Activación de la respuesta inmune innata y

específica en los pacientes con SINDROME

UREMICO HEMOLITICO (SUH).

Div. Inmunología. IIHEMA

Academia Nacional de Medicina
1)Porqué los menores de 5 años son los
más afectados de SUH?
2) Porqué sólo el 10% de los infectados
desarrolla SUH?
3) Porqué el riñón es el principal órgano
afectado?

Hipótesis de trabajo:

La respuesta inmune innata ó inflamatoria es capaz de

potenciar la toxicidad de la toxina Shiga.

La respuesta inmune humoral específica es capaz de

neutralizar la toxina Stx y proteger del SUH
 Datos Previos:
* Un recuento alto de neutrófilos (PMN) en sangre periférica a la presentación indica peor
pronóstico.
* Se detectan niveles elevados de IL-8 y elastasa en el suero y orina de pacientes cursando e
período agudo deSUH.
* Los LPS y las citoquinas TNF, IL-1 aumentan la sensibilidad de células epiteliales y
endoteliales a los efectos tóxicos de la Stx.
* En modelos animales el LPS aumenta el daño renal y la mortalidad por Stx.

PMN
„ Función dual vigilancia y eliminación in situ
„ Rápida transición de estado no-adherente a adherente

Expresión dinámica de Moléculas de adhesión

Enzimas que degraden matriz extracelular
Alta deformabilidad
Secreción de efectores en la rta inflamatoria: citoquinas
y quimioquinas
Componentes bactericidas y bacteriostáticos
 Gránulos de los PMN humanos
Biogénesis
Mieloblasto Promielocito metamielocito PMN maduro
Gránulos primarios Gránulos secundarios Gránulos terciarios Vesículas secretorias
(azurófilos) (específicos) (organelas almace)
• MPO • Lisozima
Enzimas mieloides
MPO
• Lisozima
Serín proteasas neutras • Elastasa
• Catepsina G
• Proteinasa
Metaloproteinasas • Colagenasa • Gelatinasa

Hidrolasas Acidas *N-acetil-β *N-acetil-β

glucuronidasa glucuronidasa
* Catepsina D * Catepsina D
* β-glucuronidasa * β-glucuronidasa?
* β-glicerofosfatasa * β-glicerofosfatasa
* α-manosidasa * α-manosidasa?

otras • • Proteínas
β-glucuronidasa
Lactoferrina
• Prot unión a plasmáticas:
Vitamina B12 albúmina,
• Citocromo B tetranectina
Membrana • CD63 • CD15 • Fosfatasa alcalina
• CD68 • CD66 NGALCD66 • Cit b-558
• Citb-558 • CD11b/CD18
NADPH ox •
(NADPH-ox) R-FMLP
• R-FMLP • R_uroplasminog
• R-TNF • CD10,CD13,CD16
• R-Fibronectina • CD14,CR1,DAF

CD11b/CD16
Orden de degranulación
Parámetros de activación en los PMN
Parámetros de activación de PMN en los pacientes
CD16 (FcγRIII) CD11b MPO
400 400
300

300 300
% IMF

200

% IM F
200

% IMF
200

100
100 100
0
0
p<0.01 p<0.05 0

p<0.05 n.s.
p<0.01 n.s.
p<0.01 n.s.
n.s.
100
*+
80 Disminución de marcadores de
activación y degranulación en la
% ADCC

60
* membrana de PMN
40

20
Sanos Urémicos SUH
0

* p< 0.05 vs. sanos

+ p< 0.05 vs. SUH
Comparación entre niños con SUH y con
infecciones bacterianas no asociadas a STEC
CD16 CD11b MPO Capacidad Citotóxica
200 700
140
600
150
120 *
500 *
% IMF

100
80
400 60
100
300 40
20
50 200 0
ADCC Mediada por
100 ROSIROs
- mediated
0 0

p<0.01 n.s. p<0.01 SUH Infectados

¾ Estas diferencias aún persisten

Ferná
Fernández et al. Phenotype markers and function of peripheral
neutrophils in children with HUS. Pediatric Nephrology. 17:337-
17:337-
344, 2002.
 Contenido intracelular de marcadores de
degranulación evaluados en los PMN de pacientes con
SUH ROS-production
i.c. CD66b β-Glucuronidase
140 * 160
activity
*

MFI DHR (PMA/basal)

40 140
120 * *
35 120 * *

Unidades de b-glucuronidasa
100 *
30 * 100
MFI CD66b

80 # 25 * 80
60 20
60
#
40
40 15
20
10
20 0

HUS after AP

UC
HC
HUS AP

NC
5
0
0
HC

NC

UC
HUS AP

HUS after AP

HC

NC

UC
HUS AP

HUS after AP
* p<0.05 vs SUH
# p<0.05 vs S

Los PMN de pacientes con SUH están “exhaustos”, probablemente como

consecuencia de un fuerte proceso previo de activación, el cual tendría lugar en el
tiempo que transcurre entre la diarrea y el diagnóstico de SUH.

Fernández GC et al, Impaired neutrophils in children with the typical form of Hemolytic
Uremic Syndrome Pedr Nephrol 20:1306-1314, 2005..
 % live cells (ANN-/IP-)

100
200
300

0
HUS

Ioduro deHC
propidio
NC
Vivas

UC

*
2,7 %

31,9 %
mild HUS

severe HUS

Vivas Anexina V
% cells ANN+/PI-
% cells ANN+/PI+
0
100
200

0
100
300
400
10,2 %

HUS
HUS
sis

HC
HC
tardía
Apopto
*

20,1200% temprana
Apoptosis

NC NC

UC UC
Apoptosis temprana

*
*
Apoptosis tardía

mild HUS mild HUS

severe HUS
severe HUS
 Correlación entre estado funcional de los
PMN y la severidad
SUH

Sanos Leves Moderados Graves Correlación

Nº PMN 3.8±0.38. 8.7±0.9* 10.4±1.2* 15.3±1.2*# *r=0.6,
(x109/L) p=0.001
CD16 151.1±16.4 55.0±8.3* 60.8±10.1* 39.8±7.0* No correl.

CD11b 184.0±26.1 124.1±19.2* 80.1±11.2* 62.3±7.9*§ -0.37,p=0.01

CD66b 184.6±32.31 156.8±16.5 81.2±15.9*§ 103.3±13.8* -0.35,p=0.01

Mieloperox 166.7±24.0 160.3±23.0 99.3±17.1§ 96.0±19.3*§ -0.51,p=0.01
IROs 99.0±10.1 113.6±21.7 123.3±34.0 37.7±17.4*§ -0.51,p=0.01
% apoptosis 54.6±3.3 45.7±4.2 41.05±16.5 25.1±2.9*§ -0.51,p=0.01

*p<0.05 vs sanos; §p<0.05 vs leves

 El otro componente celular inflamatorio: los monocitos???
•Datos previos:
•Niveles aumentados de citoquinas derivadas de los monocitos (Mo) en
suero y orina de pacientes con SUH.
*La Stx in vitro induce la síntesis de IL-1β, TNF, IL-6, e IL-8 por Mo.
• La eliminación de macrófagos hepáticos y esplénicos disminuye la
toxicidad de la Stx2 en ratones.
A
Sanos SUH IC UC
CD
14

CD16 1800

IMF del CD14 en Mo CD16+

1600 *
40 1400
% of CD16+ cells

25 250
Spearman r=-0,66 # 1200

IMF del CD16 en Mo CD16+

30 p<0,01
20 200 1000
% Mo CD16+

* # #
20 * 800
15 **
150
*
** 600
10
10 100 400
0 200
5 50
0 1 2 3 4 5 6 0

SUH PA

SUH rec

UC
SC

NC
Time elapsed since the 0 0

SUH PA

SUH rec

UC
SC

NC
acute period (months) SC SUH SUH NC UC
PA rec

Los Mo de los pacientes con SUH muestran signos de haber recibido un

estímulo activante previo, el cual los ha diferenciado hacia un perfil o
“subset inflamatorio”
Fernandez et al. Differential expression of function-related antigens on blood monocytes in
children with Hemolytic Uremic Syndrome. J. Leuk. Biol. In press.
 Porqué es el riñón el principal órgano afectado??

Fractalquina: CX3CL1
* La expresión de fractalquina y la presencia de células que expresan su
receptor (CX3CR1) en el riñón ha sido demostrado en pacientes con varios
tipos de nefropatias.
* En modelos animales, el tratamiento con anti-CX3CR1 bloquea la
infiltración de leucocitos en el glomérulo y mejora la función renal.

Fractalquina expresada sobre el endotelio inflamado

podría potenciar el daño vascular, capturando células
citotóxicas circulantes que expresan el CX3CR1.
 Poblaciones Leucocitarias en sangre periférica
que expresan el CX3CR1
PMN

Monocitos
Linfocitos y NK

Control de isotipo Niños sanos Niños con SUH

SSC

CX
12%
3CR1 3%

CX3CR1
16
14

Leucocitos que expresan el CX3CR1 incluyen:

% C X 3 C R 1 + ce lls
12
10
monocitos, células NK y un subset de células 8

T citotóxicas 6
4

Todas estas poblaciones tiene un alto

2
0

potencial citotóxico HC HUS UC NC

 Cambios en la poblaciones positivas para CX3CR1
Monocitos Células NK
100
90 HUS AP 20
80
HC

% CD3- CD56+
70 15
60 *
*
%

50 10
40
*
30 * 5
20
10 0
0 HC HUS UC IC
CXC-/16+ CXC+/16+ CXC-/16- CXC+/16-

CD56bright
CD16-
14 CX3CR1-
12
CD56 dim
% CD3-CD56 Dim

4,0
10
3,5

8 CD16+ 3,0

6
CX3CR1+
2,5
*
4 2,0

1,5
2
1,0
0
0,5

HC HUS UC IC 0,0

HC HUS UC IC
La expresión aumentada de fractalquina en el riñón y la específíca
disminución de los leucocitos circulantes positivos para este
receptor, sugiere que esta quimioquina podría participar en la
patogénesis del SUH, favoreciendo la adhesión al endotelio y
epitelio, y potenciando el daño iniciado por la toxina Stx2.
 Papel de la respuesta inflamatoria en la toxicidad de la Stx.

PMN Activation
PMN degranulation, ROS release

Daño Endotelial
Monocyte activation
Stx-direct mechanism:
IL-8 Inhibition of protein sinthesis
TNF-α 2- Endothelial Activation
IL-1⠁ P y E-selectinas e ICAM Stx-indirect mechanism:
IL-8 secretion, FKN induction Mediated by activated PMN, Mo
TNF-α 1- GB3 induction and NK
IL-1β
Endothelium

Subendotelium
 La intensidad o tipo de respuesta inflamatoria
durante el prodromo, tendría un papel activo
en la evolución de la enfermedad
Infección con E. coli productora de Stx

Diarrea no sanguinolenta

Papel de la
Respuesta Diarrea sanguinolenta (90%)
Inflamatoria?
?

SUH (10%)
 Servicios de nefrología
División Inmunología
Lic Leticia Bentancor
Lic María Victoria Ramos
Bioq. Romina Fernández Brando
Dra. Gabriela Fernández
Dra. Graciela Dran
Gabriela Camerano
Dr. Martín Isturiz
Departamento de Patología.
Dr. Roberto Meiss
Dr. Ramón Exeni
Dra. Irene Grimoldi
Dra. Marta Alduncín
Dr. Mario Diaz
Dra. Laura Lopez
Dra. Flavia Ramirez
Dra. Graciela Vallejo
Dra. Christian Elias-Costa
MUCHAS GRACIAS!!!