VI IBEROLAB

1
GUIA PARA LA VERIFICACION DE ESPECTOFOTOMETROS UV-VISIBLE UTILIZADOS EN EL ANALISIS
DE SUELO Y AGUA.


Azcarate M.P.
(1)
; Kloster N.S.
(2)
; Ostinelli M.
(3)
; Carreira D.
(3)



1
Laboratorio de Anlisis Agronmicos. E.E.A. Chubut. INTA. Ex Ruta 25 Km 1480. (9100) Trelew. Chubut. Argentina. E-
Mail: mpazcarate@yahoo.com.ar
2
Laboratorio de Suelo y Agua. E.E.A. Anguil, INTA. RN N5 km 580. (6326) Anguil. La Pampa. Argentina. E-Mail:
nkloster@anguil.inta.gov.ar
3
Laboratorio de Suelos. Instituto de Suelos. INTA Castelar. Las Cabaas y De Los Reseros s/n (1712) Villa Udaondo.
Castelar. Buenos Aires. Argentina. E-Mail: mostinelli@cnia.inta.gov.ar; dcarreira@cnia.inta.gov.ar.



REA TEMTICA. (Marque una opcin) REQUISITOS TCNICOS


RESUMEN.
La espectrofotometra es una tcnica ampliamente utilizada
en los laboratorios para el anlisis cuantitativo de
numerosos compuestos, debido principalmente a su
sencillez operativa y a la rapidez en el anlisis. La
concentracin de una sustancia puede ser calculada a partir
de la cantidad de luz absorbida por una muestra, en el
rango del espectro del ultravioleta (UV) y visible (Vis)
aplicando la ley de Lambert-Beer. Por ello, para generar
datos confiables es de gran importancia la verificacin
previa del funcionamiento del espectrofotmetro. Los
principales parmetros a controlar en estos equipos son: la
exactitud de la longitud de onda, la exactitud y precisin
fotomtrica, la linealidad fotomtrica y la verificacin de la
luz difusa o parsita.
PALABRAS CLAVE. Espectrofotmetro. UV-Vis.
Verificacin. Suelo. Agua




1. Introduccin

En el anlisis de muestras de suelo y agua, el
espectrofotmetro constituye una herramienta fundamental
para la cuantificacin de nutrientes y contaminantes. Del
correcto desempeo de este instrumento depender en gran
medida la calidad de los resultados obtenidos, por lo que se
considera un equipo crtico en los ensayos de laboratorio y
que necesariamente deber ser verificado peridicamente.


2. Objetivos

El objetivo de sta gua es proporcionar informacin til
para verificar el correcto funcionamiento de los
espectrofotmetros UV-Vis del laboratorio.


3. Campo de aplicacin

Espectrofotmetros UV-Vis utilizados para el anlisis de
muestras de suelo y agua para uso agropecuario.


4. Fundamentos

4.1. Equipamiento

La mayora de los instrumentos espectroscpicos, como el
espectrofotmetro, estn constituidos por cinco
componentes: lmpara o fuente luminosa, selector de
longitud de onda , celda para alojar la muestra, detector
de radiacin, y amplificador de seal con medidor o
registrador.

4.2. Teora

Desde hace muchos aos se han utilizado las propiedades
de la luz y su interaccin con las sustancias para
identificarlas y determinar la concentracin de las mismas.
Estos estudios se basan en la estrecha relacin que existe
entre la absorcin de la radiacin electromagntica de las
sustancias, tanto en la zona del espectro visible como en el
ultravioleta e infrarrojo, y su concentracin.
Si un haz de luz monocromtico paralelo (I
0
) atraviesa
una cubeta de b cm de paso ptico, conteniendo una
solucin con una concentracin (c) de una especie
absorbente. A causa de la interaccin de la luz y de las
partculas absorbentes la intensidad del haz se atena de I
0

a I.
La transmitancia (T) de la solucin es entonces la fraccin
de la radiacin incidente transmitida por la solucin:

T = I / I
0
(1)

Tambin puede expresarse en forma porcentual:

T (%) = I / I
0
x 100 (2)

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2

A fin de obtener ecuaciones de ajuste lineal se utiliza su
transformada logartmica conocida como absorbancia (A)
de una solucin y definida por la ecuacin

A = - log

T = log I
0
/I (3)

La absorbancia de una solucin aumenta cuanto mayor es la
atenuacin del haz de luz, ocurriendo lo inverso en la
transmitancia. La absorbancia es directamente proporcional
a la longitud b de la trayectoria a travs de la solucin, y a
la concentracin c de la especie absorbente. Estas relaciones
se expresan en la ley de Lambert-Beer como:

A = bc (4)

= absortividad molar expresada en L mol
-1
cm
-1

b = distancia recorrida a travs de la solucin (paso ptico)
expresada en cm
c = concentracin de la solucin expresada en mol L
-1
,


5. Desarrollo

El Responsable del Sistema de Gestin de Calidad del
Laboratorio (SGC) deber definir el programa de
verificacin del equipamiento del laboratorio, en el cual
incluir las actividades a realizar, sus responsables y la
periodicidad de los controles. Esta ltima se define en
funcin de las condiciones de uso y el registro acumulado
de funcionamiento de los equipos.
Las principales pruebas recomendadas en la bibliografa
consultada, para verificar el correcto funcionamiento de un
espectrofotmetro incluyen: la exactitud de la longitud de
onda, la exactitud y precisin fotomtrica, la linealidad
fotomtrica y la verificacin de la luz difusa o parsita.

5.1. Soluciones de calibracin

Se encuentran disponibles en el mercado, materiales de
referencia certificados de estas soluciones, aunque las
mismas se pueden preparar en el laboratorio a partir de
reactivos de alta pureza y cuyas propiedades fsicas y
qumicas sean conocidas. Para materiales sin evidencia
formal de la trazabilidad (y su incertidumbre) es
responsabilidad de los laboratorios demostrar que los
mismos son aptos para el fin previsto.

5.1.1. Solucin de xido de holmio en cido perclrico.

Disolver en un vaso de precipitados 4,0 g de xido de
holmio (III) en 96,0 g de cido perclrico al 10% (v/v).
Calentar y agitar para facilitar su disolucin y luego dejar en
reposo por 24 hs, a temperatura ambiente.

5.1.2. Solucin de sulfato de cobre en cido sulfrico.

Disolver en un vaso de precipitados 20,0 g de sulfato de
cobre pentahidratado, de una pureza mayor al 99,9%, en
suficiente agua destilada. Adicionar, con cuidado, 10 ml
de cido sulfrico (d = 1,84 g cm
-3
), y trasvasar
cuantitativamente la solucin a un matraz aforado de 1
litro. Enrasar con agua destilada y homogeneizar.

5.1.3. Solucin de cido sulfrico 0,005 mol L
-1


Pesar en un vaso de precipitados 0,49 g de cido sulfrico
(d = 1,84 g cm
-3
), diluir con agua destilada y trasvasar
cuantitativamente a un matraz de 1 litro. Enrasar con agua
destilada y homogeneizar.

5.1.4 Soluciones de Dicromato de potasio

a) Solucin de concentracin 0,10 g L
-1


Secar aproximadamente 1 g de dicromato de potasio, de
una pureza mnima de 99,95%, en estufa a 105 C por 2
horas y enfriar en desecador. Pesar 0,10 g y disolver en un
vaso de precipitados con la solucin de cido sulfrico
0,005 mol L
-1
. Trasvasar cuantitativamente a un matraz de
un litro, enrasar con la solucin de cido sulfrico 0,005
mol L
-1
y homogeneizar.

b) Serie de soluciones de Dicromato de potasio

Preparar cuatro soluciones de dicromato de potasio de
diferente concentracin, requeridas para los controles, a
partir de la solucin de 0,10g L
-1
, tal como se indica en la
tabla 1, enrasando a un volumen final de 100 ml con cido
sulfrico 0,005 mol L
-1
.

Tabla 1. Serie de soluciones de dicromato de potasio.

Concentracin
(g L
-1
)
ml de solucin
de concentracin 0,10 g L
-1

0,02 20
0,04 40
0,06 60
0,08 80

5.1.5. Solucin de Nitrito de sodio

Secar aproximadamente 70 g de nitrito de sodio en estufa
a 105C por 2 horas y enfriar en desecador. Pesar 50 g,
disolver en un vaso de precipitados con agua destilada y
trasvasar cuantitativamente a un matraz de un litro.
Enrasar con agua destilada y homogeneizar.

5.2. Parmetros

5.2.1 Control de la exactitud de la longitud de onda

La desviacin de la longitud de onda puede causar errores
en los resultados cuantitativos de la lectura en el UV-Vis.
En este control se verifica el grado de concordancia entre
la longitud de onda seleccionada para la mxima
absorbancia y la longitud de onda de referencia.
Con una misma cubeta, ajustar el cero (0) del instrumento
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3
con la solucin de cido perclrico al 10%.
Se recomienda medir segn el rango espectral una longitud
de onda para el espectro UV y tres longitudes de onda para
el espectro Vis.
Dependiendo del ancho de banda del equipo, la mxima
absorcin de la solucin de xido de holmio en cido
perclrico se detectar a las longitudes de onda indicadas en
la tabla 2.

Tabla 2. Longitudes de onda () de mxima absorcin de la
solucin de xido de Holmio en cido perclrico.

Ancho
de
banda
(nm)
de mxima absorcin
(nm)
Rango UV
1 241,1 249,9 278,1 287,2 333,5 345,4 361,3
2 241,0 250,1 278,1 287,6 333,5 345,5 361,1
Rango Vis
1 385,6 416,3 451,4 467,8 485,2 536,6 640,5
2 386,0 416,9 451,3 468,1 485,2 537,2 641,1

5.2.2. Control de la exactitud fotomtrica

La exactitud fotomtrica se determina comparando la
absorbancia de una solucin de referencia (Tabla 3) con la
lectura de sta, obtenida en el espectrofotmetro. Para
cubrir satisfactoriamente el rango UV-Vis del espectro, se
utilizan dos soluciones diferentes: dicromato de potasio,
para el espectro UV y sulfato de cobre, para el espectro Vis.

Tabla 3. Absorbancias de referencia de las soluciones en el
rango UV-Vis


Longitud de
onda (nm)
Absorbancia de
Referencia
235 0,748
257 0,865
313 0,292
Rango UV
Solucin de
dicromato de potasio
en cido sulfrico
350 0,640
600 0,068
650 0,224
700 0,527
Rango Vis
Solucin de sulfato
de cobre en cido
sulfrico 750 0,817

Con una misma cubeta ajustar el 0 de absorbancia del
instrumento con la solucin de cido sulfrico de
concentracin 0,005 mol L
-1
, utilizada para preparar las
soluciones de referencia.

Control en el rango UV:
Realizar 6 lecturas consecutivas de la solucin de
dicromato de potasio en cido sulfrico de
concentracin 0,06 g L
-1
a las longitudes de onda de
235, 257, 313 y 350 nm, registrando los valores y
confrontndolos con los valores de referencia.
Control en el rango Vis:
Realizar 6 lecturas consecutivas de la solucin de
sulfato de cobre en cido sulfrico a las longitudes de
onda de 600, 650, 700 y 750 nm, registrando los
valores y confrontndolos con los valores de
referencia.


5.2.3. Control de la precisin fotomtrica

Se denomina precisin fotomtrica a la medida de la
dispersin de una serie de mediciones de absorbancia
alrededor de la media, y se expresa como coeficiente de
variacin porcentual. Para la determinacin, utilizar los
datos obtenidos en la prueba de exactitud fotomtrica
(5.2.2), con la solucin de dicromato de potasio de 0,06 g
L
-1
a las siguientes longitudes de onda: 235, 257, 313, 350
nm.

5.2.4. Control de la linealidad fotomtrica

El estudio de la linealidad fotomtrica permite establecer
el rango de absorbancia en el que el instrumento tiene
respuesta proporcional a los cambios de concentracin.
Para ello se determina la respuesta del espectrofotmetro
a diferentes concentraciones de una sustancia que cumpla
con la ley de Lambert-Beer.
Se evala la linealidad fotomtrica realizando lecturas de
absorbancia de la serie de soluciones de dicromato de
potasio (0,02; 0,04; 0,06; 0,08 y 0,1 g L
-1
), utilizando la
solucin de cido sulfrico 0,005 mol L
-1
para realizar el
ajuste a 0 de absorbancia del equipo. Las longitudes de
onda a que se realizan las lecturas sern: 235, 257, 313 y
350 nm.

5.2.5. Control de Luz difusa o parsita

Se denomina as a toda radiacin electromagntica de
longitud de onda distinta a la seleccionada por el
monocromador, que alcanza el detector y por lo tanto
queda registrada por el instrumento. Este control se basa
en la medida del porcentaje de transmitancia de una
solucin de nitrito de sodio 50 g L
-1
. Esta sustancia tiene
la propiedad de que sus soluciones absorben toda la
radiacin incidente de longitudes de onda menores a los
390 nm, es decir, que es pticamente opaca a la luz. Por lo
tanto, la transmitancia a 340 nm de esta solucin debe ser
igual a cero, y toda transmitancia detectada corresponde a
luz parsita.
El ajuste del equipo a 0 de transmitancia se realiza con
aire, luego se mide la transmitancia de la solucin de
nitrito de sodio a una longitud de onda de 340 nm.
Realizar las lecturas por triplicado.


6. Resultados

En la tabla 4 se muestran los clculos y los resultados
aceptables en la verificacin del funcionamiento del
espectrofotmetro. Estos valores de aceptabilidad de los
parmetros, fueron tomados de bibliografa relacionada
con la industria farmacutica y de lineamientos de la
farmacopea de diferentes pases.
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4


Tabla 4. Clculos y evaluacin de resultados de verificacin
de espectrofotmetros.

Parmetros Clculos Resultados
Exactitud de
la longitud
de onda
E =
m
-
ref

Aceptable:
UV 1 nm
Vis 3 nm
Exactitud
fotomtrica
%Error = A
m
A
ref
100
A
ref

Error entre 2% Optima
Error entre 3% Aceptable
Precisin
fotomtrica
CV% = SD .100
x
CV%<0,5% optima
CV%< 1% aceptable
Linealidad
fotomtrica
Graficar A
m
vs A
ref
.
Calcular con una
regresin lineal el
coeficiente de regresin
(r).
r 0,999 Aceptable

Luz difusa o
parsita
T<0,01 A >2
E = exactitud;
m=
longitud de onda medida
;

ref
= longitud de onda de
referencia; A
m
= Absorbancia medida; A
ref
=

Absorbancia de referencia;
CV% = coeficiente de varianza; SD = desvo estndar; x = media de los
datos; T = tramitancia; A = absorbancia.


7. Conclusiones

En la bibliografa consultada, la mayora de las
verificaciones se realizan en el rango del espectro UV (200 -
400 nm), sto se debe a que la informacin disponible est
orientada a la verificacin de espectrofotmetros destinados
al anlisis de muestras farmacuticas y bioqumicas.
Tambin esto influye sobre los valores de aceptabilidad de
los resultados obtenidos para los equipos. La regin del
espectro utilizada en la mayora de los anlisis qumicos de
muestras de suelo y agua para uso agropecuario, es la regin
del Vis (400 - 800 nm), por lo que es necesario proponer
soluciones de referencia, que puedan preparse en el
laboratorio, y demostrar, adems, que las mismas pueden
ser utilizadas para evaluar en ste rango del espectro.
Asimismo debera evaluarse la posibilidad de modificar los
rangos de aceptabilidad de los parmetros propuestos. Esto
se debe a que, al tratarse de muestras para uso agropecuario,
tal vez pueda permitirse una mayor flexibilidad en los
valores aceptados para los espectrofotmetros utilizados en
sta disciplina.


BIBLIOGRAFIA
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Manual de Uso Metrolab 330. Espectrofotmetro 330-1000 nm. Marca
Metrolab.
Manual de Uso Metrolab Plus 1600. Espectrofotmetro 330-1000 nm.
Marca Metrolab.
Mavrodineanu R, Baldwin JR (1980) Metal-on-quartz filters as a
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