Influncia de Diferentes Fontes de Carbono e Nitrognio
na Produo de Penicilina G Acilase por Bacillus
megaterium ATCC 144! "aura #$ Pinotti% &anessa '$ de (ou)a* 'osineide G$ (il+a% 'oberto C$ Giordano% 'a,uel "$ C$ Giordano Universidade Federal de So Carlos-Departamento de Engenharia Qumica-Via Washington Lui! "m #$%- C&'%'-So Carlos (S&-)rail- *a+ %%-,'-#'- .#'' (e-mail/ ra0uel1de02u*scar23r '-(.#/ Este trabalho teve por objetivo estudar a influncia de diferentes fontes de nitrognio e de carbono na produo de PGA durante cultivo do B. megaterium. Fontes estudadas foram glicerol! case"na hidrolisada en#imaticamente sob diferentes condi$es! prote"nas do soro de %ueijo hidrolisadas com Alcalase! peptona! triptona e amino&cidos livres em diferentes concentra$es! na ausncia e na presena de soro de %ueijo. 'nvestigou(se ainda o efeito da retirada de carbonato de c&lcio do meio de cultivo e a e)istncia de inibio da produo da en#ima pela am*nia produ#ida. +esultados obtidos mostraram %ue o microrganismo aceita diferentes fontes de carbono! mas %ue a produo da en#ima somente ocorre %uando ele cresce consumindo amino&cidos livres como fonte de carbono e de nitrognio! na presena de soro de %ueijo! observando(se! para ,-!- g./ de amino&cidos! significativo aumento da atividade en#im&tica em relao 0s outras fontes de nitrognio. 1s resultados mostraram tamb2m %ue a omisso de 3a314 no afeta o crescimento do microrganismo e a produo da en#ima e %ue no h& efeito inibidor da am*nia. INT'/D.01/ 4 penicilina 5 acilase - &54 6E2C2$2%2,2,,7 8 uma enima de grande import9ncia industrial! tendo sua principal aplica:o comercial na hidr;lise de penicilina 5! visando produ:o do <cido '-aminopenicil9nico 6'-4&472 Esse composto 8 intermedi<rio chave na produ:o de anti3i;ticos semi-sint8ticos tais como ampicilina e amo+icilina2 4 &54 8 proveniente de v<rios microrganismos! apresentando di*erentes caractersticas e propriedades! sendo mais comumente encontrado em Escherichia coli! Proteus rutgeri e B. megaterium =>spina et al2!,??#@2 Dentre os microrganismos produtores de &54! Bacillus megaterium 8 dos poucos 0ue a produem de modo e+tracelular! o 0ue simpli*ica procedimentos de puri*ica:o! com conse0uente redu:o de custos2 >s mecanismos regulat;rios para a e+presso da &54 no so 3em esta3elecidos desde 0ue a *un:o natural da enima no 8 conhecida 6Done et al2!,??.72 Aem sido sugerido 0ue a &54 pode estar envolvida na degrada:o de compostos *enilacetilados para a gera:o de <cido *enil ac8tico! 0ue pode ser usado como *onte de car3ono 0uando a 3act8ria est< no seu modo livre 6Valle et al2!,??,72 >s tra3alhos reportados na literatura re*erentes B produ:o de &54 por B. megaterium relatam 0ue a enima pode consumir o indutor! <cido *enil ac8tico! como *onte de car3ono 6Clhanes et al2! ,??D7 e 0ue glicose atua como repressora na sntese de penicilina 5 acilase 6Cllanes et al2!,??D E Savidge!,?.D E &inotti et al! #---72 4 utilia:o de soro de 0ueiFo como *onte de car3ono e de micronutrientes demostrou ser muito e*etiva na produ:o da enima e no crescimento do microrganismo 6)eraan! ,??.E &inotti et al2! #--#72 4 produ:o de &54 tam38m 8 *ortemente dependente da *onte de nitrogGnio2 Em tra3alho pr8vio era o3servado 0ue a protease utiliada para hidrolisar a casena tinha in*luGncia na produ:o da enima! possivelmente devido Bs composi:Hes di*erentes de amino<cidos e peptdeos resultantes6&inotti et al2!#---72 Este tra3alho teve assim como o3Fetivo analisar a in*luGncia de di*erentes *ontes de car3ono e de nitrogGnio na produ:o de &542 >s nutrientes testados *oram/ glicerol! casena hidrolisada enimaticamente so3 di*erentes condi:Hes! protenas do soro de 0ueiFo hidrolisadas com 4lcalase! peptona! triptona e amino<cidos livres em di*erentes concentra:Hes! na ausGncia e na presen:a de soro de 0ueiFo2 >s resultados o3tidos *oram comparados com um meio padro contendo a lactose presente no soro de 0ueiFo como *onte de car3ono! casena hidrolisada com 4lcalase como *onte de nitrogGnio! solu:o de di*erentes sais! <cido *enil ac8tico como indutor e car3onato de c<lcio para impedir 0ueda de pI2 Cnvestigou-se ainda o e*eito da retirada de car3onato de c<lcio do meio de cultivo e a e+istGncia de correla:o entre a concentra:o de amJnia produida durante o cultivo e a produ:o da enima #AT-'IA" - #2T/D/( #ateriais3 Soro de 0ueiFo 6Sigma7! glicerol 6SKnth7! peptona e triptona 6di*co7! amino<cidos 6doados pela 4Finomoto7! casena 6Liedel7! 4lcalase
-!'L 6doada pela Movo Mordis" 4NS7!
tripsina 6Sigma7! 0uimotripsina 6Sigma7! <cido *enil ac8tico 6Carlo Er3a7! car3onato de c<lcio 6SKnth7! e &enicilina 5 6&ara0umica72 Demais reagentes utiliados eram de grau analtico de di*erentes marcas comerciais2 #icrorganis4o3 Bacillus megaterium 4ACC ,D?D% cedido pela Funda:o Aropical ( Campinas! S&! mantido em criotu3os! a (O-PC! utiliando glicerol #-Q como crioprotetor2 #5todos Preparo do In6culo3 utiliavam-se erlenmeKers contendo meio comple+o ou sint8tico! nas seguintes composi:Hes/ a7 4eio co4ple8o/ casena hidrolisada enimaticamente 6D-!- gNL7E soro de 0ueiFo 6O!- gNL7! -!% mlNL de antiespumante e solu:Hes de sais 6Cllanes et al2!,??D7E 37 4eio sint5tico/ casena hidrolisada era su3stituda por amino<cidos livres na mesma propor:o encontrada na casena 6,- gNL7E -!% mlNL de antiespumante e solu:Hes de sais 6Cllanes et al2!,??D72 Em alguns ensaios esse meio era suplementado com soro de 0ueiFo 6O!- gNL72 Depois de adicionar o microrganismo! o meio l0uido de germina:o era incu3ado durante #D horas a $-- rpm e $-PC2 Produo de en)i4a3 o meio padro para produ:o de enima era constitudo de/ casena hidrolisada com 4lcalase! %,!$D gNLE soro de 0ueiFo! ,?!'D gNLE car3onato de c<lcio! D!,$ gNLE <cido *enil ac8tico! #!OgNL! antiespumante -!-#% gNL e solu:o de sais 6Cllanes et al2!,??D72 Mos testes com di*erentes *ontes de car3ono o meio era o mesmo! e+ceto pela su3stitui:o do soro de 0ueiFo por glicerol 6,D!O gNL72 4 *onte de nitrogGnio 6casena hidrolisada7 era su3stituda por soro hidrolisado 6$D!- gNL7! peptona 6#%!' gNL7! triptona 6%,!D gNL7 e amino<cidos livres 6%,!- e ,- gNL7 com e sem soro de 0ueiFo2 >s ensaios *oram realiados em c9mara rotativa 6MeR )runsRic" Scienti*ic7 por D.h a $-PC e $--rpm2 Aranscorrido .h da inocula:o do microrganismo! adicionou-se o <cido *enil ac8tico2 4p;s o t8rmino da *ermenta:o as amostras eram centri*ugadas a ,D2---g por #- minutos a D o C2 > material sedimentado era coletado e seco para determina:o da concentra:o celular e o so3renadante utiliado em an<lises posteriores2 Ati+idade en)i49tica3 determinada pela hidr;lise da &enicilina 5 -!# S a pI . 6tampo *os*ato #-- mS7 e $OTC2 > '-4&4 produido era medido espectro*otometricamente a D,%nm! depois da rea:o com p-dimetilamino3enaldedo 6&D4)7 de acordo com )alashingham et al2! ,?O#. Uma unidade internacional 6UC7 era de*inida como a 0uantidade de enima 0ue catalisa a *orma:o de , mol de '-4&4 de &en 5 em , minuto so3 condi:Hes e+perimentais2 Dosage4 de prote:nas% lactose e glicerol3 concentra:o de protenas determinada usando o m8todo de LoRrK modi*icado por Iartree! ,?O#! e pelo m8todo de )rad*ord! ,?O'E lactose3 dosada pelo m8todo de SomogKi! ,?%#E glicerol3 dosado por I&LC 6Waters7! coluna ionpa" US .-,! *ase m;vel <gua milli-Q! ,!- mLNmin! detec:o por re*ratometria2 '-(."TAD/( - DI(C.((1/ Influncia da fonte de carbono na produo de PGA 4 ta3ela , apresenta os resultados o3tidos na produ:o de &54 por Bacillus megaterium utiliando meio de cultivo padro 6ensaio ,7! meio padro com su3stitui:o do soro de 0ueiFo por glicerol 6ensaio #7 e a adi:o conFunta de glicerol com soro de 0ueiFo 6ensaio $72 Aa3ela ,2 Cn*luGncia da *onte de car3ono na produ:o de &54 Ensaio S& A 6h7 pI C+ 6gNL7 42E 6UCNL7 C2&2, 6gNL7 C2&2# 6gNL7 Lactose 6gNL7 4mJnia 6gNL7 5licerol 6gNL7 , Casena Soro sais #+ 4F4 CaC> $ - O!O -!O - D#!# -!? ,,!O - ,# .!, $!D %? $?!O -!? ,,!' -!$ #D .!D %!, ?% $.!' -!? ,,!$ -!O D. .!O %!% ,-, $'!' -!? ,,!$ ,!' # Casena 5licerol sais #+ 4F4 CaC> $ - O!. -!% - D,!$ -!$ - - ,$!- ,# O!. ,!$ #. D,!D -!$ - -!# ,,!' #D O!O #!- #. $.!. -!$ - -!D ,-!% D. O!O #!O $- $.!O -!$ - -!% %!$ $ Casena Soro 5licerol sais #+ 4F4 CaC> $ - O!O -!' - DD!. -!. ,,!% - ,D!- ,# O!O $!% %# D#!? -!. ,,!$ -!, ,#!O #D O!% %!? D' D#!? -!. ,,!$ -!, O!. D. .!- '!O ,-- D-!. -!? ,,!D -!' - C+ V Concentra:o celularE 42E2 V atividade enim<tica E C2&2, V Concentra:o de protenas dosadas pelo m8todo de LoRrK E C2&2# V Concentra:o de protenas dosadas pelo m8todo de )rad*ord Comparando-se os resultados o3tidos no ensaio , com os do ensaio $! onde era acrescentado glicerol! o3serva-se aumento da concentra:o celular 0uando este era adicionado! o 0ual no est<! contudo! associado a aumento da atividade enim<tica2 &ode-se! at8 mesmo! o3servar uma represso na sntese de &54 no tempo de #D horas! atingindo valores semelhantes em D. horas2 Quando se utiliou apenas glicerol como *onte de car3ono 6ensaio #7! tanto a concentra:o celular como a atividade enim<tica diminuiu2 Um *ato interessante a ser notado 8 em rela:o B velocidade de consumo do glicerol2 Quando o meio 8 constitudo apenas por glicerol! o microrganismo consome este nutriente numa menor velocidade do 0ue 0uando est< presente tam38m o soro de 0ueiFo! indicando 0ue o soro de 0ueiFo possui algum nutriente 0ue au+ilia no transporte ou assimila:o do glicerol2 Influncia da fonte do carbonato de c9lcio no cresci4ento do 4icrorganis4o e na produo de PGA >s ensaios de produ:o de &54 realiados at8 o momento em nosso la3orat;rio utiliaram car3onato de c<lcio com o o3Fetivo de impedir a 0ueda de pI ao longo do cultivo2 Mo entanto! 8 de interesse retirar esse nutriente do meio! pois ele di*iculta a medida da massa celular 6re0uer dissolu:o do car3onato s;lido com <cido ac8tico antes da *iltra:o para massa seca72 Desse modo resolveu-se estudar se a retirada do CaC> $ do meio iria inter*erir no meta3olismo do microrganismo e na produ:o de &542 &ara tal! era realiado ensaio retirando-se o car3onato de c<lcio e o su3stituindo por tampo *os*ato na mesma concentra:o molar 0ue o car3onato 6ensaio %72 Aa3ela #2 E*eito da omisso do car3onato de c<lcio na produ:o de &54 Ensaio S5 S& t 6h7 &I C+ 6gNL7 42E 6UCNL7 C2&2, 6gNL7 C2&2# 6gNL7 Lactose 6gNL7 4mJnia 6gNL7 D Casena soro sais Casena soro sais #+ 4F4 CaC> $ - O!O -!O - D#!# -!. ,,!? - ,# O!? $!$ %' D#!- -!? ,,!$ -!$ #D .!# D!% ,-# D-!O -!. ,,!O -!O D. .!O %!% ,-. $D!D -!? ,,!O ,!' % Casena soro sais Casena soro sais #+ 4F4 Aampo - O!' -!D - DD!? -!. ,#!# - ,# O!? $!- DO DD!' -!? ,,!$ -!$ #D .!# D!- O' D-!? -!? ,,!# -!O D. .!O %!, ?D $'!# -!? ,,!' ,!% C+ V Concentra:o celularE 42E2 V atividade enim<tica E C2&2, V Concentra:o de protenas dosadas pelo m8todo de LoRrK E C2&2# V Concentra:o de protenas dosadas pelo m8todo de )rad*ord Con*orme mostram os resultados o3tidos no ensaio %! a omisso do car3onato no meio de produ:o no resultou em decr8scimo da produ:o de &54 6compara:o com o ensaio D72 Essas pe0uenas oscila:Hes na atividade so consideradas no signi*icativas2 Deste modo! os ensaios mostrados a seguir no apresentam mais o CaC> $ na composi:o do meio2 &ara am3os os conFuntos de ensaios 6ta3elas , e #7 8 apresentado a evolu:o da amJnia ao longo do cultivo do microrganismo2 Essa vari<vel era acompanhada pois tinha-se o interesse de veri*icar se a amJnia estava causando algum e*eito ini3it;rio2 Esse componente 8 respons<vel pelo aumento de pI o3servado durante o cultivo! decorrente do consumo da *onte de nitrogGnio 6cata3olismo de amino<cidos72 Mo entanto! pelo contr<rio as maiores concentra:Hes de enima parecem estar associadas aos maiores teores de amJnia! correlacionando consumo de amino<cidos e produ:o2 Influncia da fonte de nitrognio na produo de PGA > *ato de cada enima proteoltica ter uma especi*icidade di*erente permite 0ue a hidr;lise da casena resulte em peptdeos com di*erentes pesos moleculares e estruturas2 Dessa *orma! a mesma 0uantidade de casena hidrolisada pode conter 0uantidades di*erentes de *ontes de nitrogGnio *acilmente assimil<vel2 Essa condi:o nos motivou a realiar a hidr;lise da casena com di*erentes proteases e veri*icar a in*luGncia desses produtos na produ:o de &542 Ma ta3ela $ temos os resultados da produ:o de &54 0uando se utiliou casena hidrolisada por alcalase 6ensaio ' ( ensaio padro7! alcalase W tripsina 6ensaio O7 e alcalase W tripsina W 0uimotripsina 6ensaio .72 >s valores encontrados de atividade e crescimento celular para os $ ensaios *oram muito semelhantes! indicando no haver muita di*eren:a nos produtos *ormados2 4 an<lise em I&LC dos produtos resultantes dessas hidr;lises con*irmou essa hip;tese 6resultados no apresentados72 Aa3ela $2 Cn*luGncia das di*erentes casenas na produ:o de &54 Ensaio S5 S& t 6h7 pI C+ 6gNL7 42E 6UCNL7 &rotenas LoRrK 6gNL7 Lactose 6gNL7 ' Casena 6alc27 Soro Sais Casena 6alc27 Soro Sais #+ 4F4 - O!? -!% - D.!O #D .!D D!' .- D$!O D. .!% D!O .? $.!$ O Casena 6alc27 Soro Sais Casena 6alc2 W trip7 Soro Sais #+ 4F4 - O!? -!' - %$!? ,,!' #D .!$ D!$ O? DO!$ ,-!% D. .!D D!D OD DD!# ,-!. . casena 6alc27 Soro Sais Casena 6alc W trip W 0uim27 Soro sais #+ 4F4 - .!- -!D - %#!' ,,!, #D .!$ D!' .' D?!, ,-!% D. .!' D!. .% DD!O ,-!' Uma ve 0ue no houve altera:o signi*icativa na produ:o de &54 0uando se utiliou casena hidrolisada com di*erentes proteases! decidiu-se testar di*erentes *ontes de protenas2 Mo ensaio ? as protenas presentes no soro de 0ueiFo Xin-naturaY *oram hidrolisadas com alcalase! no ensaio ,- e ,, utiliaram-se peptona e triptona! respectivamente! como *ontes de nitrogGnio2 &ode-se o3servar na ta3ela D 0ue para todas as *ontes testadas houve uma 0ueda na produ:o de &54 0uando comparada com a casena hidrolisada 6ensaios , ( .7! em3ora a concentra:o celular tenha atingido valores semelhantes em todos os ensaios2 Aa3ela D Cn*luGncia de di*erentes su3stratos prot8icos na produ:o de &54 Ensaio S5 S& A 6h7 pI C+ 6gNL7 42E 6UCNL7 ? Casena Soro Sais Soro Iidrolisado 6$D gNL7 Sais #+ 4F4 - O!? -!% - #D .!# D!- D- D. .!. D!$ $. ,- Casena Soro Sais &eptona 6#%!' gNL7 Soro Sais #+ 4F4 - O!? -!' - #D .!. $!? $% D. ?!, D!, D' ,, Casena Soro Sais Ariptona 6%,!D gNL7 Soro Sais #+ 4F4 - - - - #D .!$ D!, D' D. .!. D!# '- Decidiu-se a seguir testar amino<cidos livres como *onte de nitrogGnio2 Essa tentativa nos indicaria se as *ontes anteriores no continham os amino<cidos re0ueridos pelo microrganismo ou ento as concentra:Hes dos mesmos no eram su*icientes2 4t8 esses ensaios ainda no estava claro se eram amino<cidos livres ou pe0uenos peptdeos o su3strato cuFo consumo conduia B produ:o de &542 Esses ensaios permitiriam responder a essas 0uestHes2 Foram assim realiados ensaios a di*erentes concentra:Hes de amino<cidos na ausGncia e na presen:a de soro de 0ueiFo2 Aa3ela %2 Cn*luGncia da adi:o de amino<cidos livres no meio de produ:o de &54 Ensaio S5 S& t 6h7 pI C+ 6gNL7 42E 6UCNL7 Lactose 6gNL7 ,# a2a 6D-gNL7 lactose aa6%,gNl7 lactose sais6#+7 4F4 - .!# Z-!, - ,D!$ #D .!# Z-!, #, ,D!# D. .!# Z-!, ## ,D!D ,$ a2a 6#-gNL7 lactose sais a2a 6,-gNL7 Lactose Sais 6#+7 4F4 - .!, Z-!, - ,D!, #D .!$ Z-!, ,? ,$!? D. .!$ -!# ,' ,$!' ,D a2a2 6,-gNL7 soro sais a2a 6,-gNL7 soro sais 6#+ 7 4F4 - .!, - - - #D .!% $!% ,O# ,$!O D. ?!$ $!# ,D- ,$!' Como podemos o3servar na Aa3ela % o uso de amino<cidos livres no meio de cultivo conduiu a um aumento signi*icativo na produ:o de &54! mas somente 0uando se utiliou conFuntamente o soro de 0ueiFo 6ensaio ,D72 Uma ve 0ue a lactose no parece ser consumida e 0ue se tem apenas #!O gNL de 4F4 no meio! para uma produ:o de $!% gNL de c8lulas os amino<cidos tam38m esto sendo usados como *onte de car3ono2 Esses resultados indicam 0ue a produ:o da enima est< associada ao consumo de amino<cidos livres pelo microrganismo2 Quando o cultivo era *eito utiliando-se *ontes de nitrogGnio comple+as! a produ:o da enima pode ter sido limitada pelo esgotamento dessa *onte ou reprimida pelo e+cesso dela em rela:o ao contido no hidrolisado enim<tico de casena! pois poderia ter ocorrido represso da produ:o da enima! caso a e+presso desta *osse regulada pela concentra:o da *onte de nitrogGnio2 Essa hip;tese *oi posteriormente con*irmada atrav8s de detalhado estudo do e*eito da composi:o de amino<cidos na produ:o da enima 6Soua e col2! #--#72 >s resultados tam38m mostram claramente 0ue algum dos nutrientes presentes no soro de 0ueiFo 8 essencial para o crescimento do microrganismo e produ:o de &54 0uando se utiliam amino<cidos como *onte de nitrogGnio e de car3ono2 C/NC".(;-( >s resultados o3tidos nesse tra3alho nos mostram 0ue Bacillus megaterium pode crescer utiliando di*erentes nutrientes como *onte de car3ono2 Contudo! a produ:o de &54 somente ocorre 0uando ele cresce consumindo amino<cidos livres como *onte de car3ono! na presen:a de um ou mais nutrientes presentes no soro de 0ueiFo2 4ltas concentra:Hes de amJnia produida e ausGncia de car3onato de c<lcio no a*etaram a produ:o da enima2 AG'AD-CI#-NT/( >s autores agradecem B F4&ES&! o au+lio *inanceiro para a realia:o deste tra3alho2 '-F-'<NCIA( =I="I/G'>FICA( )alasingham! U2E War3urton! D2E Dunnil! &2E LillK! D2 6,?O#7! Ahe Csolation and Uinetics o* &enicillin 4midase *rom Escherichia 3oli2 Biochimica E5 Bioph6sica Acta! #%--#%'2 )eraan! [2 52 I2 Q2! IoFo! >2! and Io""a! C2 >2 6,??.7! Utiliation o* Cheese WheK *or the &roduction o* &enicillin 5 4cKlase *rom Bacillus megaterium 4ACC ,D?D%2 &roceedings o* ES)ES-#-# nd European SKmposium on )iochemical Engineering Science! O#-OO2 )rad*ord! S2S2 6,?O'7! 4 rapid and Sensitive Sethod *or the Quantitation o* Sicrogram Quantities o* &rotein Utiliing the &rinciple o* &rotein-DKe )inding2 Anal6tical Biochemistr6! O#! #D.-#%D2 Done! S2I2E )rannigan! [242E SoodK! &2C2E2E Iu33ard! L2E2 6,??.7! Ligant-induced Con*ormational Change in &enicillin 4cKlase2 7. 8ol. Biol2! #.D! D'$-DO%2 Iartree! E2 F2 6,?O#7! Determination o* &rotein/ 4 Sodi*ication o* the LoRrK that gives a Linear &hotometric Lesponse2 Anal. Biochem. D.! D##-D#O2 Cllanes! 42E 4cevedo! F2E 5entina! [2C2E LeKes! C2E Aorres! L2E Cartagena! >2E Lui \S! 42 6,??D7! &roduction o* &enicillin 4cKlase *rom Bacillus megaterium in Comple+ and De*ined Sedia2 Process Biochemistr6! #?! #'$- #O-2 >spina! S2 S2 6,??#7! Characteriation and Use o* a &enicillin 4cKlase )iocatalKst2 7. 3hem. 5ech. Biotechnol2! #-%-#,D2 &inotti! L2S2E Silva! 42 F2S2E Silva! L252E 5iordano! L2L2C 6#---7! StudK o* Di**erent Sedia *or &roduction o* &enicillin 5 4cKlase *rom Bacillus megaterium 4ACC ,D?D%2 Applied Biochemistr6 and Biotechnolog6! .D-.'! ''%-''$2 &inotti! L2S2E Silva! L252E 5iordano! L2C2E 5iordano! L2L2C26#--#7E Cnoculum Studies in &roduction o* &enicillin 5 4cKlase 3K Bacillus megaterium 4ACC ,D?D%2 Applied Biochemistr6 and Biotechnolog6!?.-,--! 'O?-'.'2 Savidge! A242 6,?.D7! EnKmatic Conversions used in the &roduction o* &enicillins and Cephalosporins2 Cn/ Biotechnolog6 of 'ndustrial Antibiotics! edited 3K Vandame! E2 [2! Ed2 Sarcel De""er2 SomogKi2 6,?%#7! S2 Motes on Sugar Determination 7. Biol. 3hem2 ,?%6,7! ,?-#$2 Soua! V2L2E &inotti! L2S2E CnocGncio! 52E2S2 E 5iordano! L2L2C26#--#7E Cn*luence o* amino acids composition in the production o* penicillin 5 acKlase 3K Bacillus megaterium 4ACC ,D?D%2 Anais do 9'' :emin&rio de ;idr<lise En#im&tica de Biomassa =:;EB>! Saring<2 Valle! F2! )al3<s! &2! Serino! E2! and )olivar! F2 6,??,7! 5rends Biochem. :ci. ,'! $'-D-2