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ANLISIS FITOQUMICOS PRELIMINARES Y DE

ACTIVIDAD BIOLGICA DE CUATRO ESPECIES NATIVAS
DE LAS REAS RURALES DEL DISTRITO CAPITAL
Erika Andrea Plazas Gonzlez
QUMICA-M.Sc QUMICA
234-2012

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ANLISIS FITOQUMICOS PRELIMINARES Y DE ACTIVIDAD BIOLGICA DE
CUATRO ESPECIES NATIVAS DE LAS REAS RURALES DEL DISTRITO
CAPITAL






Erika Andrea Plazas Gonzlez
QUMICA-MAGISTER EN CIENCIAS QUMICA
CONTRATO 234










JARDN BOTNICO JOS CELESTINO MUTIS
SUBDIRECCIN CIENTFICA
BOGOT D.C.
2012
3




CONTENIDO

1. INTRODUCCIN .............................................................................................. 10
2. DESCRIPCIN DEL PROBLEMA .................................................................... 11
3. JUSTIFICACION ............................................................................................... 12
4. OBJETIVOS ...................................................................................................... 14
4.1.Objetivo general ........................................................................................... 14
4.2. Objetivos especficos................................................................................... 14
5. ESTADO ACTUAL DEL TEMA ........................................................................ 15
5.1. Familia Hyperaceae .................................................................................... 15
5.1.1. Gnero Hypericum ................................................................................... 16
5.2. Familia Apiaceae ......................................................................................... 21
5.2.1 Gnero Hydrocotyle................................................................................... 21
5.3. Familia Coriariaceae ................................................................................... 24
5.3.1. Gnero Coriaria ........................................................................................ 25
5.4 Familia Astereraceae ................................................................................... 28
5.4.1. Gnero Diplostephium .............................................................................. 30
6. DISEO METODOLGICO .............................................................................. 34
6.1. Revisin bibliogrfica .................................................................................. 34
6.2. Recoleccin del material vegetal ................................................................ 34
6.3. Obtencin de extractos ................................................................................ 34
6.4. Anlisis fitoqumico preliminar .................................................................... 34
6.5. Estudio cromatogrfico preliminar ............................................................... 35
6.6. Cuantificacin de fenoles ............................................................................ 35
6.7. Evaluacin de la toxicidad ........................................................................... 35
7. RESULTADOS ................................................................................................. 37
7.1. Recoleccin del material vegetal ................................................................ 37
4


7.2. Obtencin de extractos ................................................................................ 38
7.3. Anlisis fitoqumico preliminar .................................................................... 42
7.4. Cuantificacin de fenoles ............................................................................ 54
7.5. Fraccionamiento de extractos ..................................................................... 58
7.6. Estudio cromatogrfico ................................................................................ 63
7.7. Evaluacin de la toxicidad ........................................................................... 66
8. REPORTE DE METAS PLAN DE DESARROLLO .......................................... 69
8.1. Estudio fitoqumico preliminar y evaluacin de actividad antioxidante y txica
de las especies Hypericum mexicanum e Hydrocotyle bonplandii ....................... 69
8.2. Estudio fitoqumico preliminar y evaluacin de txica frente a Artemia salina
de las especies Coriaria ruscifolia y Diplostephium rosmarinifolius .................. 87
9. REPORTE DE METAS PLAN DE ACCIN ................................................... 102
9.1. Reporte fitoqumica de 16 especies ......................................................... 102
10. REFORMULACIN DEL PROYECTO 318 .................................................. 109
11. BIBLIOGRAFIA ........................................................................................... 113
12. ANEXOS ...................................................................................................... 117










5


LISTA DE TABLAS


Pag
Tabla 1. Especies seleccionadas para el estudio fitoqumico y de actividad txica
2012 ...................................................................................................................... 15

Tabla 2. Rendimientos de obtencin de extractos etanlicos ............................... 40

Tabla 3. Resultados del anlisis fitoqumico preliminar de los extractos etanlicos
de C. ruscifolia y D. rosmarinifloium, H. mexicanum e H. bonplandii. ................. 53

Tabla 4. Curva de calibracin de cido glico para cuantificacin de
fenoles................................................................................................................55

Tabla 5. Concentracin de fenoles totales en extractos etanlicos de la especies
de estudio56

Tabla 6. Resultados del fraccionamiento de los extractos etanlicos de C.
ruscifolia 60

Tabla 7. Resultados del fraccionamiento de los extractos etanlicos de D.
rosmarinifolius.Error! Marcador no
definido..61

Tabla 8. Resultados del fraccionamiento del extracto etanlico de H. bonplandii 62

Tabla 9. Reveladores especficos para la CDD63

Tabla 10. CL
50
calculadas por el mtodo
Probit68





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ABREVIATURAS

AcOEt : Acetato de etilo
CCD : Cromatografa en capa delgada
CC : Cromatografa en columna
CL
50
: Concentracin letal 50
CHCl
3
: Cloroformo
DCM : Diclorometano
EtOH : Etanol
IR : Infrarrojo
L : litro
mg : Miligramo
mL : Mililitro
mm : Milmetro
Me : Metilo
MeOH : Metanol
min : Minuto
ppm : Partes por milln
UV : Ultravioleta



7


GLOSARIO

Aceite esencial: los aceites esenciales son las fracciones lquidas voltiles,
responsables del aroma de las plantas, generalmente son mezclas complejas
constituidas por terpenos. En la naturaleza los aceites esenciales desempean un
papel importante en la defensa y proteccin de las plantas.
Anlisis fitoqumico: pruebas qumicas cualitativas que producen alteraciones
estructurales y que se manifiestan en cambios de color o formaciones de
precipitados y se emplean para determinar la presencia de grupos funcionales.
Alcaloides: metabolitos secundarios de carcter bsico que contienen nitrgenos
formando parte de un anillo heterocclico, poseen marcada actividad farmacolgica
y amplia distribucin en la naturaleza.
Artemia salina: Microcrustceo braquipodo de origen marino empleado para
determinar la toxicidad relativa de un compuesto o extracto por ensayo de
concentracin-respuesta.
CL
50
: Concentracin de una muestra necesaria para matar al 50% de una
poblacin.
CMI: Concentracin de una muestra necesaria para inhibir totalmente el
crecimiento una poblacin.
Cromatografa: Tcnica analtica de separacin basada en las interacciones
analito-fase estacionaria-fase mvil. Se puede clasificar de acuerdo al tipo de fase
mvil (lquido o gas) o fase estacionaria (slida o lquida).
Cumarinas: Son lactonas derivadas de la benzopirona, poseen diferentes
sustituciones en los anillos aromticos. Se caracterizan por ser fotosensibilizantes,
anticoagulantes y vasodilatadoras. Se dividen en furano y piranocumarinas.
Esteroides: Metabolitos cuya estructura presenta el sistema anular del
ciclopentano perhidrofenantreno, poseen diferentes sustituciones y grupos
funcionales.
Esteroles: Tienen como ncleo base el ciclopentano perhidrofenantreno como
patrn de sustitucin, metilos en las posiciones 10 y 13 y Hidroxilo en la posicin
3.
8


Flavonoides: Grupo de compuestos de origen natural que se caracterizan por
poseer un ncleo C
6
-C
3
-C
6
, dos anillos bencnicos unidos por una cadena de tres
tomos. Los flavonoides se pueden clasificar de acuerdo a su origen biosinttico o
de acuerdo a las variantes en la cadena C
3
.
Fenoles: Los compuestos que poseen anillos aromticos con por lo menos un
sustituyente hidroxilo. Los fenoles de origen natural son biosintetizados va cido
shikmico o cido malnico. Se clasifican de acuerdo a su esqueleto qumico en
simples, cidos benzocos, fenil acticos, fenil propanoides, etc.
Infrarrojo: Tcnica espectroscpica de elucidacin estructural que permite
establecer la presencia de grupos funcionales dada una frecuencia de
estiramiento, flexin y sobretonos.
Maceracin: Tcnica de extraccin discontinua por la cual se hace actuar un
solvente sobre el material a extraer a temperatura ambiente.
Metabolitos 2
rios
: Productos del metabolismo especial, biosintetizados a partir de
metabolitos primarios, con distribucin restringida a ciertos organismos vivos y
comprenden alcaloides, terpenoides, flavonoides, glicsidos, fenilpropanoides,
lignanos, cumarinas, etc
Probit : Programa estadstico usado para establecer las consecuencias
desfavorables sobre una poblacin. Se distribuye segn una ley log-normal.
Asociacin de una probabilidad a un evento negativo que permite estimar
parmetros de potencia del dao.
Quinonas: Dicetonas cclicas instauradas que por reduccin se convierten en
polifenoles. Se clasifican teniendo en cuenta el ncleo aromtico en:
Benzoquinonas, naftoquinonas, antraquinonas y fenantroquinonas.
Saponinas: Grupo de glicsidos esteroidales solubles en agua, tienen la
propiedad de hemolizar la sangre y disminuir la tensin superficial del agua,
formando espumas estables y abundantes.
Sesquiterpenlactonas: Son compuestos con 15 tomos de carbono formados a
partir del cido mevalonico, parte del esqueleto es un anillo de metilbutenolido,
poseen restringida distribucin se encuentran en las familias: Umbeliferaceae,
Magnolicea, Laurcea y Acantcea principalmente.
9


Taninos: Metabolitos secundarios involucrados en el mecanismo de defensa de
muchas plantas, son polmeros de fenoles con alto peso molecular. Los taninos se
clasifican en hidrolizables y condensados.





















10


1. INTRODUCCIN

Los productos naturales, entendidos como los compuestos producidos por los
organismos vivos, son de gran importancia para la Humanidad. Las plantas han
sido utilizadas desde hace muchos aos por hombres y animales, como fuente de
alimento, para tratar dolencias y como herramientas para su supervivencia. La
importancia del estudio de los componentes qumicos de las plantas se evidencia
en el impacto que tienen en la vida cotidiana de los humanos, es por ello que
actualmente todos los productos cosmticos, gran parte de los productos
farmaceticos y cerca de la mitad de los productos usados en el sector agrcola,
provienen o estn relacionados con compuestos qumicos descubiertos en plantas
(Samuelsson, 2004).
Los estudios fitoqumicos son estudios multidisciplinarios entre botnicos,
qumicos, farmaclogos y farmacognosistas, anualmente se realizan miles de
estudios qumicos de diversas plantas con el fin de conocer los principios activos
responsables de curar o aliviar enfermedades, controlar plagas de los cultivos, o
con importancia a nivel industrial, separarlos de las plantas que los contienen,
determinar sus estructuras, intentar sintetizarlos, proponer modificaciones
estructurales en busca de mayor actividad y selectividad (Sarker et al., 2006).
La investigacin fitoqumica se divide en dos grandes etapas, la investigacin
cualitativa o preliminar y la estructural. Para la estas dos etapas se comienza con
la obtencin de un extracto, en la investigacin fitoqumica preliminar se realizan
separaciones sucesivas empleando solventes de diferentes polaridades con el fin
de agrupar en fracciones los metabolitos estructuralmente semejantes y de esta
forma caracterizarlos por su comportamiento qumico frente a diferentes
reacciones qumicas. Este screening qumico permite seleccionar algunas
especies promisorias para continuar con el aislamiento y purificacin de
metabolitos (Satyajit et al., 2006; Colegate y Molyneux, 2008).
El presente trabajo pretende realizar los anlisis fitoqumicos preliminares y la
evaluacin de actividad biolgica de cuatro especies nativas de las reas rurales
del Distrito Capital, dentro del proyecto Uso Sostenible. Y seleccionar dos
especies para continuar los estudios qumicos y de actividad txica y antioxidante.


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2. DESCRIPCION DEL PROBLEMA
Tradicionalmente las plantas han sido el recurso ms empleado por el hombre y
los animales para su alimentacin y la cura de sus dolencias, este saber popular
se ha transmitido de generacin en generacin y constituye un pilar en la qumica
de los productos naturales. Los estudios fitoqumicos comienzan con la
comprobacin de un uso tradicional y puede concluir en el aislamiento de un
compuesto lder o compuesto activo, el cual puede llegar despus de diferentes
estudios al desarrollo de un agente teraputico novedoso, aunque cabe resaltar
que este procedimiento puede tardar aos.
Colombia ha sido catalogada como el segundo pas ms diverso en flora silvestre
del mundo. De las 260.000 especies de plantas registradas a nivel mundial,
50.000 se encuentran en nuestro territorio, y aproximadamente la tercera parte
son endmicas (Caldern et al., 2007). Nuestro pas cuenta con la mayor
extensin de paramos en el mundo. Se calcula que la regin paramuna
colombiana alberga alrededor de 118 familias, 566 gneros y 3379 especies,
equivalente a cerca del 12% de la flora calculada para todo el pas (Rangel, 2001).
Pese a la importancia de la flora en Colombia, existe un alto riesgo de sufrir
extinciones masivas, producidas por la destruccin de hbitats, por deforestacin y
por contaminacin. Algunos estudios sealan que cerca de 1800 especies de
plantas de nuestra flora nativa se encuentran en va de extincin (Caldern et al.,
2007). La eminente extincin de las especies nativas conllevara a la prdida del
conocimiento qumico, usos tradicionales, actividades biolgicas y potenciales
aplicaciones asociados a estas. Es por ello que actualmente se estn adelantando
programas de conservacin, recuperacin y uso sostenible, que contrarresten los
efectos nocivos de las actividades humanas sobre la flora nativa.
Muchas plantas y animales silvestres pueden ser la base para la elaboracin de
medicinas, fibras y alimentos. Desde esta perspectiva, la biodiversidad es el
capital biolgico del mundo y representa opciones estratgicas para su uso
sostenible. Teniendo en cuenta que existen pocos estudios qumicos de la flora
altoandina y de paramo de nuestro pas, esta constituye un patrimonio fitoqumico
muy importante. El presente trabajo propone realizar el tamizaje fitoqumico y de
actividad citotxica de la especies nativas Hydrocotile bonplandii, Hypericum
mexicanum, Coriaria ruscifolia y Diplostephium rosmarinifolius con el fin de
seleccionar dos especies promisorias para continuar con la separacin y
purificacin de metabolitos con posibles actividades biolgicas.
12



3. JUSTIFICACIN
En la actualidad las investigaciones en productos naturales estn orientadas a la
bsqueda de compuestos con diversas actividades biolgicas, debido a la
necesidad de nuevos agentes teraputicos, alimenticios, nutraceuticos y
agroqumicos ms efectivos y seguros.
Alrededor del 25% de los frmacos prescritos en el Mundo provienen de plantas.
De las 252 sustancias consideradas esenciales y bsicas por la Organizacin
Mundial de la Salud (OMS), 11% provienen exclusivamente de plantas y un
nmero significativo son frmacos sintticos obtenidos de precursores naturales
(Rates, 2001). Algunos frmacos histricamente importantes para la teraputica se
han obtenido de fuentes vegetales como la digitalina de Digitalis sp., con accin
cardiovascular, la quinina de Cinchona sp., utilizada durante muchos aos en el
tratamiento de la malaria, los alcaloides antitumorales vincristina y vinblastina de
Catharanthus roseus, alcaloides que poseen accin sobre el sistema nervioso
central como la morfina y codena de Papaver somniferum. Actualmente cerca de
200 nuevos compuestos de origen natural se encuentran en diferentes fases
clnicas para el desarrollo de agentes anti-cancerigenos y anti-infectivos, siendo
los productos naturales de plantas los ms representativos numricamente
(Harvey, 2008).
Los estudios fitoqumicos han tomado gran impulso en la bsqueda de sustancias
con posibles aplicaciones a nivel agroindustrial, cosmtico, alimenticio, y
teraputico. El estudio de los compuestos naturales puede resultar en el hallazgo
de una sustancia considerada como una plantilla que presenta una actividad
moderada frente a alguna diana especifica (Balunas y Kinghorn, 2005). Una vez
determinada la estructura de la plantilla es posible obtener varias sustancias con
estructuras similares gracias a la qumica combinatoria.
Uno de los bioensayos preliminares que permite detectar un amplio espectro de
actividades biolgicas en extractos y fracciones es el ensayo de toxicidad frente a
Artemia salina. Esta tcnica de aislamiento biodirigido caracteriza por ser rpida,
econmica, simple y emplear bajas cantidades de material de prueba. El ensayo
frente a A. salina ha evidenciado una importante correlacin de sus resultados con
resultados de toxicidad en clulas cancergenas principalmente en lneas celulares
9 KB carcinoma nasofarngeo humano, P388 en leucemia murina In vivo y otros
tumores slidos. Gracias a esto el ensayo frente a A. salina se ha utilizado en el
13


aislamiento de agentes antitumorales y pesticidas producidos por las plantas,
obteniendo as un gran nmero de compuestos bioactivos, como la acetogenina,
ascimicina de Asiminia triloba que ha presentado actividad citotoxica, antitumoral,
antimalarica, antimicrobiana, immunosupresora, entre otras (Colegate y Molyneux,
2008).


En este trabajo se realizarn los ensayos de toxicidad frente a A. salina de
extractos y fracciones de cuatro especies empleadas como medicinales en las
areas rurales del Distrito Capital y la regin.






















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4. OBJETIVOS


4.1. OBJETIVO GENERAL
Realizar los anlisis fitoqumicos preliminares y de actividad biolgica de cuatro
especies nativas de las areas rurales del Distrito Capital

4.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS
1. Realizar el estudio fitoqumico preliminar de cuatro especies nativas priorizadas
en el proyecto 318.
2. Realizar la extraccin, purificacin e identificacin de los metabolitos
secundarios en dos especies.
3. Consolidar la informacin del componente de fitoqumica y bromatologa del
proyecto 318 requerida para el plan de investigacin, informes de gestin,
seguimiento a procesos y procedimientos, seguimiento a metas e indicadores,
u otros reportes de la entidad y socializarlos en los espacios requeridos
4. Apoyar la reformulacin del proyecto 318 para la armonizacin con el Plan de
Desarrollo "Bogot Humana Ya"








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5. ESTADO ACTUAL
La seleccin de las especies se realiz teniendo en cuenta los resultados de las
exploraciones Etnobotnicas realizadas durante el ao 2011, en la tabla 1 se
presentan las especies objeto de estudio.
Tabla 1: Especies seleccionadas para el estudio fitoqumico y de actividad txica
2012
Especie Familia Parte a trabajar Nombre comn
Coriaria ruscifolia Coriariaceae
Hojas, frutos y
semillas
Maqui del diablo
Hydrocotile bonplandii Apiaceae Hojas Sombrerito
Hypericum mexicanum Guttiferaceae Parte erea
Mano de oso
Diplostephium
rosmarinifolius
Asteraceae Hojas, tallos, flores
Romero de
paramo

5.1. Familia Hypericaeae
Las especies pertenecientes a esta familia son arbustos, hierbas anuales,
perennes o arbolitos de mediano tamao y lianas (en el trpico), con aceites y
resinas de color amarillo intenso. La familia consta de 9 gneros con 560 especies
de distribucin cosmopolita (Figura 1). Algunos botnicos incluyen la familia
Hypericaceae dentro de las Clusiaceas (Nurk y Blattner, 2010).

Figura 1. Distribucin mundial de la familia Hypericaeae
Tomado de: http://www.thecompositaehut.com
16



Los gneros ms representativos de la familia son Hypericum, Vismia, Harungana.
El gnero ms Extenso es el gnero Hypericum.
5.1.1. Gnero Hypericum
Este gnero cuenta con aproximadamente 484 especies, con presencia natural o
introducida en todos los continentes del mundo excepto en la Antrtida. Las
especies de este gnero son hierbas, arbustos y rara vez arboles.
Las plantas del gnero Hypericum tradicionalmente han sido utilizadas como
medicinales en diversas partes del mundo y se caracterizan por la importante
presencia de aceites esenciales (Crocket y Robson, 2011).
Las especies del gnero Hypericum son generalmente plantas herbceas
perennes, de 5-10 cm de altura, o arbustos y rara vez rboles hasta de 12 m de
altura. Las hojas son opuestas, ovales, de 1-8 cm de longitud. Las flores varan de
amarillo plido a intenso, con un dimetro de 0.5-6 cm, tetrmeras o pentmeras.
El fruto normalmente es una cpsula seca con semillas pequeas y numerosas
(Figura 2).

Figura 2. Caractersticas morfolgicas de Hypericum sp.
Tomado de: http://luirig.altervista.org

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Algunas especies del gnero Hypericum han sido utilizadas en la medicina
tradicional de diferentes pases alrededor del mundo. A partir de las flores de H.
perforatum se preparan infusiones o decocciones que se toman fines sedativos y
se aplican externamente en cataplasmas para tratar neuralgias. En Europa y
Estados Unidos se prescriben y comercializan extractos de flores de la especie H.
perforatum como antidepresivos moderados. El uso de estos extractos tiene gran
importancia econmica. Se estima que en 2008 en Estados unidos se vendieron
aproximadamente 8,2 millones de USD en este tipo de productos teraputicos
(Crocket y Robson, 2011).
Por medio de los estudios qumicos de extraccin y aislamiento de metabolitos
secundarios en especies del gnero Hypericum se han identificado
mayoritariamente seis tipos de compuestos principalmente, naftodiantronas,
floroglucinoles, flavonoides, biflavonas, fenilpropanos y proantocianidinas.
Adicionalmente, en menor cantidad taninos, xantonas y aceites esenciales
(Crockett y Robson, 2011).
Flavonoides: Son los metabolitos secundarios bioactivos ms ampliamente
distribuidos en el gnero Hypericum (2-4%). En la especie ms representativa del
gnero (H. perforatum) se aislaron e identificaron cuatro agliconas de flavonol,
kaempferol, luteolina, myricetina y quercetina. Unos de los flavonoides ms
abundantes en este gnero son los glicosidos hyperosido y ruteina (Figura 3).

Figura 3. Flavonoides ms comunes aislados en el gnero Hypericum

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Los glicosidos de flavonoide presentaron actividad espasmoltica y tambin
mostraron inhibicin de la enzima monoamina oxidasa A, responsable del
catabolismo de aminas. La fraccin de flavonoides de H. perforatum puede inhibir
el receptor de benzodiazepina. La ruteina aislada a partir de H. perforatum mostr
una importante actividad antidepresiva (Saddiqe, 2010).

Naftodiantronas: Este tipo de compuestos caractersticos del gnero Hypericum
poseen colores rojizos intensos y propiedades fototxicas. Los componentes
mayoritarios de este grupo de compuestos son las hypericinas, tambin conocidas
como protoderivados, protohypericinas y pseudoprotohypericinas, que debido a su
naturaleza inestable se transforman rpidamente en los derivados estables
hypericina y pseudohypercina (Figura 4). La hypericina y pseudohypericina se
encuentran comnmente en los extractos crudos de hojas y flores de especies del
gnero en concentraciones de 0,03% al 0,3% en peso seco y las cantidades
varan de acuerdo al estado de desarrollo de la planta (Saddiqe, 2010).

Figura 4. Naftodiantronas comunes en el gnero Hypericum

Las naftodiantronas son poco solubles en la mayora de solventes orgnicos. Las
hypericinas son los compuestos ms interesantes del gnero Hypericum debido a
que poseen un amplio espectro de actividades biolgicas y efectos
farmacolgicos. La hypericina y pseudohypericina inhiben la protena kinasa C con
una CI
50
a 1,7 mg/L y 15 mg/L respectivamente y mostraron actividad
antiproliferativa frente a clulas de mama. La inhibicin de la kinasa C explica la
actividad antirretroviral, la cual es atribuida a la inhibicin de la fosforilacin de la
kinasa C durante la infeccin viral a las clulas. La hypericina juega un papel muy
importante como mediador en enfermedades relacionadas con las clulas T,
19


debido al efecto inhibitorio sobre los linfocitos T CD
8+
. Por otra parte la hypericina
es responsable de la fotosensibilizacin y se estn adelantando estudios para
emplearlo en tratamientos de radioterapia para el cncer (Saddiqe, 2010).

Floroglucinoles: Los derivados de floroglucinol se encuentran ampliamente
distribuidos en el gnero Hypericum. A partir de la especie Hypericum perforatum
se aislaron la hypeforina y la adhyperforina con rendimientos del 3,5% y 1,5%
respectivamente (Figura 5).

Figura 5. Hyperforina aislada de Hypericum perforatum

Los floroglucinoles se encuentran solamente en los rganos reproductores de las
especies del gnero Hypericum, en porcentajes de aproximadamente 2% en
flores, 4,4% en frutos maduros y 4,5% en frutos inmaduros. La hyperforina es
altamente inestable a la luz y el calor especialmente cuando se encuentra en
soluciones acuosas. Se han realizados pocos estudios de actividades
farmacolgicas de los floroglucinoles del gnero Hypericum. La hyperforina
presenta actividad inhibitoria de los sistemas neurotransmisores in vitro por
inhibicin de serotonina, dopamina y noradrenalina, esta actividad permite inferir
que este tipo de compuestos son los responsables de la actividad antidepresiva de
especies de este gnero. La hyperforina tambin present inhibicin de
Plasmodium falciparum a bajas concentraciones por lo que se puede esperar que
posea actividad anti-malarica (Saddiqe, 2010).
Biflavonas: Son un grupo de dimeros de flavona poco encontrados en la
naturaleza y en el gnero Hypericum. En la especie H. perforatum se aislaron tres
biflavonas, amentoflavona (0,01-0,05%), I3, II8-biapigenina (0,1-0,5%) (Figura 6).
20



Figura 6. Biflavonas aisladas de H. perforatum

Xantonas: A partir de algunas especies del gnero se han aislado en baja
cantidad algunas xantonas como manguiferina y kielcorina C con rendimientos de
0,01% (Figura 7)

Figura 7. Xantonas aisladas en el gnero Hypericum

Se han aislado tambin esteres de los cidos cinmico, p-cumarico y cafeico como
el cido clorognico (Figura 8). Los taninos del tipo de las proantocianidinas se
han encontrado en forma de dmeros, trimeros y tetrmeros.

Figura 8. Otros metabolitos secundarios aislados en gnero Hypericum
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5.2. Familia Apiaceae

La familia Apiaceae tambin conocida como Umbelliferae, incluye cerca de 3750
especies, con 300 a 450 gneros (Downie et al., 2001). Sin embargo, filogenias
moleculares recientes sugieren que la subfamilia Hydrocotyloideae es polifiltica y
que varios gneros incluidos tradicionalmente en esta subfamilia, parecen estar
ms estrechamente relacionados con Araliaceae. Son especies herbceas y rara
vez presentan porte arbustivo. El tallo, articulado en nudos y entrenudos, porta
hojas alternas y en su mayora divididas. Una de las caractersticas ms
sobresaliente de la familia es la inflorescencia en forma de umbela, simple o
compuesta (Figura 9).

Figura 9. Caractersticas morfolgicas de la familia Apiaceae
Tomado de: www.plant-pictures.de

5.2.1. Gnero Hydrocotyle
Hydrocotyle es un gnero ampliamente distribuido en el mundo con ms de 130
especies que presentan importantes variaciones morfolgicas, entre especies y
dentro de ellas (Daz, 2011). Tiene distribucin cosmopolita y est compuesto por
especies herbceas anuales y perennes, algunas de ellas adaptadas a diversos
tipos de humedales. La subfamilia Hydrocotyloideae comprende 42 gneros y
22


aproximadamente 470 especies, principalmente herbceas y distribuidas en zonas
elevadas de Suramrica, Nueva Zelanda y Australia (Nicolas y Plunkett, 2009).
Las especies del gnero Hydrocotyle se caracterizan por ser hierbas rastreras con
nudos radicantes. Tallos filiformes de 0,5-1 mm de dimetro. Hojas
crenadolobadas de 7- 5 mm de dimetro. Pecolo de 2-5 cm de largo y 0,5-1 mm
de dimetro. Pednculo floral unifloro (Figura 11). Flores pequeas de ptalos
ovados, superficie exterior purprea, de 2- 2,5 mm de largo y 0,6-0,8 mm de
ancho. Fruto elptico, de 6-7 mm de largo y 4-5 mm de ancho, geocrpico.
Pericarpio cubierto de pelos rgidos. Generalmente aborta un carpelo a la
madurez, adquiriendo entonces una forma reniforme (Figura 10) (Alvarez, et al.
2008).

Figura 10. Caractersticas morfolgicas del gnero Hydrocotyle
Tomado de: http://ciencia-natural.blogspot.com

En Colombia se realiz en 2011 una revisin taxonmica de las especies del
gnero Hypericum encontrando, 24 especies (7 endmicas) y 1 variedad, siendo
Colombia el pas ms rico en especies de este gnero comparado con otros
pases de centro y sur Amrica como, Per (23), Ecuador (18), Argentina (15),
Venezuela (13), Brasil (Estado Catarina 10) y Guatemala (7). El gnero se
distribuye en todas las regiones naturales del pas, pero se presenta un mayor
nmero de especies en la regin andina, crece desde el nivel del mar hasta los
23


3900 m de altitud (Diaz, 2011) y estas especies se conocen popularmente como
paragitas, orejas de ratn o sombreritos en Cundinamarca y Boyac, como
sombreritos en el Valle del Cauca y plegaderas en Cauca (Bernal, 2011).
El gnero Hydrocotyle posee especies medicinales, ornamentales y alimenticias.
La especie H. asitica conocida popularmente como centella asitica, es la
especie medicinal ms importante de este gnero; a esta especie se le atribuyen
propiedades antibacterianas, antidepresivas, anitiinflamatorias y estimulantes de la
circulacin, entre otras. Las propiedades asociadas al metabolismo de grasas se
han utilizado ampliamente para la obtencin de productos comerciales
adelgazantes. La especie H. sibthorpioides es usada en la medicina folclrica de
China en el tratamiento de la fiebre, el edema, la desintoxicacin y dolores de
garganta (Gan, 1991). La especie H. leucophala es usada en Colombia y Brasil
con diferentes fines medicinales. La decoccin de las races se toma como
diurtico y para limpiar el hgado (Anomino, 2010). Adems se reportan usos como
antihelmntico, antidiarreico y en Corea como biorremediador de aguas
contaminadas con sustancias inorgnicas (Ramos et al., 2006).
Los estudios qumicos previos realizados en especies del gnero Hydrocotyle han
permitido el aislamiento e identificacin de metabolitos secundarios de tipo
flavonoide como la 3-O-galactosidilquercitina de H. umbellata (Adams et al., 1998).
Terpenos como trans--farneseno, timol y -terpineno de H. sibthorpioides.
Triterpenos glicosilados de tipo oleano y ursano aislados de H. ranunculoides y H.
sibthorpoides (Huang et al., 2008).
En un estudio realizado en la especie Colombiana Hydrocotyle leucocephala se
aislaron e identificaron diferentes tipos de metabolitos poco comunes en plantas,
tres diacetilenos 1, 2 y 3 reportados por primera vez en la literatura (Figura 11),
siete leucoceramidas, seis leucocerebrosidos y nueve compuestos previamente
reportados en el gnero (Figura 12) (Ramos et al., 2006).

Figura 11. Diacetilenos aislados de Hydrocotyle leucocephala
24



Figura 12. Leucoceramidas y leucocerebrosidos de Hydrocotyle leucocephala

A partir del extracto etanlico de la especie H. sibthorpioides se aislaron siete
saponinas de tipo oleano que presentaron actividad citotxica frente a clulas
tumorales (Figura 13) (Huang et al., 2008).

Figura 13. Sapinonas citotxicas aisladas de H. sibthorpioides

5.3. Familia Coriariaceae
La familia Coriariaceae es una pequea familia de plantas que comprende un solo
gnero Coriaria y aproximadamente 15 especies. Distribuidas principalmente en
China, la regin del Himalaya de Japn, Filipinas, Nueva Zelandia, Amrica
Central y Sur Amrica (Figura 14) (Tianlu y Brach, 1990).
25



Figura 14. Distribucin mundial de la familia Coriariaceae
Tomado de: http://www.mobot.org

5.3.1. Gnero Coriaria
Arbusto de bordes de bosque en las tierras fras, de ramas largas y extendidas,
hojas simples, opuestas, elpticas y muy pequeas, y con racimos colgantes que
llevan numerosos frutos esfricos, jugosos y de color morado (Figura 15) (Tianlu y
Brach, 1990).

Figura 15. Caractersticas morfolgicas de especies de la familia Coriariaceae
Tomado de: www.terrain.net.

En Colombia las especies del gnero Coriaria se distribuyen principalmente en la
zona andina en los departamentos de Nario, Antioqua, Cundinamarca y Boyac,
en donde se conocen popularmente con los nombres de teidera, curtidera,
barbasco o uvillas (Bernal, 2012).
26


Los frutos de estas especies se usan con fines tintreos y se tienen reportes de
efectos narcticos y alucingenos. Los pobladores de diferentes regiones de
Chile, Ecuador y Colombia los reconocen como venenosos para el hombre y para
animales domsticos (Kvist y Moraes, 2006).
La especie Coriaria myrtifolia (Figura 16) ampliamente distribuida en el
mediterraneo, es reconocida como una de las especies ms txicas del gnero.
La marcada neurotoxicidad de esta especie se le atribuye a las altas
concentraciones de coriamyrtina presentes en las bayas. La ingestin algunos
frutos (muy similares a las moras, figura 16), induce manifestaciones digestivas y
neurolgicas que van desde vmitos, convulsiones y apnea hasta el coma. En
Francia, Espaa y Marruecos se han reportado 83 casos de envenenamiento por
ingestin con frutos de C. myrtifolia, los sntomas se presentaron
aproximadamente a los 150 minutos despus del consumo y los signos ms
frecuentes fueron los trastornos neurolgicos. Se reporta tambin que 11 de los
83 pacientes murieron, de los cuales 6 eran nios y 5 adultos (Haro et al., 2005).


Figura 16. Frutos de Coriaria myrtifolia

En la literatura no se han realizado reportes de casos por envenenamiento con la
especie Coriaria ruscifolia, sin embargo es reconocida por los habitantes de
diferentes regiones como una especie txica, mientras que otros la reportan como
una especie alimenticia.

Los estudios qumicos realizados en especies del gnero Coriaria se han
orientado a la bsqueda de los metabolitos secundarios responsables de la
actividad biolgica. Aunque estas especies son popularmente conocidas como
txicas existen diferentes reportes de usos etnobotnicos. Algunas especies de
China han sido usadas para tratar el entumecimiento, dolor de muelas, lesiones
traumticas, la conjuntivitis aguda y enfermedades mentales. Las especies del
27


gnero Coriaria se caracterizan por poseer lactonas sesquiterpenicas, cumarinas,
taninos, flavonoides y compuestos fenlicos (Valencia et al., 2001).
A partir de diferentes especies del gnero Coriaria se ha aislado la
sesquiterpenlactona coriarina (1) a la cual se le atribuyen los efectos neurotxicos.

A partir del estudio fitoqumico de la especie Coriaria intermedia se aislaron
fitosteroles, cido 3,3-dimetilter elagico (2), cido urslico y dos
sesquiterpenlactonas coriamirtina (3) y tutina (4) (Chang et al., 1996).

A partir de las hojas y frutos maduros de la especie C. nepalensis colectada en la
provincia de Yunnan (China) se obtuvieron los extractos de acetona. Empleando
tcnicas cromatogrficas se aislaron dos compuestos novedosos. Una cumarina
(5) y un derivado fenlico (6) llamadas corialinas A y B respectivamente (Yang et
al., 2011)
28



En 2001 se realiz el estudio qumico de la especie C. ruscifolia colectada en el
Parque Nacional Vicente Prez Rosales de Chile. Esta es especie no posee usos
tradicionales sin embargo sus frutos son utilizados para matar ratones debido a su
alta toxicidad. A partir del extracto metanlico de frutos de la especie fueron
aislados el ter del cido elagico (3) y la coririna (1). El extracto y los compuestos
fueron sometidos a ensayos de actividad antibacteriana frente a diferentes
bacterias y al ensayo de toxicidad frente a Artemia salina. Tanto los compuestos
como el extracto total presentaron baja actividad y toxicidad moderada (Figura 17)
(Valencia et al., 2001).

Figura 17. Resultados de actividad antibacteriana y txica de C. ruscifolia


5.4. Familia Asteraceae
Las especies de la familia Asterceae tambin se conocen como Compuestas.
Esta familia de plantas posee una gran diversidad biolgica debido a que
comprende ms de 23000 especies comprendidas en aproximadamente 1500
gneros con distribucin cosmopolita, especialmente representada en las
regiones semiridas de los trpicos y subtrpicos (Figura 18)
29



Figura 18. Distribucin de la familia Asteraceae
Tomado de: http://www.euita.upv.es

Son plantas herbceas, raramente rboles o arbustos trepadores, monoicas.
Poseen hojas alternas u opuestas, simples o bipinnadas, y estipuladas. Tienen
inflorescencias o flores en captulo, que a menudo se disponen secundariamente
en asociaciones cimosas y ms raramente en racemosas. Las flores son
pequeas, perfectas o imperfectas, regulares o irregulares, estriles, unisexuales
o hermafroditas. Poseen principalmente dos tipos de flores, tubulosas o liguladas y
caractersticas variables (Figura 19)

Figura 19. Tipos de flores en compuestas
Tomado de: Tomado de: http://www.euita.upv.es

30


Las especies de esta familia poseen usos variados que pueden ir desde
comestibles hasta medicinales e industriales (Figura 20). Se caracterizan por
poseer compuestos qumicos como los poliacetilenos, aceites esenciales y
frecuentemente se presentan lactonas sesquiterpnicas.


Figura 21. Especies de compuestas con usos tradicionales
Tomado de: Tomado de: http://www.euita.upv.es

5.4.1. Gnero Displostephium
Diplostephium es un gnero plantas generalmente rboles y arbustos que cuenta
con aproximadamente 110 especies (Ulloa y Jorgensen, 2004). Se distribuye
principalmente en zonas de alta montaa, en bosques alto andinos y ecosistemas
de pramo, desde Venezuela hasta Chile. Colombia posee la mayor riqueza de
especies con 63 de las 110 reportadas, la mayora de estas en la Cordillera
Oriental (Luteyn, 1999).
El gnero fue descrito por Humboldt, Bonpland y Kunth bajo el trmino
Diplostephium (gr. diplos: doble, y gr. stphos: corona, doble papo) en el ao de
1820 y publicado en 1857. Las especies del gnero son generalmente arbustos o
pequeos rboles. Poseen hojas alternas, enteras, lineares a oblongas, coriceas.
Las inflorescencias son corimbosas-paniculadas con cabezuelas hetergamas, de
pocas a muchas flores. Las flores pueden poseer colores variados que van desde
el amarillo al violeta (Figura 21).
31



Figura 21. Flores de Diplostephium sp
http://www.efloras.org

La especie Diplostephium rosmarinifolius es un arbusto, nativo de las partes altas
de las montaas, se conoce popularmente como romero de pramo debido a su
similitud superficial con el romero cultivado (Rosmarinus officinalis, figura 22). El
romero de pramo crece en forma de un arbusto con ramas retorcidas, cubiertas
con hojas muy estrechas. Sin embargo, las hojas del romero de pramo suelen
tener un tono ms gris que las del autntico romero y no poseen olor como en el
caso de R. officinalis debido a la ausencia de aceites esenciales.


Figura 22. Romero (R. officinalis) y Romero de paramo (D. rosmarinifolius)

Pese a la amplia distribucin del gnero Diplostephium en Colombia no se han
realizado muchos estudios o reportes qumicos y de actividad biolgica. A partir de
las especies D. rneyenii, D. floribundurn y D. ericoides se han aislado
diterpenoides de tipo clerodano (Figura 24) y terpenos derivados del geraniol.
32



Figura 23. Diterpenoides de tipo clerodano

A partir de un extracto de diclorometano de la especies D. cinereum se obtuvieron
dos flavonoides: naringenina (7) y isosakuranetina (8).


En 2006 se realiz el estudio de la actividad antibacteriana de la especie vegetal
Diplostephium tolimense, colectada en el pramo del Nevado del Tolima. A partir
de un extracto etanlico crudo y mediante un estudio biodirigido, se obtuvieron
fracciones semipurificadas que actividad antibacteriana frente a Staphylococcus
aureus (ATCC 25923). Por medio de los anlisis fitoqumicos a las fracciones
activas se realiz una correlacin de la accin antibacteriana con la presencia de
terpenos (Figura 23) (vila et al., 2006)

33



Figura 24. Resultados de actividad antibacteriana de D. tolimense












34



6. DISEO METODOLOGICO
6.1. Revisin bibliogrfica

Durante el transcurso de la investigacin se realiz una continua bsqueda de
bibliografa relacionada con la fitoqumica de la familia y gnero de las especies
objeto de estudio, as como de la actividad biolgica de compuestos de origen
natural, empleando las bases de datos cientficas y buscadores electrnicos
relacionados con los temas de inters.

6.2. Recoleccin del material vegetal

El material vegetal de las especies objeto de estudio se recolecto en las dos zonas
de trabajo para el ao 2012. Veredas las Mercedes, Santa Rosa y Santa Brbara
de la localidad de Ciudad Bolvar y el pramo de Cruz Verde.

6.3. Obtencin de extractos

El material vegetal recolectado se separo en los diferentes rganos colectados:
hojas, tallos, frutos y flores. Se limpio y sec a la sombra o en el horno a 40C. El
material seco y molido se someti a extraccin por maceracin con etanol del
96% a temperatura ambiente. El extracto etanlico resultante se concentr
eliminando el solvente por destilacin a presin reducida (rotavapor).

6.4. Anlisis fitoqumico preliminar

El anlisis fitoqumico preliminar se llev a cabo empleando un protocolo
modificado basado en las metodologas y pruebas cualitativas propuestas
previamente por varios autores (Sanabria, 1983; Bilbabo, 1993; Lock, 1988;
Merck, 2001). El protocolo desarroll en dos etapas, en la primera se realizaron
reacciones cualitativas en tubo de ensayo y en la segunda parte pruebas de
coloracin en cromatografa de capa delgada CCD. Se utilizaron controles
positivos y negativos para corroborar los resultados obtenidos.




35


6.5. Estudio cromatogrfico preliminar

El estudio cromatogrfico preliminar se realiz empleando cromatografa en capa
delgada CCD. Usando como fase estacionaria silica gel y diferentes sistemas de
solventes, desde de baja hasta alta polaridad.

6.6. Fraccionamiento de extractos
Los extractos etanlicos de hojas H. bonplandii, hojas, tallos y flores de D.
rosmarinifolius, hojas, semillas y frutos de C. ruscifolia y hojas de H. mexicanum
se fraccionaron empleando extraccin slido-liqudo con solventes de polaridad
creciente, ter de petrleo, acetato de etilo y metanol.
6.7. Cuantificacin de fenoles

La concentracin de fenoles totales en los extractos se determin por el mtodo
colorimtrico de Follin-Ciocalteau.
Se realiz una curva de calibracin empleando un patrn de cido glico (reactivo
analtico). A partir de una solucin Stock de 200 ppm se prepararon diluciones
seriadas de 150, 100 50, 25, 10, 5 y 1 ppm de cido glico completando a
volumen con agua destilada.
Para el anlisis de las muestras se pesaron 10 mg de extracto y se disolvieron con
1 ml de metanol. Esta solucin se diluy a 1:10 con agua destilada. Se tomaron
alcuotas de 1 ml de los estndares de cido glico y de las muestras previamente
preparadas y se les aadi 5 ml de reactivo diluido Follin-Ciocalteu (1:10 en agua
destilada) y se dej en reposo por 5 minutos. Posteriormente se adicionaron 4ml
de la solucin de carbonato de sodio al 7,5% y se dej reposar durante 2 horas a
temperatura ambiente y en la oscuridad. La absorbancia se midi a 740 nm en una
celda de 1 cm contra el blanco de reactivo realizado para el mismo procedimiento.
Los resultados son expresados en mg de cido glico por g de extracto.

6.8. Evaluacin de la toxicidad
Para evaluar la toxicidad de extractos y fracciones se us el ensayo de letalidad
en Artemia salina de acuerdo con el protocolo sugerido por McLaughlin y
colaboradores. Los huevos de A. salina se incubaron durante 48 horas a una
temperatura de 28 C en un medio de cultivo de sal marina a una concentracin de
38 g/L. Los ensayos se realizaron por triplicado empleando 10 nauplios por pozo
36


los cuales se expusieron a diferentes concentraciones de extractos o fracciones.
Al cabo de 24 horas se hicieron las lecturas, y se registr el nmero de
sobrevivientes en cada pozo.
Los datos obtenidos fueron procesados con el programa estadstico Epa probit
analysis program con el fin de determinar la concentracin letal 50 (CL
50
) y un
rango de confianza de 95 %.


















37


7. RESULTADOS

7.1. Recoleccin del material vegetal
El material vegetal de la especie Hypericum mexicanum (Figura 25) se recolect
en Febrero de 2012 en la vereda las Mercedes de Ciudad Bolvar.

Figura 25. H. mexicanum

El material de las especies Coriaria ruscifolia (hojas, tallos y frutos), Diplostephium
rosmarinifolius (hojas, tallos y flores) y Hydrocotyle bonplandii (hojas) se colect
en la vereda San Francisco del Pramo de Cruz Verde en febrero de 2012
(Figuras 26, 27 y 28).



Figura 26. C. ruscifolia Figura 27. D. rosmarinifolius Figura 28 H.bonplandii

38



7.2. Obtencin de extractos etanlicos
El material vegetal colectado se lav y separ en los diferentes rganos. Hojas
frutos y semillas de C. ruscifolia (Figura 29), hojas, tallos y flores de D.
rosmarinifolius (Figura 30) y hojas de H. mexicanum y H. bonplandii (Figuras 31 y
32). El material vegetal se sec en el horno a 40C durante 48 horas y se troce
en la licuadora para disminuir el tamao de partcula.

Figura 29. Hojas, frutos y semillas de C. ruscifolia



Figura 30. Flores y hojas de D. rosmarinifolius


Figura 31. Hojas de H. mexicanum Figura 32. Hojas de H. bomplandii
39


El material seco y molido se pes y se someti a extraccin, empleando la tcnica
de maceracin en fro con etanol del 70%. Este procedimiento se realiz de forma
exhaustiva durante 60 das, con el fin de extraer la totalidad de los metabolitos
secundarios presentes en el material vegetal (Figuras 33 y 34). Para ello se repiti
el procedimiento de maceracin hasta observar una baja cantidad de residuo
slido.

Figura 33. Obtencin del extracto etanlico de frutos de C. ruscifolia


Figura 34. Obtencin del extracto etanlico de flores de D. rosmarinifolius

Los extractos resultantes se concentraron a presin reducida en el rotavapor y se
secaron en la cabina de extraccin para calcular los respectivos rendimientos
usando la siguiente frmula:






En la siguiente tabla se reportan los resultados de extraccin para las especies H.
mexicanum, H. bonplandii, D. rosmarinifolius y C. ruscifolia

40


Tabla 2. Rendimientos de obtencin de extractos etanlicos
Especie rgano Peso material
vegetal seco
(g)
Peso del
extracto (g)
Rendimiento
(%)
H. mexicanum P. aerea 63,5 14,6 23,0
H. bonplandii Hojas 72,4 15,1 20,8
D. rosmarinifolius Hojas 128,0 24,8 19,4
D. rosmarinifolius Flores 10,1 0,6 6,0
C. ruscifolia Hojas 28,6 6,32 22,1
C. ruscifolia Frutos 60,6 11,0 18,2
C. ruscifolia Semillas 9,8 0,80 7,2

En la Figura 35 se presentan los porcentajes de rendimiento para la obtencin de
los extractos etanlicos de las especies de estudio.


Figura 35. Rendimientos de obtencin de extractos etanlicos

Los rendimientos de obtencin de los extractos (Tabla 2 y figura 35) se encuentran
entre un 6% y 23%, este rango de extraccin es caracterstico en la extraccin en
productos naturales. Los rendimientos varan de acuerdo a la especie y al rgano
de la planta sometido a extraccin. Es posible observar que las hojas son el
rgano que present el mayor rendimiento para las diferentes especies
41


estudiadas, esto debido a la presencia de mayor cantidad de metabolitos solubles
en alcohol.

Los extractos de semillas y frutos de C. ruscifolia poseen color rojizo debido a la
presencia de pigmentos antocianicos. El extracto de hojas es de color verde y de
apariencia pastosa, este se obtuvo con un rendimiento superior al 20% fue el
rgano de mayor extraccin para esta especie (Figura 36).


Figura 36. Extractos etanlicos de C. ruscifolia

El extracto de hojas de D. rosmaronifolius es de color verde oscuro y apariencia
pastosa. Las hojas presentan una mayor cantidad de metabolitos solubles en
etanol (19,4%) comparado con las flores, a partir de las cuales se obtuvo poco
extracto de color caf-naranja (Figura 37).


Figura 37. Extractos de D. rosmarinifolius

El extracto de la parte area de H. mexicanum es viscoso y de color naranja-
verdoso (Figura 38), este color es caracterstico de la presencia de naftodiantronas
(Saddiqe, 2010).

42


A partir de las hojas de H. bonplandii se obtuvo un extracto pastoso de color verde
oscuro con un rendimiento cercano al 20% (Figura 39)

Figura 38. Extracto de H. mexicanum Figura 39. Extracto H. bonplandii


7.3 Anlisis fitoqumico preliminar

El estudio fitoqumico preliminar comenz con la obtencin del extracto etanlico,
posteriormente se realizaron separaciones sucesivas empleando solventes de
diferentes polaridades con el fin de agrupar los metabolitos estructuralmente
semejantes en fracciones.

De esta forma fue posible caracterizar los diferentes grupos de compuestos, de
acuerdo a su comportamiento qumico, frente a diferentes reacciones cualitativas,
que implican cambios estructurales que se evidencian en formacin de
precipitados o desarrollo de coloraciones.

En la primera parte protocolo se realizaron reacciones qumicas en tubo de ensayo
para los diferentes tipos de metabolitos, para corroborar los resultados se
emplearon controles positivos y negativos. Como control positivo se uso un
extracto rico en metabolitos del tipo a analizar o un compuesto puro o patrn.
Como control negativo se uso etanol o el solvente de extraccin (Figura 40).

Los procedimientos y controles utilizados para cada prueba cualitativa se
describen detalladamente en el anexo 1.




43



Figura 40. Ensayos cualitativos del anlisis fitoqumico preliminar


Las pruebas de flavonoides, quinonas, taninos, fenoles, saponinas, cardiotonicos y
cumarinas se realizaron empleando los extractos etanlicos de las especies objeto
de estudio, las convenciones empleadas se muestran en la figura 41.





44



Figura 41. Extractos etanlicos empleados en el anlisis fitoqumico preliminar
CH, CF y CS: Coriaria hojas, frutos y semillas
DH, DT y DF: Displsotephyum hojas, tallos y flores
HyH y HH: Hydrocotyle hojas e Hypericum hojas


Para el anlisis de flavonoides se realizaron las pruebas de Shinoda y
leucoantocianidinas. Todos los extractos analizados presentaron pruebas positivas
frente a los reactivos empleados desarrollando coloraciones rosas, naranjas o
rojas (Figura 42).

Los extractos de frutos y semillas de C. ruscifolia evidencian coloraciones rojas
muy intensas debido a la presencia de antocianinas que toman esta coloracin a
pH cido.

Los extractos de hojas, tallos y flores de D. rosmarinifolius, hojas de H. bonplandii
y hojas de C. ruscifolia desarrollaron coloraciones tenues frente en las pruebas
culaitativas de flavonoides lo que indica presencia de este tipo de metabolitos en
cantidades bajas (Figura 42).

El extracto de hojas de H. mexicanum desarrollo una coloracin roja comparable
con la del control positivo, extracto de t verde, especie que se conoce por su alto
contenido de flavonoides.


45




Figura 42. Ensayos cualitativos para flavonoides

Para el anlisis de taninos se tomaron 1 o 2 ml del extracto etanlico de la especie
de estudio y se adicionaron los reactivos de Cloruro frrico (FeCl
3
) y gelatina-sal,
como control positivo se emple cido tnico. El cloruro frrico permite evidenciar
la presencia de grupos fenlicos por el desarrollo de coloraciones verdes o azules.
El grupo funcional fenol es caracterstico de los taninos, pero tambin est
presente en diferentes tipos de metabolitos secundarios como flavonoides,
cumarinas, quinonas, lignanos entre otros. El reactivo de gelatina-sal permite
confirmar la presencia de taninos por la propiedad que tienen estos de precipitar
las protenas.

Todos los extractos analizados desarrollaron coloraciones verdes o azules con el
reactivo de cloruro frrico (Figura 43). El extracto de hojas de Hydrocotyle
present una coloracin tenue, mientras que los dems extractos mostraron
coloraciones fuertes comparables con el control positivo, lo que indica una
importante presencia de compuestos fenlicos. Los extractos analizados no
46


mostraron precipitado con el reactivo de gelatina-sal (figura 43), por lo tanto los
compuestos fenlicos no son de tipo tanino.


Figura 43. Ensayos cualitativos para taninos

Para determinar la presencia de quinonas en los extractos etanlicos se realizaron
las pruebas de comportamiento frente a HCl, NaOH y Rodamina. Las quinonas
son metabolitos secundarios responsables de coloraciones oscuras en diferentes
familias de plantas y cambian de color con la adicin de cidos y bases en
presencia de metales como el Zinc debido a que son inestables, como control
positivo se empleo antrona un derivado de la antraquinona.

Todos los extractos de D. rosmarinifolius y el extracto de H. mexicanum
presentaron pruebas positivas para quinonas (Figura 44). En la literatura no
existen aun reportes del aislamiento de este tipo de metabolitos en el gnero
Diplostephium.

47



Figura 44. Ensayos cualitativos para quinonas

Para el anlisis de saponinas se realiz la prueba de espuma, debido a que este
tipo de metabolitos tienen la propiedad de formar soluciones jabonosas en
presencia de agua, se us como control positivo extracto de quinua amarga que
se caracteriza por una alta presencia de saponinas. Se confirmo la presencia de
este tipo de metabolitos con la prueba de Rosenthaler.

Los extractos de frutos, hojas y semillas de C. ruscifolia formaron soluciones
espumosas despus de la agitacin y mostraron coloraciones naranjas en la
prueba de Rosenthaler, lo que indica la presencia de saponinas (Figura 45).
48



Figura 45. Ensayos cualitativos para saponinas

Los resultados obtenidos para el anlisis de saponinas son muy relevantes debido
a que en el gnero Hydrocotyle se reporta una importante presencia de saponinas,
este tipo de compuestos son responsables de la actividad antiinflamatoria y
diurtica en varias especies del gnero (Huang et al., 2008), principalmente en
especies utilizadas con fines cosmticos en preparaciones para adelgazar como
H. asitica (centella asitica), sin embargo la especie de estudio no posee este
tipo de compuestos.

Para el anlisis de cardiotnicos se realizaron las pruebas de Baljet y Antrona,
como control positivo se us extracto de Digitalis purpurea (Figura 46). No se
observaron resultados positivos para ninguno de los extractos analizados, este
tipo de metabolitos secundarios son muy restringidos en el reino plantae. De
acuerdo a la revisin bibliogrfica no se reportan este tipo de metabolitos
secundarios en las familias y gneros de las especies de estudio por lo tanto los
resultados obtenidos estn de acuerdo con la quimiotaxonoma.

49



Figura 46. Ensayos cualitativos para saponinas


El anlisis preliminar de cumarinas se realiz mediante las reacciones de
fluorescencia e hidroxamato frrico (Figura 47). Estos ensayos no son especficos
para la verificar la presencia de este tipo de metabolitos pero permiten identificar la
presencia del grupo funcional ester caracterstico del ncleo de las cumarinas. La
reaccin de hidroxamto se emplea tambin para detectar el grupo lactona de las
sesquiterpenlactonas.

Los extractos de frutos y semillas de C. ruscifolia mostraron prueba positiva en el
ensayo de hidraxamto frrico, el extracto de hojas mostr una coloracin tenue,
estos resultados sugieren la presencia de grupos ester o lactona en los extractos.
50



Figura 47. Ensayos cualitativos para cumarinas


Con el fin de determinar la presencia de alcaloides se realiz una extraccin cido-
base tomando 0,1g de extracto crudo y con HCl al 0,5%. Al extracto cido se le
realiz la prueba de Dargendorff (Figura 48). Como control positivo se us un
extracto de la especie Zanthoxylum monophylum rica en alcaloides Berberinicos.
Los extractos analizados no mostraron presencia de alcaloides con la reaccin de
precipitacin (Figura 48), lo que est de acuerdo con los reportes de metabolitos
secundarios para los diferentes gneros y familias.

51



Figura 48. Ensayo cualitativo para alcaloides


Para el anlisis de esteroides se realizaron las pruebas de Liebermman-Burchard,
Vainillina-cido ortofosfrico (VAO) y dienos homoanulares, partiendo de los
extractos etreos de las cinco especies y empleando como control positivo lupeol
(Figura 49). El extracto de ter de petrleo se obtuvo por extraccin slido-liquido
a partir del extracto crudo.
En la Figura 49 se presentan los resultados obtenidos para la prueba de
Liebermman-Burchard, la presencia de coloraciones verdes o azules claras
evidencian la presencia de esteroles, todos los extractos a excepcin de los
extractos de frutos y semillas de C. ruscifolia presentaron coloraciones verdes o
azules que indican la presencia de esteroles o triterpenos.
Para confirmar la presencia de esteroides o triterpenos en los extractos etreos se
realiz la prueba de VAO, se observaron coloraciones violetas o azules los
extractos que presentaron prueba positiva para Liebermman-Burchard (Figura 49).
52



Figura 49. Ensayos cualitativos para esteroides


Los resultados del anlisis cualitativo preliminar de los extractos etanlicos de las
especies de estudio se resumen en la tabla 3.




53


Tabla 3. Resultados del anlisis fitoqumico preliminar de los extractos etanlicos
de C. ruscifolia, D. rosmarinifloium, H. mexicanum e H. bonplandii.
METABOLITO PRUEBA CH CF CS DH DT DF HyH HH
Flavonoides
Shinoda
Leucoantocianidinas
+
+
+++
+++
+++
+++
+
+
+
+
++
++
++
++
+++
+++
Quinonas
Zn/HCl
Zn/NaOH
-
-
-
-
-
-
++
++
++
++
++
++
-
-
+++
+++
Taninos
FeCl
3

Gelatina-sal
+++
-
+++
-
+++
-
+++
-
+++
-
+++
-
+
-
+++
++
Saponinas
Espuma
Rosenthaler
+
++
+++
++
++
++
++
++
-
-
-
-
-
-
-
-
Cardiotnicos
Baljet
Antrona
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Cumarinas
Hidroxamato
Fluorescencia
+
+
++
-
++
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
Esteroides
Liebermman
VAO
Dienos
+++
++
++
-
+
+
-
+
+
+++
++
++
+++
++
++
+++
++
++
++
++
++
+++
++
++
Alcaloides Dragendorff - - - - - - - -

Convenciones: - negativo, + escaso, ++ observable, +++ abundante
CH, CF, CS: Coriaria ruscifolia frutos y semillas
DH, DT, DF: Diplostephium rosmarinifolius hojas, tallos y flores
HH: Hypericum mexicanum hojas
HyH: Hydrocotyle bonplandii hojas


Todos los extractos analizados evidenciaron la presencia de fenoles, flavonoides,
terpenos y esteroides, este tipo de metabolitos se encuentran ampliamente
distribuidos en plantas y han sido previamente reportados en las familias y
gneros de las especies objeto de estudio.

Por medio del anlisis fitoqumico preliminar fue posible determinar la presencia de
metabolitos secundarios como fenoles, esteroides, terpenos y saponinas en los
extractos de hojas, frutos y semillas de C. ruscifolia. Los metabolitos de mayor
importancia qumica en las especies del gnero Coriaria son las lactonas-
sesquiterpenicas reconocidas por ser los componentes responsables de la
54


toxicidad en varias especies (Valencia et al., 2001). Por medio del anlisis
cualitativo no fue posible determinar la presencia de este tipo de compuestos
puesto que no se tiene una prueba especifica que permitiera identificarlos, sin
embargo se obtuvieron resultados positivos en la prueba de hidroxamto frrico
que permite analizar grupos lactona o ester, caracterstico del ncleo
sesquiterpenlactona, por lo que es posible inferir la presencia de compuestos
txicos principalmente en los frutos de la especie de estudio.

Los extractos de hojas, tallos y flores de D. rosmarinifolius presentaron pruebas
positivas para flavonoides, fenoles, terpenos, esteroides y quinonas, este es el
primer reporte de un estudi qumico de esta especie y est de acuerdo con los
reportes de metabolitos secundarios en otras especies de este gnero en
Colombia (vila et al., 2006).

En el extracto de hojas de H. bonplandii se determin la presencia de fenoles,
flavonoides y terpenos en baja cantidad comparado con las dems especies. Este
es el primer reporte de composicin qumica en la especie de estudio, no se
encontr presencia de saponinas, metabolitos secundarios de amplia distribucin
en especies asiticas del gnero Hydrocotyle.

Los extractos de hojas y tallos de H. mexicamun mostraron una importante
presencia de quinonas, fenoles, terpenos, cumarinas, esteroides y saponinas,
estos resultados estn de acuerdo con la fitoqumica del genero. Este es el primer
reporte de composicin qumica de la especies H. mexicanum.

7.4. Cuantificacin de fenoles

Se pes 1 mg de extracto etanlico de las especies de estudio: C. ruscifolia (hojas,
semillas y frutos), D. rosmarinifolius (hojas, tallos y flores), H. bonplandii (hojas) y
H. mexicanum (hojas), se disolvi con 1 ml de metanol y la solucin resultante se
llevo a 10 ml con agua destilada.
Para la curva de calibracin se emplearon soluciones de cido glico a 200, 150,
100, 50, 25, 10, 5, 1 ppm. El anlisis de fenoles se llevo a cabo desarrollando
coloraciones con soluciones de Follin 1:10 y carbonato de sodio al 7,5%. Las
muestras se dejaron en reposo durante 30 min en la oscuridad. La aborsorbancia
fue determinada en el espectrofotmetro Helios a 740 nm (Figura 50).
55



Figura 50. Cuantificacin de fenoles totales por el mtodo de Follin
En la siguiente tabla se reportan los resultados de absorbancia de la curva de
calibracin:
Tabla 4. Curva de calibracin de cido glico para cuantificacin de fenoles







Por medio de la curva de calibracin obtenida para el patrn de cido glico se
determin la ecuacin para la cuantificacin de fenoles en las muestras problemas
(Figura 51).
C de cido
glico (ppm)
A
740 nm

1
0,045
5
0,065
10
0,130
25
0,295
50
0,495
100
0,985
150
1,350
200
1,825
56



Figura 51. Curva de calibracin de cido glico

La concentracin total de fenoles se calcul empleando la siguiente formula y se
expreso en mg de cido glico por gramo de extracto.

Este resultado se multiplico por 10 que es el factor de dilucin.
Tabla 5. Concentracin de fenoles totales en extractos etanlicos de la especies
de estudio
Extracto A
740 nm
Concentracin de fenoles
totales mg AG/g extracto
CH
0,296 312,5
CF 0,496 562,5
CS 0,338 365,0
DH 0,208 202,5
DT 0,196 187,5
DF 0,259 266,2
HyH 0,188 177,5
HH 0,505 573,7

y = 0,0089x + 0,0465
R = 0,9984
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
0 50 100 150 200 250
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

7
4
0

n
m

Concentracin de a. galico (ppm)
Curva de calibracin
57


Los resultados de la tabla 5 muestran que todos los extractos analizados poseen
fenoles en cantidades significativas. En la figura 52 se pueden observar las
concentraciones de fenoles totales determinadas para los extractos de estudio.

Figura 52. Cuantificacin de fenoles totales en los extractos de las especies de
estudio

La mayor concentracin de fenoles totales la present el extracto de hojas de H.
mexicanum.

Los extractos de C. ruscifolia muestran una alta concentracin de metabolitos de
tipo fenol, siendo mayoritarios en el extracto de frutos (562,5 mgAG/g), que se
caracteriza por la presencia de antocianinas, metabolitos responsables de las
coloraciones rojas de estos. Los compuestos fenlicos de los extractos de esta
especie pueden ser de tipo flavonoide de acuerdo a los resultados del anlisis
cualitativo preliminar.

Los extractos de D. rosmarinifoilus presentaron concentraciones muy similares de
fenoles. El extracto de flores posee una concentracin mayor. Segn el anlisis
fitoqumico preliminar es posible esperar que los compuestos fenlicos sean de
tipo flavonoide o quinona.

El extracto de hojas de H. bonplandii presento una baja cantidad de compuestos
fenlicos sin embargo esta cantidad es comparable con otras especies
reconocidas a nivel medicinal por su contenido de fenoles.
0
100
200
300
400
500
600
CH CF CS DH DT DF HyH HH
312,5
562,5
365
202,5
187,5
266,25
177,5
573,7
58


7.5. Fraccionamiento de extractos

Con el fin de agrupar los metabolitos secundarios por polaridades semejantes y
as tener grupos de compuestos ms purificados, se realiz un fraccionamiento
con solventes de polaridad creciente: Eter de petrleo, acetato de etilo y metanol a
los extractos de C. ruscifolia (hojas, semillas y frutos), D. rosmarinifolius (hojas,
tallos y flores), H. bonplandii (hojas) y H. mexicanum (hojas).

Se tomaron los extractos etanlicos y se realiz un fraccionamiento slido-lquido
directo. Los extractos se homogenizaron con el solvente a extraer y se sometieron
a calentamiento leve (30C) y agitacin constante, en la plancha de calentamiento,
durante 20 minutos. Posteriormente la mezcla se filtr y concentr a presin
reducida. Este procedimiento se realiz de forma exhaustiva, hasta no observar
coloracin en el solvente empleado (Figura 53).

Figura 53. Fraccionamiento de extractos etanlicos


59



Figura 54. Fracciones de acetato de etilo de las especies de estudio

Las fracciones obtenidas se secaron y pesaron para determinar el rendimiento de
extraccin de acuerdo con la siguiente frmula:





El porcentaje de rendimiento indica la cantidad de compuestos solubles en cada
solvente de acuerdo a su polaridad. En las tablas 6, 7 y 8 se presentan los
resultados del fraccionamiento.

60


Tabla 6. Resultados del fraccionamiento de los extractos etanlicos de C.
ruscifolia
Parte Solvente Sigla Masa de
fraccin (g)
%
rendimiento
Hojas
EDP CHE 0,98 16,3
AcOEt CHA 1,53 25,5
Metanol CHM 3,33 55,5
Frutos
EDP CFE 0,22 2,0
AcOEt CFA 1,36 11,4
Metanol CFM 9,36 85,1
Semillas
EDP CSE 0,05 6,25
AcOEt CSA 0,25 31,2
Metanol CSM 0,51 63,4

Los resultados del fraccionamiento de los extractos crudos de C. ruscifolia (Figura
55) muestran que los compuestos presentes en los diferentes rganos de esta
especie poseen carcter altamente polar, por lo tanto fueron separados en la
fraccin metanlica. Los frutos presentan el mayor porcentaje de compuestos
polares con 85%, esto puede deberse principalmente a la presencia de los
pigmentos antocianicos que generalmente se encuentran en forma de glicosidos.
Los compuestos de carcter lipoflico, fueron extrados en ter de petrleo y
representan la menor proporcin de los metabolitos totales con porcentajes de 16,
2 y 6% en los diferentes rganos.


Figura 55. Rendimientos para el fraccionamiento de los extractos etanlicos de C.
ruscifolia
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
CHE CHA CHM CFE CFA CFM CSE CSA CSM
16,3
25,5
55,5
2
11,4
85,1
6,25
31,2
63,4
61


Tabla 7. Resultados del fraccionamiento de los extractos etanlicos de D.
rosmarinifolius
Parte Solvente Sigla Masa de
fraccin (g)
%
rendimiento
Hojas
EDP DHE 3,84 16,0
AcOEt DHA 17,60 73,3
Metanol DHM 2,98 12,4
Tallos
EDP DTE 3,64 36,4
AcOEt DTA 2,29 22,9
Metanol DTM 5,88 58,8
Flores
EDP DFE 0,08 13,3
AcOEt DFA 0,25 41,2
Metanol DFM 0,28 46,7

Los resultados del fraccionamiento de los extractos de la especie D.
rosmarinifolius, muestran que los compuestos presentes en las hojas, tallos y
flores poseen diferentes polaridades y por tanto fue posible separarlos con los
diferentes tipos de solventes (Figura 56).


Figura 56. Rendimientos para el fraccionamiento de los extractos etanlicos de D.
rosmarinifolius

En el extracto de hojas se observa que la mayor parte de los metabolitos (73%)
poseen polaridades medias y fueron separados en la fraccin de acetato de etilo.
En el extracto de tallos la mayor parte de los compuestos fueron solubles en
0
10
20
30
40
50
60
70
80
DHE DHA DHM DTE DTA DTM DFE DFA DFM
16
73,3
12,4
36,4
22,9
58,8
13,3
41,2
46,7
62


metanol (59%), mientras que en el extracto de flores cerca de un 88% de los
compuestos presentes poseen polaridades medias y altas. De acuerdo con los
resultados del anlisis fitoqumico preliminar podra esperarse que los compuestos
polares fueran de tipo, fenol, quinona o flavonoide. Los compuestos con carcter
lipoflico como esteroides, terpenos y carotenos fueron minoritarios en todos los
rganos y se separaron en las fracciones eteras.


Tabla 8. Resultados del fraccionamiento del extracto etanlico de H. bonplandii
Parte Solvente Sigla Masa de
fraccin (g)
%
rendimiento
Hojas
EDP HyHE 4,44 29,6
AcOEt HyHA 2,86 19,1
Metanol HyHM 8,68 57,9

Los compuestos presentes en el extracto de H. bonplandii son principalmente de
polaridades altas por lo tanto se separaron con el metanol (Figura 57). Los
compuestos lipoflicos se extrajeron con ter de petrleo y representan
aproximadamente un 30% del total del extracto etanlico. La menor cantidad de
compuestos de este extracto poseen polaridades medias y se separaron en la
fraccin de acetato de etilo.


Figura 57. Rendimientos para el fraccionamiento del extracto etanlico H.
bonplandii
0
10
20
30
40
50
60
HyHE HyHA HyHM
29,6
19,1
57,9
63



Este mtodo de fraccionamiento es eficiente, rpido y permite separar
adecuadamente grupos de compuestos de acuerdo a su polaridad, sin someter el
extracto a calentamiento fuerte, como ocurre en la extraccin slido-lquido tipo
soxhlet.

7.6 Estudio Cromatogrfico

El control del fraccionamiento se realiz por cromatografa en capa delgada CCD,
empleando como fase estacionaria silica gel y como fases mviles, Hexano-
acetato de etilo 8:2, Tolueno-Acetato de etilo 7:3 para las fracciones lipoflicas y
Dicloro metano-acetato de etilo 8:2 y Cloroformo-metanol 9:1 de polaridad media y
alta (Figura 58).



Figura 58. Fases mviles empleadas en la CCD

Con el fin de determinar los tipos de metabolitos presentes en cada fraccin las
placas de cromatografa se analizaron con los reveladores especficos
relacionados en la tabla:

Tabla 9. Reveladores especficos para la CDD
Fase mvil Revelador Tipo de compuesto
Hex- AcOEt Liebermman-Burchard Esteroles
Tolueno- AcOEt Vainillina-acido sulfrico Esteroides y terpenos
DCM- AcOEt FeCl
3
Fenoles
CHCl
3
-MeOH Cloruro de Zin Flavonoides

64


Se analizaron las fracciones etreas, de acetato de etilo y metanol de todas las
especies con las fases mviles anteriormente descritas. Las fracciones se
sembraron en las placas cromatogrficas como se representa en la figura 59.


Figura 59. CDD de las fracciones de polaridad creciente de las especies de
estudio

Por medio del anlisis en cromatografa en capa delgada empleando reveladores
especficos fue posible confirmar la presencia de tipos de compuestos en las
fracciones purificadas.

En la Figura 60 se observa la CCD de las fracciones etreas. Al revelar las placas
con los reactivos de VAO y Liebermman-burchard se desarrollan manchas de
colores morados y verdes debido a la presencia de compuestos de tipo terpeno o
esterol, lo que indica que en las fracciones lipoflicas se tiene principalmente
compuestos de este tipo.

Figura 60. CCD de fracciones etereas
65



Los extractos de hojas de C. ruscifolia, hojas de D. rosmarinifolius y hojas de H.
bonplandii evidencian la mayor abundancia de compuestos esteroidales.

Las fracciones de AcOet y metanol se revelaron con cloruro ferrico y cloruro de
zinc que permiten evidenciar la presencia de fenoles y flavonoides (Figuras 61 y
61), estos reveladores fueron seleccionados teniendo en cuenta los resultados del
anlisis fitoqumico preliminar.


Figura 61. CCD de las fracciones de AcOet


Figura 62. CDD de las fracciones de MeOH

Las fracciones de media y alta polaridad desarrollaron coloraciones verdes y
azules con el reactivo de FeCl
3
permitiendo evidenciar la presencia de
compuestos fenlicos de diferentes polaridades presentes en las diferentes
66


fracciones. Las fracciones de AcOet y MeOH de hojas de D. rosmarinifolius
presentaron la mayor abundancia de compuestos fenlicos y flavonoide
comparado con los dems rganos de la especie en donde revelaron pocas
manchas coloreadas (Figuras 61 y 62).

Los extractos de hojas y semillas de C. ruscifolia tambin presentaron compuestos
de tipo flavonoide y fenol, sin embargo en el extracto de frutos no se observa
migracin de los compuestos en la CCD lo que indica una alta polaridad de los
compuestos, por tratarse de antocianinas glicosiladas (Figuras 61 y 62).

En el extracto de hojas de H. bonplandii hay baja presencia de compuestos en
todas las fracciones, los compuestos de mayor polaridad revelan con cloruro
frrico


7.7. Ensayo de toxicidad frente a Artemia salina
Con el fin de realizar un estudio preliminar del potencial farmacolgico de los
extractos de las especies de estudio, se evalu la actividad citotxica empleando
como organismo indicador el microcrustceo Artemia salina, altamente sensible a
una gran variedad de sustancias qumicas.
Los huevos de A. salina se incubaron durante 24 horas a una temperatura de 28
C en un medio de cultivo. Los organismos se dejaron madurar 24 horas antes del
ensayo (Figura 63).

Figura 63. Medio de cultivo y nauplios de Artemia salina

67


10 mg de los extractos etanlicos de C. ruscifolia (hojas, semillas y frutos) D.
rosmarinifoilus (hojas y flores), H. bonplandii (hojas) y H. mexicanum (hojas) se
solubilizaron en 1 mL de DMSO (dimetilsulfxido), a partir de esta solucin stock
se prepararon soluciones a concentraciones de 1000, 500, 250, 100 y 10 g/ml
(Figura 64). Se realiz un control negativo empleando DMSO a la concentracin
mxima 2 % en medio de cultivo.

Figura 64. Soluciones Stock y diluciones de extractos de Frutos de C. ruscifolia

Los ensayos se realizaron por triplicado empleando 10 nauplios por pozo. Se
completaron los pozos de la caja con 4 ml de las soluciones preparadas con medio
de cultivo. Al cabo de 24 horas se hicieron las lecturas, y se registr el nmero de
sobrevivientes en cada pozo (Figura 65).

Figura 65. Ensayo de toxicidad frente a A. salina
68


Los datos obtenidos fueron procesados con el programa estadstico Epa probit
analysis program con el fin de determinar la concentracin letal 50 (CL
50
) y un
rango de confianza de 95 %.
En la siguiente tabla se presentan los resultados de las concentraciones letales
para la mitad de la poblacin de los microcrustaceos CL
50
, calculadas con el
programa estadstico Probit para los extractos etanlicos analizados:
Tabla 10. CL
50
calculadas por el mtodo Probit
Extracto Parte sigla CL
50
ppm
Coriaria ruscifolia Hojas CH 588.12
Coriaria ruscifolia Frutos CF 14.44
Coriaria ruscifolia Semillas CS 53.56
Diplostephium rosmarinofolius Hojas DH 407.15
Diplostephium rosmarinofolius Flores DF 1090.57
Hydrocotyle bonplandii Hojas HyH 26,57
Hypericum mexicanum Hojas HH 9,60

La concentracin letal cincuenta CL
50
es la cantidad (mg/L de agua) de extracto
necesaria para provocar la muerte a la mitad de la poblacin de microcrustceos
de Artemia salina. En la Figura 66 se observa que estas cantidades de extracto
son variables y diferentes para cada rgano de una especie.


Figura 66. CL
50
de los extractos etanlicos de las especies de estudio

CH CF CS DH DF HyH HH
588,12
14,44
53,56
407,15
1090,57
26,57
9,6
CL50 ppm de extractos etanlicos
69


En el ensayo de toxicidad en Artemia, valores inferiores a 100 g/ml, en extractos,
son considerados txicos, aunque los extracto de mayor toxicidad presentan
valores desde 1-10 g/ml, como los resultados reportados para los extractos
crudos de la especie Annona squamosa, especie reconocida por contener
metabolitos secundarios txicos como las acetogeninas (Pisutthanan et al., 2004).
De acuerdo con estos parmetros por medio del ensayo de Artemia salina se
determin que los extractos de frutos y semillas de C. ruscifolia, hojas de H.
bonplandii y hojas de H. mexicanum son citotxicos frente al microcrustaceo. El
extracto de y hojas de H. mexicanum es altamente txico por poseer un CL
50

menor a 10 ppm.
El extracto de frutos (pulpas) de C. ruscifolia result ser ms txico que el extracto
de semillas, lo que indica una mayor concentracin de los principios activos en las
pulpa del fruto. Los resultados de citoxicidad sugieren la posible presencia de
sesquiterpenlactonas como la coriarina y la coriamyrtina en los frutos C. ruscifolia,
puesto que estos han sido identificados como los compuestos responsables de la
neurotoxicidad de las bayas de la especie Coriaria myrtifolia (Haro et al., 2005). El
extracto de hojas resulto ser inactivo en el ensayo de toxicidad, lo que est de
acuerdo con las pruebas cualitativas en donde no se evidencio la presencia de
lactonas con la prueba de hidroxamato.
Los extractos de D. rosmarinifolius resultaron ser poco txicos frente a los
microcrustacios de A. salina, el extracto de flores posee una CL
50
mayor a 1000
ppm. Los resultados de toxicidad para la especie son consecuentes con la
presencia de compuestos de tipo flavonoide, fenol, esteroide y terpeno
determinados mediante el anlisis fitoqumico preliminar puesto que este tipo de
compuestos generalmente presentan toxicidades bajas.
Los resultados de toxicidad sugieren que es posible realizar un estudio de
aislamiento biodirigido de los principios activos a partir de los extractos de frutos y
semillas de la especie C. ruscifolia y evaluar otras actividades biolgicas
(antimicrobiana, antifngica, insecticida o antioxidante) a los extractos de D.
rosmarinifolius para determinar un potencial farmacolgico.
En la especie H. mexicanum se est realizando un estudio biodirigido de actividad
antibacteriana frente a diferentes bacterias patgenas, como trabajo de grado de
la Estudiante de Noveno semestre de Biologa Valeria Rodrguez Snchez de la
Universidad del Bosque. El proyecto de tesis se anexa a este informe.

70


8. REPORTE DE METAS PLAN DE DESARROLLO

Se realiz la compilacin de los resultados del componente de investigacin en
fitoqumica para el reporte de metas de plan de desarrollo. Se reportaron los
resultados de la fitoqumica y actividad biolgica de cuatro especies de estudio en
dos artculos.

8.1. Estudio fitoqumico preliminar y evaluacin de actividad antioxidante y
txica de las especies Hypericum mexicanum e Hydrocotyle bonplandii

Introduccin

Los productos naturales, entendidos como los compuestos producidos por los
organismos vivos, son de gran importancia para la humanidad. Su marcada
utilidad se demuestra fcilmente en el impacto de la vida cotidiana del hombre.
Todos los productos cosmticos, la gran mayora de productos farmaceticos, y la
mitad de los productos usados en el sector agrcola, estn relacionados con los
productos naturales. Desde esta perspectiva, la biodiversidad es el capital
biolgico del mundo y representa opciones estratgicas para su uso sostenible.
Las Especies Reactivas de Oxgeno (ROS, por sus siglas en ingles) son especies
qumicas radicales y no radicales que debido a su inestabilidad se comportan
como agentes oxidantes. Las ROS pueden tener en nuestro organismo un origen
endgeno relacionado con el metabolismo del oxgeno y con distintas reacciones
de defensa de nuestro sistema inmunolgico. Por otro lado factores externos como
el cigarrillo, la luz ultravioleta, algunos alimentos y factores medio ambientales
disparan la produccin de especies reactivas de oxigeno, acelerando diferentes
procesos degenerativos. El dao oxidativo se relaciona con el origen y desarrollo
de enfermedades multifactoriales, como la oxidacin de las LDL, las
enfermedades cardiovasculares, el dao oxidativo al ADN, el cncer, la oxidacin
de las protenas de las lentes oculares y la alteracin de la visin (Pourmorad et
al., 2006). La ingesta de alimentos ricos en sustancias antioxidantes como
vitaminas C y E, carotenoides o compuestos fenlicos, previene o disminuye el
desarrollo de estas enfermedades. Se cree que la dieta aumenta la defensa
antioxidante del organismo evitando el dao oxidativo. Los compuestos fenlicos
son sustancias orgnicas ampliamente distribuidas en el reino vegetal. Se
71


sintetizan como metabolitos secundarios con funciones de defensa, y son en gran
medida responsables de las propiedades del color, la astringencia y el flavor
(sabor y aroma) de los vegetales (Valenteao et al., 2002).
Los compuestos antioxidantes son tiles no solo a nivel medicinal, tambin en el
sector alimenticio y cosmtico. La bsqueda de este tipo de compuestos se ha
convertido en una prioridad y las plantas son una fuente impresionante de
compuestos antioxidantes.
Hypericum es un gnero de plantas pertenecientes a la familia Hyperaceae, este
gnero cuenta con aproximadamente 484 especies, con presencia natural o
introducida en todos los continentes del mundo excepto en la Antrtida. Las
especies de este gnero son hierbas, arbustos y rara vez arboles.
Algunas especies del gnero Hypericum han sido utilizadas en la medicina
tradicional de diferentes pases alrededor del mundo. A partir de las flores de H.
perforatum se preparan infusiones o decocciones que se toman fines sedativos y
se aplican externamente en cataplasmas para tratar neuralgias. En Europa y
Estados Unidos se prescriben y comercializan extractos de flores de la especie H.
perforatum como antidepresivos moderados. El uso de estos extractos tiene gran
importancia econmica. Se estima que en 2008 en Estados Unidos se vendieron
aproximadamente 8,2 millones de USD en este tipo de productos teraputicos
(Crocket & Robson, 2011).
Por medio de los estudios qumicos de extraccin y aislamiento de metabolitos
secundarios en especies del gnero Hypericum se han identificado
mayoritariamente seis tipos de compuestos, naftodiantronas, floroglucinoles,
flavonoides, biflavonas, fenilpropanos y proantocianidinas. Adicionalmente, en
menor cantidad taninos, xantonas y aceites esenciales (Crockett & Robson, 2011).
El gnero Hydrocotyle pertenece a la familia Apiaceae. Tiene distribucin
cosmopolita y est compuesto por especies herbceas anuales y perennes,
algunas de ellas adaptadas a diversos tipos de humedales. Este gnero posee
especies medicinales, ornamentales y alimenticias. La especie H. asitica
conocida popularmente como centella asitica, es la especie medicinal ms
importante de este gnero; a esta especie se le atribuyen propiedades
antibacterianas, antidepresivas, anitiinflamatorias y estimulantes de la circulacin,
entre otras. Las propiedades asociadas al metabolismo de grasas se han utilizado
ampliamente para la obtencin de productos comerciales adelgazantes (Nicolas &
Plunkett, 2009).
72



Los estudios qumicos previos realizados en especies del gnero Hydrocotyle han
permitido el aislamiento e identificacin de metabolitos secundarios de tipo
flavonoide como la 3-O-galactosidilquercitina de H. umbellata (Adams et al., 1998).
Terpenos como trans--farneseno, timol y -terpineno de H. sibthorpioides.
Triterpenos glicosilados de tipo oleano y ursano aislados de H. ranunculoides y H.
sibthorpoides (Huang et al., 2008).
En un estudio realizado en la especie Colombiana Hydrocotyle leucocephala se
aislaron e identificaron diferentes tipos de metabolitos poco comunes en plantas,
tres diacetilenos 1, 2 y 3 reportados por primera vez en la literatura (Figura 1),
siete leucoceramidas, seis leucocerebrosidos y nueve compuestos previamente
reportados en el gnero (Ramos et al., 2006).

Figura 1. Compuestos diacetilenicos aislados de H. leucocephala

El presente trabajo pretende realizar el tamizaje fitoqumico y de actividad
antioxidante y citotxica de dos especies nativas, Hydrocotyle bonplandii e
Hypericum mexicanum con el fin de identificar el tipo de metabolitos secundarios
responsables de la actividad antioxidante.

Materiales y mtodos

Recoleccin del material vegetal
El material vegetal (hojas y tallos) de la especie Hypericum mexicanum se
recolect en la vereda las Mercedes de Ciudad Bolvar. Las hojas de la especie
Hydrocotyle bonplandii se colectaron en la vereda San Francisco del Pramo de
Cruz Verde.

73


Obtencin de extractos
El material vegetal colectado se lav y sec en un horno a 40C con conveccin
de aire. El material seco y molido se someti a extraccin por maceracin con
etanol del 96% a temperatura ambiente. El extracto etanlico resultante se
concentr eliminando el solvente por destilacin a presin reducida (rotavapor).

Anlisis fitoqumico preliminar
Para el anlisis fitoqumico preliminar se dise un protocolo modificado basado
en las metodologas y pruebas cualitativas propuestas previamente por varios
autores (Sanabria, 1983; Bilbabo, 1993; Lock, 1988; Merck, 2001). El protocolo se
llevo a cabo en dos etapas, en la primera se realizaron reacciones cualitativas en
tubo de ensayo y en la segunda parte pruebas de coloracin en cromatografa de
capa delgada CCD. Se utilizaron controles positivos y negativos para corroborar
los resultados obtenidos.

Cuantificacin de fenoles
La concentracin de fenoles totales en los extractos se determino por el mtodo
colorimtrico de Follin-Ciocalteau. Se realizo una curva de calibracin empleando
un patrn de cido glico (reactivo analtico). Para el anlisis de los extractos se
prepararon soluciones de 10 mg/ml de en metanol y se determino la absorbancia a
740 nm en una celdas de vidrio. Los resultados se expresan en mg de cido glico
por g de extracto.

Fraccionamiento de extractos
Los extractos etanlicos de parte area de H. mexicanum se fraccion empleando
la tcnica de extraccin slido-liqudo con solventes de polaridad creciente,
hexano, acetato de etilo y metanol.

Actividad antioxidante

Bioautografa con -caroteno
Se determin la actividad protectora de los metabolitos secundarios sobre el -
caroteno (Cavin et al., 1998). Los extractos y fracciones secas se solubilizaron con
de metanol. 10 L de las soluciones se aplicaron en placas de silica gel para
cromatografa a 2 cm de la base. Las placas se desarrollaron con sistemas de
solventes de diferente polaridad. Las placas secas se rociaron con una disolucin
de -caroteno al 0.005% en cloroformo. La placa se expuso a luz UV (254 nm)
74


hasta que el fondo se decolor. Los compuestos activos aparecen como manchas
amarillo-naranjas contra un fondo blanco.

Captacin de radicales DPPH
Para la cuantificacin de la actividad antioxidante de los extractos y fracciones de
las especies de estudio se realiz el ensayo de captacin de radicales DPPH. Se
determin la concentracin inicial y final de radical de DPPH, luego de adicionar
los extractos y fracciones que presentaron actividad en el bioensayo de -
caroteno. Se prepararon soluciones a concentraciones de 100 ppm. Se tomaron 2
ml de la solucin de extracto y se le adiciono 2,0 ml de DPPH y se determin la
concentracin de DPPH por espectrofotometra UV-vis a 517 nm. La actividad
antioxidante se determino por la disminucin de la absorcin de radiacin (Yen &
Chen, 1995).

6.9. Evaluacin de la toxicidad
Para evaluar la toxicidad de extractos y fracciones se us el ensayo de letalidad
en Artemia salina de acuerdo con el protocolo sugerido por McLaughlin y
colaboradores. Los huevos de A. salina se incubaron durante 24 horas a una
temperatura de 28 C en un medio de cultivo de sal marina a una concentracin de
38 g/L. Los ensayos se realizaron por triplicado empleando 10 nauplios por pozo
los cuales se expusieron a diferentes concentraciones de extractos o fracciones.
Al cabo de 24 horas se hicieron las lecturas, y se registr el nmero de
sobrevivientes en cada pozo.

Los datos obtenidos fueron procesados con el programa estadstico Epa probit
analysis program con el fin de determinar la concentracin letal 50 (CL
50
) y un
rango de confianza de 95 %.

Resultados y discusin

Obtencin de extractos etanlicos
El material vegetal recolectado se lav y se separ en los diferentes rganos. Las
hojas y tallos de Hypericum mexicanum (Figura 2), se secaron en el horno a 40C
durante dos das. Las hojas de Hydrocotyle sp (Figura 3), se secaron al sol
durante 4 das. El material seco se troce en la licuadora.

75



Figura 2. Tallos y hojas frescas de H. mexicanum


Figura 3. Hojas frescas de H. bonplandii

La obtencin de extractos se realiz de forma exhaustiva, con el fin de extraer la
totalidad de los metabolitos secundarios presentes en el material vegetal. Para
esto se repiti el procedimiento de maceracin hasta observar una baja cantidad
de residuo slido luego de la eliminacin del solvente a presin reducida. Los
extractos totales resultantes de la evaporacin del solvente se dejaron secar en la
cabina durante una semana y se pesaron para calcular el rendimiento, por medio
de la siguiente frmula:




En la siguiente tabla se reportan los resultados de extraccin

Tabla 1. Rendimientos de obtencin de extractos etanlicos
Especie rgano Peso material
vegetal seco (g)
Peso del
extracto
(g)
Rendimiento
(%)
H. bonplandii Hojas 66,3 6,90 10,3
76


H. mexicanum Hojas 63,5 14,6 23,0
H. mexicanum Tallos 57,8 7,9 13,7

Los rendimientos para la obtencin de extractos etanlicos de H. mexicanum son
altos comparado con el extracto de hojas de H. bonplandii. El mayor rendimiento
se obtuvo para el extracto de hojas (23%), los tallos presentaron un menor
rendimiento (13,7%), debido a una mayor presencia de compuestos insolubles en
etanol. Los extractos de hojas y tallos de H. mexicanum son viscosos y de color
naranja (Figura 4), este color es caracterstico de la presencia de naftodiantronas
(Saddiqe, 2010).

Figura 4. Extractos etanlicos de hojas y tallos de H. mexicanum

Anlisis fitoqumico preliminar
El estudio fitoqumico preliminar comenz con la obtencin de los extractos
etanlicos, posteriormente se realizaron separaciones sucesivas empleando
solventes de diferentes polaridades con el fin de agrupar los metabolitos
estructuralmente semejantes en fracciones. De esta formafue posible caracterizar
los diferentes grupos de compuestos, de acuerdo a su comportamiento qumico,
frente a diferentes reacciones cualitativas. En la primera parte protocolo se
realizaron reacciones qumicas en tubo de ensayo para los diferentes tipos de
metabolitos. Como control positivo se uso un extracto rico en metabolitos del tipo a
analizar o un compuesto puro o patrn. Como control negativo se uso etanol.

En la siguiente tabla se resumen los resultados del anlisis fitoqumico preliminar
en tubo de ensayo.




77


Tabla 2. Resultados del anlisis fitoqumico preliminar de los extractos etanlicos
de H. mexicanum y H. bonplandii
METABOLITO PRUEBA HmH HmT HbH
Flavonoides Shinoda
Leucoantocianidinas
Rosenhein
+++
++
+++
-
++
+++
-
-
-
Quinonas Zn/HCl
Zn/NaOH
Borntrger-Kraus
+++
+++
+++
+++
+++
+++
-
-
Taninos FeCl
3

Gelatina-sal
+++
++
+++
++
++
-
Saponinas Espuma
Rosenthaler
+
-
-
-
-
-
Cardiotnicos Baljet
Antrona
+
+
-
-
-
-
Cumarinas Erlich
Fluorescencia
+
+
+
+
-
-
Esteroides Salkowski
Liebermman-Burchard
VAO
Dienos-homoanulares
+++
+
+
++
-
-
+
-
++
+++
++
+
Alcaloides Mayer
Valser
Wagner
Dragendorff
-
-
-
-

-
-
-
-

-
-
-
-

Convenciones: - negativo, + escaso, ++ observable, +++ abundante
HmH, HmT: H. mexicanum hojas y tallos; HbH: H. bonplandii hojas

Todos los extractos analizados evidenciaron la presencia de fenoles, terpenos y
esteroides, este tipo de metabolitos se encuentran ampliamente distribuidos en las
plantas.

Los extractos de hojas y tallos de H. mexicamun mostraron una importante
presencia de quinonas, fenoles, terpenos, cumarinas, esteroides y saponinas,
estos resultados estn de acuerdo con la fitoqumica del genero. Este es el primer
78


reporte de composicin qumica de la especie H. mexicanum (Crockett, & Robson,
2011).

El extracto de hojas de H. bonplandii solo present pruebas positivas para
esteroides, terpenos y fenoles, aunque estos resultados estn de acuerdo con los
reportes previos para la fitoqumica del gnero, es importante resaltar que no se
evidenci la presencia de saponinas, metabolitos secundarios representativos de
estas especies y responsables de la actividad antiinflamatoria en especies como la
centella asitica (Nicolas & Plunkett, 2009).

Fraccionamiento de extractos
Se realiz un anlisis cromatogrfico preliminar empleando cromatografa en capa
delgada CCD en silica gel y diferentes sistemas de solventes con el fin de
determinar la complejidad de los extracto etanlicos y polaridad de los metabolitos
presentes. Con estos resultados se pudo evidenciar que el extracto de H.
bonplandii no posee una gran cantidad de metabolitos secundarios, por lo tanto no
se realiz fraccionamiento del mismo.
Por otro lado los extractos de H. mexicanum poseen una gran variedad de
metabolitos de baja y alta polaridad. Por medio de la CCD se logr determinar que
los extractos de hojas y tallos de esta especie son muy similares en composicin
por lo tanto fueron reunidos para el fraccionamiento (Figura 5).


Figura 5. CCD de los extractos de hojas y tallos de H. mexicanum y hojas de H.
bonplandii

Hojas de H. mexicanum
Talloss de H. mexicanum
Hojas de H. bonplandii
79


Se tomaron 20 g de los extractos de hojas y tallos de H. mexicanum y se realiz
un fraccionamiento slido-lquido empleando tres solventes de polaridad creciente:
hexano, acetato de etilo y metanol. El extracto se homogenizo con el solvente a
extraer y se someti a calentamiento leve (30C) y agitacin constante, durante 20
minutos. Posteriormente la mezcla se filtr y concentr a presin reducida. Este
procedimiento se repiti con cada solvente comenzando desde el de menor
polaridad y aumentando hasta llegar a metanol.

Las fracciones obtenidas se secaron y pesaron para determinar el rendimiento de
extraccin de acuerdo con la siguiente frmula:




Tabla 3. Resultados del fraccionamiento del extracto etanlico de parte area de
H. mexicanum
Solvente Sigla Masa extracto (g) % Rendimiento
Hexano HHM 6,4 32,0
Acetato de etilo AHM 4,9 24,5
Metanol MHM 7,4 37,0
Total 18,7 93,5%

Los resultados de la tabla 3, muestran que los compuestos presentes en el
extracto etanlico de esta especie poseen diferentes polaridades y fue posible
separarlos con los diferentes solventes. Los compuestos de mayor polaridad
(37%) fueron extrados con metanol. Los compuestos de carcter lipoflico que se
solubilizaron preferiblemente en hexano constituyen alrededor del 32% del
extracto.

Cuantificacin de fenoles en extractos y fracciones
Se pes 1 mg de extracto o fraccin y se disolvi con 1 ml de metanol. Esta
solucin se diluy a 1:10 con agua destilada. Se prepararon las soluciones de
cido glico a 200, 150, 100, 50, 25, 10, 5, 1 ppm y las soluciones de Follin 1:10 y
carbonato de sodio al 7,5%. Se revelaron las coloraciones a una dilucin de 10mL.
Las muestras se dejaron en reposo durante 30 min en la oscuridad. La
aborsorbancia fue determinada en el espectrofotmetro Helios a 740 nm.

80


Por medio de la curva de calibracin obtenida para el patrn de cido glico se
determin la ecuacin para la cuantificacin de fenoles en las muestras problemas
(Figura 6).


Figura 6. Curva de calibracin de cido glico

La concentracin total de fenoles se calcul empleando la siguiente formula y se
expreso en mg de cido glico por gramo de extracto.



Este resultado se multiplico por 10 que es el factor de dilucin. En la tabla 4 se
presentan los resultados de la absorbancia y la concentracin de fenoles
calculada.

Tabla 4. Concentracin de fenoles totales en extractos y fracciones
Extracto Sigla A
740 nm
Concentracin de fenoles
totales mg AG/g extracto
H. mexicanum hexano HMH 0,257 217,8
H. mexicanum acetato HMA 0,406 383,3
H. mexicanum metanol HMM 0,430 410,0
H. bonplandii etanol HS 0,188 141,1

81


Los resultados de la tabla 4 muestran que todos los extractos analizados poseen
fenoles en cantidades significativas. En la figura 7 se presentan los resultados de
cuantificacin de fenoles en forma grfica.


Figura 7. Concentracin de fenoles totales en extractos y fracciones

Las fracciones de acetato de etilo y metanol de H. mexicanum evidenciaron la
mayor concentracin de fenoles totales, lo cual indica que estos compuestos
poseen polaridades medias y altas. De acuerdo con la fitoqumica del gnero
Hypericum estos fenoles pueden ser de tipo flavonoide o quinona. El extracto total
de H .bonplandii presenta una baja cantidad de metabolitos fenlicos comparado
con las fracciones de H. mexicanum, sin embargo esta concentracin total es
representativa frente a otras especies vegetales. Por medio de los ensayos de
actividad antioxidante se pretende comprobar si la actividad de los extractos y
fracciones est dada por la presencia de compuestos fenlicos, puesto que estos
metabolitos son conocidos como antioxidantes naturales.

Actividad antioxidante por bioautografa en CCD
A partir de los extractos etanlicos y las fracciones de polaridad creciente se
realiz la evaluacin de la actividad antioxidante por el mtodo autobriogrfico en
CCD. 10 l del extracto o fraccin se sembraron en una placa de cromatografa de
slica gel a 1 cm del borde inferior, este procedimiento se llevo a cabo con cuatro
cromatoplacas. Dos placas fueron eluidas con el sistema de solventes Hexano-
Acetato de etilo 8:2 (baja polaridad) y las dos restantes con la mezcla Cloroformo-
82


Metanol 85:15 (alta polaridad). Dos placas de diferente polaridad se revelaron
asperjando con -caroteno y otras dos con el revelador especifico para fenoles
FeCl
3
. Las placas asperjadas con -caroteno se sometieron a luz UV de 254 nm,
hasta degradar el fondo naranja. Este ensayo cualitativo permite observar la
presencia de compuestos con actividad antioxidante que impiden la oxidacin del
-caroteno, como compuestos naranjas-amarillos sobre un fondo blanco (Figura
8).
El revelador de FeCl
3
permite determinar la presencia de compuestos fenlicos a
los cuales se les atribuye la actividad antioxidante de diferentes especies, se
observan manchas azules, verdes o rojas de acuerdo al tipo de fenol (Figura 8).
El extracto y las fracciones de H. mexicanum se sembraron en el siguiente orden,
hexano (H), acetato de etilo (A), total (E) y metanol (M). En la figura 8 se observan
varias manchas que revelaron diferentes colores con FeCl
3
y que mostraron
actividad antioxidante en el ensayo con beta-caroteno en las fracciones de hexano
y acetato de etilo.



Figura 8. Bioautografia con -caroteno y FeCl
3
de extractos y fracciones de H.
mexicanum

Para continuar con el estudio de actividad se realiz la cuantificacin de la
actividad antioxidante con DDPH por el mtodo colorimtrico.

Actividad antioxidante por captacin de radicales DPPH
Este ensayo se realiz en el Laboratorio de Bioprospeccin de la Universidad
Jorge Tadeo Lozano. Se tomo una alcuota de 2ml de cada uno de los extractos y
fracciones. Se prepararon soluciones a concentraciones de 100 ppm. Se tomaron
2 ml de la solucin de extracto y se le adiciono 2,0 ml de DPPH, la mezcla se agito
por un minuto y se dejo en un lugar oscuro durante 30 minutos a temperatura
Polaridad baja
Polaridad alta
-caroteno
FeCl3
83


ambiente. Como control positivo se utiliz el acido ascrbico en concentraciones
entre 0,4 y 50 g/ml.
Se midi la absorbancia a 517 nm, y se calcul el efecto neutralizador de radicales
como:

% de neutralizacin = [ 1-(A
muestra
A
blanco
)/ A
control
] *100

En la Siguiente tabla se reportan los resultados de la captacin de radicales DPPH
para los extractos y fracciones analizados.

Tabla 5. Porcentajes de neutralizacin de radicales DPPH
Extracto Sigla A 517 nm % de neutralizacin
DPPH
H. mexicanum hexano HMH 0,368 75,14
H. mexicanum acetato HMA 0,067 96,64
H. mexicanum metanol HMM 0,036 98,86
H. bonplandii etanol HS 0,068 96,57

En la Figura 9 se observa la alta captacin de radicales DPPH a la concentracin
evaluada para los diferentes extractos.


Figura 9. Porcentajes de neutralizacin de radicales DPPH

84


Debido a que la mayora de extractos a los que se les evalu la actividad
antioxidante fueron capaces de neutralizar el radical DPPH a la concentracin
evaluada, se debe realizar una curva de disminucin de la absorbancia, para
determina la concentracin efectiva CE
50
y encontrar el potencial antioxidante de
estos.

Teniendo en cuenta la importante actividad que presentaron los diferentes
extractos y fracciones de las especies evaluadas se evalu la actividad txica en
el modelo de Artemia salina, con el fin de determinar el ndice de selectividad. El
desarrollo de agentes antioxidantes requiere compuestos o extractos activos y
poco txicos.

Ensayo de toxicidad frente a Artemia salina
100 mg de los extractos etanlicos y fracciones se solubilizaron en 1 mL de DMSO
(dimetilsulfxido), a partir de esta solucin stock se prepararon soluciones a
concentraciones de 1000, 500, 250, 100 y 10 g/ml. Se realiz un control negativo
empleando DMSO a la concentracin mxima 2 % en medio de cultivo. Los
ensayos se realizaron por triplicado empleando 10 nauplios por pozo. Se
completaron los pozos de la caja con 4 ml de las soluciones preparadas con medio
de cultivo. Al cabo de 24 horas se hicieron las lecturas, y se registr el nmero de
sobrevivientes en cada pozo. Los datos obtenidos fueron procesados con el
programa estadstico Epa probit analysis program con el fin de determinar la
concentracin letal 50 (CL
50
) y un rango de confianza de 95 %.
En la siguiente tabla se presentan los resultados de las concentraciones letales
para la mitad de la poblacin de los microcrustaceos CL
50
, calculadas con el
programa estadstico Probit para los extractos analizados:

Tabla 6. CL
50
calculadas por el mtodo Probit para los extractos y fracciones
Extracto Fraccin sigla CL
50

ppm
H. mexicanum Hojas HmH 9,60
H. mexicanum Hexano HMH 667
H. mexicanum A. etilo HMA 540
H. mexicanum Metanol HMM >1500
H. bonplandii Hojas HyH 26,57

En el ensayo de toxicidad en Artemia, valores inferiores a 100 g/ml, en extractos,
son considerados txicos aunque los extracto de mayor toxicidad presentan
85


valores desde 1-10 g/ml, como los resultados reportados para los extractos
crudos de la especie Annona squamosa, especie reconocida por contener
metabolitos secundarios txicos como las acetogeninas (Pisutthanan et al., 2004).
Teniendo en cuenta esto es posible concluir que los extractos totales de H.
mexicanum y H. bonplandii presentan una alta toxicidad frente al microcrustceo.

Al realizar el fraccionamiento del extracto total H. mexicanum altamente activo, se
llevo a cabo una prdida de la toxicidad, las fracciones presentaron toxicidad baja
o nula frente al microorganismo. La disminucin de la actividad en los casos
anteriores puede deberse a que en el extracto total se presenta un efecto
sinergista de los metabolitos secundarios. Este resultado es muy importante
debido a que la actividad antioxidante aumento con el fraccionamiento, mientras la
toxicidad disminuy, mejorando as la selectividad en la actividad antioxidante

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87


8.2. Estudio fitoqumico preliminar y evaluacin de txica frente a Artemia
salina de las especies Coriaria ruscifolia y Diplostephium rosmarinifolius

Introduccin

Tradicionalmente las plantas han sido el recurso ms empleado por el hombre y
los animales para su alimentacin y la cura de sus dolencias, este saber popular
se ha transmitido de generacin en generacin y constituye un pilar en la qumica
de los productos naturales. Los estudios fitoqumicos comienzan con la
comprobacin de un uso tradicional y puede concluir en el aislamiento de un
compuesto lder o compuesto activo, el cual puede llegar despus de diferentes
estudios al desarrollo de un agente teraputico novedoso.

Los estudios fitoqumicos han tomado gran impulso en la bsqueda de sustancias
con posibles aplicaciones a nivel agroindustrial, cosmtico, alimenticio, y
teraputico. El estudio de los compuestos naturales puede resultar en el hallazgo
de una sustancia considerada como una plantilla que presenta una actividad
moderada frente a alguna diana especifica (Balunas y Kinghorn, 2005). Una vez
determinada la estructura de la plantilla es posible obtener varias sustancias con
estructuras similares gracias a la qumica combinatoria.

Uno de los bioensayos preliminares que permite detectar un amplio espectro de
actividades biolgicas en extractos y fracciones es el ensayo de toxicidad frente a
Artemia salina. Esta tcnica de aislamiento biodirigido caracteriza por ser rpida,
econmica, simple y emplear bajas cantidades de material de prueba. El ensayo
frente a A. salina ha evidenciado una importante correlacin de sus resultados con
resultados de toxicidad en clulas cancergenas principalmente en lneas celulares
9 KB carcinoma nasofarngeo humano, P388 en leucemia murina In vivo y otros
tumores slidos. Gracias a esto el ensayo frente a A. salina se ha utilizado en el
aislamiento de agentes antitumorales y pesticidas producidos por las plantas,
obteniendo as un gran nmero de compuestos bioactivos, como la acetogenina,
ascimicina de Asiminia triloba que ha presentado actividad citotoxica, antitumoral,
antimalarica, antimicrobiana, immunosupresora, entre otras (Colegate y Molyneux,
2008).

88




Coriaria es un gnero de plantas arbustivas que se caracterizan por la presencia
de racimos de frutos esfricos, jugosos y de color morado (Tianlu y Brach, 1990).

Los frutos de estas especies se usan con fines tintreos y se tienen reportes de
efectos narcticos y alucingenos. Los pobladores de diferentes regiones de Chile,
Ecuador y Colombia los reconocen como venenosos para el hombre y para
animales domsticos (Kvist y Moraes, 2006).

La especie Coriaria myrtifolia ampliamente distribuida en el mediterraneo, es
reconocida como una de las especies ms txicas del gnero. La marcada
neurotoxicidad de esta especie se le atribuye a las altas concentraciones de
coriamyrtina presentes en las bayas. La ingestin algunos frutos (muy similares a
las moras), induce manifestaciones digestivas y neurolgicas que van desde
vmitos, convulsiones y apnea hasta el coma (Haro et al., 2005).

Los estudios qumicos realizados en especies del gnero Coriaria se han
orientado a la bsqueda de los metabolitos secundarios responsables de la
actividad biolgica. Las especies del gnero Coriaria se caracterizan por poseer
lactonas sesquiterpenicas, cumarinas, taninos, flavonoides y compuestos fenlicos
(Valencia et al., 2001).

Diplostephium es un gnero plantas generalmente rboles y arbustos que cuenta
con aproximadamente 110 especies (Ulloa y Jorgensen, 2004). Se distribuye
principalmente en zonas de alta montaa, en bosques alto andinos y ecosistemas
de pramo, desde Venezuela hasta Chile. Colombia posee la mayor riqueza de
especies con 63 de las 110 reportadas, la mayora de estas en la Cordillera
Oriental (Luteyn, 1999).

Pese a la amplia distribucin del gnero Diplostephium en Colombia no se han
realizado muchos estudios o reportes qumicos y de actividad biolgica. A partir de
89


las especies D. rneyenii, D. floribundurn y D. ericoides se han aislado
diterpenoides de tipo clerodano y terpenos derivados del geraniol.

En 2006 se realiz el estudio de la actividad antibacteriana de la especie vegetal
Diplostephium tolimense, colectada en el pramo del Nevado del Tolima. A partir
de un extracto etanlico crudo y mediante un estudio biodirigido, se obtuvieron
fracciones semipurificadas que actividad antibacteriana frente a Staphylococcus
aureus (ATCC 25923). Por medio de los anlisis fitoqumicos a las fracciones
activas se realiz una correlacin de la accin antibacteriana con la presencia de
terpenos (Figura 23) (vila et al., 2006)

El presente trabajo pretende realizar el tamizaje fitoqumico y de actividad
citotxica de dos especies nativas, Coriaria ruscifolia y Diplostephium
rosmarinifolius con el fin de identificar el tipo de metabolitos secundarios y
determinar el potencial farmacolgico mediante el ensayo de toxicidad frente a A.
salina.

Materiales y mtodos

Recoleccin del material vegetal
El material de las especies Coriaria ruscifolia (hojas, tallos y frutos) y
Diplostephium rosmarinifolius (hojas, tallos y flores) se colect en la vereda San
Francisco del Pramo de Cruz Verde en febrero de 2012.

Obtencin de extractos
El material vegetal recolectado se separo en los diferentes rganos colectados:
hojas, tallos, frutos y flores. Se limpio y sec a la sombra o en el horno a 40C. El
material seco y molido se someti a extraccin por maceracin con etanol del
96% a temperatura ambiente. El extracto etanlico resultante se concentr
eliminando el solvente por destilacin a presin reducida (rotavapor).


Anlisis fitoqumico preliminar
Para el anlisis fitoqumico preliminar se dise un protocolo modificado basado
en las metodologas y pruebas cualitativas propuestas previamente por varios
autores (Sanabria, 1983; Bilbabo, 1993; Lock, 1988; Merck, 2001). El protocolo se
llevo a cabo en dos etapas, en la primera se realizaron reacciones cualitativas en
tubo de ensayo y en la segunda parte pruebas de coloracin en cromatografa de
90


capa delgada CCD. Se utilizaron controles positivos y negativos para corroborar
los resultados obtenidos.

Cuantificacin de fenoles
La concentracin de fenoles totales en los extractos se determino por el mtodo
colorimtrico de Follin-Ciocalteau. Se realizo una curva de calibracin empleando
un patrn de cido glico (reactivo analtico). Para el anlisis de los extractos se
prepararon soluciones de 10 mg/ml de en metanol y se determino la absorbancia a
740 nm en una celdas de vidrio. Los resultados se expresan en mg de cido glico
por g de extracto.

Fraccionamiento de extractos
Los extractos etanlicos de hojas, tallos y flores de D. rosmarinifolius, hojas,
semillas y frutos de C. ruscifolia se fraccionaron empleando extraccin slido-
liqudo con solventes de polaridad creciente, ter de petrleo, acetato de etilo y
metanol.

Evaluacin de la toxicidad
Para evaluar la toxicidad de extractos y fracciones se us el ensayo de letalidad
en Artemia salina de acuerdo con el protocolo sugerido por McLaughlin y
colaboradores. Los huevos de A. salina se incubaron durante 24 horas a una
temperatura de 28 C en un medio de cultivo de sal marina a una concentracin de
38 g/L. Los ensayos se realizaron por triplicado empleando 10 nauplios por pozo
los cuales se expusieron a diferentes concentraciones de extractos o fracciones.
Al cabo de 24 horas se hicieron las lecturas, y se registr el nmero de
sobrevivientes en cada pozo.
Los datos obtenidos fueron procesados con el programa estadstico Epa probit
analysis program con el fin de determinar la concentracin letal 50 (CL
50
) y un
rango de confianza de 95 %.

Resultados y discusin

Obtencin de extractos etanlicos
El material vegetal colectado se lav y separ en los diferentes rganos. Hojas
frutos y semillas de C. ruscifolia, hojas, tallos y flores de D. rosmarinifolius (Figuras
1 y 2). El material vegetal se sec en el horno a 40C durante 48 horas y se troce
en la licuadora para disminuir el tamao de partcula.

91




El material seco y molido se pes y se someti a extraccin, empleando la tcnica
de maceracin en fro con etanol del 70%. Este procedimiento se realiz de forma
exhaustiva durante 60 das, con el fin de extraer la totalidad de los metabolitos
secundarios presentes en el material vegetal (Figuras 33 y 34). Para ello se repiti
el procedimiento de maceracin hasta observar una baja cantidad de residuo
slido.
Los extractos resultantes se concentraron a presin reducida en el rotavapor y se
secaron en la cabina de extraccin para calcular los respectivos rendimientos
usando la siguiente frmula:






En la siguiente tabla se reportan los resultados de extraccin:

Tabla 1. Rendimientos de obtencin de extractos etanlicos
Especie rgano Peso material
vegetal seco
(g)
Peso del
extracto (g)
Rendimiento
(%)
D.
rosmarinifolius
Hojas 128,0 24,8 19,4
D.
rosmarinifolius
Flores 10,1 0,6 6,0
C. ruscifolia Hojas 28,6 6,32 22,1
C. ruscifolia Frutos 60,6 11,0 18,2
C. ruscifolia Semillas 9,8 0,80 7,2

92


Los extractos de semillas y frutos de C. ruscifolia poseen color rojizo debido a la
presencia de pigmentos antocianicos. El extracto de hojas es de color verde y de
apariencia pastosa, este se obtuvo con un rendimiento superior al 20% fue el
rgano de mayor extraccin para esta especie.

El extracto de hojas de D. rosmaronifolius es de color verde oscuro y apariencia
pastosa. Las hojas presentan una mayor cantidad de metabolitos solubles en
etanol (19,4%) comparado con las flores, a partir de las cuales se obtuvo poco
extracto de color caf-naranja.


Anlisis fitoqumico preliminar
El estudio fitoqumico preliminar comenz con la obtencin del extracto etanlico,
posteriormente se realizaron separaciones sucesivas empleando solventes de
diferentes polaridades con el fin de agrupar los metabolitos estructuralmente
semejantes en fracciones.Se realizaron reacciones qumicas en tubo de ensayo
para los diferentes tipos de metabolitos, para corroborar los resultados se
emplearon controles positivos y negativos. Como control positivo se uso un
extracto rico en metabolitos del tipo a analizar o un compuesto puro o patrn.
Como control negativo se uso etanol o el solvente de extraccin.

Las pruebas de flavonoides, quinonas, taninos, fenoles, saponinas, cardiotonicos y
cumarinas se realizaron empleando los extractos etanlicos de las especies objeto
de estudio. Las pruebas para el anlisis de terpenos, esteroides, esteroles y
carotenos se realizaron a partir del extracto etreo de los diferentes rganos de las
dos especies. Las pruebas de alcaloides se realizaron a partir del extracto cido
obtenido por extraccin slido-lquido del extracto crudo.

Los resultados del anlisis cualitativo preliminar se resumen en la tabla 2.

Tabla 2. Resultados del anlisis fitoqumico preliminar de los extractos etanlicos
de C. ruscifolia y D. rosmarinifloium.
METABOLITO PRUEBA CH CF CS DH DT DF
Flavonoides
Shinoda
Leucoantocianidinas
+
+
+++
+++
+++
+++
+
+
+
+
++
++
Quinonas
Zn/HCl
Zn/NaOH
-
-
-
-
-
-
++
++
++
++
++
++
93


Taninos
FeCl
3

Gelatina-sal
+++
-
+++
-
+++
-
+++
-
+++
-
+++
-
Saponinas
Espuma
Rosenthaler
+
++
+++
++
++
++
++
++
-
-
-
-
Cardiotnicos
Baljet
Antrona
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Cumarinas
Hidroxamato
Fluorescencia
+
+
++
-
++
-
-
-
-
-
-
-
Esteroides
Liebermman
VAO
Dienos
+++
++
++
-
+
+
-
+
+
+++
++
++
+++
++
++
+++
++
++
Alcaloides Dragendorff - - - - - -
Convenciones: - negativo, + escaso, ++ observable, +++ abundante
CH, CF, CS: Coriaria ruscifolia frutos y semillas
DH, DT, DF: Diplostephium rosmarinifolius hojas, tallos y flores

Por medio del anlisis fitoqumico preliminar fue posible determinar la presencia de
metabolitos secundarios como fenoles, esteroides, terpenos y saponinas en los
extractos de hojas, frutos y semillas de C. ruscifolia. Los metabolitos de mayor
importancia qumica en las especies del gnero Coriaria son las lactonas-
sesquiterpenicas reconocidas por ser los componentes responsables de la
toxicidad en varias especies (Valencia et al., 2001). Por medio del anlisis
cualitativo no fue posible determinar la presencia de este tipo de compuestos
puesto que no se tiene una prueba especifica que permitiera identificarlos, sin
embargo se obtuvieron resultados positivos en la prueba de hidroxamto frrico
que permite analizar grupos lactona o ester, caracterstico del ncleo
sesquiterpenlactona, por lo que es posible inferir la presencia de compuestos
txicos principalmente en los frutos de la especie de estudio.

Los extractos de hojas, tallos y flores de D. rosmarinifolius presentaron pruebas
positivas para flavonoides, fenoles, terpenos, esteroides y quinonas, este es el
primer reporte de un estudi qumico de esta especie y est de acuerdo con los
reportes de metabolitos secundarios en otras especies de este gnero en
Colombia (vila et al., 2006).

Cuantificacin de fenoles
94


Se pes 1 mg de extracto etanlico de las especies de estudio: C. ruscifolia (hojas,
semillas y frutos) y D. rosmarinifolius (hojas, tallos y flores), se disolvi con 1 ml de
metanol y la solucin resultante se llevo a 10 ml con agua destilada.

Para la curva de calibracin se emplearon soluciones de cido glico a 200, 150,
100, 50, 25, 10, 5, 1 ppm. El anlisis de fenoles se llevo a cabo desarrollando
coloraciones con soluciones de Follin 1:10 y carbonato de sodio al 7,5%. Las
muestras se dejaron en reposo durante 30 min en la oscuridad. La aborsorbancia
fue determinada en el espectrofotmetro Helios a 740 nm

Por medio de la curva de calibracin obtenida para el patrn de cido glico se
determin la ecuacin para la cuantificacin de fenoles en las muestras problemas
(Figura 3).


Figura 3. Curva de calibracin de cido glico

La concentracin total de fenoles se calcul empleando la siguiente formula y se
expreso en mg de cido glico por gramo de extracto.

95


Tabla 3. Concentracin de fenoles totales en extractos etanlicos de la especies
de estudio
Extracto A
740 nm
Concentracin de fenoles
totales mg AG/g extracto
CH 0,296 312,5
CF 0,496 562,5
CS 0,338 365,0
DH 0,208 202,5
DT 0,196 187,5
DF 0,259 266,2

Los extractos de C. ruscifolia muestran una alta concentracin de metabolitos de
tipo fenol, siendo mayoritarios en el extracto de frutos (562,5 mgAG/g), que se
caracteriza por la presencia de antocianinas, metabolitos responsables de las
coloraciones rojas de estos. Los compuestos fenlicos de los extractos de esta
especie pueden ser de tipo flavonoide de acuerdo a los resultados del anlisis
cualitativo preliminar.

Los extractos de D. rosmarinifoilus presentaron concentraciones muy similares de
fenoles. El extracto de flores posee una concentracin mayor (266 mg AG/g
extracto) respecto a los dems rganos. Segn el anlisis fitoqumico preliminar es
posible esperar que los compuestos fenlicos sean de tipo flavonoide o quinona.

Fraccionamiento de extractos
Con el fin de agrupar los metabolitos secundarios por polaridades semejantes y
as tener grupos de compuestos ms purificados, se realiz un fraccionamiento
con solventes de polaridad creciente: Eter de petrleo, acetato de etilo y metanol a
los extractos de C. ruscifolia (hojas, semillas y frutos) y D. rosmarinifolius (hojas,
tallos y flores).

Los extractos se homogenizaron con el solvente a extraer y se sometieron a
calentamiento leve (30C) y agitacin constante, en la plancha de calentamiento,
durante 20 minutos. Posteriormente la mezcla se filtr y concentr a presin
reducida. Este procedimiento se realiz de forma exhaustiva, hasta no observar
coloracin en el solvente empleado

Las fracciones obtenidas se secaron y pesaron para determinar el rendimiento de
extraccin de acuerdo con la siguiente frmula:
96








El porcentaje de rendimiento indica la cantidad de compuestos solubles en cada
solvente de acuerdo a su polaridad.

Tabla 4. Resultados del fraccionamiento de los extractos etanlicos de C.
ruscifolia
Parte Solvente Sigla Masa de
fraccin (g)
%
rendimiento
Hojas EDP CHE 0,98 16,3
AcOEt CHA 1,53 25,5
Metanol CHM 3,33 55,5
Frutos EDP CFE 0,22 2,0
AcOEt CFA 1,36 11,4
Metanol CFM 9,36 85,1
Semillas EDP CSE 0,05 6,25
AcOEt CSA 0,25 31,2
Metanol CSM 0,51 63,4

Los resultados del fraccionamiento de los extractos crudos de C. ruscifolia
muestran que los compuestos presentes en los diferentes rganos de esta especie
poseen carcter altamente polar, por lo tanto fueron separados en la fraccin
metanlica. Los frutos presentan el mayor porcentaje de compuestos polares con
85%, esto puede deberse principalmente a la presencia de los pigmentos
antocianicos que generalmente se encuentran en forma de glicosidos. Los
compuestos de carcter lipoflico, fueron extrados en ter de petrleo y
representan la menor proporcin de los metabolitos totales con porcentajes de 16,
2 y 6% en los diferentes rganos.

Tabla 5. Resultados del fraccionamiento de los extractos etanlicos de D.
rosmarinifolius
Parte Solvente Sigla Masa de
fraccin (g)
%
rendimiento
Hojas EDP DHE 3,84 16,0
AcOEt DHA 17,60 73,3
97


Metanol DHM 2,98 12,4
Tallos EDP DTE 3,64 36,4
AcOEt DTA 2,29 22,9
Metanol DTM 5,88 58,8
Flores EDP DFE 0,08 13,3
AcOEt DFA 0,25 41,2
Metanol DFM 0,28 46,7

Los resultados del fraccionamiento de los extractos de la especie D.
rosmarinifolius, muestran que los compuestos presentes en las hojas, tallos y
flores poseen diferentes polaridades y por tanto fue posible separarlos con los
diferentes tipos de solventes.

En el extracto de hojas se observa que la mayor parte de los metabolitos (73%)
poseen polaridades medias y fueron separados en la fraccin de acetato de etilo.
En el extracto de tallos la mayor parte de los compuestos fueron solubles en
metanol (59%), mientras que en el extracto de flores cerca de un 88% de los
compuestos presentes poseen polaridades medias y altas. De acuerdo con los
resultados del anlisis fitoqumico preliminar podra esperarse que los compuestos
polares fueran de tipo, fenol, quinona o flavonoide. Los compuestos con carcter
lipoflico como esteroides, terpenos y carotenos fueron minoritarios en todos los
rganos y se separaron en las fracciones eteras.

Ensayo de toxicidad frente a Artemia salina
Con el fin de realizar un estudio preliminar del potencial farmacolgico de los
extractos de las especies de estudio, se evalu la actividad citotxica empleando
como organismo indicador el microcrustceo Artemia salina, altamente sensible a
una gran variedad de sustancias qumicas.

10 mg de los extractos etanlicos de C. ruscifolia (hojas, semillas y frutos) y D.
rosmarinifoilus (hojas y flores), se solubilizaron en 1 mL de DMSO
(dimetilsulfxido), a partir de esta solucin stock se prepararon soluciones a
concentraciones de 1000, 500, 250, 100 y 10 g/ml (Figura 4).

98



Figura 4. Soluciones Stock y diluciones de extractos de Frutos de C. ruscifolia

Al cabo de 24 horas se hicieron las lecturas, y se registr el nmero de
sobrevivientes en cada pozo.

En la siguiente tabla se presentan los resultados de las concentraciones letales
para la mitad de la poblacin de los microcrustaceos CL
50
, calculadas con el
programa estadstico Probit para los extractos etanlicos analizados:

Tabla 6. CL
50
calculadas por el mtodo Probit
Extracto Parte sigla CL
50

ppm
Coriaria ruscifolia Hojas CH 588.12
Coriaria ruscifolia Frutos CF 14.44
Coriaria ruscifolia Semillas CS 53.56
Diplostephium rosmarinofolius Hojas DH 407.15
Diplostephium rosmarinofolius Flores DF 1090.57

La concentracin letal cincuenta CL
50
es la cantidad (mg/L de agua) de extracto
necesaria para provocar la muerte a la mitad de la poblacin de microcrustceos
de Artemia salina. En la Figura 5 se observa que estas cantidades de extracto son
variables y diferentes para cada rgano de una especie.

99



Figura 5. CL
50
de los extractos etanlicos de las especies de estudio

En el ensayo de toxicidad en Artemia, valores inferiores a 100 g/ml, en extractos,
son considerados txicos, aunque los extracto de mayor toxicidad presentan
valores desde 1-10 g/ml (Pisutthanan et al., 2004). De acuerdo con estos
parmetros por medio del ensayo de Artemia salina se determin que los extractos
de frutos y semillas de C. ruscifolia son citotxicos frente al microcrustaceo.

El extracto de frutos (pulpas) de C. ruscifolia result ser ms txico que el extracto
de semillas, lo que indica una mayor concentracin de los principios activos en las
pulpa del fruto. Los resultados de citoxicidad sugieren la posible presencia de
sesquiterpenlactonas como la coriarina y la coriamyrtina en los frutos C. ruscifolia,
puesto que estos han sido identificados como los compuestos responsables de la
neurotoxicidad de las bayas de la especie Coriaria myrtifolia (Haro et al., 2005). El
extracto de hojas resulto ser inactivo en el ensayo de toxicidad, lo que est de
acuerdo con las pruebas cualitativas en donde no se evidencio la presencia de
lactonas con la prueba de hidroxamato.

Los extractos de D. rosmarinifolius resultaron ser poco txicos frente a los
microcrustacios de A. salina, el extracto de flores posee una CL
50
mayor a 1000
ppm. Los resultados de toxicidad para la especie son consecuentes con la
presencia de compuestos de tipo flavonoide, fenol, esteroide y terpeno
determinados mediante el anlisis fitoqumico preliminar puesto que este tipo de
compuestos generalmente presentan toxicidades bajas.
100



Los resultados de toxicidad sugieren que es posible realizar un estudio de
aislamiento biodirigido de los principios activos a partir de los extractos de frutos y
semillas de la especie C. ruscifolia y evaluar otras actividades biolgicas
(antimicrobiana, antifngica, insecticida o antioxidante) a los extractos de D.
rosmarinifolius para determinar un potencial farmacolgico.

Bibliografa

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102


9. REPORTE DE METAS PLAN DE ACCIN

Los resultados de los estudios fitoqumicos y de actividad biolgica de 16 especies
objeto de estudio fueron reportados para la compilacin CARACTERIZACIN DE
20 ESPECIES EN LOS COMPONENTES DE ETNOECOLOGA,
ECOFISIOLOGA, BROMATOLOGA Y FITOQUMICA, realizada por el
contratista Hctor Lancheros. Estos resultados se resumen en la siguiente tabla:

Especie Resultados de la lnea de Fitoqumica
Bomarea sp

De las hojas y races se obtuvieron extractos
etanlicos con rendimientos de 13.98% y 13.91%
respectivamente. Por medio de los anlisis
fitoqumicos preliminares de estos extractos se
determin la presencia de, Alcaloides, flavonoides,
esteroides, triterpenos y fenoles en el extracto de hojas
Esteroides y triterpenos en el extracto de races.
Se obtuvieron fracciones de polaridad creciente a partir
del extracto de hojas y se evalu la actividad
antibacteriana. El extracto etanlico y las fracciones de
cloroformo, acetato etilo y metanol, presentaron
actividad inhibitoria frente a Staphylococus aureus y
Escherichia coli.
Hedyosmum parvifolium

El material vegetal fue recolectado en el Pramo de
Cruz Verde (va Choach) en Cundinamarca. Las hojas
y frutos fueron sometidos a extraccin por
hidrodestilacin para obtener los aceites esenciales. La
caracterizacin qumica se llevo a cabo por
cromatografa de gases acoplada a espectrometra de
masas (CG-EM) con una columna DB-5. La
identificacin de los compuestos se realiz por medio
de la comparacin con los ndices de retencin
reportados y los espectros de masas de las bases de
datos Wiley 138.L y 75K.L NBS. El aceite de hojas est
compuesto mayoritariamente por sesquiterpenos
(39%) y sesquiterpenos oxigenados (30%), mientras el
aceite de frutos posee principalmente sesquiterpenos
oxigenados (51%).
A los aceites obtenidos se les realiz la evaluacin de
la actividad antifngica in vitro frente a los hongos
fitopatgenos Fusarium oxysporum f. sp. dianthi y
103


Botrytis cinerea. Tanto el aceite esencial de hojas com
de frutos de la especie Hedyosmum parvifolium
presentaron porcentajes de inhibicin cercanos al 50%
a 350 l de aceite por litro de aire.
Cavendishia bracteata

Se obtuvieron los extracto etanlicos de hojas, flores y
frutos y se realiz el anlisis fitoqumico preliminar de
acuerdo con la metodologa propuesta por Antonio
Sanabria y Olga Lock. Por medio de este anlisis se
determin qu: El extracto etanlico de las hojas posee
compuestos de tipo flavonoide, fenol, esteroide o
terpeno y lactona. El extracto de flores evidencio la
presencia de flavonoides, fenoles, cumarinas,
esteroides y terpenos. El extracto etanlico de frutos
mostr la presencia de flavonoides, fenoles y estroles
o triterpenos.
Se determin la concentracin de fenoles totales en los
extractos etanlicos de hojas, flores y frutos por el
mtodo colorimtrico de Folin-Ciocalteau (Vsquez et
al, 2007). El extracto de hojas posee la mayor
concentracin de fenoles, con una concentracin de
750 mg de cido glico/g. La alta concentracin de
fenoles sugiere la posibilidad de una importante
actividad antioxidante.
Disterigma alaternoides

El material vegetal se recolect en el pramo de Cruz
verde, vereda San Francisco. Los extractos etanlicos
fueron obtenidos por maceracin a partir de las hojas,
tallos, flores y frutos. Los rendimientos de extraccin
para hojas, flores y frutos fueron cercanos al 23%,
mientras para el extracto etanlico de tallos el
rendimiento fue de 16,9.
Por medio del anlisis fitoqumico preliminar realizado
empleando la metodologa de Antonio Sanabria y
Mara Bilbao se determin la presencia de flavonoides,
quinonas, taninos, saponinas, fenoles y esteroles o
triterpenos en los extractos de tallos, frutos, flores y
hojas.
Debido a las intensas coloraciones formadas en las
pruebas de fenoles y flavonoides se realiz la
cuantificacin de fenoles por el mtodo colorimtrico
de Folin-Ciocalteau (Vsquez et al, 2007). El extracto
de los frutos posee la menor cantidad (357 mg/g) de
fenoles y el extracto de flores la mayor cantidad (482
mg/g).
104


Gaultheria anastomosans

A partir de las hojas y flores se obtuvieron los extractos
etanlicos con rendimientos de 17,7% y 12,3%. Por
medio del anlisis fitoqumico preliminar se determin
la presencia de flavonoides, fenoles y terpenos o
esteroles.
Debido a las intensas coloraciones formadas en las
pruebas de cloruro frrico, Shinoda y
leucoantocinidinas, se decidi realizar la cuantificacin
de fenoles por el mtodo colorimtrico de Folin-
Ciocalteau. Se determin la concentracin de fenoles
totales en los extractos hojas y flores. El extracto de
hojas present una concentracin de 499,00 mg c
glico/g extracto y el de las flores 433,50 mg cido
glico/g.
Pernettya prostrata

Por medio del anlisis fitoqumico preliminar se detect
la presencia de fenoles, flavonoides, taninos, terpenos,
esteroides, cumarinas y steres en los extractos de
frutos y parte vegetativa area.
A partir del extracto de la parte area se hizo un
fraccionamiento slido-lquido directo empleando como
solventes: hexano, cloroformo, acetato de etilo, butanol
y metanol. El extracto de frutos se fraccion por
cromatografa lquida al vaco, con el fin de hacer un
estudio biodirigido de actividad antioxidante y txica
frente a Artemia salina.
Los extractos etanlicos, de frutos y parte vegetativa
rea, poseen CL50 (concentracin letal 50) de 634,1
g/ml y 540,43 g/ml, lo que significa que son
necesarios 634 mg de extracto etanlico de frutos
disueltos en un litro de agua para provocar la muerte a
la mitad de la poblacin de microcrustceos de Artemia
salina.
En los ensayos de toxicidad en Artemia salina, valores
inferiores a 100 g/ml son considerados txicos,
aunque los extractos de mayor toxicidad presentan
valores de 1-10 g/ml. De acuerdo con esto, los
valores encontrados en los extractos de P. prostrata no
indican toxicidad.
El extracto total y las fracciones de acetato de etilo,
butanol y metanol mostraron alta capacidad de
captacin de radicales libres DPPH. Los extractos y
fracciones presentaron alta cantidad de compuestos
antioxidantes; se observaron principalmente
105


compuestos fenlicos antioxidantes en los extractos de
acetato de etilo y metanol.
Orthrosanthus chimboracensis


A partir de la hojas se obtuvo un extracto etanlico con
un porcentaje de rendimiento de 14,3%. En el anlisis
fitoqumico preliminar se realizaron extracciones con
solventes de diferente polaridad, para el anlisis de
grupos de metabolitos. Se determin la presencia de
metabolitos secundarios como fenoles,taninos,
esteroides y triterpenos.
Miconia squamulosa

Los extractos obtenidos presentaron una apariencia
verde pastosa y un olor desagradable, muy similar al
de la valeriana. Las flores y hojas presentaron
rendimientos de extraccin cercanos al 10%, mientras
los tallos presentaron un rendimiento del 5,6%.
Para el anlisis fitoqumico preliminar dise un
protocolo modificado basndose en diferentes
metodologas y pruebas cualitativas propuestas
previamente por varios autores. Los extractos de
hojas, tallos y flores presentaron pruebas positivas
para fenoles, flavonoides, taninos, esteroides y
quinonas, estos resultados estn de acuerdo con la
quimiotaxonomia del gnero Miconia, en el cual se han
aislado e identificado metabolitos secundarios como
triterpenos y flavanonas.
A partir del extracto de hojas se realiz un
fraccionamiento slido-lquido directo obteniendo tres
extractos de polaridad creciente (hexano, acetato de
etilo y metanol), enriquecidos en metabolitos
especficos. A los extractos y fracciones se les evalu
la actividad antioxidante y txica. Los extractos de
hojas y frutos resultaron poco txicos frente al
microscrustaceo Artemia salina
Ardisia sp.
De la parte area se obtuvo el extracto etanlico con
un rendimiento de 19.67%. Se realiz el anlisis
fitoqumico preliminar en el extracto crudo de la parte
area empleando la metodologa propuesta por
Antonio Sanabria. El extracto de la parte area
present compuestos de tipo flavonoide, saponina,
esteroide, triterpeno, fenol y quinona.
El extracto crudo se someti a un fraccionamiento
106



slido-lquido con solventes (ter de petrleo,
cloroformo, acetato de etilo y metanol), obteniendo
cuatro extractos de polaridad creciente, enriquecidos
en compuestos de caractersticas estructurales
similares.
A los extractos etanlicos y de polaridad creciente se
les evalu la actividad antibacteriana por la tcnica de
difusin en sensidiscos frente a la bacteria Gram
positiva S. aureus y las bacterias Gram-negativas E.
coli y P. aeruginosa. Los extractos de etanol,
cloroformo y acetato de etilo, mostraron actividad
inhibitoria frente a S. aureus con porcentajes de 85,
130 y 169%, y frente a E. coli con porcentajes de 87,
50 y 117%.
Teniendo en cuenta la promisoria actividad del extracto
de acetato de etilo, se realiz un fraccionamiento por
cromatografa en columna, obteniendo 25 fracciones
que fueron reunidas en ocho fracciones a las que se
les evalu la actividad antibacteriana. Las fracciones
AAE-6, AAE-9, AA-12y AAE-17 presentaron
moderada actividad frente a S aureus. A partir las
fracciones activas y por cromatografas sucesivas se
aislaron cuatro compuestos A-A, A-B, A-C y A-D.
Hesperomeles obtusifolia

Partiendo de 189,8 g de material vegetal seco, se
realiz la extraccin por maceracin en fro,
obtenindose 41,33 g de extracto etanlico.
Posteriormente mediante en la marcha fotoqumica
preliminar se identific la presencia de carotenoides,
esteroides, triterpenos, flavonoides, cardiotnicos y
cumarinas.
Por extraccin slido-lquido, se obtuvieron extractos
de ter de petrleo, cloroformo, acetato de etilo y
metanol, a los cuales se les realizaron ensayos de
actividad antibacteriana por difusin en agar con
sensidiscos, frente a los microorganismos patgenos
P. aeruginosa, E. coli y S. aureus, resultando como
extractos ms activos el de ter y cloroformo, con un
porcentaje de inhibicin altamente significativo frente a
S. aureus, de 165% y 127% respectivamente. De estos
extractos, se obtuvieron fracciones purificadas
mediante cromatografa en columna a los que se
contino evaluando su inhibicin frente a S. aureus.
Empleando la tcnica de difusin en pozo, se
107


determin la concentracin mnima inhibitoria (CMI)
para los extractos y sus fracciones finales,
encontrndose para las fracciones clorofrmicas HC1 y
HC2 0,62 mg/ml, HC1-7 1,25 mg/ml y HC2-4 de 0,62
mg/ml y para las fracciones etreas E3 10mg/ml, HE4-
3 y HE4-4 15 mg/ml.
Rubus acanthophyllos

El extracto de esta especie se obtuvo a partir de
plantas sembradas en el Jardn Botnico; a partir del
extracto etanlico crudo (12,5%) se realiz el anlisis
fitoqumico preliminar. El extracto de hojas evidencio la
presencia de terpenos, esteroles y compuestos
fenlicos.
Rubus megalococcus

A partir de la parte area se obtuvo un extracto
etanlico con un rendimiento del 14,8%. A partir del
estudio fitoqumico preliminar del extracto crudo se
determin la presencia de esteroides, triterpenos,
taninos, carotenoides, flavonoides y quinonas. El
extracto crudo se fraccion con solventes de polaridad
creciente ter de petrleo, cloroformo, acetato de etilo
y metanol con rendimientos iguales a 13,6%, 9,7%,
2,6% y 61,7% respectivamente.
El extracto crudo y los sub-extractos obtenidos fueron
sometidos al ensayo de actividad antibacteriana frente
a E. coli, P. aeruginosa y S. aureus. Los extractos de
metanol y etanol fueron los que presentaron mayor
inhibicin frente a las bacterias evaluadas, los dems
subextractos solo presentaron inhibicin contra E. coli.
El extracto metanlico se fraccion por cromatografa
en columna, de lo cual se obtuvieron 8 fracciones que
fueron sometidas al ensayo de actividad antibacteriana
y en todas se encontr actividad frente a las cepas
evaluadas; luego se determin la concentracin
mnima inhibitoria (CMI) de los extractos y fracciones
que presentaron mayor porcentaje de inhibicin.
Para E. coli el extracto etanlico fue activo en todo el
intervalo de concentraciones ensayadas (1,0 mg/ml
30 mg/ml); para los dems extractos la CMI fue de 5
mg/mL para esta bacteria. En relacin con la bacteria
P. aeruginosa, todos los extractos presentaron CMI de
5 mg/ml, a excepcin de la fraccin R6 que solo
presento inhibicin con una concentracin de 30
mg/ml, esta fraccin corresponde a una de las
108


fracciones del extracto metanlico. Finalmente para la
bacteria S. aureus el comportamiento de los diferentes
extractos es similar en relacin con la CMI y de nuevo
la fraccin R6 solo presento inhibicin con 30 mg/mL
Cestrum buxifolium

Para la obtencin del extracto etanlico de la parte
area se tomaron 43,3 g de hojas y tallos secos y
molidos. El extracto de parte area present un
rendimiento de 15%. A partir de los resultados del
anlisis fitoqumico preliminar se encontr que: el
extracto etanlico de la parte area posee metabolitos
secundarios de tipo tanino, saponina y esteroide o
terpeno, lo cual coincide con lo reportado en la
literatura para especies de este gnero.
Pilea sp.

A partir de hojas y tallos se realiz una extraccin
exhaustiva con etanol del 96% obteniendo un extracto
crudo con un rendimiento de 21,6%. Por medio del
anlisis fitoqumico, empleando reacciones cualitativas
en tubo de ensayo se determin la presencia de
metabolitos secundarios de tipo fenol, esteroide y
triterpeno. Se realiz la cuantificacin de fenoles
totales por el mtodo colorimtrico de Folin-Ciocalteau.
Para determinar las potencialidades de uso de esta
especie se evalu la antifngica frente a Botrytis
cinerea y Fusarium oxysporum, la actividad
antioxidante por bioautografia en CCD y captacin de
radicales DPPH y la actividad txica empleando
Artemia salina como organismo indicador.
Esta especie result ser inactiva frente a los hongos
fitopatgenos. Por otro lado exhibi baja toxicidad con
una CL50 de 780 ppm y baja capacidad de captacin
de radicales libres.






109


10. REFORMULACIN DEL PROYECTO 318
MANEJO Y APROVECHAMIENTO SOSTENIBLE DE RECURSOS VEGETALES
EN EL DISTRITO CAPITAL Y LA REGIN.
Planteamiento del problema
Colombia ha sido catalogada como un pas megadiverso en especies vegetales y
animales, es el segundo pas del mundo en diversidad de genes, especies y
ecosistemas.
1
Sin embargo, la acelerada disminucin de la biodiversidad y el
desconocimiento de las potencialidades de los recursos vegetales nativos, ha
propiciado la prdida de recursos genticos y del conocimiento tradicional. Es por
ello que actualmente se han implementado programas de uso sostenible como
estrategia de conservacin, que contrarreste el impacto antrpico sobre los
ecosistemas y los recursos vegetales.
La agenda internacional de conservacin de jardines botnicos (2001), ha definido
que stos tienen responsabilidad en el desarrollo de investigaciones en especies
vegetales tiles con importancia econmica con valor actual o potencial como
fundamento para implementar programas de uso sostenible.
El proyecto MANEJO Y APROVECHAMIENTO SOSTENIBLE DE RECURSOS
VEGETALES EN EL DISTRITO CAPITAL Y LA REGIN consiente de la misin
del Jardn Botnico de Bogot, pretende avanzar en la investigacin de especies
vegetales alto andinas y de pramo, mediante la generacin de modelos de
aprovechamiento sostenibles, para mitigar la prdida de diversidad biolgica,
cultural y favorecer las oportunidades de desarrollo social y econmico.
PREGUNTA DE INVESTIGACIN

1
Instituto de investigacin de recursos biolgicos Alexander Von Humboldt. Biocifras
110


Cules son las estrategias de conservacin basadas en el aprovechamiento y
manejo sostenible que pueden ser implementadas en proyectos productivos para
la poblacin del Distrito Capital?

DESCRIPCIN (Lneas accin)
El proyecto Manejo y Aprovechamiento sostenible de Recursos Vegetales en el
Distrito Capital y la Regin tiene 4 lneas de accin:

1. Modelos in situ de aprovechamiento sostenible de especies nativas
Etnobotnica
Multiplicacin vegetal: Estudios
Ecofisiologia:
Valoracin agronmica: Rendimientos por unidad de rea
Manejo integrado de cultivos
Sistemas productivos sostenibles: agroforestal, silvopastoril


2. Modelos ex situ de manejo y uso sostenible de especies
Terrazas verdes
Domesticacin de especies: Nuevas especies implementadas,
rendimentos por unidad de rea
Permacultura: Cultivos organponicos y aeropnicos

3. Evaluacin del potencial de uso de especies vegetales
Bioprospeccin (fitoqumica, bromatologa)
Manejo post-cosecha
Cultivo de tejidos vegetales

111


4. Investigacin aplicada en proyectos productivos sostenibles
Valoracin agronmica
Procesos de transformacin (BPM)
Educacin ambiental
Biocomercio

JUSTIFICACIN
Colombia ha sido catalogada como uno de los pases ms diversos de flora
silvestre. De las 260.000 especies de plantas registradas a nivel mundial, 50.000
se encuentran en nuestro territorio, aproximadamente la tercera parte son
endmicas (Caldern et al., 2007). Nuestro pas cuenta con la mayor extensin de
paramos en el mundo. Se calcula que la regin paramuna colombiana alberga
alrededor de 118 familias, 566 gneros y 3379 especies, equivalente a cerca del
12% de la flora calculada para todo el pas. Las familias ms abundantes en esta
regin son: Asteraceae, Orchidaceae, Poaceae, Melastomataceae, Bromeliaceae
y Ericaceae (Rangel, 2001). Sin embargo, la biodiversidad colombiana presenta
una enorme vulnerabilidad, existe un alto riesgo de sufrir extinciones masivas,
producidas principalmente por la destruccin de hbitats por deforestacin y
contaminacin. Recientes estudios sealan que cerca de 1800 especies de
plantas de nuestra flora nativa se encuentran en va de extincin (Caldern et al.,
2007). Es por ello que actualmente se estn desarrollando programas de
conservacin, recuperacin y uso sostenible, que contrarresten los efectos nocivos
de las actividades humanas sobre los ecosistemas y sus recursos biolgicos.
Se ha evidenciado que la inestabilidad en el mercado laboral y su vulnerabilidad a
la crisis de carcter econmico lleva a un impacto directo sobre la pobreza (Urban
Harvest, 2006). Al respecto, el aprovechamiento sostenible de especies vegetales
nativas, representa una fuente de potencialidad capaz de generar una contribucin
positiva para la seguridad alimentaria, a partir de la variabilidad de productos, as
112


como el autoabastacemiento de estos, incentivando el intercambio de saberes y
experiencias que fortalezcan el tejido social.
Muchas plantas y animales silvestres pueden ser la base para la elaboracin de
medicinas, fibras y alimentos. Desde esta perspectiva, la biodiversidad es el
capital biolgico del mundo y representa opciones estratgicas para su uso
sostenible.

OBJETIVO GENERAL
Establecer estrategias de conservacin a travs de modelos de manejo y
aprovechamiento sostenible de las especies vegetales nativas para
beneficio de las comunidades en el D.C y la Regin.

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117


ANEXO 1

Reacciones cualitativas para el anlisis fitoqumico preliminar
METABOLITO
SECUNDARIO
PRUEBA QUIMICA
CONTROL
POSITIVO
PROCEDIMIENTO
CAROTENOIDES Salkowiski -caroteno
A 1 mL de cido
sulfrico al 85%
aadir lentamente
por las paredes de
un tubo 1mL de
extracto etreo.
Observar la
coloracin azul en la
interfase.
ESTEROIDES
Liebermann-
Burchard
Lupeol
Agregar 4 gotas del
reactivo de
Liebermann-
Burchard al extracto
etreo. Observar los
cambios de
coloracin.
Vainillina-cido
orto-fosfrico
Lupeol
A 0,5 mL del
extracto etreo
adicionar 4 gotas
del reactivo VAO
por las paredes del
tubo. Observar la
coloracin azul-
violeta en la
interfase.
Dienos
homoanulares
Lupeol
A 0,5 mL de
extracto etreo
agregar 1 mL de de
solucin metanlica
de cido
tricloroactico al
118


40% y calentar a
90C. Observar el
cambio de
coloracin de azul a
purpura.
FLAVONOIDES
Shinoda Quercitina
A 0,5 mL de
extracto etanlico
agregar un trozo de
magnesio metlico y
5 gotas de HCl al
10%. Observar la
aparicin de una
coloracin rojiza.
Leucoantocianidinas Quercitina
Agregar 1 mL de
HCl al 10% al
extracto etanlico y
calentar durante 10
minutos. Observar
la coloracin roja.
QUINONAS
Borntrger-Kraus Antrona
A 5 mL del extracto
etanlico se le
agregan 3 mL de
cido sulfrico 20%
y 2 mL de perxido
de hidrogeno 20%,
calentar por 15 min
en bao de mara
hirviendo. Enfriar y
extraer con 10 mL
de benceno. Tomar
2 mL de la capa
bencnica y
adicionarle 2 mL de
la solucin de
NaOH-NH
4
OH.
Comportamiento
cido-base
Antrona
A 0,2 mL del
extracto agregar
Zinc en polvo y 2
119


gotas de HCl
concentrado.
Observar el
desarrollo de una
coloracin amarilla.
Repetir el
procedimiento con
NaOH al 40%.
Rodamina Antrona
Mezclar una gota de
extracto y una gota
de solucin de
rodamina saturada y
por otro lado una
gota con amoniaco.
Observar el
desarrollo de
colores verdes,
azules o violetas.
Hidrosulfito de
sodio
Antrona
A 0,2 mL del
extracto agregarle
una gota de NaOH
5N y 0,1 g de
NaHSO
3
. Calentar y
observar la
coloracin roja.
TANINOS
Cloruro frrico cido tnico
Agregar 2 gotas de
solucin de cloruro
frrico en etanol al
1% a 0,5 mL de
extracto y observar
la coloracin azul o
verde.
Gelatina-sal cido tnico
A 1 mL de extracto
etanlico agregar 1
mL de reactivo de
gelatina-sal y
observar el
precipitado.
120


SAPONINAS
Espuma Quinua
Tomar 1 mL de
extracto etanlico y
agregarle 5 mL de
agua. Agitar
vigorosamente
durante 5 minutos.
Observar la
formacin de una
espuma estable
hasta de 2 cm en
forma de panal.
Rosenthaler Quinua
Adicionar a 0,5 mL
del extracto
etanlico 4 gotas del
reactivo VAO por las
paredes del tubo.
Observar la
coloracin azul-
violeta.
CARDIOTONICOS
Baljet
Digitalis
purpurea
Agregar 0,5 mL de
reactivo de Baljet a
0,5 mL de extracto
etanlico. Observar
la formacin de una
coloracin naranja
rojiza.
Antrona
Digitalis
purpurea
Adicionar por las
paredes de un tubo
de ensayo 5 gotas
del reactivo de
antrona a 0,5 mL de
extracto etanlico.
Observar la
formacin de una
coloracin verdosa
en la interfase.
Molish
Digitalis
purpurea
Mezclar 0,5 mL de
extracto y 0,5 mL de
121


reactivo de Molish,
verter la mezcla
gota agota por las
paredes del tubo
que contenga 1 mL
de cido sulfrico
concentrado.
Observar la
coloracin violeta en
la interfase.
LACTONAS
SESQUITERPENICAS
Hidroxamato frrico Manzanilla
Tomar 0,2 mL de
extracto y
adicionarle una gota
de solucin
metanlica 2N de
clorhidrato de
hidroxilamina y una
gota de KOH en
metanol. Calentar
durante 5 minutos,
enfriar, acidular con
HCl 0,5N y aadir
una gota de FeCl
3

1%. Observar la
coloracin violcea
CUMARINAS
Hidroxamato frrico
7-
hidroxicumarina
Ver procedimiento
anterior
Erlich
7-
hidroxicumarina
A 1 mL de extracto
etanlico agregar 1
mL de reactivo de
Erlich. Observar la
coloracin naranja.
Fluorescencia
7-
hidroxicumarina
Calentar al bao de
mara hirviendo un
tubo de ensayo con
1mL de extracto
etanlico. Colocar
en la boca del tubo
122


un papel de filtro
impregnado con sln
0.1N de NaOH.
Observar la
fluorescencia al UV.
ALCALOIDES
Dragendorff Berberina
Agregar 4 gotas de
reactivo de
Dragendorff a 1 mL
de extracto cido.
Observar formacin
de un precipitado
naranja.
Valser Berberina
Agregar 4 gotas de
reactivo de Valser a
1 mL de extracto
cido. Observar
formacin de un
precipitado.
Mayer Berberina
Agregar 4 gotas de
reactivo de Mayer a
1 mL de extracto
cido. Observar
formacin de un
precipitado blanco.
Wagner Berberina
Agregar 4 gotas de
reactivo de Wagner
a 1 mL de extracto
cido. Observar
formacin de un
precipitado blanco.