PRCTICA N 2

FORMAS DE EXPRESAR LA ACTIVIDAD ENZIMTICA

INTRODUCCIN
La determinacin de la actividad de una enzima consiste en averiguar cuanto de enzima
activa hay en una muestra, esta se expresa en Unidades de actividad enzimtica "U"
principalmente, en Katales, como numero de recambio o como actividad especifica,
dependiendo de la enzima y de las caractersticas del trabajo.
Las Unidades de actividad enzimtica (U) vienen a ser los moles de sustrato
transformados por minuto, bajo condiciones adecuadas y estrictamente controladas de pH y
temperatura. Los Katales por su parte, son los moles de sustrato transformados por
segundo, tambin bajo condiciones adecuadas de pH y temperatura; estas unidades de
expresin de la actividad son utilizadas para enzimas o muestras enzimticas muy activas.
El nmero de recambio viene a ser el nmero de molculas de sustrato transformadas por
una sola enzima (o un solo centro activo), en un segundo, esta forma de expresin es
tambin para enzimas de alta actividad. La actividad especifica son las Unidades de
actividad enzimtica por miligramo de protena, esta unidad es utilizada en procesos de
purificacin de enzimas.
Algunas veces es imposible utilizar alguna de estas formas de expresar la actividad
enzimtica, al hacer la evaluacin de una enzima; esto ocurre cuando el sustrato es un
polimero cuyo pero molecular es variable, como en el caso del almidn, el glucgeno, la
quitina, la celulosa, etc., en donde no hay manera de determinar en molaridad el sustrato
transformado, ya que no existe un peso molecular definido del mismo, al inicio de la
reaccin. En tal sentido, se puede hacer la medida de una consecuencia de la accin de la
enzima. A continuacin presentamos algunos ejemplos:

ENZIMA METODOLOGA
Proteasas Capacidad para coagular la leche.
Liberacin de algn aminocido especifico.
Accin sobre pelculas fotogrficas.
Amilasas Prdida de la capacidad de formar complejos de color yodo amilasa.
Disminucin de la viscosidad inicial.
Incremento del poder reductor.
Pectinasas Capacidad para clarificar jugo de manzana.
Disminucin de la viscosidad inicial.
Incremento en el poder reductor.
Disminucin del precipitado alcohlico del medio de reaccin
Al hacer la determinacin de la actividad de una enzima, si no existe especificacin sobre
las condiciones de la determinacin, muchas veces el trabajo requiere el establecerlas
previamente. En tal sentido, se debe conocer perfectamente la reaccin qumica catalizada
por la enzima en prueba; el sustrato o sustratos que participan, el producto o productos
formados, la necesidad o no de cofactores, participacin de moduladores, condiciones de
pH, temperatura y fuerza inica apropiadas, as como el valor de la K
M
, el cual nos permite
saber cuanto de sustrato debemos utilizar para garantizar que estamos en una reaccin de
orden cero, por lo menos el intervalo de tiempo que dura la medida de la actividad de la
enzima.
El siguiente problema por resolver, es la decisin sobre qu es ms conveniente medir, si el
consumo de sustrato, la formacin de producto o alguna modificacin del cofactor, lo cual
va a depender de 4 factores fundamentalmente, la precisin, la sencillez, la rapidez y el
costo del mtodo de determinacin. Est en el investigador en enzimas decidir que es lo
ms conveniente para su trabajo.
Para expresar los resultados obtenidos en alguna de las unidades de medida propuestas, es
fundamental realizar una curva de calibracin, para cualquiera de los mtodos de
determinacin de actividad empleado; por esta razn en la presente practica, vamos a
elaborar las curvas de calibracin para el mtodo qumico de ureasa desarrollado en la
prctica 1 y la curva de amilasas utilizando como sustrato almidn de papa.
OBJETIVOS:
1. Que el alumno aprenda a elaborar una curva de calibracin.
2. Que el alumno determine el intervalo de validez del mtodo empleado.
3. Que el alumno sepa calcular y utilizar el factor de calibracin.
4. Que el alumno sepa expresar sus resultados en alguna de las unidades de expresin
propuestas.
PARTE EXPERIMENTAL
EXPERIMENTO 1
DETERMINACIN DE LA CURVA DE CALIBRACIN DEL REACTIVO DE NESSLER
EN LA CUANTIFICACIN DEL AMONIO
Procedimiento
En diez tubos de ensayo prepare soluciones acuosas de sulfato de amonio SO
4
(NH4
+
)
2
, las
cuales contengan equitativamente entre 0,1 y 2 micromoles de la sal; a partir de una
solucin madre de concentracin 5 x 1O
-4
M.
Complete con agua destilada cada tubo hasta hacer un volumen final de 4,5ml (con la
mxima precisin posible), mezclar bien.
Aadir a cada tubo 0,5 ml de reactivo de Nessler y mezclar.
Esperar diez minutos a temperatura ambiente y luego leer en el espectrofotmetro a una
longitud de onda de 420 o empleando filtro azul.
Nota: no olvide considerar un blanco y asimismo, descarte todo tubo que no sea totalmente
transparente.
Resultados
Coloque en la siguiente tabla los resultados obtenidos:
Ttulo: ________________________________________________________________

ml de
sulfato de
amonio
ml de
H
2
O
moles de
SO
4
(NH
4
+
)

Absorbancia
Absorbancia
neta
moles
de amonio
moles de
urea










Blanco: _______________
En el siguiente espacio, pegue el papel milimetrado donde a graficado moles de urea vs
Absorbancia neta:
INTERROGANTES
1. Entre qu concentraciones de amonio la curva cumple con la ley de Lambert y Beer?


2. Calcule el Factor de calibracin promedio, para urea:



__
FC = _______________
EXPERIMENTO 2
ELABORACIN DE LA CURVA DE CALIBRACIN PARA EL FERRICIANURO DE
POTASIO EN LA CUANTIFICACIN DE MALTOSA
Fundamento
El ferricianuro en presencia de carbonato de sodio concentrado es muy sensible a la
reduccin a ferrocianuro, por pequeas cantidades de azcares reductores; por esta razn,
es utilizado como mtodo qumico en determinaciones enzimticas de hidrlisis de
polisacridos. Su utilidad se debe a que mientras est oxidado es de color amarillo y cuando
se reduce se vuelve transparente.
Procedimiento
Preparar 6 tubos de ensayo que contengan entre 0,01 y 0,18 mg de maltosa (se emplea este
azcar reductor porque es el principal producto de las amilasas que estudiaremos
posteriormente, sobre el almidn; se debe preparar la curva de calibracin con el azcar
reductor que se forme durante la catlisis, pues cada uno de ellos tiene distinto
comportamiento).
Completar con agua destilada hasta un volumen final de 1,5 ml.
Adicionar a cada tubo, 2 ml de reactivo de color (0,5g de ferricianuro de potasio en un litro
de carbonato de sodio 0,5M).
Cubrir cada uno de los tubos con un trozo de papel aluminio (sin estropearlo), para evitar el
ingreso del oxgeno, el cual puede reoxidar al ferrocianuro cuando este, est a altas
temperaturas
Llevar los tubos a bao mara hirviente por exactamente 15 minutos.
Enfriarlos, luego descubrirlos y leer sus absorbancias a 420 nm (o filtro azul). Considerar
que el color es estable entre 10 a 30 minutos.
Preparar adicionalmente un tubo blanco con 1,5 ml de agua destilada o el buffer que se
emplear en las determinaciones enzimticas, y 2 ml del reactivo. Una buena lectura para el
blanco es de 0,850; si no es as, es que est fallando el cromgeno o la sensibilidad del
espectrofotmetro.
Resultados
Coloque en la siguiente tabla sus resultados:
Ttulo: ________________________________________________________________

ml de maltosa
_________
ml de agua
destilada
mg de maltosa Absorbancia Absorbancia
neta






Blanco: ____________
A continuacin plotee mg de maltosa vs Absorbancia neta en papel milimetrado y pguelo
en el espacio siguiente:











INTERROGANTES
1. Cul es el rango de utilidad del reactivo para maltosa?


2. Calcular el factor de calibracin promedio, para miligramos de maltosa:




___
FC = _______________
INTERROGANTES:
1. Cul de los dos mtodos es ms conveniente? Por qu?




2. Exprese los resultados del experimento 1 de la prctica 1 en unidades de actividad
enzimtica (U)

TUBOS 1 2 3 4 5
Absorbancia
neta

Actividad
enzimtica (U)

3. Cul sera la unidad de expresin de la actividad enzimtica en el experimento 2 de
esta prctica?



4. Cmo se usa el factor de calibracin promedio? Cul es su beneficio?







5. Qu importancia tiene la elaboracin de un mayor nmero de estndares en estos
mtodos?






6. Escriba las frmulas del ferricianuro y del ferrocianuro:



PRCTICA N 3
MTODOS EXPERIMENTALES DE PARMETROS CINTICOS
INTRODUCCIN
Los bioqumicos alemanes Leonor Michaeles y Maud Menten el ao 1913 propusieron por
primera vez la ecuacin que hoy lleva su nombre:
v
o
= Vmx [S]
Ks + [S]
Esta es la misma que la ecuacin propuesta por Henri el ao de 1903, pero sustentada con
ms solidez, pues por primera vez se emple el trmino velocidad inicial (v
o
). Esta tena
el inconveniente de considerar a la constante de velocidad K
2
, con un valor mucho menor
que K
-1
, lo cual es solo vlido para algunas enzimas.
Posteriormente en 1925 Briggs y Haldane mejoraron el concepto, considerando a la
constante K
2
de un valor igual o mayor que K
-1
, con lo cual aparece el principio del estado
estacionario, propio de la mayora de enzimas.
El trabajo de Michaelis y Menten fue tan importante para entender el comportamiento de
las enzimas, que la ecuacin en su actual concepcin lleva su nombre y la constante que
considera, toma esa abreviacin en honor a ellos:
v
o
= Vmx [S]
KM + [S]
El gran inconveniente de esta ecuacin es que la velocidad mxima no es un valor real,
pues por definicin de hiprbola rectangular, que es la grfica de sta expresin
matemtica, se entiende que Vmx solo se alcanzar en el infinito. Por esta razn algunos
aos despus, empezaron a aparecer en los trabajos de investigacin sobre enzimas, un gran
nmero de ecuaciones que resolvan este problema. Dentro de ellas cabe destacar las
siguientes:
Ecuacin de Lineweaver-Burk o ploteo de los inversos:
1 = K
M
1 + 1
v
o
Vmax [S] Vmax
Ecuacin de Eadie-Hoffstee:
v
o
= -K
M
v
o +
Vmax


[S]
Ecuacin de Hanes:
[S] = 1 [S] + K
M

v
o
Vmax Vmax
Ecuacin de Eisenthal y Cornish-Bowden:
Vmax = K
M
+ 1
v
o
[S]
A pesar que estos mtodos son difundidos por los especialistas en cintica enzimtica, el
mtodo de Lineweaver-Burk es el ms ampliamente empleado; lo importante es obtener
buenos resultados experimentales que cubran un amplio rango de concentraciones de
sustrato, seleccionadas de modo que se encuentren homogneamente distribuidas en el
grfico.
Seleccin de las concentraciones de sustrato:
Se piensa siempre que los ensayos enzimticos se deben ejecutar a altas concentraciones de
sustrato (mayores que la K
M
), porque se obtienen velocidades constantes por mas tiempo de
incubacin; pero tambin hay desventajas como la que, slo una pequea cantidad del total
del sustrato, se est utilizando en ese instante; esto es derrochador y costoso cuando el
sustrato usado es caro. Asimismo, el sustrato a altas concentraciones puede actuar como
inhibidor de la enzima.
Por esta razn es recomendable hacer las determinaciones a concentraciones de sustrato en
las inmediaciones de la K
M
; por esta razn, se emplea como criterio de seleccin la
siguiente frmula: v
o
2
/ [S]; y se toman en cuenta los valores ms altos de esta relacin.
PARTE EXPERIMENTAL
En la presente prctica se exponen resultados experimentales de una enzima pero en
condiciones ideales:

[S] (mM) v
o
(mol/min) v
o
2
/ [S]
1000 10
100 9,9
10 9,1
5 8,3
2 6,7
1 5,0
0,5 3,3
0,2 1,67
0,1 0,91
0,01 0,099
0,001 0,010
Seleccione de estos datos solo 7, luego de calcular para cada uno el valor de v
o
2
/[S]
Los siete datos seleccionados colquelos en la siguiente tabla y haga los clculos que la
misma le exige:

[S] (mM) v
o

(mol/min )
1/[S] 1
v
o

v
o
[S]
[S]
v
o








Una vez completada la tabla, en hojas de papel milimetrado, haga las grficas de Michaelis-
Menten, Lineweaver-Burk, Eadie-Hoffstee, Hanes y Eishental-Cornish y adjntelas al
informe.
Calcule los valores de K
M
y Vmax en cada una de ellas, tanto usando las respectivas
frmulas, como grficamente.
INTERROGANTES
1. Cul de los mtodos permite graficar ms fcilmente los resultados? Por qu?








2. Con cul de los mtodos se calcula ms fcilmente Vmax y K
M
? Explique










3. Cul de los mtodos manifiesta mejor los errores experimentales? Por qu?