de la hiperhidratacin 51
2.3.3.2.2 Factores que influyen en la hiperhidratacin 51
2.3.3.2.3 Signos 52

2.4 MICROPROPAGACIN DE CLAVEL ................................................................. 52

viii
3. FORMULACIN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIN................................ 56
3.1 FORMULACIN DEL PROBLEMA..................................................................... 56
3.2 J USTIFICACIN DE LA INVESTIGACIN........................................................... 56

4. OBJETIVOS.................................................................................................... 58
4.1 OBJ ETIVO GENERAL..................................................................................... 58
4.2 OBJ ETIVOS ESPECFICOS ............................................................................. 58

5. MATERIALES Y MTODOS.......................................................................... 59
5.1 DISEO DE LA INVESTIGACIN...................................................................... 59
5.1.1 Diseo experimental del Componente I. Atenuacin del CarMV........ 60
5.1.2 Diseo Experimental del Componente II. Proceso de Micropropagacin
del Material Vegetal ..................................................................................... 61
5.1.3 Poblacin de estudio y muestra ......................................................... 62
5.1.4 Variables del estudio. ......................................................................... 63
5.4.1.1 Componente I. Atenuacin del CarMV 63
5.4.1.2 Componente II. Proceso de Micropropagacin del Material Vegetal
64

5.2 MTODOS ................................................................................................... 66
5.2.2 Termoterapia ...................................................................................... 68
5.2.3 Deteccin de partculas virales........................................................... 69
5.2.3 Micropropagacin del Material Vegetal .............................................. 71
5.2.3.1 Establecimiento de meristemos in vitro 72
5.2.3.1.1 Desinfestacin...................................................................... 72
5.2.3.1.2 Obtencin y siembra del explante ........................................ 72
5.2.3.1.3 Medio y condiciones fsicas del cultivo................................. 73
5.2.3.2 Propagacin in vitro 73
5.2.3.3 Enraizamiento in vitro 74

5.3 RECOLECCIN DE LA INFORMACIN............................................................. 74

5.4 ANLISIS DE LA INFORMACIN...................................................................... 75
5.4.1. Componente I. Atenuacin del CarMV.............................................. 75
5.4.1.1Prueba no paramtrica de Kruskall Wallis 75
5.4.1.2 Prueba de Rango Mltiple Duncan 76
5.4.2 Componente II. Proceso de micropropagacin ................................. 76
5.4.2.1 Anlisis de Varianza (ANOVA) 76
5.4.2.2 Prueba de Rango Mltiple Duncan 77

6. RESULTADOS Y DISCUSIN ....................................................................... 78
6.1 COMPONENTE I. ATENUACIN DEL CARMV .................................................. 78

ix
6.2 COMPONENTE II. PROCESO DE MICROPROPAGACIN DEL MATERIAL VEGETAL83
6.2.1 Establecimiento in vitro de meristemos .............................................. 86
6.2.2 Propagacin in vitro............................................................................ 89
6.2.2.1 Ciclo de multiplicacin 1 89
6.2.2.2 Ciclo de multiplicacin 2 91
6.2.2.3 Efecto de la concentracin de agar en la hiperhidratacin 95
6.2.3 Fase de Enraizamiento in vitro........................................................... 97
6.2.4 Comportamiento de las variedades a travs del tiempo................... 101
6.2.5 Clculo del potencial productivo....................................................... 106

7. CONCLUSIONES ......................................................................................... 109

8. RECOMENDACIONES................................................................................. 111

9. LITERATURA CITADA................................................................................. 112

x
LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Requerimientos nutricionales del clavel......................................................25

Tabla 2. Componente I. Mtodos empleados para la atenuacin del CarMV...........59

Tabla 3. Componente II. Fases del proceso de micropropagacin...........................60

Tabla 4. Niveles del Factor 1 (mtodos de atenuacin del CarMV) del componente I
..................................................................................................................................60

Tabla 5. Niveles del Factor 2 (variedades) del componente I...................................61

Tabla 6. Niveles del Factor 1 (variedades) del componente II..................................62

Tabla 7. Poblacin y variables del estudio en cada etapa del proceso de
micropropagacin......................................................................................................63

Tabla 8. Tratamientos evaluados en la fase de enraizamiento.................................74

xi
LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Esquejes de Dianthus caryophyllus, durante la etapa de enraizamiento en
los invernaderos de la empresa floricultora...............................................................67

Figura 2. Esquejes de cinco variedades de clavel durante el mtodo de termoterapia
en una Cmara de crecimiento (fitotron) a temperatura constante de 38C.
Instalaciones de la Unidad de Biotecnologa Vegetal PUJ ........................................68

Figura 3. Metodologa empleada para la atenuacin del CarMV .............................70

Figura 4. Esquema de las fases realizadas en condiciones in vitro. Establecimiento
de meristemos, multiplicacin y enraizamiento. Medio Murashige & Skoog (MS).
Kinetina (Kin), Acido indolactico (AIA).....................................................................71

Figura 5. Meristemo apical del esqueje de Dianthus caryophyllus. A. Meristemo
ubicado en el cono primordial del esqueje. B. Meristemo apical extraido del esqueje.
..................................................................................................................................73

Figura 6. Resultados de la prueba DAS ELISA, en las cinco variedades y con
cada mtodo de atenuacin de virus, a partir de los valores promedio de
absorbancia (nm). .....................................................................................................79

Figura 7. Efecto de los mtodos para la atenuacin del virus moteado de clavel
(CarMV) en esquejes de cinco variedades de clavel. ...............................................81

Figura 8. Porcentaje de supervivencia de los esquejes sometidos a termoterapia.83

Figura 9. Nmero de brotes desarrollados y perdidos para cada variedad en el
proceso de micropropagacin...................................................................................85

Figura 10. Esquejes de la variedad Picote Vanesa luego de ser sometidos al
mtodo de termoterapia. A) Grupo I. B) Grupo II. .....................................................86

Figura 11. Valores totales de la Tasa de Prdida (TP) en la fase de establecimiento
in vitro de las 5 variedades de Dianthus caryophyllus...............................................87

Figura 12. Valores totales de la Tasa de Prdida (TP) en la fase de
establecimiento in vitro de las 5 variedades de Dianthus caryophyllus.....................88

Figura 13. Tasa de multiplicacin en el ciclo de propagacin 1, para las variedades
Mercedes, Orange Bri, Picote Vanesa y White Sim de Clavel..................................90

Figura 14. Valores totales de la Tasa de Prdida (TP) en el ciclo de multiplicacin 1
de las 5 variedades de Dianthus caryophyllus. .........................................................90

xii
Figura 15. Tasa de velocidad de multiplicacin en el ciclo de propagacin 2 para las
variedades Mercedes, Picote Vanesa y White Sim...................................................92

Figura 16. Valores totales de la Tasa de Prdida (TP) en el ciclo de propagacin 2
de las 5 variedades de Dianthus caryophyllus. .........................................................95

Figura 17. Efecto de la concentracin de agar sobre la hiperhidratacin de los
explantes de las variedades Mercedes, Picote Vanesa y White Sim durante la etapa
de multiplicacin. T1: 8 % de agar; Control: 7 % de agar. ........................................96

Figura 18. Efecto de la concentracin del medio de cultivo y del AIA sobre el
desarrollo de races (%) en las variedades: Mercedes, Picote Vanesa y White Sim.
..................................................................................................................................99

Figura 19. Comparacin del efecto de los tratamientos aplicados para la induccin
de races in vitro para cada variedad. .....................................................................100

Figura 20. Tasa de prdida en el tiempo para cada variedad................................101

Figura 21. Tasa de velocidad de multiplicacin en el ciclo de multiplicacin 1 y 2
para cada variedad..................................................................................................103

Figura 22. Nmero de brotes exitosos en cada variedad a travs del tiempo........104

Figura 23. Brotes de Dianthus caryophyllus obtenidos in vitro. A: Brote
hiperhidratado de la variedad Mercedes. B: Brote no hiperhidratado de la variedad
Picote Vanesa. ........................................................................................................104

Figura 24. Nmero de brotes hiperhidratados por variedad a travs del tiempo....105

xiii
LISTA DE ANEXOS

Anexo 1. Composicin del medio nutritivo Murashige & Skoog (MS) (1962).........127

Anexo 2. Resultados de la prueba ELISA (valores de absorbancia nm) en cada
mtodo de cada variedad........................................................................................128

Anexo 3. Componente I Atenuacin del CarMV. Prueba de Normalidad de la prueba
ELISA para los 3 mtodos.......................................................................................128

Anexo 4. Componente I. Atenuacin del CarMV. Prueba de Homoestacidad de la
prueba ELISA para los 3 mtodos...........................................................................129

Anexo 5. Tabla de los tratamientos (mtodo y variedad) para aplicar la prueba
Kruskall Wallis......................................................................................................129

Anexo 6. Componente I. Atenuacin del CarMV. Prueba Kruskall Wallis para las
variables mtodo y variedad ...................................................................................130

Anexo 7. Componente I. Atenuacin del CarMV . Prueba Duncan para las variables
mtodo y variedad...................................................................................................130

Anexo 8. Componente II. Proceso de micropropagacin Establecimiento in vitro.
Prueba ANOVA para la variable Tasa de prdida (Primera Fecha)........................131

Prueba Duncan para la variable Tasa de prdida (Primera Fecha)........................132

Prueba ANOVA para la variable Tasa de prdida (Segunda Fecha)......................132

Prueba Duncan para la variable Tasa de prdida (Segunda Fecha). .....................133

Anexo 12. Componente II. Proceso de micropropagacin Propagacin in vitro.
Prueba ANOVA para la variable Tasa de velocidad de Multiplicacin (Ciclo de
Multiplicacin 1).......................................................................................................133

Prueba Duncan para la variable Tasa de velocidad de Multiplicacin (Ciclo de
Multiplicacin 1).......................................................................................................134

Prueba ANOVA para la variable Tasa de prdida (Ciclo de Multiplicacin 1).........134

Prueba Duncan para la variable Tasa de prdida (Ciclo de Multiplicacin 1)........135
14
Multiplicacin 2).......................................................................................................135

Multiplicacin 2).......................................................................................................136

Prueba ANOVA para la variable Tasa de prdida (Ciclo de Multiplicacin 2).........136

Prueba Duncan para la variable Tasa de prdida (Ciclo de Multiplicacin 2)........137

15

RESUMEN

El presente trabajo tuvo como objetivo desarrollar una metodologa para la
micropropagacin de cinco variedades comerciales de Dianthus caryophyllus
L. (clavel), a partir de meristemos apicales. Adicionalmente se analizaron las
concentraciones del virus moteado del clavel (CarMV) en tejido vegetal de
cinco variedades mediante la utilizacin de la prueba de ELISA luego de
haber recibido los mtodos de termoterapia y cultivo in vitro de meristemos y
la combinacin de ambos. Se evaluaron las tasas de prdida y las de
velocidad de multiplicacin para cada variedad con el fin de determinar el
comportamiento de cada una en condiciones in vitro. En la fase de
establecimiento in vitro se confirm que la variedad se asocia con la tasa de
prdida; y con la presencia de microorganismos, vitrificacin y oxidacin de
los explantes. Durante la fase de multiplicacin in vitro, la tasa de velocidad
de multiplicacin aumento en el segundo 2 ciclo de propagacin, dejando de
manifiesto el aumento de la capacidad morfognetica a travs de los
subcultivos. Durante la etapa de induccin de races se evidenci la
capacidad rizognetica de las variedades. El comportamiento de cada
variedad durante las etapas fue diferente por lo que se concluye que la
respuesta es especfica para cada genotipo. Se estableci la presencia del
virus en las 5 variedades estudiadas. La concentracin del virus se redujo
utilizando el tratamiento combinado de termoterapia y cultivo in vitro de
meristemos.

16
ABSTRACT

The main object of the following project was to develop a methodology for the
micropropagation of five different commercial varieties of Dianthus
caryophyllus L. based on apical meristems. In addition to the above, another
purpose of the investigation was to analyze the different concentrations of the
CarMV virus in every of the five carnation varieties using the ELISA test. All
the varieties were treated before trying the ELISA test with thermotherapy, in
vitro culture or both. After, another analysis was the one based on the lost
rates and the multiplication velocity for each and every variety, looking
forward to determine their behavior under in vitro conditions. During the in
vitro establishment phase, the results allowed to confirm that the variety
influenced the lost rate. The latter was also influenced by the presence of
microorganisms, hiperhydratation and explants oxidation. The in vitro
multiplication phase was also reviewed and the multiplication velocity rate
was higher in the second propagation cycle, permitting to conclude that the
morphogenetic capacity was higher after several subcultures. During the root
induction stage, there was also another factor analyzed which was the
rizogenetic capacity of each variety. Nevertheless, each variety behavior was
different in each treatment. The latter may allow concluding that the specific
answer depends on each genotype. It was established the presence of the
CarMV in the five different varieties. The virus concentration was reduced
after the use of the combination of thermotherapy and meristem in vitro
culture treatments.

17
1. INTRODUCCION

La economa colombiana ha entrado a competir en el mercado mundial
gracias a productos como el petrleo, el caf, las frutas y las flores, los
cuales tienen una importancia significativa para el pas.

El rubro de la floricultura se ha convertido en una interesante opcin
productiva para la agricultura en Colombia. De acuerdo con la Asociacin
Colombiana de Exportadores de Flores (Asocolflores), la floricultura ocupa el
primer lugar como generadora de divisas dentro de las exportaciones no
tradicionales de Colombia. El 95% de la produccin se destina a la
exportacin. En el ao 1979 Colombia export flores por un valor de 75
millones de dlares y en 1992 la cifra alcanz ya los 341 millones. En 1994 el
material exportado fue de 430 millones de dlares y en 1996 se totalizaron
509,9 millones de dlares, cifra que supone un crecimiento del 17% con
relacin al ao anterior. Los principales mercados son Estados Unidos (80%)
y la Unin Europea (14%); dentro de este bloque econmico se destacan el
mercado britnico y alemn, con participaciones del 6,2% y del 2,0%,
respectivamente, sobre el valor exportado (Asocolflores, 2005).

En Colombia el rea sembrada con flores de corte asciende a 6544
hectreas. El 85% de la produccin se desarrolla en la Sabana de Bogot,
12% en el rea de Rionegro y 3% en Valle, Cauca y el Eje Cafetero. La
principal especie exportada es el clavel (estndar y miniatura), con ms de
4.000 hectreas dedicadas a este cultivo. (ASOCOLFLORES, 2005).

Una de las principales zonas productoras de clavel es la Sabana de Bogot;
en esta regin el cultivo de clavel se ha convertido en una alternativa de
produccin. Sin embargo, los mtodos de propagacin vegetativa
18
convencionales presentan limitaciones con respecto al suministro de plantas
madres con condiciones fisiolgicas y fitosanitarias adecuadas.
Las enfermedades causadas por virus afectan el rendimiento y la calidad de
la produccin de flores de clavel, en especial el virus moteado de clavel
(CarMV), responsable de prdidas del 16 % en la produccin de flores
exportables en plantas infectadas por este.

La aplicacin de tcnicas de cultivo in vitro de tejidos en ornamentales es una
alternativa que permite suministrar al floricultor material vegetal revigorizado
(rejuvenecimiento) y con condiciones fitosanitarias adecuadas para
enraizamiento y produccin de esquejes para multiplicacin masiva
(Hartmann et al., 1997).

Teniendo en cuenta la importancia econmica del clavel, la empresa privada
se ha interesado en utilizar sta herramienta, que ofrece alternativas
respecto a la calidad del material vegetal. Sin embargo, se conoce poco del
comportamiento in vitro de las variedades comerciales cultivadas en
condiciones colombianas, razn por la cual se ha formado un vnculo con la
academia con el fin de investigar, conocer, y ofrecer alternativas que apoyen
los sistemas de propagacin convencional.

El presente trabajo tuvo como objetivo adaptar y desarrollar metodologas
para la propagacin in vitro de cinco variedades comerciales de clavel y
evaluar el comportamiento de la respuesta en condiciones in vitro. As
mismo, se aplicaron diferentes mtodos dirigidos a analizar el efecto de la
concentracin del virus moteado del clavel.

19

2. MARCO TERICO Y REVISIN DE LITERATURA

2.1 Dianthus caryophyllus L. (clavel)

2.1.1 Clasificacin botnica

La clasificacin sistemtica del clavel segn J anes (1988) es:

CLASE: Dicotiledonea
SUBCLASE: Caryophyllidae
ORDEN: Caryophyllales
FAMILIA: Caryophyllaceae
SUBFAMILIA: Silenoideae
GENERO: Dianthus
ESPECIE: Dianthus caryophyllus L.
Nombre Cientfico: Dianthus caryophyllus L.
Nombres Comunes: Clavel, Clavel del poeta

2.1.2 Descripcin botnica

Es una planta perenne de base leosa con tallos de hasta 80 cm de altura,
glabros y de da largo.
Hojas: lineares de 0.8-1.5 cm de longitud, planas y blandas, acuminadas y
glaucas, con la base envainadora.
Flores: En grupos de 1-5, muy olorosas. Sin estipulas. Epicliz con 4-6
brcteas anchas, abruptamente acuminadas, mucho ms cortas que el cliz.
Cliz de 2.5-3 cm de longitud, con dientes triangulares. Ptalos dentados de
forma irregular, no barbados, de 1-1.5 cm de longitud, de color rosado-
prpura en las especies silvestres (Heywood & Moore, 1998).

20

2.1.3 Origen e historia

Luego de las rosas y los crisantemos, el clavel es la tercera flor de corte ms
popular del mundo, siendo originario de la cuenca mediterrnea. Sus
orgenes datan del ao 300 A.C., cuando el filsofo griego Theophratus
nombr a esta flor Dianthus, que significa en su lengua, dios (Dios) y anthos
(Flor). Posteriormente, la Flor divina, fue descrita por Linneo como Dianthus
caryophyllus (Ball, 1998).

El inters comercial por esta especie data de inicios del siglo XVI, poca en
la que se realizaron los primeros mejoramientos. Las variedades de claveles
de floracin permanente fueron desarrolladas en Francia en 1840 e
introducidas a Amrica en 1852 (Larson, 1992).

En 1938, William Sim, obtuvo por hibridaciones y selecciones, una serie de
claveles que llevaron su nombre Clavel Sim o Clavel Americano. Se
caracterizaron por presentar una mayor longitud y un cliz ms firme. Sin
embargo, presentaba problemas como la susceptibilidad a adquirir
enfermedades y la dificultad de ser cultivadas al aire libre. (Larson, 1992).

Lpez (1989) clasifica el clavel utilizado en floricultura en tres grupos:
1. Claveles europeos
2. Claveles americanos (Sim)
3. Miniclaveles (Spray)

Los europeos son los ms fciles de cultivar, ya que se adaptan al aire libre
sin el uso de tecnologa. El Sim es el mejor remunerado, tiene mayor calidad
y es comercializado por el floricultor tecnificado. Durante el invierno es
21
necesario protegerlo en invernaderos. El miniclavel o tipo spray, es muy
apreciado en el norte de Europa (Lpez, 1989).

2.1.4 Zonas de produccin

Las reas de mayor produccin de clavel son Holanda, Colombia, Israel,
Kenia y Espaa. De igual manera, las reas cercanas a los 30 de latitud
norte o sur y en el borde oeste de los continentes, presentan condiciones
apropiadas para su cultivo. Dentro de estas reas se incluye el sur de
California, el rea Mediterrnea, cerca de Perth en Australia, las cercanas de
Valparaso en Chile y en Sudfrica (Ball, 1998; Ojeda, 2004).

2.1.5 Variedades

En la produccin comercial para flor cortada se cultivan tres tipos de clavel:
Americano o Sim, Europeo y Miniatura o Spray. Dentro de dichos tipos existe
un gran nmero de variedades que se diferencian por su color, textura del
ptalo, resistencia o susceptibilidad a enfermedades, adaptabilidad al aire
libre o invernadero y rendimiento. Basndose en estas caractersticas, el
floricultor selecciona las variedades de acuerdo con las condiciones
ambientales y demandas del mercado (Larson, 1992).

El mejoramiento de la calidad de las variedades obtenidas de clavel, resulta
de los cruces intraespecficos entre los diferentes tipos. Debido a las
exigencias del mercado, el nmero de variedades es elevado, apareciendo
de manera contnua nuevas formas y tipos, producto de mutaciones
inducidas, hibridaciones y seleccin de caractersticas deseadas. (Larson,
1992).

22
Las flores de los claveles Americanos o Sim se caracterizan por ser las ms
bellas debido a su diversidad de colores, tallos de gran porte y una
sobresaliente durabilidad. Entre los claveles europeos se destacan los tipos
Chabaud y Flamands, que producen flores de gran tamao, tallo largo
adecuado para el manejo en el cultivo y uso en floristeras (Ojeda 2004).

Las variedades miniatura se caracterizan por tener tallos muy cortos y
abundante floracin. Con sta caracterstica se pretende que el clavel tenga
el mayor nmero de botones florales (Lpez, 1989).

Actualmente, la produccin de nuevas variedades esta basada en las
siguientes caractersticas: resistencia al hongo Fusarium oxysporum,
limpieza de virus, longitud del tallo, precocidad y rapidez de crecimiento,
duracin de la flor, ausencia de botones laterales, diversidad de colores y
adaptacin a cultivos al aire libre (Ojeda, 2004).

En los ltimos aos se ha intentado recuperar el olor, una caracterstica que
se haba perdido en estas flores a favor de su belleza visual, pero que las
tendencias del mercado estn exigiendo (Ojeda, 2004).

2.1.6 Cultivo y produccin

Se estima que el clavel tiene un ciclo de vida til de dos aos bajo
condiciones como las colombianas. La produccin de flores comienza a partir
del sexto mes, aunque depende de la variedad. Se calcula que la
productividad promedio del clavel estndar (Europeo y Sim) se encuentra
entre 180 y 210 flores / m al ao (rendimiento bruto). Mientras que el clavel
miniatura tiene una productividad de 190 flores/m. Sin embargo, estos datos
23
pueden variar por la influencia de factores ambientales y por el manejo de
cada uno de los cultivos (Pizano, 2000).

2.1.6.1 Factores ambientales que influyen sobre la produccin

2.1.6.1.1 Temperatura

La temperatura ptima diurna es de 20 C a 25C que se obtiene fcilmente
bajo invernaderos a la altura de los 2600 metros sobre el nivel del mar;
rasgos predominantes en la zona de la Sabana de Bogot. Con respecto a la
temperatura nocturna, sta baja a 6 y 8 C, razn por la cual se hace
necesario el uso de invernaderos en sta regin (Pizano, 2000).

2.1.6.1.2 Suelo

El clavel se adapta a un amplio rango de suelos, desde arenosos a franco-
arcillosos, pero requiere de una profundidad efectiva es de 30 a 40 cm. El
rango de pH debe estar entre 6,5 - 7. Es importante destacar que a mayor
restriccin de las caractersticas antes mencionadas, se pierde ms calidad
que produccin (Ojeda, 2004).

2.1.6.1.3 Riego

El sistema de riego ms indicado para la produccin de clavel es el goteo, ya
que dosifica de manera precisa la cantidad de agua aplicada y evita la
dispersin de algunas enfermedades y plagas del follaje y de las flores por
salpicadura (Pizano, 2000).

2.1.6.1.4. Nutrientes

A continuacin se presenta una tabla con las necesidades bsicas de
nutrientes.
24

Tabla 1. Requerimientos nutricionales del clavel
Elemento Gramos / cama - semana
Potasio 135
Nitrgeno 98
Calcio 52
Magnesio 20
Fsforo 20
Azufre 20
Zinc 0.44
Boro 0.35
Cobre 0.25
Nota: Los requerimientos nutricionales han sido calculados para camas de 30 m y una
densidad de siembra promedio de 1000 plantas por cama. Tomado de Pizano, 2000.

2.1.7 Plagas y Enfermedades
2.1.7.1 Plagas

Las plagas ms comunes que afectan al cultivo del clavel son algunos
insectos, caros y nemtodos.

2.1.7.1.1 caros

El caro ms comn que afecta el cultivo de clavel es la araita roja
(Tetranychus cinnabarinus). Es un artrpodo de ocho patas en su estado
adulto, sin alas y con un aparato bucal que posee una articulacin prensil que
le permite perforar las hojas para succionar el contenido de sus clulas
(Gmez, 1992).
25
Los primeros signos manifestados en el haz del follaje son puntos blancos
que luego se tornan en manchas rojizas oscuras. En casos de grandes
poblaciones puede llegar a secar la planta por completo. Los daos ms
importantes se producen en los primeros estados vegetativos de la planta,
produciendo retraso en el crecimiento (Gmez, 1992).

2.1.7.1.2 fidos

Los fidos son una plaga muy frecuente en el clavel. Se alimentan de hojas y
flores, en donde succionan los azcares que se transportan por el floema.
(Lpez, 1989).

2.1.7.1.3 Trips

Las especies ms importantes que atacan al cultivo del clavel son Haplothrips
sp y Thrip tabaco. Estos insectos se alimentan de flores y centros de
crecimiento provocando decoloraciones y deformaciones en los tejidos
afectados. Para el control se prefieren los insecticidas sistmicos (Lpez, 1989).

2.1.7.1.5 Nemtodos

Los gneros Meloidogyne y Heterodera, son endoparsitos que se alimentan
de la parte area y radicular del clavel, produciendo decoloracin,
debilitamiento y enanismo. Adicionalmente, los nemtodos pueden actuar
como vectores de algunos virus. Igualmente pueden ser la causa de la
invasin por bacterias y hongos sobre las plantas. Para su control se debe
identificar los gneros y poblaciones presentes en el suelo, para determinar
una posible aplicacin de nematicidas granulares o esterilizantes de suelo,
previo a la siembra (Marroqun & Arbelez, 1992).

26
2.1.7.2 Enfermedades causadas por hongos y bacterias

2.1.7.2.1 Marchitamiento vascular

Enfermedad originada por el hongo Fusarium oxysporum f. sp. dianthi. Afecta
al sistema vascular pudiendo llevar a la desecacin y muerte de la planta
(Carver et al., 1996). Inicialmente los signos se manifiestan en las hojas
inferiores hasta llegar a las hojas superiores. En los estados finales el tallo
muestra agrietamiento por la parte exterior y toma el aspecto de lea seca
(Ochoa, 1996; Arbelez, 1999).

Como medidas de manejo preventivo esta la desinfeccin del suelo previo a
la siembra y control de la humedad (Mirkova, 1998).

2.1.7.2.2 Botritis

Botrytis cinerea es un hongo que infecta inicialmente a las flores, luego se
transmite hacia las hojas, pecolos y tallos. Los signos en las flores se
manifiestan como necrosis del tejido; en las hojas se desarrollan lesiones
necrticas con forma de V que se cubren con moho gris y posteriormente se
marchita y muere la hoja. Su desarrollo se favorece por la alta humedad,
poca ventilacin y exceso de nitrgeno (Latorre et al., 1998).

2.1.7.2.3 Roya del clavel

Causada por el hongo Uromyces caryophyllinus, ataca las hojas y los tallos,
produciendo manchas amarillas, estas producen agrietamiento de la cutcula,
posteriormente aparecen manchas de color caf en forma de ampollas que al
reventar liberan las esporas cuyo polvo cubre las hojas, flores y tallos. Las
pocas de mayor incidencia de sta enfermedad son las de lluvias o cuando
27
los cultivos permanecen con su follaje mojado por causa del riego mal
realizado (Arbelez, 1987)

2.1.7.2.4 Mancha foliar

Producida por Pseudomonas andropogonis (Smith) Stapp bacteria gram-
negativa con forma de bastoncillo. Los signos se manifiestan a nivel del
follaje al formarse lesiones circulares e irregulares con centros marrones y
bordes de color pardo rojizo (Ochoa, 1996).
2.1.7.3 Enfermedades causadas por virus

Las enfermedades causadas por virus juegan un papel muy importante en la
productividad de las plantas. En el clavel, el rendimiento en la produccin
puede descender entre un 30 y un 50% con la mayora de las virosis (Oliger
et al., 1994). Actualmente se conocen doce virus distintos capaces de
infectar el clavel, de los cuales cinco se encuentran en todas las regiones del
mundo. Aun cuando se ha identificado su presencia en los cultivos no es
motivo de preocupacin para los floricultores, ya que la expresin de los
signos es leve e incluso imperceptible. Sin embargo, la productividad y
calidad del material vegetal libre de virus es significativamente mejor que la
de las plantas infectadas (Gonzles et al., 1990; Pizano, 2000).

A continuacin se describirn cinco de los virus ms frecuentes del clavel:

2.1.7.3.1 Virus del mosaico de las nerviaciones del clavel (CaVM)

Pertenece al grupo de los potyvirus. Se manifiesta sobre el tejido foliar cerca
de las nerviaciones con un jaspeado difuso localizado principalmente sobre
las hojas. Durante el invierno estos signos quedan enmascarados (Oliger et
al., 1994).
28

2.1.7.3.2 Virus del jaspeado del clavel (CaERV)

Corresponde al gnero de los Caulimovirus e infecta solamente a las plantas
de la familia Caryophyllaceae. Se expresa por pequeas manchas necrticas
en lneas o anillos sobre los bordes. Algunas veces, las necrosis se
distribuyen en placas bordeadas de color pardo o prpura, situadas en la
punta de las hojas, provocando deformaciones en el borde. (Oliger et al.,
1994; Bchen Osmond, 2002).

2.1.7.3.3 Virus de la mancha anular del clavel (CaRSV)

Es un pequeo virus de ARN isomtrico que infecta principalmente a
Dianthus caryophyllus, Dianthus barbatus. Se ha logrado inocular
artificialmente en plantas de varias familias. Se transmite mecnicamente y
por contacto entre plantas o por injertacin. Sobre las hojas infectadas se
desarrollan anillos concntricos y moteados (Arbelez 1999; Pizano, 2000;
Bchen Osmond, 2002).

2.1.7.3.4. Virus del moteado necrtico del clavel (CaNFV)

Pertenece al grupo de los closterovirus. Infecta principalmente a D.
caryophyllus, D. barbatus y D. chinensis. Se ha reportado como vectores los
insectos de la familia Aphididae (fidos). Sus signos son moteados y rayados
sobre las hojas de color gris o rojo (Brunt et al., 1996).

29
2.1.7.3.5 Virus moteado del clavel (CarMV)

2.1.7.3.5.1 Clasificacin

De acuerdo con el comit internacional en taxonoma de virus (ICTV), el virus
moteado del clavel pertenece al grupo de los Tombovirus, genero Carmovirus
y familia Tombusviridae. Presenta una morfologa isosadrica y posee un
genoma monopartito de ARN linear de cadena simple y polaridad positiva
(Carrington & Morris, 1985; Rodriguez et al., 2000; Bchen Osmond, 2002).

2.1.7.3.5.2 Historia y distribucin

Fue descrito por primera vez en Inglaterra en 1955 por Kassanis. Diez aos
despus se encontraron variedades de clavel infectadas con el CarMV
(Hollings & Stone, 1964).
La distribucin de ste virus inicio en Estados Unidos en la costa oeste,
especialmente en California. En la actualidad se encuentra en todo el mundo.
Colombia es uno de los pases ms afectados. Rodriguez et al. 2000,
reportaron la alta incidencia del CarMV en la Sabana de Bogot, encontrando
una proporcin del 82% de muestras positivas.

2.1.7.3.5.3 Transmisin

El CarMV es transmitido mecnicamente y se propaga fcilmente de una
planta a otra por las heridas o injertacin (Pizano, 2000; Bchen Osmond,
2002). Generalmente sucede por la siembra de esquejes de plantas madres
contaminadas o infectadas(Cano & Snchez, 1994).

2.1.7.3.5.4 Citopatologa

El virus moteado del clavel infecta todas las estructuras de la planta,
causando alteraciones citopatolgicas en las clulas. Las ms comunes son
30
formacin de vesculas perifricas en el citoplasma, mltiples membranas,
variaciones del ncleo y desarrollo de burbujas en las vacuolas por
acumulacin de virus (Castr, 1973).

2.1.7.3.5.5 Sintomatologa del clavel

Los claveles infectados por el CarMV se caracterizan por presentar tenues
moteados clorticos, manchas y punteados en las hojas nuevas. Las hojas
viejas pueden presentar el virus enmascarado. Tambin se presenta
deformacin de hojas y falta de vigor, comparado con plantas sanas (Cano &
Sanchez, 1994; Pizano, 2000; Ojeda 2004).
Segn esto es de suma importancia establecer cultivos de clavel libres del
CarMV, ya que la calidad y cantidad de las flores se ve aumentada en
comparacin del material infectado con el virus (Caldern & Arbelez, 1999).

2.1.7.3.5.6 Rango natural de hospederos

El CarMV se puede encontrar en las siguientes especies: Dianthus
caryophyllus, D. barbatus, D. chinensis, D. superbus, Saponaria officinalis, S.
Vaccaria, Daphne odora, Begonia eliator. Sin embargo, se ha logrado
inocular artificialmente en una gran cantidad de especies (Pizano, 2000).

2.1.7.4 Tcnicas para la deteccin de virus

Para la eleccin de la tcnica utilizada en el diagnstico de la enfermedad y
la deteccin del virus responsable, se debe tener en cuenta la finalidad del
trabajo a realizar, la experiencia del investigador y la disponibilidad de
equipos y reactivos del laboratorio (Conti et al., 2001).

31
2.1.7.4.1 Pruebas biolgicas

Consiste en la utilizacin de plantas indicadoras (herbceas) que se inoculan
con virus fitopatgenos; posteriormente las plantas manifiestan signos tpicos
de la infeccin. Para el aislamiento de la mayora de los virus de las plantas
hortcolas se utilizan como huspedes, herbceas de las siguientes familias:
Chenopodiaceae, Cucurbitaceae, Solanaceae (Conti et al., 2001). Estas
pruebas se utilizan cuando no se dispone de reactivos para el diagnstico en
el laboratorio.

2.1.7.4.2 Citopatologa

Se basa en el reconocimiento de un conjunto de modificaciones de las
clulas de los tejidos vegetales que son el resultado de un metabolismo
alterado por la infeccin viral, dando como resultado el desarrollo de cuerpos
de inclusin (protenas estructurales, no estructurales, y funcionales,
utilizadas en la replicacin viral). Estas estructuras son detectadas por el
microscopio ptico. Si se requiere una observacin detallada se puede usar
el microscopio electrnico. Sin embargo, su identificacin no es rpida ni
fcil y requiere de personal capacitado (Mattews, 1991).

2.1.7.4.3 Inmunoabsorbancia en microscopio electrnico (ISEM)

Se utiliza para detectar virus en pequeas concentraciones o en mezclas con
otros virus. La muestra infectada se coloca sobre un retculo de microscopa
electrnica previamente sensibilizado con un anticuerpo; el anticuerpo
captura de forma especfica a las partculas virales de la muestra y lo
concentra en el retculo, facilitando la bsqueda con el microscopio
electrnico (Conti et al., 2001). La sensibilidad del ensayo es similar a la
obtenida con la prueba inmunoenzimtica que se menciona a continuacin.
Sin embargo, la metodologa es costosa en trminos de instrumentos y
personal, dificultando diagnsticos a gran escala.
32

2.1.7.4.4 Prueba inmunoenzimtica (ELISA)

La prueba ELISA (Enzyme-Linked-Inmunosorbent Assay) es el mtodo
serolgico ms usado actualmente, dada su alta sensibilidad, rapidez y
evaluacin cuantitativa y cualitativa del virus (Conti et al., 2001).
Esta tcnica se basa en el reconocimiento de un antgeno (partculas de
virus) por anticuerpos y la posterior unin de este complejo con una enzima.
Este conjugado retiene simultneamente la actividad inmunolgica y
enzimtica de los componentes. Si existe una unin entre los anticuerpos
especficos y su respectivo antgeno, se produce un cambio de color de la
solucin y esto permite determinar los resultados visualmente o cuantificarlos
por medio de un espectofotmetro. Existen varias modificaciones de la
prueba ELISA, que se usan de acuerdo con el objetivo del anlisis, dentro de
las ms conocidas se encuentra el mtodo de doble anticuerpo o "Sandwich"
y el mtodo indirecto (Clark & Adams, 1977; Mattews, 1991; Coll, 1993).

El test ELISA incluye varios pasos: el primero consiste en la adsorcin del
anticuerpo en un pozo plstico tratado. Se utiliza este material porque tiene
gran afinidad por las protenas. El segundo paso es la unin del antgeno con
el anticuerpo. El tercer paso se basa en la conjugacin del anticuerpo con
una enzima (ej. Fosfatasa alcalina) capaz de producir un cambio de color en
un sustrato adecuado (ej. Fosfato disdico de p-nitrofenilo), cuyo producto
absorbe luz a una determinada longitud de onda, que es proporcional a la
concentracin de antgeno (Clark & Adams, 1977; Castao Zapata, 1998).
En esta tcnica se utilizan anticuerpos monoclonales o policlonales que se
diferencian en el nmero de sitios de unin al virus (Schumann, 1998).

Con el fin de hacer la prueba ELISA ms verstil y aplicada a diagnsticos a
gran escala, se han desarrollado diferentes tcnicas: Western Blot, Dot Blot,
Dipstisck Tissue Blot, que difieren del ELISA por la utilizacin de otros
33
soportes (membranas de nitrocelulosa, nylon, polivinildiflurida) (Conti et al.,
2001).

2.1.7.4.5 Hibridacin molecular

Las tcnicas moleculares han contribuido a aumentar el conocimiento en el
campo de la virologa vegetal. Su ventaja radica en la posibilidad de
diagnosticar y/o identificar el genoma viral completo. Especialmente es til en
casos como la deteccin de virus inestables, con bajo poder inmungeno,
escasa presencia en el husped natural, viroides y cepas de virus
serolgicamente prximos o indistinguibles. Sin embargo, la metodologa es
muy costosa en trminos de reactivos y equipos y necesita personal
capacitado en tcnicas moleculares; por este motivo, no se emplea en
investigaciones bsicas y de diagnstico a gran escala (Hammond & Rosner,
1994; Matthews, 1991; Conti et al., 2001)

La hibridacin molecular se basa en la preparacin de construcciones
genticas que contienen secuencias de nucletidos homlogas al genoma
viral, ya que a partir de estas construcciones se sintetizan las sondas que se
utilizan para sealar la presencia o ausencia de virus en muestras de plantas.
La deteccin de virus por hibridacin molecular ha sido ampliamente
utilizada, en particular la hibridacin sobre extractos de cidos nucleicos
totales de plantas aplicados sobre membranas de nitrocelulosa o nylon.
Recientemente se han utilizado tcnicas de hibridacin molecular sobre
improntas de secciones de tejidos de plantas cuya obtencin es ms sencilla
que los extractos de cidos nucleicos (Foster & Taylor, 1998).

2.1.7.4.6 Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

La tcnica de reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) basada en la
amplificacin de un segmento de DNA utilizando la enzima DNA polimerasa y
34
cebadores (oligonucletidos que hibridan con la cadena complementaria a la
secuencia a amplificar). Se utiliza para la deteccin de secuencias
nucleotdicas virales (Hames et al., 1995). La reaccin se produce en tres
fases:
1. El DNA que se quiere amplificar se desnaturaliza en cadenas sencillas.
2. Los cebadores hibridan al DNA de cadena sencilla.
3. Sntesis de la cadena complementaria del DNA producida por la DNA
polimerasa (Taq polimerasa)
Cada etapa o ciclo se realiza a una temperatura diferente. El ciclo se puede
repetir llevando a cabo otra vez todos los pasos. El resultado obtenido es un
producto amplificado de DNA que puede ser detectado por una electroforesis
(Foster & Taylor 1998; Klug & Cummings, 1999).

Para que esta tcnica sea aplicada a virus con cadena RNA, es necesario
sintetizar una cadena de DNA complementario mediante transcripcin
inversa (RT-PCR) (Foster & Taylor, 1998).

La mayor ventaja derivada de la PCR es la identificacin de secuencias
nucleotdicas virales que no pueden ser detectadas por pruebas serolgicas.
Sin embargo, requiere de ms tiempo por lo que su aplicacin se dificulta
para diagnsticos en masa (Conti et al., 2001).

2.1.7.5 Control de virus

La mejor forma de mantener los cultivos de plantas libres de virus es el
establecimiento de material certificado y su continua inspeccin respecto a
determinados virus. Si el virus ya est presente dentro del cultivo se pueden
realizar diferentes tratamientos; el xito de estos depender de las
propiedades del virus y de la especie vegetal (Razdan, 2003).

35
2.1.7.5.1 Quimioterapia

En la actualidad no se ha desarrollado ninguna sustancia qumica capaz de
erradicar los virus de plantas infectadas. Hasta el momento se han realizado
trabajos con el fin de suprimir virus de tejidos vegetales y protoplastos con la
adicin de sustancias qumicas (antimetablicos) en el medio. Sin embargo,
no se han obtenido resultados exitosos, ya que en algunos casos el virus se
suprime y en otros se estimula su produccin. Se ha reportado que el uso de
ribavirin (anlogos nucleosdicos) tiene efectos positivos en la eliminacin del
virus PVX en plantas de papa (Razdan, 2003). No obstante, la quimioterapia
presenta ciertos problemas de orden tcnico, ya que las sustancias con
propiedades viricidas han producido toxicidad en los tejidos vegetales
tratados (Media & Daz, 1981).

2.1.7.5.2 Termoterapia

Consiste en colocar plantas completas o estructuras de stas, en cmaras de
crecimiento a temperatura de 35 a 40C. El tiempo de exposicin al calor es
variable y depende de la especie. Con esto se pretende reducir la
concentracin de virus en la planta (Razdan, 2003).

Experimentos llevados a cabo por Kassanis en 1965, muestran que la
habilidad del virus para infectar o multiplicarse en plantas a 36C no est
correlacionada con su punto de inactivacin trmica. La eliminacin de los
virus puede ser atribuida a algn sistema metablico, el cual causa un
desbalance entre la sntesis y la degradacin de los virus o a una dificultad
para la multiplicacin a esa temperatura (Razdan, 2003).

Por otro lado, Quak (1977), report que la reduccin en la concentracin del
virus, se puede dar por la competencia entre las clulas del husped que se
36
encuentran en proceso de rpida divisin y las partculas del virus, por
lugares de sntesis de cidos nucleicos y protenas lo cual puede llevar a un
cambio en el balance entre la sntesis y degradacin de las partculas del
virus.

Se ha encontrado que no todos los virus reaccionan de la misma manera a la
termoterapia. Para la eliminacin de algunos virus isomtricos, 4 a 6
semanas podran ser suficientes. Mientras que virus como el del
enrollamiento de la hoja (PLRV) en papa necesitan de un perodo ms
prolongado (varios meses), probablemente ms largo del que la planta pueda
resistir. Trabajos realizados por Hearon y Lawson (1980) en Saponaria
vaccaria y Baker y Kinnaman (1973) en clavel, obtuvieron una reduccin en
la concentracin de los virus presentes en cada especie. A pesar de esto el
porcentaje de plantas que sobrevive es bajo porque no toleran las altas
temperaturas. Adicionalmente, muchos virus no pueden ser inactivados por
tratamientos de calor, se sugiere utilizar el cultivo in vitro de meristemos
(Razdan, 2003)

2.2 CRECIMIENTO Y DESARROLLO
El conjunto de eventos que contribuyen a la progresiva formacin del cuerpo
de la planta y que le permiten obtener alimento, reproducirse y adaptarse a
su ambiente se define como desarrollo (o morfognesis). Este involucra dos
procesos: crecimiento (se manifiesta por cambios cuantitativos) y
diferenciacin (se refiere a los cambios cualitativos) (Azcn Bieto & Taln,
2000)

El crecimiento se explica como un incremento irreversible en tamao y
volumen, que esta dado por la combinacin de expansin y divisin celular.
La expansin celular ocurre por una mayor extensibilidad de la pared, con
intervencin de expansinas (protenas que promueven la prdida de rigidez),
37
endoglucanasas, y un aumento en la presin de turgencia. Esta extensin se
convierte en irreversible una vez que la pared recupera su rigidez (Raven et
al., 1999). El control de la divisin celular radica en el ciclo celular, que se
define como la secuencia de eventos bioqumicos y morfolgicos que llevan a
la generacin de clulas nuevas a partir de una clula madre (Azcn Bieto
& Taln, 2000).

Para que el cuerpo de la planta se desarrolle es necesario un proceso de
diferenciacin celular, en el que las clulas se especializan para ser
estructural y funcionalmente diferentes unas de otras. Este proceso depende
bsicamente de la expresin diferencial del material gentico. Estas clulas
tendrn toda la informacin necesaria para formar una nueva planta. Este
fenmeno se conoce como totipotencia celular (Azcn Bieto & Taln,
2000). Las zonas de crecimiento (meristemos) que se mantienen en
constante divisin presentan la mayor proporcin de clulas totipotentes
(Taiz & Zeiger, 1998)

2.2.2 Zonas de crecimiento meristemos

El meristemo, es una estructura dinmica en la que continuamente se est
produciendo crecimiento y divisin celular (Azcon Bieto & Taln, 2000).

Los meristemos se pueden clasificar por su origen, posicin y la estructura
que originan. Los meristemos apicales (o primarios) del tallo y de la raz
conducen al desarrollo del cuerpo primario (races, tallos y hojas) de la planta
y se forman durante la embriognesis (Randall & Hake 1997). Los
meristemos secundarios como los axilares son similares a los primarios en
estructura y desarrollo, aunque dan origen a races o tallos secundarios
(Margara, 1988; Kerstetter & Hake 1997; Randall & Hake 1997).

38
Adicional al desarrollo del cuerpo primario est el desarrollo del cuerpo
secundario que se diferencia porque no da lugar a una planta completa ya
que slo est formado por un nmero limitado de tejidos y la ausencia de
ciertos rganos. Tal crecimiento deriva de los meristemos laterales (Taiz &
Zeiger, 1998; Azcon Bieto & Taln, 2000).

En los meristemos suceden eventos morfogenticos que conducen a la
formacin de la planta; el origen de un nuevo primordio foliar est
determinado por un cambio en el plano de divisin. Generalmente una
divisin periclinal en el corpus (capa interna) o en la tnica (capa externa)
sugiere que se est desarrollando un nuevo primordio (Kerstetter & Hake
1997).

El meristemo apical se divide en tres regiones o zonas:

Zona central (ZC): ubicada en el extremo distal, presenta clulas vacuoladas
y ncleos prominentes, ocurren menos divisiones celulares que en el resto.
Zona perifrica (ZP): Rodea a la zona central, presenta ndices ms
elevados de divisin celular, su funcin principal es la formacin de rganos
laterales.
Zona medular (ZM): Situada en la base del meristemo, las clulas que
origina son la parte central del tallo y los tejidos vasculares.

Durante el desarrollo vegetativo se conserva la organizacin del meristemo,
pero la posicin y el destino de las clulas derivadas del mismo cambian con
el tiempo. Este proceso est regulado por la informacin de la posicin y por
la regulacin gnica (Azcon Bieto & Taln, 2000).

39

2.2.3 Reguladores de crecimiento

El desarrollo de las plantas est influenciado por la interaccin de factores
externos e internos. Dentro de los factores internos se incluyen las
hormonas (o fitohormonas), las cuales se definen como seales qumicas
que facilitan la comunicacin entre las clulas y coordinan sus actividades. El
control hormonal lo realizan cinco grupos principales: auxinas, giberelinas,
citoquininas, etileno y cido abscsico. Sin embargo, en los ltimos aos se
han aislado una serie de sustancias que tambin pueden clasificarse como
hormonas vegetales. En este nuevo grupo de hormonas se incluyen:
jasmonatos, poliaminas, salicatos y brasinosteroides (Azcon Bieto & Taln,
2000).

Las clulas vegetales responden a las seales hormonales mediante un
mecanismo de acoplamiento estmulo respuesta que requiere la percepcin
de la seal (primer mensajero) por un receptor, seguido de la generacin y
transmisin de la seal que activar la respuesta. Estos procesos constituyen
la cadena de transduccin de la seal hormonal (Azcon Bieto & Taln,
2000).
2.2.2.1 Auxinas

El nombre auxina significa en griego 'crecer' y es dado a un grupo de
sustancias que estimulan la elongacin. El cido indolactico (IAA) es la
forma predominante, sin embargo, se aceptan como auxinas naturales el
cido fenilactico, ciertos cloro-indoles y el cido indolbutrico. A su vez
existen varias sustancias que causan un efecto fisiolgico similar y que se
han producido sintticamente; entre las cuales se encuentra el cido
naftalenactico (NAA), El cido 2,4 diclorofenoxiactico (2,4 D) y el cido
2 metil 4 clorofenoxiactico (MCPA) (Taiz & Zeiger, 1998).
40

Una de las principales caractersticas de las auxinas es la fuerte polaridad
exhibida en su transporte a travs de la planta. Las hormonas son
transportadas por medio de un mecanismo dependiente de energa,
alejndose en forma basiptala, es decir, desde el punto apical de la planta
hacia su base. Este flujo de auxinas reprime el desarrollo de brotes axilares
laterales a lo largo del tallo, manteniendo de esta forma la dominancia apical.
El movimiento de las auxinas fuera de la lmina foliar hacia la base del
pecolo parece tambin prevenir la abscisin de las hojas (Raven et. al.,
1999).

Las auxinas participan en diferentes procesos del desarrollo vegetal:
alargamiento o elongacin celular, formacin de races adventicias,
partenocarpia, tropismos, promocin de biosntesis del etileno, entre otros.
Por ello, se han desarrollado auxinas sintticas que son utilizadas en el rea
agronmica y biotecnolgica (Azcon Bieto & Taln, 2000).

En el cultivo in vitro de tejidos se utiliza principalmente para estimular el
crecimiento y favorecer la formacin de races. Sin embargo, la respuesta
que se produce tras la aplicacin al explante depende de la edad fisiolgica
del material vegetal, la naturaleza de las auxinas, concentracin y tiempo de
aplicacin (Hartmann et al., 1997).

2.2.2.2 Citoquininas

En 1956 Skoog y colaboradores aislaron la quinetina (6 furfurilaminopurina)
a partir del DNA del esperma del arenque sometido al autoclave. El trmino
41
hace referencia a su capacidad para promover la divisin celular en tejidos
vegetales. A pesar de su gran actividad biolgica, no es sintetizada por las
plantas. Se puede obtener a partir de mezclas de adenina y furfuril alcohol.
La primera citoquinina natural identificada fue la zeatina, a parir del
endospermo del maz. A partir de esto se han descubierto varias sustancias
naturales y sintticas, que tienen efectos anlogos a la quinetina. (Roca &
Mroginski 1991; Taiz & Zeiger, 1998).

Las citoquininas se pueden derivar de la base prica adenina (6
aminopurina) y de la fenilrea. Las derivadas de la adenina poseen un
sustituyente de naturaleza isoprenoide o aromtica, en el nitrgeno amnico
de la posicin 6 del anillo de purina, en este grupo se encuentran citoquininas
naturales como la zeatina, benciladenina y citoquininas sintticas como la
kinetina (6 furanosil aminopurina). A pesar de tener similitudes en la
estructura pueden presentar analogas respecto a la sntesis, actividad y
metabolismo (Van Staden & Crouch, 1996).

Las citoquininas procedentes de la fenilrea, son compuestos sintticos
divididos en dos grupos, las piridylureas y las thidiazolureas. En el grupo de
las thidiazolureas se encuentra el thidiazuron, un compuesto con actividad de
citoqunina, el cual es ms efectivo que las citoquininas naturales en la
promocin del desarrollo de yemas axilares, o la diferenciacin de yemas
adventicias en cultivos in vitro (Huetteman et al., 1993).

Las citoquininas regulan varios procesos del desarrollo de las plantas,
incluyendo divisin celular, proliferacin de yemas axilares, senescencia
foliar y floracin, entre otros. Gran parte de estos procesos estn afectados
por otros estmulos, especialmente ambientales y hormonales. Como caso
tpico esta la interaccin de las citoquininas con las auxinas que se utiliza
para regular la neoformacin de rganos in vitro y controlar la dominancia
42
apical fundamental en la industria de la micropropagacin (Ascn Bieto &
Taln, 2000).

2.3 CULTIVO IN VITRO DE MERISTEMOS
El cultivo de tejidos in vitro comprende una serie de tcnicas mediante las
cuales un explante (porcin de tejido o de un rgano que se retira del resto
de la planta) se cultiva en un medio de composicin qumica definida en
condiciones ambientales controladas (Razdan, 2003).

Los factores que se deben tener en cuenta para obtener una respuesta
adecuada del explante incluyen: la posicin en la planta donadora, edad
ontogentica y estado fisiolgico de la misma. Adicionalmente se debe
considerar la especie con la que se est trabajando y los objetivos que se
buscan. Uno de estos, es el uso de meristemos apicales para la produccin
de plantas libres de virus (Razdan, 2003).

En los aos 50 en estudios realizados sobre dalias dirigidos por Morel y
Martin se descubri que las plantas obtenidas a partir de meristemos estaban
libres de virus. Despus de este trabajo y ante la evidencia de las
aplicaciones de este mtodo, se iniciaron estudios en busca de las razones
por las cuales esto suceda. Una primera hiptesis explica la ausencia del
virus en el meristemo por la inexistencia de tejido vascular (tejido a travs del
cual se movilizan los virus) en directa relacin con el meristemo. Incluso si el
virus fuera capaz de invadir o moverse de clula a clula, la velocidad de
avance de los virus sera inferior a la de crecimiento del meristemo, lo cual
impedira su invasin. Otras hiptesis proponen una inhibicin de la
replicacin de los virus en la zona meristemtica debido a la alta tasa
metablica del meristemo y a la elevada concentracin de reguladores
(auxinas) en esa zona. Aunque el motivo de la ausencia de virus en el
43
meristemo no est totalmente esclarecido, estas hiptesis o una conjuncin
de las mismas parece ser bastante acertada (Azcn Bieto, 2000; Pea,
2000).

Sin embargo, existen argumentos que contradicen la absoluta ausencia de
meristemos libres de virus, ya que es un proceso probabilstico, que no
ocurre en el 100% de los casos, sino slo en una alta proporcin (Gonzles
et al., 1990).

Una vez obtenidos los meristemos se proceden a la siembra en un medio de
cultivo, con el cual se busca el crecimiento y regeneracin de estos mediante
el aporte de nutrientes. La composicin general de los medios de cultivo no
vara mucho de especie a especie y sus elementos esenciales son
macronutrientes (nitrgeno, fsforo, potasio, calcio, magnesio y azufre),
micronutrientes (boro, cobalto, manganeso, hierro, zinc, molibdeno y cobre),
compuestos orgnicos (vitaminas como tiamina, piridoxina y acido nicotnico),
fuente de carbono (generalmente sacarosa), reguladores de crecimiento y
materiales de soporte. El medio ms usado para micropropagacin es el de
Murashige & Skoog (1962) cuya composicin puede variar de acuerdo con
los requerimientos de cada especie (Razdan, 2003).

Dentro de los materiales de soporte el ms utilizado es el agar, cuyo
componente es la agarosa, proveniente de ciertas algas. Otros son el
Phytagely Gel Riteque se componen de cido glucornico, ramanos y
glucosa. Al tener elementos sustitutos del agar su potencial mtrico es ms
bajo, lo que permite mayor disponibilidad de agua para el explante cultivado
in vitro; no obstante se pueden presentar problemas de hiperhidratacin
(Passqualetto, 1990; George, 1996). Existen otros materiales de soporte
como el medio lquido en agitacin puentes de papel filtro.

44
Con respecto al pH del medio, el rango entre el cual se debe ajustar previo a
autoclavar es de 5.6 a 5.8. En general la respuesta de las plantas no es muy
sensible a los cambios de pH en rangos pequeos. Es importante recalcar
que el crecimiento del material vegetal en un perodo de tiempo puede
generar cambios en el pH, hacindose necesaria la transferencia a medios
frescos (Smith, 1992).

Dentro de los factores fsicos a tener en cuenta se incluyen la luz, la
temperatura y la humedad relativa. Se ha reportado que cambios de
irradiancia (cantidad y calidad de luz), fotoperodo (duracin de la luz) y
longitud de onda afectan el tamao de las hojas y brotes al igual que la
morfognesis (J eong et al., 1995). De igual manera, la temperatura influye
sobre el desarrollo del explante in vitro. El promedio para la mayora de
especies es de 25C (Razdan, 2003). Temperaturas tan bajas como los 6C
pueden reducir significativamente la tasa de crecimiento, mientras que otras
tan altas como 30C pueden inhibir la multiplicacin de brotes (Hartmann et
al., 1997). Se debe considerar que utilizar una misma temperatura durante
los perodos de luz (generalmente, 16 horas) y oscuridad (8 horas) favorece
la organognesis.

El tercer factor fsico a tener en cuenta es la humedad relativa del recipiente
que puede ser cercana al 100% en condiciones in vitro. El potencial hdrico
del aire y el sustrato es menos negativo o cercano a cero. Por lo tanto, no se
presenta un gradiente de potencial hdrico suficiente para dirigir un proceso
de transpiracin, lo cual contribuye a la hiperhidratacin de los tejidos
cultivados in vitro (Ziv, 1991; J eong et al., 1995).

Un ltimo aspecto a tener en cuenta es la composicin de gases dentro del
recipiente. Los principales son etileno, oxgeno, dixido de carbono, y
45
acetaldehdo. Los efectos producidos por estos gases afectan la
morfognesis, promoviendo crecimientos celulares anormales. Sin embargo,
an se desconoce del todo la interaccin de estos gases entre s y su efecto
en el comportamiento de las plantas (Razdan, 2003).

2.3.1 Etapas del cultivo de meristemos in vitro

El cultivo in vitro de meristemos, comprende las siguientes etapas:

2.3.1.1 Etapa 0: Etapa preparativa

Consiste en clasificar el material que se encuentra en condiciones fisiolgicas
y fitosanitarias adecuadas. Usualmente las plantas que donan el explante se
someten a termoterapia con el fin de eliminar partculas virales (Hartmann et
al., 1997).

2.3.1.2 Etapa I: Establecimiento del explante

Las plantas donadoras de explantes deben someterse a una desinfestacin
superficial, con productos qumicos que sean txicos para los
microorganismos, puesto que si no se eliminan podran competir con el
crecimiento y desarrollo del explante en condiciones in vitro (Debergh &
Zimmerman 1991).
Dentro de los productos qumicos ms utilizados se encuentran el etanol (50
%), que posee una baja tensin superficial y puede fcilmente humedecer el
tejido; hipoclorito de sodio (NaClO) y el hipoclorito de calcio (CaClO). El
hipoclorito de sodio se utiliza con mayor frecuencia; para su aplicacin se
manejan diluciones a concentraciones de 2 a 3.5 % y tiempos de
desinfestacin que no afecten el tejido. Adems, se recomienda realizar
46
lavados (3 a 5 veces) con agua destilada estril, con el fin de eliminar
residuos de desinfectantes que pueden inhibir el crecimiento del explante.
Estos procedimientos se deben realizar dentro de una cmara de flujo
laminar que garantice la asepsia del procedimiento (Hartmann et al., 1997).

Durante la etapa de establecimiento, el explante pasa por un periodo inicial,
donde se estabiliza despus del estrs producido por el aislamiento de la
planta donadora y por los tratamientos de desinfestacin. De esta manera, se
espera que ocurra un crecimiento resultado de la divisin y elongacin celular
(Smith, 1992).

2.3.1.3 Etapa II: Multiplicacin y elongacin de brotes

Tiene como objetivo la multiplicacin de los brotes obtenidos a partir del
meristemo. Por lo general, el medio de cultivo es similar al de la fase de
establecimiento y es comn utilizar citoquininas con el propsito de estimular
la divisin celular e inhibir la dominancia apical para lograr el crecimiento de
brotes (Razdan, 2003).

El nmero de subcultivos y la composicin del medio de cultivo pueden
afectar la estabilidad gentica y la tasa de multiplicacin de las plantas
obtenidas (Hartmann et al., 1997).

2.3.1.4 Etapa Enraizamiento in vitro

Los brotes obtenidos son sometidos a condiciones de enraizamiento y
preparacin para ser transplantados ex vitro. Para este procedimiento se
deben transferir por unos das a un medio de cultivo sin reguladores de
crecimiento y posteriormente se subcultivan en medio para la induccin de
47
races in vitro. Se recomienda que se disminuyan los niveles de citoquininas
exgenas y se aumenten los de auxinas exgenas. Adicionalmente, se debe
disminuir la concentracin de las sales y de la fuente de carbono (Razdan,
2003).
El tiempo de duracin de esta etapa depende de la especie o variedad y el
tipo y concentracin del regulador de crecimiento (Luttge et al., 1993;
Debergh & Zimmermann 1991).

2.3.1.5 Etapa IV: Aclimatacin del material obtenido in vitro

Es la etapa conocida como endurecimiento, proceso mediante el cual las
plantas obtenidas en condiciones in vitro se transfieren gradualmente a un
ambiente ex vitro. Para obtener xito en los resultados se debe reducir
gradualmente la humedad relativa que rodea a la planta, con el objetivo de
lograr que la planta controle la transpiracin y pueda adaptarse a un sustrato
en condiciones de campo (Hartmann et al., 1997).

2.3.2 Problemas asociados al cultivo in vitro
2.3.2.1 Contaminacin

La presencia de microorganismos en los cultivos in vitro reduce el xito de
los resultados, especialmente durante las primeras etapas. Esta situacin se
genera por las condiciones fsicas del cultivo que conforman un ambiente
propicio para su desarrollo (Debergh & Zimmerman, 1991).

La mayor fuente de contaminacin en el cultivo de tejidos vegetales se
produce por la presencia de microorganismos superficiales y sistmicos de la
planta donadora. Para controlar la contaminacin superficial se deben
descartar los individuos que estn en mal estado fitosanitario, realizar
48
procedimientos de desinfestacin adecuados, utilizando desinfectantes
superficiales y fungicidas. A pesar de esto, el material puede no quedar
completamente estril, ya que es probable que se presenten
microorganismos sistmicos como virus, bacterias y hongos. Algunos de
estos contaminantes se pueden tratar con el uso de antibiticos o de
tratamientos de quimioterapia y termoterapia (Casells, 1991).
Adicional al uso de sustancias qumicas de desinfeccin, es necesario
trabajar en ambientes adecuados, esterilizar los medios de cultivo, y realizar
los cultivos siguiendo ciertas normas de asepsia (Roca & Mroginski, 1991).
2.3.2.2 Oxidacin
Durante el cultivo in vitro el explante sufre siempre en mayor o menor medida
situaciones de estrs, ocasionadas por daos mecnicos o por las
condiciones del cultivo in vitro (como la composicin del medio). Estas
situaciones estimulan el metabolismo de los compuestos fenlicos. La
sntesis de fenoles va a producir una serie de reacciones de
hipersensibilidad, tales como la exudacin al medio del contenido de las
clulas deterioradas. De igual forma, las clulas vecinas de las que
inicialmente fueron lesionadas se ven afectadas, incluso aunque esas clulas
no parezcan estarlo, llevando finalmente a una muerte prematura (Debergh
& Read, 1991).

En general, los fenoles son sustancias lbiles y fciles de oxidar. Los
productos generados por la oxidacin tienen carcter fitotxico, por lo que
son capaces de alterar eventos morfogenticos y/o de crecimiento y
desarrollo, potenciando en otras ocasiones otros procesos de oxidacin,
puesto que se convierten en potentes oxidantes (Dixon & Paiva, 1995).

Por todo lo dicho, en el cultivo de tejidos se hace necesario controlar el
efecto de la oxidacin. Una forma mediante la cual se puede realizar esto es
49
evitando el estrs que estimula la biosntesis de compuestos fenlicos, con el
fin de impedir que estas sustancias aparezcan en los cultivos y produzcan
efectos txicos e inhiban el crecimiento (Debergh & Read, 1991).

Otros mtodos que han dado buen resultado cuando la sntesis de fenoles no
puede evitarse son: la dispersin, adsorcin o lavado, con sustancias como
el carbn activado (CA) o la polivinilpirrolidona (PVP); la modificacin del
potencial redox (disminuyendo los agentes redox), o la disponibilidad de
oxgeno; la inactivacin de enzimas de tipo fenolasa (quelantes), y otros
sistemas como la incubacin en condiciones de oscuridad, bajo pH,
incubacin a temperaturas ms bajas, entre otros. En general lo que se
busca al proporcionar stas condiciones es reducir la actividad fenolasa y la
disponibilidad de sustratos para esta enzima (Debergh & Zimmerman, 1991;
Thomas & Ravindra, 1997).

La adicin de sustancias antioxidantes, es otro de los mtodos que suelen
aplicarse, aunque es necesario tener mucho cuidado, ya que se pueden
convertir en oxidantes muy potentes, invirtindose su efecto positivo en el
control de los fenoles (Debergh & Read, 1991).

2.3.3.2 Vitrificacin hiperhidratacin

La vitrificacin hiperhidratacin, es un desorden fisiolgico que se presenta
en los tejidos cultivados in vitro, especialmente en las hojas, que incide sobre
dos de los procesos ms importantes que realizan estas estructuras: la
fotosntesis y el intercambio gaseoso. En menor medida los tallos y races
tambin resultan afectados por estas anomalas anatmicas, que en ciertos
50
casos van a impedir el establecimiento de plantas micropropagadas en
condiciones ex vitro (Ziv, 1991; Kevers et al., 2004; Saher et al., 2004) .

2.3.3.2.1 Posibles causas de la hiperhidratacin

Los estudios realizados sobre la hiperhidratacin, sealan que los defectos
anatmicos y fisiolgicos observados, son el resultado de varias alteraciones
en determinadas rutas metablicas. As los cambios en la sntesis de
protenas, inciden en varias enzimas implicadas en la fotosntesis (Rubisco),
en la sntesis de celulosa y lignina (fenilalanina amonioliasa, glcano
sintetasa), y en procesos asociados con la produccin de etileno
(peroxidasas) (Saher et al., 2004). Los niveles de protenas de hojas
hiperhidratadas son inferiores a los de hojas normales y se ha detectado una
proteina de 30 kD exclusiva de hojas vitrificadas y otras protenas de 30-32
kD de tipo peroxidasa asociadas con la sntesis de lignina (Kevers et al.,
1.984).

2.3.3.2.2 Factores que influyen en la hiperhidratacin

Los factores que intervienen en la hiperhidratacin estn ligados a las
diferentes condiciones del cultivo in vitro, tales como: concentracin de sales,
el agente gelificante, elevadas dosis de reguladores de crecimiento
(citoquininas, auxinas, etileno, entre otras); una baja intensidad lumnica
durante la incubacin; y la humedad relativa y un potencial hdrico, que
segn Debergh, (1987) son el factor clave para explicar estas complejas
anormalidades producidas in vitro (Majada et al., 2002; Yadav et al., 2003).

51
2.3.3.2.3 Signos

Los primeros signos de hiperhidratacin en los explantes se manifiestan
durante las primeras semanas, y se van incrementando con el tiempo de
cultivo. Inicialmente parte del explante de una o dos hojas, generalmente
las que estn en contacto con el medio. El crecimiento de los brotes es ms
rpido de lo normal y puede mostrar tamaos anormales en la formacin de
brotes axilares. Las hojas presentan una apariencia frgil y translcida y su
longitud es menor comparada con la de las hojas normales (Ziv et al., 1987;
Ziv, 1991; Kevers et al., 2004; Saher et al., 2004).

Las caractersticas morfolgicas y anatmicas de las hojas hiperhidratadas
incluyen cambios estructurales y qumicos. La capa cuticular y la epidermis
se vuelven ms delgadas, los estomas son anormales, aumenta la cantidad
de tejido parenquimatoso, y se presentan clulas del mesfilo con pocos
cloroplastos mal desarrollados y con cantidades bajas de clorofila y
protenas. Todas estas anormalidades interfieren en la aclimatacin y el
transplante, causando supervivencias bajas e incluso la muerte (Debergh et
al., 1992; Olmos & Hallin, 1998; Majada et al 2002).

2.4 Micropropagacin de clavel

La micropropagacin, constituye uno de los mtodos biotecnolgicos que
mayores logros ha aportado al desarrollo de la agricultura. El nmero de
especies hortcolas, frutcolas, ornamentales y forestales que se multiplican
por alguna de las tcnicas del cultivo in vitro, es cada vez mayor, y as son
ms numerosas las empresas comerciales que se dedican a la produccin de
plantas por medio de estas tcnicas (Razdan, 2003).

52
Dentro de la amplia gama de especies ornamentales que se propagan por
tcnicas de cultivo in vitro se destaca el clavel. En las ltimas dcadas, el
rpido crecimiento del mercado de las flores ha hecho que sea necesario el
uso de cultivo in vitro de clavel por las ventajas que ste ofrece a nivel de
calidad (plantas libres de virus) y economa (mayor produccin de plantas)
(Hartmann et al., 1997).
A nivel mundial algunas empresas de biotecnologa vegetal dedicadas a la
produccin de plantas in vitro trabajan con diferentes productos, el clavel es
uno de stos. En Espaa, la empresa Barberet & Blanc se dedica a la
produccin de plantas de clavel por medio del cultivo in vitro de meristemos
y certificacin de stas (Barberet & Blanc, 2002).

Uno de los objetivos de la implementacin de la micropropagacin en clavel
es la produccin de plantas libres de virus, siendo sta una de las
caractersticas principales con la cual dichas empresas han entrado al
mercado. Con base en ste fundamento los esfuerzos se han enfocado en
realizar trabajos que confirmen la efectividad del cultivo de tejidos in vitro
sobre la eliminacin de virus.
Ejemplos de dichos estudios son: Baker & Kinnaman (1973) quienes
utilizaron tratamientos de termoterapia y cultivo in vitro de meristemos para
obtener plantas de clavel libres del virus moteado del clavel (CarMV). Pov et
al., en 1994 realizaron un trabajo similar al anterior. J elaska & Sutina (1977)
desarrollaron un protocolo para la micropropagacin del
clavel con el objetivo de obtener plantas libres del CarMV.

Sin embargo, una de las principales limitaciones de la micropropagacin es
la hiperhidratacin de los brotes de clavel que afecta el proceso de
aclimatacin en condiciones ex vitro. Por sta razn se han realizado una
cantidad significativa de estudios en busca de solucionar ste problema. Los
53
principales temas investigados han sido la anatoma, bioqumica y fisiologa
de las hojas hiperhidratadas.
Autores como Leshem en 1983, Ziv et al en 1983, Paek en 1991, Majada en
el 2002, han estudiado los efectos de diferentes factores y sus
manifestaciones anatmicas sobre las hojas.
Por otro lado, investigadores como Kevers & Gaspar en 1986 estudiaron la
fisiologa de la vitrificacin encontrando una anormalidad en la regulacin y
distribucin de agua en los diferentes compartimentos con una mayor
proporcin de agua en el espacio extracelular combinada con aire,
produciendo espacios intracelulares en el parnquima. Las conclusiones
principales fueron que ste fenmeno es debido a un estrs osmtico.
En cuanto a la bioqumica se han estudiado diferentes alteraciones, como el
estrs oxidativo causado por superxidos, radicales libres y perxido de
hidrgeno. (Saher, 2004)

Se han planteado numerosas hiptesis dirigidas a explicar la causa de las
alteraciones generadas por la hiperhidratacin de brotes. Una de stas es la
presencia de altas concentraciones de reguladores de crecimiento como BA,
ABA (Kim et al., 1988), AIA (Li et al., 1997). En otras hiptesis se indican
cambios en los niveles de cloruro de calcio, nitrato de amonio y nitrato de
potasio. (Choudhary & Prakash, 1993; Tsay, 1998).
Otras evidencias indican que la acumulacin de gases en el recipiente como
CO2 y etileno y las bajas concentraciones de agar se relacionan con la
hiperhidratacin (Fal & Snchez Tames, 2002; Kevers & Gasper, 1986;
Tsay, 1998; Yadav et al., 2003).

Aunque el cultivo in vitro de clavel presenta limitantes, los estudios han
permitido estandarizar protocolos tiles en la produccin masiva de clavel.
Dichas variables incluyen el medio de Murashige & Skoog (1962), una
temperatura constante de 25 +2 C, fotoperodo de 16/8 h (luz/oscuridad) y
54
la humedad relativa (70-100%) (Correll & Weathers, 2001; Hayashi et al.,
2002; Fal y Sanchz, 2002; Yadav et al., 2003). Sin embargo, se debe tener
en cuenta las diferencias atribuidas a la variedad.

55
3. FORMULACIN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIN
3.1 Formulacin del problema

El establecimiento y mantenimiento de bancos de plantas madres de clavel
requiere de material vigoroso y con condiciones fitosanitarias adecuadas.
Una de las limitantes que presenta la propagacin convencional es el
suministro de material vegetal con dichas condiciones bsicas para el
enraizamiento y produccin de esquejes utilizados para la multiplicacin
masiva.

Dentro de los problemas fitosanitarios que se han identificado, se encuentran
las enfermedades causadas por virus, en especial por el virus moteado del
clavel (CarMV) el impacto ms importante de este virus se presenta en la
calidad comercial de las flores (tallos de escasa longitud y de reducido
tamao) (Caldern & Arbelez, 1999).

Considerando que el cultivo in vitro es una sistema de multiplicacin masiva
que puede contribuir a la revigorizacin (rejuvenecimiento) y a la reduccin
de agentes fitopatgenos, se pretende implementar esta estrategia que
permitir el suministro de material vegetal con condiciones fisiolgicas y
fitosanitarias adecuadas que podr ser utilizado en el establecimiento de
bancos de plantas madres.

3.2 Justificacin de la investigacin

Las exportaciones totales de flores de corte de Colombia durante el ao
2003, sumaron 679.4 millones de dlares, de los cuales aproximadamente el
30 % corresponden al clavel (Legicomex, 2004).

56
Debido a la importancia de esta especie como flor de corte, es importante
contar en los cultivos con sistemas de bloques de plantas madres. El uso de
material vegetal con condiciones fisiolgicas y fitosanitarias adecuadas para
el establecimiento de plantas madres, ser decisivo para el xito de la
propagacin. Para tal fin se requiere desarrollar estrategias que dentro de las
cuales se incluyen: la esterilizacin con vapor del sustrato de cultivo y el
medio de enraizamiento, tcnicas de propagacin por nebulizacin
intermitente, riego automatizado, fertilizacin lquida constante,
almacenamiento refrigerado de esquejes tanto enraizado como sin raz, entre
otros (Pizano, 2000).

Complementario ha esto se ha implementado el uso del cultivo in vitro de
tejidos como una estrategia de multiplicacin masiva que puede contribuir al
suministro de materiales de propagacin (plantas madres) ms adecuados
desde el punto de vista fisiolgico y fitosanitario.

El presente trabajo estableci un protocolo de micropropagacin para la
produccin de materiales de propagacin de 5 variedades comerciales de
clavel. Los resultados obtenidos constituyen una valiosa herramienta para la
realizacin de nuevos proyectos enfocados a la propagacin in vitro y
limpieza del virus moteado del clavel en variedades comerciales.

57
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo general

Adaptar y desarrollar una metodologa para la propagacin in vitro de cinco
variedades comerciales de Dianthus caryophyllus a partir de meristemos.

4.2 Objetivos especficos

Evaluar las condiciones para el establecimiento, multiplicacin y
enraizamiento in vitro a partir de meristemos de Dianthus caryophyllus.

Evaluar el comportamiento in vitro de cinco variedades de Dianthus
caryophyllus.

Analizar la concentracin del virus moteado del clavel utilizando mtodos
de termoterapia, cultivo in vitro de meristemos solos y en combinacin.

58
5. MATERIALES Y MTODOS

5.1 Diseo de la investigacin

El presente trabajo de investigacin comprendi dos componentes. El
primero corresponde a la evaluacin de 2 mtodos para la atenuacin del
virus moteado del clavel (CarMV). En el segundo componente se evala la
respuesta al cultivo in vitro de cinco variedades de clavel.

En la tabla 2, se presentan los mtodos para la evaluacin de la atenuacin
del CarMV.

Tabla 2. Componente I. Mtodos empleados para la atenuacin del CarMV.

Mtodo
Termoterapia
Cultivo in vitro de meristemos
Termoterapia +Cultivo in vitro de meristemos

El proceso de micropropagacin comprendi 3 fases. La primera fue el
establecimiento in vitro de meristemos. La segunda, propagacin in vitro, se
dividi en 2 sub fases llamadas ciclos de multiplicacin 1 y 2. La tercera
comprendi el enraizamiento in vitro. A partir de los resultados obtenidos en
cada fase se realiz la evaluacin del comportamiento in vitro de las 5
variedades de clavel (Tabla 3).

59
Tabla 3. Componente II. Fases del proceso de micropropagacin
No. Fase Fase
Fase 1 Establecimiento in vitro de meristemos
Fase 2 Propagacin in vitro
Sub fase 1 Ciclo de Multiplicacin 1
Sub - fase 2 Ciclo de Multiplicacin 2
Fase 3 Enraizamiento in vitro

5.1.1 Diseo experimental del Componente I. Atenuacin del CarMV

Para este componente se realiz un diseo factorial con dos factores. El
primer factor (mtodos de atenuacin del CarMV) present 3 niveles que
incluyen mtodos de termoterapia, cultivo in vitro de meristemos solos y en
combinacin.
El segundo factor tiene 7 niveles (Variedades) que corresponden a las
variedades Marfil, Mercedes, Picote Vanesa, Orange Bri, White Sim y a los
controles positivo (presente el CarMV) y negativo (ausencia del CarMV). Para
cada combinacin de los factores mencionados anteriormente se obtuvieron
3 replicas (Tabla 4).

Tabla 4. Niveles del Factor 1 (mtodos de atenuacin del CarMV) del
componente I

Nivel Factor 1 (Mtodo)
Nivel 1 Termoterapia
Nivel 2 Cultivo in vitro de meristemos
Nivel 3 Termoterapia +Cultivo in vitro de
meristemos

60

Tabla 5. Niveles del Factor 2 (variedades) del componente I

Nivel Factor 2 (Variedad)
Nivel 1 Marfil
Nivel 2 Mercedes
Nivel 3 Orange Bri
Nivel 4 Picote Vanesa
Nivel 5 White Sim
Nivel 6 Control Positivo
Nivel 7 Control Negativo

5.1.2 Diseo Experimental del Componente II. Proceso de
Micropropagacin del Material Vegetal

Para el componente II, en las fases de establecimiento, multiplicacin y
enraizamiento, se realiz un diseo aleatorio simple de un factor (variedades)
con 5 niveles que corresponden a las variedades Marfil, Mercedes, Picote
Vanesa, Orange Bri y White Sim (Tabla 6). Para cada nivel se formaron
aleatoriamente 5 grupos (rplicas) cada uno con 10 esquejes. Cada esqueje
presentaba entre 2 y 3 meristemos, que constituyeron la unidad de
observacin.

61

Tabla 6. Niveles del Factor 1 (variedades) del componente II

Nivel Factor 1 (Variedad)
Nivel 1 Marfil
Nivel 2 Mercedes
Nivel 3 Orange Bri
Nivel 4 Picote Vanesa
Nivel 5 White Sim

5.1.3 Poblacin de estudio y muestra

El estudio comprendi una fase de laboratorio que se realiz en las
instalaciones de la Unidad de Biotecnologa Vegetal de la Pontificia
Universidad J averiana, ubicadas en la ciudad de Bogot. All se
micropropag el material obtenido de esquejes de clavel seleccionados por
una empresa Floricultora, localizada en Facatativa, Departamento de
Cundinamarca, Colombia.

La poblacin de estudio y las variables dependientes estudiadas en cada
etapa del proceso de propagacin in vitro de 5 variedades comerciales de D.
caryophyllus se describen en la Tabla 7.

62

Tabla 7. Poblacin y variables del estudio en cada etapa del proceso de
micropropagacin.

Etapa Poblacin Variables del estudio
Termoterapia Esquejes % de Supervivencia
Prueba ELISA Hojas Absorbancia (nm)
Establecimiento in vitro Meristemos Tasa de prdida (TP)
Multiplicacin in vitro Brotes Tasa de velocidad de
multiplicacin (TVM) y (TP).
Brotes hiperhidratados y
brotes no hiperhidtrados.

Enraizamiento in vitro Brotes Presencia/ Ausencia de
races

5.1.4 Variables del estudio.

5.4.1.1 Componente I. Atenuacin del CarMV

Porcentaje de supervivencia de esquejes
Esquejes que sobrevivieron (turgentes y no contaminados) luego de ser
sometidos al mtodo de termoterapia en cada variedad.

Valores promedio de Absorbancia (nm)
Se define como la proporcin de luz incidente que es absorbida por una
sustancia (sustrato Prueba ELISA). Se expresa por un cambio de color.
Este cambio de color depende de la concentracin del virus. La unidad de
medida para sta variable es el nanmetro (nm) y se mide mediante un
lector ELISA.
63

5.4.1.2 Componente II. Proceso de Micropropagacin del Material
Vegetal

Tasa de prdida (TP) (%)
Se refiere a la relacin entre el No. de explantes totales perdidos de cada
variedad en una fase y el No. de explantes introducidos a esa misma fase
(CONIF, 2005).

TP en cada variedad = No. Explantes perdidos
No. Explantes introducidos
X 100

Explantes perdidos se refiere a aquellos que presentaron los siguientes
parmetros

Sin respuesta
Aquellos explantes que no desarrollaron brotes.

Nmero de explantes contaminados
La contaminacin se determin por la presencia de hongos, levaduras y/o
bacterias.

Nmero de explantes oxidados
Se defini como oxidacin, a aquellos explantes que presentaban
oscurecimiento (coloracin amarillo caf) de los tejidos foliares.

64
Tasa de Velocidad de la Multiplicacin (TVM)
Expresa la relacin entre el No. de explantes obtenidos al final del ciclo,
menos el No. de explantes introducidos al ciclo de la fase de
multplicacin, sobre el tiempo (t) de duracin del ciclo (CONIF, 2005).

TVM en cada variedad =
No. de explantes finales del ciclo No. De explantes introducidos al ciclo
t

Nmero de explantes hiperhidratados
Para la evaluacin de esta variable se tomaron en cuenta los brotes que
presentaban una apariencia vidriosa acompaada de una malformacin y
coloracin verde brillante de los tejidos foliares. Se determinar el
promedio de explantes hiperhidratados por cada tratamiento.

Nmero de explantes no hiperhidratados (exitosos)
Para esta variable se contabiliz el nmero de brotes desarrollados por
explante que no presentaron malformaciones morfolgicas en los tejidos
foliares.

Brotes que desarrollaron races
Para esta variable se tomaron en cuenta los brotes que desarrollaron
races y se determin el promedio de brotes que desarrollaron races en
cada variedad y en cada tratamiento.

65
5.2 Mtodos

5.2.1 Enraizamiento

El material vegetal fue obtenido de esquejes de cinco variedades comerciales
de clavel: Marfil, Mercedes, Orange Bri, Picote Vanesa y White Sim. Los
esquejes fueron seleccionados de plantas madres, por la empresa
floricultora, de acuerdo con los siguientes criterios:

Entrenudos cortos
Pares de hojas juntos (imperceptible)
Carcter vegetativo
Estabilidad gentica (Sin mutaciones ni regresiones)

Para el desarrollo de la metodologa se sembraron 72 esquejes / bandeja de
cada variedad, se colocaron en escoria y cascarilla quemada con una
proporcin de 9:1 respectivamente y a cada esqueje se le aplic
enraizadores comerciales. El sustrato fue esterilizado con vapor durante 3
horas a 90 C. El ensayo de enraizamiento fue ubicado en el invernadero de
las instalaciones de la empresa floricultora (Figura 1) en condiciones de
temperatura (18 - 20 C) y humedad relativa (HR) de 30 -40 % en el da y del
100 % en la noche (Figura 3). Este proceso tuvo una duracin de 21 das
despus de siembra (DDS). A los dos meses se repiti este procedimiento
con las mismas condiciones, constituyndose 2 grupos.

66

Figura 1. Esquejes de Dianthus caryophyllus, durante la etapa de enraizamiento en
los invernaderos de la empresa floricultora.

67

5.2.2 Termoterapia

Para este mtodo, los esquejes enraizados de cada variedad fueron
mantenidos en una cmara de crecimiento o fitotron marca LAB LINE
Biotronette, a temperatura constante de 38 +2 C, fotoperodo de 12/12 h
(luz/ oscuridad), durante 25 das (Figura 2) (Castro, 2005).
Durante la primera semana, el riego fue suministrado por aspersin foliar. En
las siguientes semanas se coloc agua destilada en la base de las bandejas.

Figura 2. Esquejes de cinco variedades de clavel durante el mtodo de termoterapia
en una Cmara de crecimiento (fitotron) a temperatura constante de 38C.
Instalaciones de la Unidad de Biotecnologa Vegetal PUJ .

68
5.2.3 Deteccin de partculas virales

La prueba serolgica DAS - ELISA (inmunoensayo de enzima ligando en
sandwich de doble anticuerpo), con anticuerpos policlonales para la
deteccin del virus moteado del clavel fue aplicada al material vegetal
sometido al mtodo de termoterapia. Posteriormente se repiti la prueba
luego de que ste material fuera cultivado en condiciones in vitro. Por otro
lado se realiz la prueba ELISA a material proveniente nicamente de cultivo
in vitro de meristemos.

Se utiliz el Pathoscreen Kit (DAS ELISA, alkaline phosphatase label) marca
Agdia. Para su desarrollo se sigui cada uno de los pasos explicados en el
manual correspondiente sin modificaciones.
Se seleccion tejido foliar de 3 muestras de cada variedad luego de haber
sido aplicado cada mtodo. Cada muestra fue macerada con nitrgeno
lquido hasta ser pulverizada; simultneamente se agreg buffer de
extraccin. Posteriormente, se dispensaron 100 l de cada muestra dentro
de los pozos. Luego se adicion 100 l de control positivo en el respectivo
pozo. Igualmente con el control negativo. La placa con los pozos se coloc
en una cmara hmeda, durante toda la noche en nevera (4C).

Terminada la incubacin se lav 6 veces la placa con 1X PBST - Tween.
Luego se agreg 100 l de la enzima conjugado. Durante 2 horas se
incub la placa en cmara hmeda a temperatura ambiente, seguido por 6
lavados con la misma solucin. A continuacin, se adicion 100 l de
solucin PNP por pozo, seguido por una incubacin de 45 minutos en
cmara hmeda. La reaccin fue detenida al agregar 50 l de 3M de
hidrxido de sodio a cada pozo.

69
Para la interpretacin de los resultados se realiz una lectura de la
absorbancia mediante un lector ELISA (MULTISKAN MCC/340 P. Version
2.33) utilizando un filtro a 405 nm.

TERMOTERAPIA
72 esquejes/ bandeja
por variedad
Cmara de crecimiento
38 +2 C
12/12 h luz/oscuridad
25 das

ENRAIZAMIENTO
72 esquejes/ bandeja
por variedad
21 das

Prueba serolgica ELISA

Pathoscreen Kit (DAS ELISA,
alkaline phosphatase label)

Virus moteado del clavel

CULTIVO in vitro DE
MERISTEMOS

Figura 3. Metodologa empleada para la atenuacin del CarMV
70
5.2.3 Micropropagacin del Material Vegetal

ESTABLECIMIENTO DE
MERISTEMOS in vitro

Desinfectacin
Etanol (50 %) 30 s
Hipoclorito de sodio (0.5 %) 3 min
4 Lavados de agua destilada
Obtencin y siembra del explante
Meristemo apical con 1 2 primordios
foliares

Medio y condiciones fsicas del cultivo
MS 7% agar
0.1 ppm de Kin
T 22 +2 C
16/8 h luz/oscuridad
HR 61 +2 %
30 das

MULTIPLICACIN in vitro
Brotes con 2 nudos
Ciclo 1 y Ciclo 2
MS 7 y 8% agar
25 das

Control: MS

T1: MS/2 Sacarosa 1.5 %

T2: MS/2 Sacarosa 1.5 % 1 ppm
de AIA.

ENRAIZAMIENTO in vitro
Brotes

Figura 4. Esquema de las fases realizadas en condiciones in vitro. Establecimiento
de meristemos, multiplicacin y enraizamiento. Medio Murashige & Skoog (MS).
Kinetina (Kin), Acido indolactico (AIA).

71

5.2.3.1 Establecimiento de meristemos in vitro

En esta fase, se utilizaron los esquejes de cada variedad que sobrevivieron a
la termoterapia. Los criterios de seleccin fueron las condiciones fisiolgicas
(turgencia del esqueje) y fitosanitarias (ausencia de hongos y/o bacterias)
(Figura 4).

5.2.3.1.1 Desinfestacin

Los esquejes se colocaron en recipientes estriles, mantenindose en
constante agitacin con diferentes sustancias de acuerdo con el siguiente
protocolo de desinfestacin (Castro, 2005):

1. Etanol al 50 % durante 30 segundos.
2. Solucin de Hipoclorito de sodio (Clorox) al 0.5 % durante 3 minutos.
3. Cuatro lavados con agua destilada, desionizada estril, en cmara de
flujo laminar.

5.2.3.1.2 Obtencin y siembra del explante

Los meristemos fueron extrados de los esquejes previamente desinfestados.
Cada uno fue colocado sobre una caja de Petri estril bajo el estereoscopio.
A cada esqueje se le retir el mayor nmero de hojas utilizando pinzas y
cuchilla No. 11 completamente estriles, hasta obtener el meristemo apical
del tallo con 2 primordios foliares (Figura 5.A). Cada meristemo se retir con
agujas y se sembr en el medio de cultivo (Figura 5.B).

El medio de cultivo utilizado fue el de MS (1962) cuya composicin se
describe en el Anexo 1. El pH del medio se ajusto a 5.7, se esteriliz
autoclavado durante 25 minutos a 120C y a 15 libras de presin por pulgada
72
cuadrada. Posterior a la siembra los tubos de ensayo se taparon con
VINIPEL. Los cuales fueron mantenidos en cuartos de incubacin con
temperatura de 22 + 2 C, con fotoperodo de 16 horas luz/ 8 horas
oscuridad y humedad relativa de 61 +2 %.

A B

Figura 5. Meristemo apical del esqueje de Dianthus caryophyllus. A. Meristemo
ubicado en el cono primordial del esqueje. B. Meristemo apical extraido del esqueje.

5.2.3.1.3 Medio y condiciones fsicas del cultivo

Durante la fase de establecimiento, el medio de cultivo fue suplementado con
3% de sacarosa y 0.1 ppm de Kinetina. El agente gelificante usado fue Agar
OXOID al 7 %. Estos explantes fueron mantenidos durante 30 das en este
medio. Posteriormente, fueron transferidos a medio MS sin reguladores de
crecimiento y 7 % de agar por 30 das.

5.2.3.2 Propagacin in vitro

El material proveniente de la fase de establecimiento se utiliz para iniciarla.
Los brotes diferenciados que presentaban 2 nudos fueron cortados y
transferidos a medio MS, con densidad de 2 3 explantes por recipiente. Los
recipientes fueron cubiertos con tapas Magenta para permitir el intercambio
gaseoso con el ambiente exterior. En esta fase se calcul la TP y TVM para
cada variedad.

73
Dentro de esta fase se definieron 2 ciclos de multiplicacin a realizarse.
Estos se generaron por la respuesta de los explantes en las condiciones in
vitro. Cada ciclo tuvo una duracin de 25 das.
Adicionalmente se evalu la consistencia del medio con respecto a la
hiperhidratacin de los explantes. Se utilizaron 2 concentraciones de agar
OXOID 7 % (Control) y 8% (T1).

5.2.3.3 Enraizamiento in vitro

En esta fase se subcultivaron los brotes desarrollados in vitro en medio MS,
con macronutrientes diludos a la mitad (MS/2), sacarosa al 1.5%,
correspondiente al tratamiento 1. El tratamiento 2 correspondi al MS/2 y 1
ppm de cido indolactico (AIA), para inducir la formacin de races. El
control perteneci a MS bsico sin reguladores de crecimiento (Tabla 8).

Tabla 8. Tratamientos evaluados en la fase de enraizamiento

Control MS
Tratamiento 1 MS / 2
Tratamiento 2 MS / 2 1ppm AIA

5.3 Recoleccin de la informacin

Los valores promedio de absorbancia obtenidos correspondieron a los tejidos
foliares de las 5 variedades sometidos a diferentes mtodos de atenuacin
del CarMV. Estos datos registrados con el lector ELISA (Anexo 2).

74
Para el proceso de micropropagacin se observ e identific cada una de las
fases. Se tomaron los datos para cada variable dependiente (% de
supervivencia, Tasa de prdida, Tasa de Velocidad de Multiplicacin, % de
brotes hiperhidratados y % de brotes que se desarrollo races), teniendo en
cuenta el tipo de muestra, durante cada una de las fases. Las lecturas se
iniciaron a los 20 de establecido el cultivo y se continuaron realizando con la
misma frecuencia (20 das). La informacin fue registrada en Excel y
organizada en tablas para ser analizada estadsticamente. Para esto se
utiliz el programa estadstico Statistical Anlisis System (S.A.S versin
8.11).

5.4 Anlisis de la informacin

5.4.1. Componente I. Atenuacin del CarMV

5.4.1.1 Prueba no paramtrica de Kruskall Wallis

Inicialmente se realiz un ANOVA para explicar las variaciones de la
respuesta del factor mtodo de atenuacin de virus y variedad. Al aplicar las
pruebas de normalidad de Shapiro Wilk y Kolmogorov Smirnov y las
pruebas de homocedasticidad de Levene. Se encontr que no se cumpli el
supuesto de normalidad, por lo que se determin que un anlisis de varianza
paramtrico no es el adecuado. Teniendo en cuenta estos resultados se
realiz un anlisis no-paramtrico. El nivel de significancia utilizado fue del
5% (Anexo 3 y 4).

Este anlisis se realiz utilizando la prueba de Kruskall-Wallis, la cual permite
un factor de anlisis por lo que se gener una variable llamada tratamiento
la cual present 21 niveles por la combinacin de los 3 mtodos
75
(termoterapia, cultivo in vitro de meristemos y la combinacin de los dos), las
5 variedades, el control positivo y negativo (Anexo 5 y 6).

El modelo estadstico utilizado para explicar las variaciones de la respuesta
del factor 1 y 2 y su interaccin, se describe a continuacin:

ijk ij j i ijk
y + + + + = ) (
con 3 , 2 , 1 = i y . 7 ...., 2 , 1 = j

Donde es la variable respuesta (absorbancia); es el efecto de la media
general; es el efecto del mtodo de atenuacin del CarMV; es el efecto
de la variedad; ( ) es la interaccin de los 2 factores (mtodo de
atenuacin del CarMV y variedad); y es el efecto debido al error
experimental.

5.4.1.2 Prueba de Rango Mltiple Duncan

Para determinar diferencias entre los 21 tratamientos (combinacin de los 3
mtodos de atenuacin del CarMV, las 5 variedades, el control positivo y
negativo), se utiliz la prueba de comparacin de medias (Prueba de Rango
Mltiple Duncan), a partir de los valores de absorbancia calculados para cada
muestra sometida a los mtodo de atenuacin del CarMV (Anexo 7).
5.4.2 Componente II. Proceso de micropropagacin

5.4.2.1 Anlisis de Varianza (ANOVA)

Para cada variedad se calcul un ANOVA (Modelo aleatorio simple MAS) y
una prueba de rango mltiple Duncan para encontrar diferencias
76
estadsticas entre las diferentes variedades en cada fase de la
micropropagacin (Anexos 8,10,12,14,16,18) .

En este caso se tiene un solo factor de inters por lo cual el modelo a ajustar
esta dado por la siguiente ecuacin:

ij i ij
y + + =
con 5 ,..., 2 , 1 = i

Donde es la variable respuesta (Tasa de prdida, Tasa de Velocidad de
multiplicacin); es el efecto de la media general; es el efecto de la
variedad; y es el efecto debido al error experimental.

Para utilizar este anlisis, fue necesario probar los supuestos de normalidad
y homocedasticidad. En este caso, al probar estas hiptesis se encontr que
los datos no son normales, por lo que se aplicaron diferentes
transformaciones de las cuales, al sacar la raz cuadrada, estos dos
supuestos se cumplan.

5.4.2.2 Prueba de Rango Mltiple Duncan

Para comprobar las diferencias entre las variedades se utiliz la prueba de
comparacin de medias (Prueba de Rango Mltiple Duncan), a partir de los
valores promedio de Tasa de Prdida calculados para cada variedad (Anexos
9, 11,13, 15, 17, 19).

77
6. RESULTADOS Y DISCUSIN
6.1 Componente I. Atenuacin del CarMV

La prueba inmunoenzinmtica ELISA detect la presencia del virus moteado
del clavel en los tejidos foliares de las 5 variedades analizadas en este
trabajo. Sin embargo, no se descarta la posibilidad de la presencia de otros
virus en las mismas. Pizano & Salazar (1992), reportan que adicional a la
incidencia del CarMV, el virus de la mancha anillada del clavel se encuentra
en las variedades sembradas en la Sabana de Bogot.

La presencia del CarMV encontrado en las 5 variedades mediante la prueba
ELISA, coincide con los resultados obtenidos en otros trabajos (Caldern &
Arbelez, 1999; Rodrguez et al., 2000), que establecen la alta incidencia del
virus moteado del clavel en los cultivos de la Sabana de Bogot,
encontrndose una proporcin del 82 % de muestras positivas. Martnez et
al., 1974 concluye que este virus presenta caractersticas endmicas en los
cultivos de esta regin.

Los resultados de las pruebas ELISA para detectar la presencia del CarMV
indican que las diferencias de los mtodos de termoterapia, el cultivo de
meristemos, solos y en combinacin, en cada variedad, mostraron
diferencias estadsticas entre s. Estas diferencias pueden estar relacionadas
con caractersticas genticas de cada variedad y su resistencia al virus.
Estos resultados son similares a los reportados por Caldern & Arbelez
(1999).

En la Figura 6 se observa el comportamiento de las muestras de cada
variedad sometidas a cada mtodo de atenuacin del virus. En general, las
cinco variedades actan de manera similar respecto a cada mtodo. La
variedad Marfil en la combinacin de ambos mtodos presenta valores de
78
0,1580 nm siendo estadsticamente iguales a los presentados por el control
negativo (0,1303 nm). Las dems variedades muestran diferencias
estadsticas con el control negativo respecto con los valores promedio de
absorbancia.
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
1,400
1,600
C.
Negativo
C. Positivo Marfil Mercedes Oranbri Picote
Vanesa
White Sim
V
a
l
o
r
e
s

p
r
o
m
e
d
i
o

d
e

a
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

(
n
m
)
COMBINADO Cultivo in vitro de meristemos TERMOTERAPIA

Figura 6. Resultados de la prueba DAS ELISA, en las cinco variedades y con
cada mtodo de atenuacin de virus, a partir de los valores promedio de
absorbancia (nm).

Los resultados obtenidos en la prueba ELISA con material vegetal sometidos
nicamente a termoterapia o a cultivo in vitro de meristemos presentaron
valores promedio de absorbancia de 1,279 y 0,987 nm respectivamente,
siendo estadsticamente iguales a los del control positivo (1,114) (Figura 7).
Mientras que a las muestras en las que se aplicaron la combinacin de los
dos mtodos, los valores presentados fueron (0,459 nm) prximos al control
negativo (0,130 nm).

Los esquejes que fueron sometidos al mtodo de termoterapia presentaron
valores desde 1,373 hasta 1,166 nm de absorbancia en las variedades.
Estos resultados fueron comparados con el control positivo (1,164 nm) y no
se mostraron diferencias estadsticas entre s. Lo que significa que la
concentracin del CarMV no se disminuy en ninguna de las muestras.

79
Estos resultados sugieren que se podra requerir un, mayor tiempo de
exposicin, ya que de acuerdo con Baker & Kinnaman (1973), la exposicin
de plantas de clavel por 2 meses a 38C, disminuye significativamente la
concentracin del CarMV. Sin embargo, la prolongacin del tiempo debe
decidirse con precaucin porque el exceso puede afectar los tejidos de las
plantas (Razdan, 2003).
No obstante, el rango del tiempo de exposicin adecuado para erradicar el
CarMV no es el nico factor que influye puesto que se han descrito
resultados opuestos como el que obtuvo Paludan (1985) con el virus del
enanismo de crisantemo (CSV). Este virus solo fue inactivado en un 2.9 % de
las plantas sometidas a termoterapia a 37C durante 210 das.

Por otro parte, el efecto de la temperatura induce variaciones en la expresin
del virus, la virulencia y modificaciones en las clulas como acumulacin de
viriones a nivel ultraestructural (Hearon & Lawson, 1980).

Resultados obtenidos con temperaturas de 32C en plantas de Saponaria
vaccaria (Familia Caryophyllaceae) con respecto al virus de la mancha
anular, evidencian que las inclusiones en el citoplasma no contienen viriones
o muy pocas partculas de stos junto con la reduccin de la virulencia. Sin
embargo, se observa como efecto adverso el aumento en la tasa de viriones
en los poros del ncleo y en ste. Esto sugiere que la sntesis de viriones
nucleares e inclusiones citoplasmticas son dos procesos separados que
incluyen diferentes enzimas o pasos con diferentes sensibilidades de
temperatura (Hearon & Lawson, 1980).

De acuerdo con estos resultados, la incubacin a una temperatura constante
de 38C pudo llegar a inhibir la formacin de inclusiones en el citoplasma
aunque pudo estimular la sntesis de partculas virales en el ncleo. Se
80
sugiere que para determinar la temperatura necesaria para inactivar el virus
del CarMV sin producir efectos adversos en las plantas, puede ser til
realizar estudios en las variaciones ultraestructurales de las clulas
infectadas a diferentes temperaturas.
Las muestras sometidas nicamente a el mtodo de cultivo in vitro de
meristemos y la combinacin de este con termoterapia presentaron
diferencias significativas con el control positivo, ya que los valores obtenidos
por las muestras sometidas al mtodo de cultivo in vitro de meristemos
fueron de 0,9878 nm, las de los mtodos combinados mostraron valores de
0,459 nm y las del control positivo fueron 1,114 nm Sin embargo los dos
mtodos fueron diferentes significativamente entre s y con respecto al
control negativo (0,130 nm) (Figura 7).

0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
Control
Negativo
Combinado Cultivo in vitro
de meristemos
Termoterapia Control Positivo
V
a
l
o
r
e
s

p
r
o
m
e
d
i
o

d
e

a
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

(
n
m
)

Figura 7. Efecto de los mtodos para la atenuacin del virus moteado de clavel
(CarMV) en esquejes de cinco variedades de clavel.

Los resultados obtenidos en la prueba ELISA con meristemos provenientes
del mtodo de cultivo in vitro presentan valores promedio de 0,987 nm
siendo menores que las muestras sometidas al mtodo de termoterapia
81
(1,279 nm) pero mayores que el que combina ambos mtodos (0,459 nm).
Adicionalmente la diferencia con el control negativo es significativa (0,130
nm). Esto indica que el material sometido nicamente a cultivo in vitro
tambin presenta el CarMV.

De acuerdo con Helliot (2001), la ventaja del cultivo in vitro de meristemos
depende del estado sanitario inicial del material vegetal (esquejes). En este
caso, el material utilizado en este proceso provino directamente del cultivo, lo
que podra sugerir una elevada concentracin del virus. Esto indica que el
estado fisiolgico y la condicin fitosanitaria de los esquejes que se van a
someter a cultivo in vitro son aspectos relevantes para el xito de los
procedimientos dirigidos a la limpieza y/o eliminacin del virus.
Adicionalmente se podra trabajar en sistemas de pre acondicionamiento in
vivo de los esquejes mediante prcticas culturales adecuadas (Horst, 1988).

Las muestras que se sometieron a la combinacin de los 2 mtodos
(termoterapia y cultivo in vitro de meristemos) presentaron los valores
promedio ms bajos de absorbancia (0,459 nm), dato significativamente
menor a los valores del material vegetal proveniente de los mtodos de
termoterapia y cultivo in vitro de meristemos por separado (1,279 y 0,987 nm
respectivamente). Sin embargo, tambin presenta diferencias con el control
negativo (0,130 nm). Este resultado demuestra que la utilizacin de los dos
mtodos parece incrementar la posibilidad de reducir la concentracin del
virus en las plantas sin ser erradicado completamente.

Hollings et al., (1972) reportan que el CarMV es el virus del clavel que
presenta mayor dificultad de ser eliminado por termoterapia y cultivo in vitro
de meristemos, razn por la cual es un excelente indicador de la calidad
sanitaria de las plantas madres de clavel.
82

Adicionalmente los efectos del CarMV pueden ser ms severos con el
tiempo, lo cual implicara un riesgo para mantener cultivos por perodos muy
prolongados, ya que las prdidas serian mayores y los daos tendran
efectos ms severos. El impacto ms importante del virus se presenta en la
calidad de las flores (Caldern & Arbelez, 1999).

Ante las limitantes atribuidas a la presencia del CarMV se propone la
realizacin de controles desde el inicio del cultivo del clavel (Gonzalez et al.,
1990). En la seleccin de las plantas madres se debe realizar un control
activo de los virus, definido por Hammond & Rosner (1994) como la
deteccin, identificacin y eliminacin de las plantas infectadas por virus.

6.2 Componente II. Proceso de micropropagacin del material vegetal

El primer material vegetal sometido a termoterapia present una respuesta
de supervivencia muy baja, especialmente en las variedades Picote Vanesa y
J un con un porcentaje del 41,7 y 11,1 % respectivamente. En las variedades
White Sim y Marfil el 70 % de los esquejes sobrevivieron (Figura 8).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
J un Marfil Orange Bri Picote Vanesa White Sim
(
%
)

S
u
p
e
r
v
i
v
e
n
c
i
a

Figura 8. Porcentaje de supervivencia de los esquejes sometidos a termoterapia

83
Los esquejes de estas variedades se caracterizaron por presentar lminas
foliares clorticas, deshidratacin y prdida de turgencia de la parte area
(Figura 10 A). Parece ser que estos fenmenos estuvieron asociados con el
bajo desarrollo del sistema radical. Snchez Daz & Aguirreola (2000)
describen que la absorcin de agua a travs de las races es
significativamente mayor a la absorcin foliar.

La prdida de agua de los esquejes pudo influir en el metabolismo de la
planta, principalmente en la reduccin del potencial hdrico y disminucin de
la presin de turgencia. Se han realizado estudios que demuestran que la
perdida de turgencia puede reducir la expansin celular y afectar el
transporte de iones a travs de las membranas (Taiz & Zeiger, 1998).

Adicionalmente, el retraso en la absorcin de agua a travs de las races y de
la lmina foliar se reflej en el marchitamiento de los esquejes. Esto tambin
se favoreci por las condiciones del mtodo (Temperatura de 38 C y
Humedad relativa de 90 %). Azcn Bieto & Taln (2000) describen que
temperaturas elevadas y la capacidad de absorcin del sistema radical son
elementos que afectan la calidad fisiolgica de la planta.

La reduccin en el nmero de esquejes tambin pudo estar relacionada con
la presencia de hongos en las lminas foliares. Esta respuesta se atribuye a
la condensacin de vapor generado por la transpiracin de las plantas, que
sumado a una temperatura alta (38C) generaron el ambiente adecuado para
el desarrollo de microorganismos.

84
Esta reduccin en el nmero de esquejes para cada variedad incidi en el
proceso de micropropagacin ya que el nmero de meristemos obtenidos fue
bajo y sus condiciones fisiolgicas no fueron las adecuadas, reflejndose en
niveles altos de prdida de material y respuestas deficientes en el nmero de
brotes. Razdan (2003) sugiere que el xito de la micropropagacin depende
en gran parte de la calidad fisiolgica de la planta donadora de explantes
(esquejes de plantas madres).

En la Figura 9, se observa que las variedades Orange Bri y Marfil perdieron
el total de meristemos sembrados (74 y 109 respectivamente), razn por la
cual no hubo una respuesta respecto al desarrollo de brotes. Por otro lado,
la variedad White Sim obtuvo los valores ms altos para el nmero de brotes
perdidos (168) y desarrollados (34) respecto a las dems variedades.

0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
J un Marfil Orange bri Picote
Vanesa
White Sim
N
m
e
r
o

Perdidos
Brotes

Figura 9. Nmero de brotes desarrollados y perdidos para cada variedad en el
proceso de micropropagacin

Con base en estos resultados no se logr realizar ningn anlisis estadstico
puesto que los datos obtenidos fueron poco representativos.

85
Del segundo material sometido a termoterapia se seleccionaron 50 esquejes
de cada variedad que se caracterizaron por presentar un buen desarrollo del
sistema radical que se vi reflejado en la turgencia del esqueje y en la
pigmentacin de las lminas foliares (Figura 10 B). Estos esquejes fueron
utilizados para el proceso de micropropagacin

A B
Figura 10. Esquejes de la variedad Picote Vanesa luego de ser sometidos al
mtodo de termoterapia. A) Grupo I. B) Grupo II.
6.2.1 Establecimiento in vitro de meristemos

Para esta fase de establecimiento in vitro se calcul la tasa de prdida a
partir de los meristemos que no presentaron ningn tipo de respuesta y los
que se contaminaron.

De acuerdo con el anlisis de varianza se determin que existen diferencias
estadsticamente significativas entre las variedades con respecto a la tasa de
prdida. Las variedades Marfil y Mercedes presentaron una tasa de prdida
similar 49,2 % y 49,3 % respectivamente, al igual que las variedades Orange
Bri (68,4 %) y Picote Vanesa (63,2 %), sin embargo entre estos dos grupos si
se presentaron diferencias.

86
En la figura 11 se observa el porcentaje de la tasa de prdida para cada
variedad. Las variedades que presentan la misma letra no difieren entre s.

0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
Marfil Mercedes Orange Bri Picote
Vanesa
White Sim
V
a
l
o
r
e
s

t
o
t
a
l
e
s

T
P

A
A
AB
B B

Figura 11. Valores totales de la Tasa de Prdida (TP) en la fase de establecimiento
in vitro de las 5 variedades de Dianthus caryophyllus.

A los 20 das se volvi a calcular la tasa de prdida para cada una de las
variedades y se encontraron diferencias estadsticas entre stas. Las
variedades Mercedes (17.6 %), Orange Bri (17.2 %), Picote Vanesa (10 %) y
White Sim (9.8 %) fueron agrupadas por la prueba Duncan, presentando una
tasa de prdida similar mientras que la variedad Marfil present la mayor tasa
de prdida con un valor de 66.2 % significativamente superior respecto a las
dems variedades (Figura 12).

87
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
Vanesa
White Sim
V
a
l
o
r
e
s

t
o
t
a
l
e
s

T
P
A
B
B B B

Figura 12. Valores totales de la Tasa de Prdida (TP) en la fase de
establecimiento in vitro de las 5 variedades de Dianthus caryophyllus.

Estos resultados indican que las tasas de prdida difieren dependiendo de la
variedad del clavel, siendo algunas ms susceptibles que otras. De acuerdo
con Fal et al., (2002) los factores genticos determinan la sensibilidad del
material vegetal a las condiciones ambientales, que se refleja en las
respuestas de crecimiento y morfognesis in vitro.

Estudios realizados en clavel revelan que cada variedad se comporta de
forma diferente. Como ejemplos se pueden citar el de Yadav et al., (2003)
que reporta que las variedades White Sim, Exquisite y Scania requirieron de
diferentes niveles de reguladores de crecimiento, concluyendo que la
respuesta es especfica para cada genotipo. Adicionalmente, Saher et al.,
(2004) encontr diferencias en la produccin de etileno en las diferentes
variedades. Fal et al., 1999 reportan que entre los diferentes genotipos de las
plantas de clavel se presentan diferencias. Densco (1987) sugiere que la
respuesta del explante puede estar afectada por el genotipo de la variedad.

88
Se podra sugerir que cada variedad tiene una respuesta a las condiciones in
vitro, razn por la cual el establecimiento del material no solo debe estar
basado en las condiciones in vitro sino en el genotipo de la variedad.

Adicional a el efecto de la variedad, la tasa de prdida tambin estuvo
asociada con la presencia de hongos en el cultivo in vitro. Debergh &
Zimmerman (1991) reportan que en las primeras etapas se alcanza el mayor
porcentaje de contaminacin. Esta situacin se atribuye a las condiciones
fsicas del cultivo que conforman un ambiente propicio para su desarrollo.

6.2.2 Propagacin in vitro

En la fase de propagacin in vitro se calcul la tasa de velocidad de
multiplicacin y la tasa de prdida para cada variedad. A la variedad Marfil no
se le cuantific la tasa de velocidad de multiplicacin, porque los brotes no
pudieron ser multiplicados ya que el tamao no era adecuado.

6.2.2.1 Ciclo de multiplicacin 1

En el ciclo de multiplicacin 1, el anlisis estadstico (p-valor=0.3803) indic
no existen diferencias estadsticas entre las variedades (Anexo 7).

En la Figura 13 se observa el comportamiento de cada variedad respecto a
la tasa total de velocidad de la multiplicacin, donde se aprecia una mayor
tasa de multiplicacin en la variedad White Sim, cercana a 0.66
explantes/da. La variedad que present la menor tasa de multiplicacin fue
Orange Bri (0.22 explantes/ da). Sin embargo las diferencias no son
estadsticamente significativas entre las variedades.

89
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
Mercedes Orange Bri Picote Vanesa White Sim
V
a
l
o
r
e
s

t
o
t
a
l
e
s

T
V
M

(
e
x
p
l
a
n
t
e
s

/

d
a
)

Figura 13. Tasa de multiplicacin en el ciclo de propagacin 1, para las variedades
Mercedes, Orange Bri, Picote Vanesa y White Sim de Clavel.

Durante este ciclo, la menor tasa de prdida correspondi a la variedad Marfil
(0), significativamente diferente a los valores presentados por las dems
variedades. Mientras que la variedad Orange Bri present la mayor tasa de
prdida con un porcentaje del 35% (Figura 14).

0%
5%
10%
15%
20%
25%
30%
35%
40%
Vanesa
White Sim
V
a
l
o
r
e
s

t
o
t
a
l
e
s

T
P
C
AB
A
AB
BC

Figura 14. Valores totales de la Tasa de Prdida (TP) en el ciclo de multiplicacin 1
de las 5 variedades de Dianthus caryophyllus.

90
La tasa de prdida estuvo asociada con la oxidacin de los explantes. Este
fenmeno se present como consecuencia de la hiperhidratacin severa de
los brotes.
Saher et al., (2004) plantean que en los tejidos hiperhidratados se observa un
aumento de las concentraciones de hierro. Estos cambios en los contenidos
de hierro pueden generar estrs oxidativo al convertir radicales superxido y
H2O2 no reactivos, en radicales hidroxilo muy txicos. De igual forma el hierro
cataltico (niveles elevados de hierro) promueve la descomposicin de lpidos
hidroperxidos a radicales alkoxy (LO) y peroxilo (LOO), lo que contribuye al
aumento de la peroxidacin de lpidos. Dicho estrs puede conducir a la
muerte tisular.

Adicionalmente el exceso de agua en los tejidos puede causar niveles de
saturacin, causando hipoxia. Bajo estas condiciones de estrs anaerbico
se pueden producir niveles txicos de H2O2 generando as estrs oxidativo.

Es probable que por estas razones, los tejidos que presentan
hiperhidratacin severa se oxiden lo cual puede conducir a la muerte celular.

Desde otra perspectiva la tasa de prdida pudo estar condicionada por las
caractersticas de las plantas donadoras, ya que stas se encontraban bajo
condiciones que afectaban su fisiologa; dicho factor se refiere al cambio de
temperatura durante la termoterapia. Read & Economou (1987) afirman que
el desempeo del explante en condiciones in vitro puede estar influenciado
por las caractersticas fisiolgicas de la planta donadora.

6.2.2.2 Ciclo de multiplicacin 2

En el segundo ciclo de multiplicacin, la variedad White Sim sigue
presentando la mayor tasa de velocidad de multiplicacin (1.49 explantes /
91
da). La respuesta ms baja la obtuvo Mercedes con un valor de 0.68
explantes/ da (Figura 15).

0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
Mercedes Picote Vanesa White Sim
V
a
l
o
r
e
s

t
o
t
a
l
e
s

T
V
M

(
e
x
p
l
a
n
t
e
s

/

d
a
)

Figura 15. Tasa de velocidad de multiplicacin en el ciclo de propagacin 2 para las
variedades Mercedes, Picote Vanesa y White Sim.

Estas diferencias pueden estar relacionadas con caractersticas del material
donante (planta madre) como son: edad, posicin del esqueje y el nmero de
podas (flush, se refiere al nmero de cosechas de esquejes). Trabajos
realizados en Corylus avellana L reportan que la multiplicacin de esta
especie utilizando explantes provenientes de plantas intactas (no
revigorizadas in vivo) o de plantas con podas leves o distanciadas entre s,
fue mas difcil que aquellas que haban recibido tratamientos revigorizantes
ms intensos. Se concluy por lo tanto que la utilizacin de material vegetal
ontognica y fisiolgicamente juvenil, permite mejores tasas de multiplicacin
durante el cultivo in vitro (Snchez-Olate et al., 2002; 2004).

Durante este ciclo para las 3 variedades aumentaron los valores de la tasa
de multiplicacin con relacin al resultado anterior (ciclo de multiplicacin 1).

92
Este resultado puede estar asociado con la revigorizacin
(rejuvenecimiento) de los tejidos que se expresa con el aumento de la
capacidad morfogentica. Al respecto Snchez- Olate et al., (2004) afirman
que la revigorizacin (rejuvenecimiento) en el cultivo in vitro se traduce en
un aumento de la tasa de multiplicacin a travs del tiempo.

Reafirmando lo anterior Daz Sala et al., (1995) reportan que brotes de
Corylus avellana L. introducidos in vitro, incrementaban su revigorizacin
(rejuvenecimiento) parcial a medida que aumentaba el nmero de
subcultivos en presencia de BAP (Bencil amino purina).

La reversin hacia un estado juvenil puede traducirse en una morfologa
diferente, modificaciones de las caractersticas fisiolgicas, y una mayor
aptitud para el enraizamiento. Estudios realizados en Sequioa sempervirens
reportan mayores tasas fotosintticas, incrementos en los contenidos de
nitrgeno y en las tasas respiratorias en tejidos revigorizados. Esto se
expresa en crecimientos ms rpidos y vigorosos de las plantas, relacionado
con el aumento de la sntesis de protenas favorecido por los altos contenidos
de nitrgeno y por la energa liberada por la respiracin (Huang et al., 2003).

La revigorizacin (rejuvenecimiento) de las plantas in vitro parece estar
favorecida por la ruptura de las interacciones entre el pice y los diferentes
rganos de la planta madre, ya que se ha visto que en una misma planta se
encuentran, yemas en diferentes estados de crecimiento (por ejemplo
crecimiento activo, reposo vegetativo y letargo inducido). De igual, forma se
ha descrito que la revigorizacin (rejuvenecimiento) es favorecida por el
pequeo tamao del explante, el reducido nmero de clulas que lo
componen y las constantes podas (Margara, 1988).

93
Adicionalmente el aumento en la tasa de multiplicacin pudo estar asociado
con el tipo de explante utilizado, es decir, el meristemo. Hartmann et al., 1997
reportan que al usar tejido meristemtico proveniente de zonas de intensa
divisin celular como son las yemas apicales o axilares, se produce una
organognesis directa, manifestada en la formacin de un nuevo brote y
races a partir de la yema explantada. Estas yemas con una adecuada
composicin del medio de cultivo pueden ser inducidas a la brotacin
mltiple, aumentando as la tasa de multiplicacin de la especie.

Corroborando lo anterior Smith (1992) expone que los tejidos meristemticos
jvenes demuestran tener mayor capacidad regenerativa. Por otro lado el
tamao del explante tambin influye, ya que los explantes grandes poseen
un potencial regenerador considerablemente mayor con respecto a los de
menor tamao, los cuales por su parte presentan una viabilidad y capacidad
regenerativa ms baja.

En el ciclo de multiplicacin 2 se presentaron diferencias estadsticas para la
tasa de prdida entre las variedades. Las variedades Marfil y Orange Bri
obtuvieron valores de 86.4 y 88 % respectivamente siendo significativamente
diferentes a las variedades Mercedes (27.3 %), White Sim (13.7 %) y Picote
Vanesa (13.5 %) a su vez esta variedad present la tasa mas baja pero esta
no difiere estadsticamente de White Sim. En la figura 16, se describe el
comportamiento de cada una de las variedades con relacin a la tasa de
prdida.

94
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Vanesa
White Sim
V
a
l
o
r
e
s

t
o
t
a
l
e
s

T
P
A A
B
CB C

Figura 16. Valores totales de la Tasa de Prdida (TP) en el ciclo de propagacin 2
de las 5 variedades de Dianthus caryophyllus.

6.2.2.3 Efecto de la concentracin de agar en la hiperhidratacin

Los datos presentados en la Figura 17 indican el porcentaje de brotes
hiperhidratados y no hiperhidratados de cada variedad respecto al
tratamiento utilizado. El porcentaje de brotes hiperhidratados disminuy con
el aumento de la concentracin de agar. Las variedades Mercedes y White
Sim presentaron un comportamiento similar entre s, en las 2 variedades los
porcentajes ms altos de brotes hiperhidratados se obtuvieron en el control
(7 % de agar) (89.2 y 83.3 % respectivamente) mientras que los porcentajes
ms altos de brotes no hiperhidratados ocurrieron en el tratamiento 1(8 % de
agar). Sin embargo, el porcentaje de brotes hiperhidratados y no
hiperhidratados de la variedad Picote Vanesa fue similar en el control y en el
tratamiento 1.
95
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
T1 Control T1 Control T1 Control
B
r
o
t
e
s

(
%
)
Hiperhidratados No Hiperhidratados

Figura 17. Efecto de la concentracin de agar sobre la hiperhidratacin de los
explantes de las variedades Mercedes, Picote Vanesa y White Sim durante la etapa
de multiplicacin. T1: 8 % de agar; Control: 7 % de agar.

Estos resultados indican que el aumento en la concentracin de agar
disminuye el porcentaje de brotes hiperhidratados en las variedades
estudiadas. Al respecto Leshem (1983), afirma que la concentracin de agar
en el medio influye en la morfognesis de los brotes por la reduccin del
potencial hdrico del medio, causndoles hiperhidratacin. Este autor
concluye que el aumento en la concentracin de agar en el medio produce un
leve estrs hdrico dando como resultado un mayor nmero de plantas no
hiperhidratadas.

Complementando este planteamiento, Kevers & Gaspar (1986), explican que
las condiciones de hiperhidratacin en medios lquidos o en medios slidos
con altos contenidos de agua inducen a un exceso en la toma de agua de las
plantas de clavel. Esta abundancia en la cantidad de agua se localiza en el
espacio extracelular, especialmente en el periplasma, como consecuencia la
96
cantidad de agua intracelular disminuye. A medida que se pierde el agua de
la clula, la vacuola se contrae progresivamente, con una cada concomitante
en la turgencia celular, lo que lleva a una plasmlisis entre el protopasto y la
pared celular. Por lo tanto, las plantas hiperhidratadas bajo condiciones de
exceso de agua se encuentran en un estrs osmtico.

Igualmente, otros estudios concluyen que el incremento en la concentracin
de agar en el medio reduce la hiperhidratacin, aunque este efecto implica un
descenso de la tasa de multiplicacin (Choudhary & Prakash 1993; Tsay,
1998). Por esta razn se sugiere que para mejorar los resultados, se debe
limitar la sntesis foliar con retardantes de crecimiento y no intentar controlar
la hiperhidratacin en la fase de multiplicacin. El desarrollo foliar se debe
permitir luego de esta etapa (Ziv, 1991). Esto se apoya en la conclusin de
Leshem (1983) que afirma que el estado hiperhdrico de las plantas puede
ser reversible.

6.2.3 Fase de Enraizamiento in vitro

En la fase de enraizamiento in vitro se calcul la presencia o ausencia de
races en los brotes. Los resultados obtenidos muestran que con los 3
tratamientos evaluados se presentaron brotes con desarrollo de races en las
cinco de variedades. La capacidad que tienen las plantas en condiciones in
vitro para la produccin de races adventicias parece estar relacionada con la
revigorizacin (rejuvenecimiento) del material vegetal. Hartmann et al.,
(1997) sealan que el incremento en la induccin de races in vitro esta
relacionado con la reversin a un estado juvenil logrado por el aumento en el
nmero de subcultivos.

97
Complementando este planteamiento Snchez Olate et al., (2004) afirman
que el aumento del potencial de enraizamiento puede persistir luego de la
micropropagacin. Dichas plantas producidas en condiciones in vitro pueden
ser muy tiles como plantas madres para la produccin de esquejes por
mtodos convencionales.

En el caso concreto del clavel, el establecimiento de plantas madres se debe
realizar solamente con esquejes enraizados y vigorosos (Pizano, 2000).
Basndose en este planteamiento la revigorizacin (rejuvenecimiento) de
los tejidos in vitro relacionado con un incremento en el potencial de
enraizamiento de los tejidos cultivados, puede ser conveniente en el
momento de sembrar las plantas madres.

En el control (MS sin reguladores de crecimiento) la variedad White Sim
present el mayor porcentaje de brotes que desarrollaron races (64.3%), al
igual que con el tratamiento 1 (MS/2 sin reguladores de crecimiento) (61.5
%). Mientras que con el tratamiento 2 (MS/2 1 ppm de AIA) el mayor
porcentaje de brotes que desarrollaron races lo obtuvo la variedad Picote
Vanesa con un valor de 81.8 %. Este fue el valor ms alto de todos los
tratamientos y variedades (Figura 18).

98
0,0%
10,0%
20,0%
30,0%
40,0%
50,0%
60,0%
70,0%
80,0%
90,0%
Presente Ausente Presente Ausente Presente Ausente
Control T1 T2
%

B
r
o
t
e
s

Figura 18. Efecto de la concentracin del medio de cultivo y del AIA sobre el
desarrollo de races (%) en las variedades: Mercedes, Picote Vanesa y White Sim.

Estos resultados muestran que la respuesta al tratamiento depende de la
variedad. El porcentaje ms alto en el desarrollo de races por variedad difiri
en los tratamientos evaluados. Las variedades Mercedes y Picote Vanesa
presentaron los porcentajes ms altos en el desarrollo de races en el
tratamiento de MS/2 con 1 ppm de cido indolactico (AIA) (54.5 y 81.8 %,
respectivamente) (Figura 19). Oliver Ortega et al., (2000) reportan que en el
enraizamiento in vitro, se ha observado que la iniciacin de raz y la
posibilidad de enraizamiento pueden aumentar de manera significativa al
disminuir los niveles de sales minerales en el medio nutritivo, lo cual mejora
el enraizamiento y la aclimatacin en invernadero. La concentracin de AIA
tambin influy en los resultados, Toro (2004) reporta un 70,8 % en la
formacin de races en Prunus avium; sin embargo el desarrollo de la
relacin raz parte rea, fue muy bajo repercutiendo en la aclimatacin del
material.

99
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
%

B
r
o
t
e
s
Control T1 T2

Figura 19. Comparacin del efecto de los tratamientos aplicados para la induccin
de races in vitro para cada variedad.

Contrario a estos resultados la variedad White Sim no mostr diferencias con
respecto a la formacin de races con ninguno de los tratamientos evaluados,
lo que sugiere que esta variedad no requiere auxinas exgenas para la
produccin de races. Esto coincide con el estudio realizado por Cuzzuol et
al., (1996) que concluyen que el enraizamiento de clavel puede ser obtenido
sin la necesidad de suplementar el medio con auxinas. Este resultado puede
ser atribuido aparentemente por la produccin de auxinas endgenas en la
planta. De acuerdo con Col et al., (1988) las partes areas, principalmente
las hojas fuentes, tienen una produccin intensa de auxinas que pueden ser
translocadas a la base para estimular la rizognesis.

Adicionalmente, estos autores describen que el enraizamiento ex vitro puede
presentar mejores resultados con relacin al enraizamiento in vitro. El
desarrollo de races en condiciones ex vitro puede producir un sistema
radical ms completo y funcional con mayor nmero de races secundarias.
Adems se sugiere que el enraizamiento en condiciones in vitro puede
presentar desventajas tales como: un sistema radical no funcional, mayores
probabilidades de contraer enfermedades durante el transplante y
conexiones limitadas del sistema vascular entre el tallo y la raz. (Debergh &
100
Read, 1991). Todo esto se ve reflejado en la supervivencia y desarrollo de
las plantas durante la aclimatizacin.

6.2.4 Comportamiento de las variedades a travs del tiempo

Al analizar el comportamiento entre variedades durante las fases se observa
que la tasa de prdida para Mercedes, Picote Vanesa y White Sim es
similar. Durante la primera fase del establecimiento (T1), se encuentran los
mayores valores en un rango de 49.3 a 68.4 %. En el segundo registro del
establecimiento (T2) decrecen los valores drsticamente con relacin al
tiempo 1 (9.8 a 17.6 %). Exceptuando la variedad Marfil ya que en esta se
observa un aumento del 17 % respecto al tiempo 1. En la siguiente fase que
incluye el ciclo de multiplicacin 1 (T3) y el ciclo de multiplicacin 2 (T4), los
valores tienden a aumentar entre un 4 y 10 % respecto al tiempo 2. Sin
embargo la variedad Orange Bri tiene un incremento de 53.8 % del tiempo 3
al tiempo 4 (Figura 20).

.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
T1 T2 T3 T4
Tiempo
V
a
l
o
r
e
s

t
o
t
a
l
e
s

T
P
Marfil Mercedes Orange Bri Picote Vanesa White Sim

Figura 20. Tasa de prdida en el tiempo para cada variedad

101
Los resultados altos en la tasa de prdida en las variedades Marfil y Orange
Bri sugieren que estas variedades presentan caractersticas recalcitrantes al
cultivo in vitro. Al respecto Benson (2000) definen a una especie recalcitrante
como aquellas que no responden o presentan una pobre reaccin al cultivo in
vitro. Esto puede ocurrir en cualquier etapa del cultivo; aunque no existe
alguna razn obvia para pensar que algn proceso del cultivo ocasione esta
reaccin.

Cuando se subcultivaron los explantes de estas variedades, la coloracin del
tejido se torn amarilla y se observ un crecimiento muy bajo, lo que no
permiti la multiplicacin de stos explantes. Anthony et al., (1999) sugieren
que la oxidacin de los tejidos es una causa frecuente de la recalcitracin
que ocurre por sus altos contenidos fenlicos

Al evaluar el comportamiento de las variedades, exceptuando la variedad
Orange Bri, en los dos ciclos de multiplicacin se observa una tendencia
creciente respecto a la tasa de velocidad de multiplicacin (Figura 21). Esto
podra ser explicado por el aumento en la capacidad morfognetica a travs
de los subcultivos (CONIF, 2005).
La variedad White Sim es la que tiene la mayor tasa de multiplicacin,
seguida por Picote Vanesa. Sin embargo, el comportamiento de la variedad
Orange Bri es totalmente opuesto, ya que tiene una tasa de velocidad de
multiplicacin de 22 explantes/da y termina con un valor 0.

102
0
0,5
1
1,5
2
Ciclo de propagacin 1 Ciclo de propagacin 2
Tiempo
V
a
l
o
r
e
s

t
o
t
a
l
e
s

T
V
M
Mercedes Orange Bri Picote Vanesa White Sim

Figura 21. Tasa de velocidad de multiplicacin en el ciclo de multiplicacin 1 y 2
para cada variedad

El nmero de brotes no hiperhidratados para cada variedad durante las
diferentes fases es variable. En la Figura 22 se observa que la variedad
Picote Vanesa presenta el mayor nmero de brotes no hiperhidratados
(Figura 23 B) durante todas las fases con valores entre 24 y 19. Mercedes y
White Sim tienen un comportamiento similar entre s; en el ciclo de
multiplicacin 2 (T4) se presenta un ligero incremento en el nmero de brotes
no hiperhidratados para las variedades Mercedes y White Sim.

103
0
5
10
15
20
25
30
T1 T2 T3 T4
Ti empo
N
m
e
r
o

d
e

b
r
o
t
e
s

n
o

h
i
p
e
r
h
i
d
r
a
t
a
d
o
s

Figura 22. Nmero de brotes exitosos en cada variedad a travs del tiempo

B A
Figura 23. Brotes de Dianthus caryophyllus obtenidos in vitro. A: Brote
hiperhidratado de la variedad Mercedes. B: Brote no hiperhidratado de la variedad
Picote Vanesa.

Como se describi anteriormente, la hiperhidratacin es un desorden
fisiolgico comn en las plantas de clavel cultivadas en condiciones in vitro.
En las variedades de estudio se present este fenmeno desde la primera
fase. Los signos iniciales se manifestaron durante las primeras semanas e
incrementaron a lo largo del cultivo. Inicialmente se present en las hojas
104
que estaban en contacto con el medio. Las hojas se caracterizaron por
presentar una apariencia frgil y translcida, en algunos casos se presentaba
oxidacin en las puntas de los tejidos (Figura 23 A).

En la Figura 24, se presenta el nmero de brotes hiperhidratados por
variedad durante las fases del proceso de micropropagacin, las cuales
mostraron un comportamiento similar. Inicialmente el nmero de brotes
vitrificados fue mayor pero con el tiempo disminuy. Las variedades
Mercedes y White Sim obtuvieron los resultados ms altos iniciando con 63 y
54 hasta 22 y 32 respectivamente. En las variedades restantes los valores
fueron similares se encontraron en un rango inicial de 36 a 26 y finalizaron
con un rango de 13 a 3.

0
10
20
30
40
50
60
70
T1 T2 T3 T4
Ti empo
N
m
e
r
o

d
e

b
r
o
t
e
s

h
i
p
e
r
h
i
d
r
a
t
a
d
o
s

Figura 24. Nmero de brotes hiperhidratados por variedad a travs del tiempo.

105

6.2.5 Clculo del potencial productivo

El clculo del potencial productivo se bas en la Tasa de prdida (TP) y de
velocidad de multiplicacin (TVM), calculada para la variedad White Sim, por
presentar el comportamiento ms eficiente en el proceso de
micropropagacin, en comparacin a las dems variedades.
Con base en estos datos se estim la produccin de 5000 plantas enraizadas
de sta variedad en un perodo de 6 meses. Teniendo en cuenta las mismas
condiciones de ste trabajo.

Para producir 77 plantas enraizadas fueron necesarios 50 esquejes de los
cuales se obtuvieron 149 meristemos, el 67.1 % (TP) fueron eliminados por
diferentes causas, dando como resultado 49 plantas, estas se incrementaron
a 77 plantas con una TVM de 1,5625. Con base en estos resultados se
estim el clculo para producir 5000 plantas.

3273 Esquejes =9750 meristemos (67.1 % TP) =3200 plantas * 1.5625
(TVM) =5.000 plantas.

Establecimiento
Meristemos obtenidos * Da (D) * 1 propagadora =100 meristemos.
No. Das laborales * Mes (M) =24
Meristemos trabajados * (M) * 1 propagadora =2400 meristemos.
No. de meses de trabajo =4 = 9750 meristemos

Multiplicacin
Plantas propagadas * (D) * 1 propagadora =210 plantas
No. Das laborales * (M) =24
106
Plantas propagadas * (M) * 1 propagadora =5000 plantas.

Enraizamiento
Plantas propagadas * (D) * 1 propagadora =210 plantas
No. Das laborales * (M) =24
Plantas propagadas * (M) * 1 propagadora =5000 plantas

Se realiz un anlisis de costos para el proceso de micropropagacin de
clavel (Variedad White Sim), de acuerdo con los parmetros operativos como
densidad de siembra, volumen los medios de cultivos utilizados, materiales,
prueba para la deteccin del virus moteado del clavel (CarMV) y personal.

Densidad de siembra: Plantas * Frasco =2
Volumen de litro (L) de Medio de Cultivo MS Sigma * Frasco=0.20
Costo (L) de medio * 100 plantas =$ 5.000
Costo de 200 L de medio MS para 5000 plantas =$ 1.000.000
Costo MS * Fase de Establecimiento = $ 500.000 (100 L)
Costo MS * Fase de Multiplicacin = $ 250.000 (50 L)
Costo MS * Fase de Enraizamiento = $ 250.000 (50 L)
Materiales * Mes =$ 500.000
Materiales * 6 Meses =$ 3.000.000
Costo propagadora * 1 Mes =$ 800.000
Costo propagadora * 6 Meses =$ 4.800.000

Prueba ELISA =$ 757.000 para 96 muestras =$ 7900 muestra.

Costo TOTAL = $ 9.560.000
Costo Unidad = $ 1912

107
El costo total de produccin para 5000 plantas de la variedad White Sim es
de $ 9.560.000 incluido la evaluacin del CarMV, lo que indica que cada
planta tiene un costo de $ 1.912. Este valor es superior comparado con el
costo de una planta obtenida por propagacin convencional. Sin embargo, se
debe tener en cuenta que el valor agregado se encuentra en la calidad del
material vegetal (revigorizacin y control del CarMV).

108

7. CONCLUSIONES

Se evidenci la capacidad morfogentica de la especie Dianthus
caryophyllus L. especialmente en las variedades Mercedes, Picote
Vanesa y White Sim. Se diseo un protocolo para la propagacin in
vitro a partir de meristemos de estas variedades.

La prueba ELISA detect la presencia del virus moteado del clavel
(CarMV) en los esquejes y meristemos de las 5 variedades
estudiadas. La concentracin del virus se redujo utilizando el mtodo
combinado de termoterapia y cultivo in vitro de meristemos.

El estado fisiolgico y la condicin fitosanitaria de los esquejes que se
van a someter a cultivo in vitro son aspectos relevantes para el xito
de los procedimientos dirigidos a la limpieza y/o eliminacin del virus.

La procedencia del material vegetal, es un factor que inciden
significativamente sobre el establecimiento, multiplicacin y
enraizamiento in vitro de explantes de 5 variedades de clavel.

La tasa de prdida y la tasa de velocidad de multiplicacin, dependen
de la variedad por lo que se concluye que la respuesta es especfica
para cada genotipo.

La tasa de prdida durante el establecimiento se asoci con la
presencia de microorganismos (hongos y bacterias), oxidacin e
hiperhidratacin.

109
La tasa de velocidad de multiplicacin de las variedades Mercedes,
Picote Vanesa y White Sim pudo estar relacionada con caractersticas
fisiolgicas inherentes al material vegetal.

Las variedades Marfil y Orange Bri presentaron caractersticas
recalcitrantes al cultivo in vitro.

Las 5 variedades son sensibles a la hiperhidratacin en condiciones in
vitro. El aumento en la concentracin de agar disminuye el porcentaje
de brotes hiperhidratados.

El medio MS con macronutrientes diluidos a la mitad, sacarosa al 1.5
% y con 1 ppm de AIA fue adecuado para estimular la formacin de
races en las plantas de las variedades Mercedes y Picote Vanesa. El
enraizamiento de las plantas in vitro de la variedad White Sim no
requiere de la adicin de AIA al medio.

Con base en el protocolo establecido para la variedad White Sim, se
estim que para la produccin de 5000 plantas madres se requiere un
perodo de 6 meses. El valor de una planta producida in vitro es de
$1.912.

110

8. RECOMENDACIONES

Realizar un seguimiento en campo del material vegetal que se someti
a cultivo in vitro para validar el proceso de micropropagacin.

Aplicar nuevamente los mtodos de Termoterapia y Cultivo in vitro de
meristemos al material vegetal.

Realizar controles activos en los bancos de plantas madres.

Evaluar diferentes condiciones para la propagacin in vitro de las
variedades Marfil y Orange Bri con el fin de optimizar la TVM.

111

9. LITERATURA CITADA

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126
ANEXOS

ANEXO 1. Composicin del medio nutritivo Murashige & Skoog (MS)
(1962)

Soluciones Referencia (SIGMA) Reactivo mg/L
Macronutrientes A3795 Nitrato de Amonio 1650
P8291 Nitrato de Potasio 1900
P8416 Fosfato de Potasio 170
monobsico
C2536 Cloruro de Calcio 440
Dihidrato
M7774 Sulfato de Magnesio 370
Heptahidrato

Micronutrientes B9645 cido Brico 6,2
M7634
Sulfato de
Manganeso 15,5
Monohidrato
Z1001 Sulfato de Zinc 8,6
Heptahidrato
C2911 Cloruro de Cobalto 0,025
Hexahidrato
M1651 Molibdato de Sodio 0,25
Dihidrato
C3036 Sulfato Cuprico 0,025
Pentahidrato

Vitaminas T3902 Tiamina-HCl 0,1
P8666 Piridoxina-HCl 0,5
N0765 cido Nicotnico 0,5

Yoduro de
Potasio KI 0,83

Glicina G6143 2

EDTA E6635 EDTA 37,3
F8263 Sulfato de Hierro 27,8
Heptahidrato

Mio - inositol I3011 100

127

Anexo 2. Resultados de la prueba ELISA (valores de absorbancia nm) en cada
mtodo de cada variedad

Mtodo de Termoterapia

Esqueje Control positivo
Picote
Vanesa Oranbri Mercedes Marfil
White
Sim
Control
negativo
1 1,27 1,3 1,326 1,101 0,889 1,131 0,104
2 1,131 1,272 1,416 1,344 1,121 1,472 0,117
3 1,129 1,235 1,438 1,208 1,312 1,348 0,18
4 1,126 1,258 1,312 1,37 1,345 1,399 0,122

Mtodo Cultivo de tejidos in vitro

Meristemo Control positivo P. Vanessa Oranbri Mercedes Marfil
White
Sim
Control
negativo
1 0,987 1,042 1,076 1,085 0,222 1,042 0,109
2 1,121 1,101 1,356 0,945 0,864 1,011 0,128
3 1,138 1,196 1,128 0,834 0,94 0,975 0,154

Mtodo Termoterapia y Cultivo de tejidos in vitro

Meristemo Control positivo P. Vanessa Oranbri Mercedes Marfil
White
Sim
Control
negativo
1 0,987 0,568 0,609 0,446 0,163 0,882 0,109
2 1,121 0,132 0,155 0,896 0,152 0,845 0,128
3 1,138 0,655 0,15 0,828 0,159 0,258 0,154

Anexo 3. Componente I Atenuacin del CarMV. Prueba de Normalidad de la prueba
ELISA para los 3 mtodos.

Prueba de Normalidad
Test Statistic p Value
Shapiro-Wilk W 0.858396 Pr <W <0.0001
128
Prueba de Normalidad
Test Statistic p Value
Kolmogorov-Smirnov D 0.171259 Pr >D <0.0100

Anexo 4. Componente I. Atenuacin del CarMV. Prueba de Homoestacidad de la
prueba ELISA para los 3 mtodos.

Homocedasticidad
Prueba Pr >F
Levene 0.8008

Anexo 5. Tabla de los tratamientos (mtodo y variedad) para aplicar la prueba
Kruskall Wallis

Mtodo Variedad Tratamiento Mtodo Variedad Tratamiento
Sin termoterapia Control + 1 Termoterapia Mercedes 12
Sin termoterapia P. Vanessa 2 Termoterapia Control - 13
Sin termoterapia Orange Bri 3 Termoterapia W. Sim 14
Sin termoterapia Marfil 4 Combinado Control + 15
Sin termoterapia Mercedes 5 Combinado P.Vanessa 16
Sin termoterapia Control - 6 Combinado Orange Bri 17
Sin termoterapia W. Sim 7 Combinado Marfil 18
Termoterapia Control + 8 Combinado Mercedes 19
Termoterapia P. Vanesa 9 Combinado Control - 20
Termoterapia Orange Bri 10 Combinado W. Sim 21
Termoterapia Marfil 11

129
Anexo 6. Componente I. Atenuacin del CarMV. Prueba Kruskall Wallis para las
variables mtodo y variedad

Kruskal-Wallis Test
Chi-Square 61.4789
DF 20
Pr >Chi-Square <.0001

Anexo 7. Componente I. Atenuacin del CarMV . Prueba Duncan para las variables
mtodo y variedad

Medias con la misma letra no son
significativamente diferentes
Duncan Grouping Media N TR
A 1.3730 4 10
A 1.3375 4 14
B A 1.2663 4 9
B A C 1.2558 4 12
B A C 1.1867 3 3
B A C 1.1668 4 11
B A C 1.1640 4 8
B A C 1.1130 3 2
B A C 1.0820 3 1
B A C 1.0820 3 15
B C 1.0093 3 7
D C 0.9547 3 5
130
Medias con la misma letra no son
significativamente diferentes
Duncan Grouping Media N TR
E D 0.7233 3 19
E 0.6753 3 4
E 0.6617 3 21
E F 0.4517 3 16
G F 0.3047 3 17
G 0.1580 3 18
G 0.1308 4 13
G 0.1303 3 6
G 0.1303 3 20

Prueba ANOVA para la variable Tasa de prdida (Primera Fecha).

Fuente g.l Suma Cuadrados Cuadrado medio F-valor Pr >F
Modelo 4 0.06221913 0.01555478 4.10 0.0138
Error 20 0.07593129 0.00379656
Total 24 0.13815042

131
Prueba Duncan para la variable Tasa de prdida (Primera Fecha).

Means with the same letter are
not significantly different.
Duncan Grouping Mean N variedad
A 0.82700 5 ORANBRI
A 0.79297 5 PICOTE
B A 0.75371 5 WHITE
B 0.70158 5 MERCEDES
B 0.70057 5 MARFIL

Prueba ANOVA para la variable Tasa de prdida (Segunda Fecha).

Model 4 1.12258713 0.28064678 11.11 <.0001
Error 20 0.50512795 0.02525640
Corrected Total 24 1.62771508

132
Prueba Duncan para la variable Tasa de prdida (Segunda Fecha).

A 0.8063 5 MARFIL
B 0.4037 5 MERCEDES
B 0.3206 5 WHITE
B 0.2462 5 PICOTE
B 0.2282 5 ORANBRI

Multiplicacin 1).

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr >F
Model 3 0.02160494 0.00720165 1.09 0.3803
Error 16 0.10534979 0.00658436

133
Multiplicacin 1).

Duncan Grouping Mean N Variedad
A 0.13333 5 WHITE
A 0.07407 5 MERCEDES
A 0.06667 5 PICOTE
A 0.04444 5 ORANBRI

Prueba ANOVA para la variable Tasa de prdida (Ciclo de Multiplicacin 1).

Model 4 0.83866536 0.20966634 4.34 0.0110
Error 20 0.96715700 0.04835785

134
Prueba Duncan para la variable Tasa de prdida (Ciclo de Multiplicacin 1).

A 0.5311 5 ORANBRI
B A 0.4098 5 MERCEDES
B A 0.3689 5 PICOTE
B C 0.2127 5 WHITE
C 0.0000 5 MARFIL

Multiplicacin 2).

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr >F
Model 2 0.08125000 0.04062500 1.24 0.3245
Error 12 0.39375000 0.03281250

135
Multiplicacin 2).

A 0.3125 5 WHITE
A 0.1875 5 PICOTE
A 0.1375 5 MERCEDES

Prueba ANOVA para la variable Tasa de prdida (Ciclo de Multiplicacin 2).

Model 4 1.93154882 0.48288721 21.32 <.0001
Error 20 0.45295820 0.02264791

Prueba Duncan para la variable Tasa de prdida (Ciclo de Multiplicacin 2).

A 0.95161 5 ORANBRI
136
A 0.90063 5 MARFIL
B 0.50847 5 MERCEDES
C B 0.37745 5 WHITE
C 0.26177 5 PICOTE

137

Tesis 68

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