Análise espectrofotométrica como alternativa à metodologia Kjeldahl

UNIVERSIDADE FEDERAL
FACULDADE DE ENGENHARIA QUMICA

CURSO DE GRADUAO EM ENGENHARIA QUMICA
ANLISE ESPECTROFOTOMTRICA COMO ALTERNATIVA
METODOLOGIA KJELDAHL PARA DETERMINAO DO TEOR DE
NITROGNIO EM AMOSTRAS DE TECIDO VEGETAL

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLNDIA


LORENA MENDES DE SOUZA

Uberlndia MG
2012
DE UBERLNDIA


UNIVERSIDADE FEDERAL


UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLNDIA


Lorena Mendes de Souza

Monografia de graduao
Universidade Federal de Uberlndia como
parte dos requisitos necessrios
aprovao na disciplina de Trabalho de
Concluso de Curso do curso de
Qumica

Uberlndia MG
2012

DE UBERLNDIA

raduao apresentada
Universidade Federal de Uberlndia como
parte dos requisitos necessrios para a
aprovao na disciplina de Trabalho de
Concluso de Curso do curso de Engenharia

FICHA CATALOGRFICA

(Coloca-se na parte inferior da pgina e do lado direito)

MEMBROS DA BANCA EXAMINADORA DA MONOGRAFIA DA DISCIPLINA
TRABALHO DE CONCLUSO DE CURSO DE LORENA MENDES DE SOUZA
APRESENTADA UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLNDIA, EM (DATA).

BANCA EXAMINADORA

____________________________________________
Prof. ...............................................
Orientador (FEQ/UFU)

____________________________________________
Prof. .............................................
FEQ/UFU

____________________________________________
Prof. .............................................
FEQ/UFU
DEDICATRIA

Dedico este trabalho minha me Nilma Mendes de Souza
AGRADECIMENTOS

Agradeo a Deus, que me deu fora e garra para superar todas as dificuldades enfrentadas
ao longo deste curso, bem como me proporcionou alegrias e bnos imensurveis.

Agradeo ao meu pai Adalberto e em especial minha me Nilma, pelo apoio, credibilidade,
amor e dedicao, pelos ensinamentos valiosos e por terem me dado a oportunidade de
cursar e me formar no curso de Engenharia Qumica.

Ao meu irmo Diego, pelo exemplo maravilhoso de dedicao, pelos ensinamentos e apoio.
Ao meu irmo Thiago e sobrinha Yasmin pelo carinho de todos os momentos. minha irm
Loyane pelo companheirismo inestimvel, pelo apoio nos estudos, enfim por enfrentar
comigo, com muita f, perseverana e convico, a mesma batalha.

Ao meu namorado Heitor pela compreenso, companheirismo, confiana e principalmente
pelo carinho e pacincia.

A todos os membros da EMBRAPA arroz e feijo, pelo suporte e por viabilizar a realizao
deste trabalho. Agradeo em especial ao Iv Matsushige, supervisor do Laboratrio de
Anlises Agroambientais e ao analista Diego Mendes de Souza pelo ensinamento e pacincia
no Laboratrio.

Ao Prof. Elozio Jlio Ribeiro pela credibilidade depositada em mim, credibilidade esta que
foi fundamental para realizao deste trabalho.

A todos os professores da Faculdade de Engenharia Qumica da Universidade Federal de
Uberlndia por transmitirem muita sabedoria, sendo assim, essenciais para o meu
crescimento pessoal e profissional. Agradeo em especial ao Prof. Lus Cludio Oliveira
Lopes por me acompanhar desde o incio da faculdade, me orientando, ensinando e
contribuindo para minha formao.

Aos meus colegas que compartilharam comigo seus conhecimentos.

A todos aqueles que de alguma forma contriburam ou torceram pela concretizao deste
projeto.

EPGRAFE

O conhecimento chega, mas a sabedoria demora." (Alfred Tennyson)
SUMRIO

LISTA DE FIGURAS ................................................................................................................. i
LISTA DE TABELAS ............................................................................................................... ii
LISTA DE SMBOLOS ............................................................................................................ iii
RESUMO .................................................................................................................................. iv
ABSTRACT ............................................................................................................................... v
1- INTRODUO ..................................................................................................................... 1
2- REVISO BIBLIOGRFICA ............................................................................................... 4
2.1- Bioqumica Vegetal .......................................................................................................................4
2.2- Amostragem Vegetal.....................................................................................................................4
2.3- Preparao das amostras para anlise qumica ............................................................................5
2.4- Destruio da matria orgnica ....................................................................................................6
2.4.1- Digesto mida ........................................................................................................ 7
2.5- Mtodo Kjeldahl para determinao de Nitrognio .....................................................................8
2.5.1- Fundamentos da titulao ......................................................................................... 8
2.5.2- O mtodo Kjeldahl ................................................................................................... 9
2.6- Mtodo espectrofotomtrico para determinao de Nitrognio ............................................. 10
2.6.1- Fundamentos da espectrofotometria....................................................................... 10
2.6.2- Lei de Lambert-Beer na espectrofotometria........................................................... 11
2.6.3- Instrumentao analtica na espectrofotometria ..................................................... 12
2.6.3.1- Fontes de Radiao ............................................................................................. 12
2.6.3.2- Monocromadores ................................................................................................ 13
2.6.3.3- Cubetas ................................................................................................................ 14
2.6.4- O mtodo espectrofotomtrico baseado na reao de Berthelot ............................ 14
2.7- Validao de um mtodo analtico ............................................................................................ 16
2.7.1- Especificidade/Seletividade ................................................................................... 17
2.7.2- Faixa de trabalho .................................................................................................... 17
2.7.3- Linearidade ............................................................................................................. 18
2.7.4- Sensibilidade .......................................................................................................... 18
2.7.5- Exatido .................................................................................................................. 18
2.7.6- Preciso .................................................................................................................. 19
2.7.7- Teste de decomposio dos reagentes .................................................................... 20
2.7.8- Teste de estabilidade da colorao ......................................................................... 20
2.7.9- Limite de Deteco (LD)........................................................................................ 20
2.7.10- Limite de quantificao (LQ) ............................................................................... 21
2.8- Estatstica ................................................................................................................................... 21
2.8.1- Importncia da estatstica ....................................................................................... 21
2.8.2- Testes estatsticos ................................................................................................... 22
2.8.2.1- Teste de Hipteses ............................................................................................... 22
2.8.2.2- Teste F para comparao de varincias ............................................................. 23
2.8.2.2- Teste T para comparao de mdias................................................................... 24
2.9- Gerenciamento de Resduos gerados em Laboratrios ............................................................. 26
3- METODOLOGIA ................................................................................................................ 27
3.1- Amostragem ............................................................................................................................... 27
3.2- Preparao das amostras para anlise qumica ......................................................................... 27
3.3- Lavagem e descontaminao de vidrarias ................................................................................. 27
3.4- O mtodo Kjeldahl ..................................................................................................................... 27
3.4.1- Insumos, equipamentos e utenslios ....................................................................... 27
3.4.2- Digesto mida para o mtodo Kjeldahl ................................................................ 29
3.4.3-Destilao ................................................................................................................ 29
3.4.4- Titulao ................................................................................................................. 30
3.5- O mtodo espectrofotomtrico baseado na reao de Berthelot ............................................ 30
3.5.1- Insumos, equipamentos e utenslios ....................................................................... 30
3.5.2- Preparo de solues ................................................................................................ 31
3.5.3- Digesto mida para o mtodo espectrofotomtrico baseado na reao de Berthelot
.......................................................................................................................................... 33
3.5.4- Diluio intermediria ............................................................................................ 35
3.5.5- Leitura das amostras ............................................................................................... 36
3.6- Validao .................................................................................................................................... 36
3.6.1- Teste de Especificidade .......................................................................................... 36
3.6.2- Faixa de trabalho/Teste de Linearidade/Teste de Sensibilidade ............................ 36
3.6.3- Teste de Exatido/Teste de Preciso ...................................................................... 37
3.6.4- Teste de decomposio dos reagentes .................................................................... 37
3.6.5- Teste da estabilidade da colorao ......................................................................... 37
3.6.6- Limite de deteco e Limite de quantificao ........................................................ 38
3.6.7- Comparao de Mdia e Varincia ........................................................................ 38
3.7- Tratamento dos resduos gerados pelas anlises qumicas ....................................................... 38
3.7.1- Tratamento de resduos contendo cobre ................................................................. 38
3.7.2 Tratamento de resduos contendo selnio ................................................................ 38
4- RESULTADOS E DISCUSSO ......................................................................................... 39
4.1- Reagentes utilizados nos mtodos ............................................................................................ 39
4.2- Digesto mida .......................................................................................................................... 39
4.3- Validao do mtodo ................................................................................................................. 40
4.3.1-Teste de especificidade............................................................................................ 40
4.3.2- Faixa de trabalho, linearidade e sensibilidade ........................................................ 42
4.3.3- Teste de Exatido ................................................................................................... 43
4.3.4- Teste de Preciso .................................................................................................... 44
4.3.5- Teste de Decomposio dos reagentes ................................................................... 45
4.3.6- Teste da estabilidade da colorao ......................................................................... 47
4.3.7- Limite de Deteco e Limite de Quantificao ...................................................... 48
4.3.8- Comparao de mdia e varincia .......................................................................... 49
4.4-Tratamento dos resduos gerados pelas anlises qumicas ........................................................ 50
4.4.1- Tratamento de resduos contendo cobre ................................................................. 50
4.4.2- Tratamento de resduos contendo selnio .............................................................. 51
5- CONCLUSES .................................................................................................................... 51

I

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Principais componentes de um espetrofotmetro .................................................... 12
Figura 2- Monocromador prismtico ........................................................................................ 14
Figura 3- Destilador de Nitrognio Marconi MA-036 ............................................................. 29
Figura 4- Preparao do reagente R1 ....................................................................................... 32
Figura 5- Pesagem das amostras em papel livre de Nitrognio ................................................ 33
Figura 6- Sais catalisadores da digesto ................................................................................... 33
Figura 7- Digesto das amostras em bloco digestor ................................................................. 34
Figura 8- Diferena da amostra na primeira hora da digesto e ao trmino da digesto.......... 35
Figura 9- Adio dos reagentes R1 e R2. ................................................................................. 35
Figura 10- Espectrofotmetro HACH DR2800 ........................................................................ 36
Figura 11- Curva padro e absorbncia do padro de 100 ppm de amnio sem e com possveis
interferentes. ............................................................................................................................. 41
Figura 12- Faixa de trabalho testada......................................................................................... 42
Figura 13- Linearidade e sensibilidade do mtodo ................................................................... 43
Figura 14- Curva padro com R1 e R2 novos .......................................................................... 45
Figura 15- Curva padro com R1 velho e R2 novo .................................................................. 46
Figura 16- Curva padro com R1 e R2 velhos ......................................................................... 47
Figura 17- Colorao dos padres ............................................................................................ 47
Figura 18- Evoluo da absorbncia ao longo do tempo.......................................................... 48

II

LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Quantidade mxima de minerais presentes no extrato e quantidade mxima testada
pela HACH. .............................................................................................................................. 40
Tabela 2- Absorbncia do padro de 100 ppm de amnio sem e com possveis interferentes. 41
Tabela 3- interferncia mxima na leitura. ............................................................................... 41
Tabela 4- Teor de nitrognio na amostra certificada obtido pelos mtodos avaliados ............. 43
Tabela 5- Erro relativo dos mtodos em relao ao valor certificado ...................................... 44
Tabela 6- Mdia, desvio padro e coeficiente de variao das anlises obtidas ...................... 44
Tabela 7- Coeficiente de variao mdio das anlises ............................................................. 45
Tabela 8- Absorbncia dos brancos .......................................................................................... 49
Tabela 9- Limite de Deteco e Limite de Quantificao ........................................................ 49
Tabela 10- Teste de comparao de varincia e mdia ............................................................ 50

III

LISTA DE SMBOLOS

A- absorbncia
- Nvel de significncia
c- concentrao do material absorvedor [ML
-3
]
CV-coeficiente de variao
DPa- desvio padro do intercepto com o eixo do Y [ML
-3
]
DPb- desvio padro do branco [ML
-3
]
DPR- desvio padro relativo
- absorvidade molecular ou coeficiente de extino [L
2
M
-1
]
Gerelab- Gerenciamento dos resduos slidos
io- intensidade de luz incidindo na soluo [Cd]
i- Intensidade da luz saindo da soluo [Cd]
l- espessura da amostra da amostra atravs da qual a luz passa [L]
L.A.A- Laboratrio de Anlises Agroambientais
LD- limite de deteco
LQ- limite de quantificao
- Comprimento de onda [L]
- mdia populacional [ML
-3
]
t
95%
- valor tabelado de t de student para n amostras (95% de confiana)
S- sensibilidade do aparelho
- desvio padro populacional [ML
-3
]
T- transmitncia

IV

RESUMO

O termo nitrognio total de Kjeldahl (Ntk) refere-se ao nitrognio orgnico presente em uma
determinada amostra e sua determinao consiste basicamente na converso de toda forma
nitrogenada a amnio que por sua vez pode ser detectado por diferentes mtodos, tais como,
titulao, potenciometria e espectrofotometria. Determinar este elemento em amostras de
tecido vegetal tem inestimvel importncia j que o mesmo est intimamente ligado ao
metabolismo de aminocidos e protenas envolvendo processos enzimticos e assimilaes
atravs de reaes de oxireduo (Dougall & Estaba, 1980). O mtodo mais utilizado para
esta anlise o mtodo de Kjeldahl, proposto pelo dinamarqus Johan Gustav Kjeldahl em
1883 que determina o Nitrognio orgnico total, isto , o nitrognio proteico e o nitrognio
no proteico, porm orgnico. Tal mtodo baseia-se na digesto sulfrica de uma amostra sob
alta temperatura, o amonaco ento liberado e destilado com hidrxido de sdio (NaOH),
logo em seguida titulado com uma soluo cida padro. A simplicidade deste mtodo
torna-o muito empregado em anlises de diferentes amostras, contudo o mtodo lento e a
operacionalidade do mesmo, no Laboratrio de Anlises Agroambientais (LAA) da
EMBRAPA arroz e feijo, ainda questionvel j que o laboratrio disponibiliza-se de
apenas um destilador. Alm disso, h uma grande quantidade de solicitaes de anlise de
Nitrognio total no LAA. Em 2011, o laboratrio recebeu cerca de 4000 solicitaes sendo
que apenas 2500 destas foram realizadas no mesmo ano. Neste contexto, o objetivo deste
trabalho o ajuste da anlise espectrofotomtrica, baseada na reao de Berthelot como
alternativa metodologia de Kjeldahl para determinao do teor de nitrognio em amostras de
tecido vegetal. Tal mtodo, que sobretudo mais operacional na rotina do laboratrio, foi
validada e comparada com a metodologia Kjeldahl.

Palavras-chave: Nitrognio, tecido vegetal, mtodo Kjeldahl, mtodo espectrofotomtrico.

V

ABSTRACT

The term total Kjeldahl nitrogen (TKN) refers to organic nitrogen present in a given sample
and the determination basically consists in the conversion of the ammonium nitrogen form
throughout which in turn can be detected by various methods, such as titration, potentiometry
and spectrophotometry. Determine this element in samples of plant tissue has inestimable
importance since it is closely linked to the metabolism of amino acids and proteins and
enzymatic processes involving assimilation through reactions oxireduo (Estaba & Dougall,
1980). The method used for this analysis is the Kjeldahl method, proposed by Danish Gustav
Johan Kjeldahl in 1883 that determines the total organic nitrogen, ie nitrogen protein and non-
protein nitrogen, but organic. This method relies on digestion sulfuric a sample under high
temperature, ammonia is then released and distilled with sodium hydroxide (NaOH) is then
immediately titrated with a standard acid solution. The simplicity of this method makes it
widely used in analyzes of different samples, but the method is slow and operability of the
same in AE Analytical Laboratory (AAL) EMBRAPA rice and beans, is still questionable
since the lab is available only a distiller. In addition, there are a lot of requests for analysis of
total nitrogen in the LAA. In 2011, the lab received about 4000 requests and only 2500 of
these were made in the same year. In this context, the objective of this work is the setting of
spectrophotometric analysis, based on the Berthelot reaction as an alternative to the Kjeldahl
method for determining nitrogen content in samples of plant tissue. This method, which is
more particularly operating in routine laboratory was validated and compared with the
Kjeldahl method.

Keywords: Nitrogen, plant tissue, Kjeldahl method, spectrophotometric method
1

1- INTRODUO
O desenvolvimento ou aprimoramento de mtodos para determinao de nitrognio
total em materiais vegetais torna-se necessrio devido importncia do controle deste
nutriente, em funo principalmente de seu papel no metabolismo de aminocidos e protenas
envolvendo processos enzimticos e assimilaes atravs de reaes de oxireduo.
(DOUGALL; ESTABA, 1980)
O Nitrognio um importante componente quanto s funes no metabolismo das
plantas, participando como constituinte de molculas de protenas, coenzimas, cido
nucleicos, citocromos, clorofila etc. (FERREIRA et al, 2001). Alm disso, um dos nutrientes
mais relevantes para o aumento da produo, pois est diretamente associado atividade
fotossinttica, aos processos de multiplicao e expanso celular, bem como fixao de
vagens e ao enchimento dos gros.
Quando ocorre na planta em nveis inferiores a 2,8% ou superiores a 6,0%, podem
ser desencadeados estados de deficincia ou toxidez, respectivamente. A deficincia de
nitrognio ocorre principalmente, em solos arenosos e lixiviados, com baixo teor de matria
orgnica (< 2 %). Em solos frteis, quando cultivados intensamente, fortemente lixiviados ou
inundados por tempo prolongado, tambm pode ocorrer deficincia de nitrognio. Essa
deficincia tambm pode ser verificada como consequncia de aplicao excessiva de
fertilizantes fosfatados. Podem ocorrer em plantas deficientes de nitrognio: amarelecimento
das folhas, iniciando-se pelas mais velhas; crescimento reduzido; baixa produo de ramos e
botes florais; menor pegamento de vagens, reduo no tamanho das sementes e
consequentemente, baixa produtividade e qualidade inferior de gros conforme MANUAL
EMBRAPA RONDNIA (2005).
O nitrognio altera-se entre vrias formas e estados de oxidao, sendo as de maior
interesse, em ordem decrescente do estado de oxidao, nitrato (NO
3-
), nitrito (NO
2-
), amnia
(NH
3
ou NH
4
+
) e nitrognio orgnico (dissolvido ou em suspenso).
Nitrognio orgnico inclui matria natural (protenas, peptdeos, cidos nucleicos,
ureia) e numerosos compostos orgnicos sintticos. A amnia est naturalmente presente em
guas superficiais e guas residurias e esta produzida largamente pela amonificao de
nitrognio orgnico e pela hidrlise da ureia. Nitrato e nitrito so formas oxidadas, sendo que
o nitrato geralmente ocorre em pequenas quantidades em guas superficiais, mas podem
alcanar altos nveis em algumas guas subterrneas. Nitrito um estado de oxidao
2

intermedirio do nitrognio, obtido tanto da oxidao da amnia a nitrato como da reduo do
nitrato. (KRAMER, 2009)
A maioria dos mtodos para determinao de nitrognio total requer a transformao
de todas as formas nitrogenadas a amnio e, neste contexto, o mtodo Kjeldahl de digesto
desenvolvido em 1883 tem sido o mais utilizado para a anlise de materiais vegetais. (JONES,
1987).
vlido ressaltar que a metodologia de Kjeldahl detecta no apenas o nitrognio
proteico de uma amostra, mas tambm o nitrognio orgnico de fonte no proteica.
Entretanto, na maioria dos alimentos este ltimo muito pequeno em relao ao proteico, o
que no confere grandes desvios ao teor real de nitrognio presente na amostra.
ons amnio podem ser quantificados por potenciometria (SHEN et al., 1997),
titulao (OHLWEILER, 1976) ou espectrofotometria utilizando reagente de Nessler
(DORICH; NELSON, 1983), salicilato de sdio (BREMNER; MULVANEY, 1982), etc, em
procedimentos que frequentemente requerem etapas de difuso gasosa ou destilao.
H tambm metodologias a seco para determinao de nitrognio presente em uma
amostra de tecido vegetal, como o caso da metodologia Dumas, proposta por Jean-Baptiste
Dumas, que um processo oxidativo seco que determina nitrognio de uma amostra aps a
combusto da mesma.
Ambos os mtodos so utilizados atualmente na rotina do laboratrio de anlises
agroambientais da EMBRAPA arroz e feijo, localizada no municpio de Santo Antnio de
Gois-GO. Porm, o alto custo de manuteno do analisador elementar utilizado no mtodo
Dumas e a falta de operacionalidade da metodologia Kjeldahl, tendo em vista o processo ser
relativamente lento faz com que alternativas a essas metodologias sejam ajustadas ao
laboratrio.
Durante a realizao deste trabalho foi ajustado o mtodo espectrofotomtrico
baseado na reao de Berthelot para determinao de Nitrognio total em amostras de tecido
vegetal. A operacionalidade, a mdia das concentraes de nitrognio bem como a preciso
do mtodo foi comparada com a metodologia padro Kjeldahl.
As anlises da validao foram feitas em amostras de feijo, arroz e braquiria
(Brachiaria sp.) j que o L.A.A de qumica de plantas da EMBRAPA arroz e feijo realiza,
principalmente, em sua rotina laboratorial, anlises de teor mineral em amostras de arroz e
feijo. Alm destes dois, a braquiria tambm foi escolhida para as anlises da validao
porque esta apresenta maior dificuldade de extrao dos seus elementos, devido ao seu alto
teor de lignina. Assim, possvel inferir que se a braquiria consegue ser oxidada na etapa de
3

digesto do mtodo validado neste trabalho, grande parte das outras amostras de tecido
vegetal tambm podero ser analisadas por este.
A anlise de nitrognio em feijo tem grande importncia principalmente porque este
uma leguminosa produtora de frutos ricos em protena. Pelo fato desta tamanha importncia
do feijo na alimentao, h grandes necessidades de se fazer adubao nitrogenada nas
culturas j que o nitrognio um nutriente com deficincia freqente em leguminosas,
sobretudo nos feijoeiros.
Em arroz, faz-se de grande valia determinar a quantidade de nitrognio, j que a
protena do arroz a mais nobre entre os cereais. A frao proteica do arroz, embora
quantitativamente pequena, apresenta a melhor composio de aminocidos para o
metabolismo humano (entre os cereais). Quando metabolizado, gera menos resduos
nitrogenados, favorecendo a funo renal de filtragem desses catablitos.
A braquiria foi introduzida no Brasil h mais de 50 anos e atualmente possui grande
relevncia econmica, devido aos seus usos como forragem animal, cobertura e adubo verde
em sistemas de produo vegetal. Sua importncia na nutrio animal pode ser avaliada
atravs das estimativas da rea sob pastagem de braquirias no Brasil, as quais j atingiam ao
redor de 85 milhes de ha em 2002 (SOUZA et al., 2012). Assim, faz-se importante
determinar o teor de nitrognio presente em amostras de braquiria tendo em vista sua
importncia na nutrio animal, bem como sua caracerstica peculiar de apresentar grande teor
de lignina.
A anlise de nitrognio em rotinas de laboratrio serve como fonte de determinao
do teor bruto de protena em uma amostra. Assim, em amostras de tecido vegetal determina-se
o teor bruto de protena a partir do nitrognio total multiplicado por um fator de correo 6,25
(GALVANI, 2008).
Para realizao das anlises, recomenda-se escolher laboratrios idneos, que
participam de programas de controle de qualidade, os quais divulgam anualmente aqueles
com padres desejveis de qualidade. O Laboratrio de Anlises Agroambientais do Centro
Nacional de Pesquisa de Arroz e Feijo da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria
(EMBRAPA), em Gois, onde foi realizado este trabalho, certificado pelo Programa
Interlaboratorial de Anlise de Tecido Vegetal (PIATV).
4

2- REVISO BIBLIOGRFICA
2.1- Bioqumica Vegetal
Na natureza vrios elementos esto disponveis s plantas, porm uma simples
anlise qumica de um vegetal no capaz de determinar quais destes elementos so
essenciais, pois a planta pode absorver e armazenar em seus tecidos muitos elementos que no
lhe so essenciais. necessrio determinar os nutrientes de acordo com um critrio de
essencialidade.
A maneira mais comum de se determinar a essencialidade de um elemento s plantas
atravs de experimentos com solues nutritivas preparadas com gua e sais purificados.
Assim, pode-se omitir os elementos da soluo um a um, podendo ser classificados como
essenciais os que atendam aos seguintes critrios (MALAVOLTA et al., 2006): Na ausncia
do elemento a planta no cresce normalmente nem completa o seu ciclo de vida, ou seja, no
se desenvolve corretamente e no se reproduz; o elemento insubstituvel, ou seja, deficincia
s pode ser corrigida atravs do seu fornecimento e no de algum outro e o ltimo critrio
estabelece que o elemento qumico faz parte de uma molcula, de um constituinte ou de uma
reao bioqumica essencial planta.
Para classificar os elementos essenciais, dividem-se estes em dois grandes grupos:
macronutrientes e micronutrientes. O primeiro refere-se aos elementos bsicos necessrios em
maior volume s plantas: carbono, oxignio, nitrognio, fsforo, potssio, clcio, magnsio e
enxofre. O segundo refere-se aos elementos requeridos em pequenas quantidades pela planta:
boro, cloro, cobre, ferro, mangans, molibdnio, cobalto, nquel e zinco.
Quando um elemento essencial est disponvel em quantidades insuficientes ou em
combinaes qumicas que so dificilmente absorvidas, a deficincia deste elemento
provocar desarranjos nos processos metablicos da planta. Muitas vezes esse distrbio
demonstrado por sintomas visveis, como desenvolvimento lento, amarelecimento e outras
anormalidades. A intensidade desses sintomas dependente do elemento em falta, da espcie
ou variedade da planta e de fatores ambientais.( EPSTEIN; BLOMM, 2006)
2.2- Amostragem Vegetal

5

A anlise dos minerais presentes em amostras de tecido vegetal uma das tcnicas
utilizadas para a verificao do estado nutricional das plantas. A coleta de tecido para
anlise deve ser feita, portanto, de forma adequada e representativa, j que os nutrientes
no existem nas diversas partes da planta em quantidades iguais, alternando de acordo com a
idade da planta e a variedade considerada. Os resultados da anlise foliar somente sero
eficientes se a amostragem for bem feita e representativa da lavoura. (VELOSO et al., 2004)
Havendo suspeita de alguma deficincia nutricional, deve-se coletar separadamente
o tecido de plantas com e sem sintomas. Segundo a COMISSO DE QUMICA E
FERTILIDADE DO SOLO (2004), na maior parte dos casos a concentrao de
nutrientes em folhas completamente expandidas de plantas a melhor indicao do seu
estado nutricional, refletindo a condio de fertilidade do solo.
As amostras so geralmente colhidas quando as culturas esto em pleno crescimento
vegetativo e o rgo colhido, em geral, a folha recm madura. Mas, em condies eventuais,
analisa-se pores do caule ou ramos. Como a composio de diferentes partes das plantas
heterognea, bem como o estgio de crescimento influi na concentrao de nutrientes, h
necessidade no s de estabelecer as partes das plantas que devem ser amostradas, mas
tambm, a melhor poca. Devido a essas variaes, a amostragem deve ser feita de acordo
com as recomendaes indicadas, para o sucesso da diagnose foliar.
Estudos realizados por MALAVOLTA et al. (1997) indicam diferentes
metodologias para amostragem de diferentes espcies vegetais. Em seu trabalho, ele
predefiniu a parte da planta a ser amostrada, bem como a idade, poca, posio e nmero de
folhas e plantas a serem amostradas para cada cultura vegetal.
2.3- Preparao das amostras para anlise qumica
O sucesso da anlise qumica de tecido vegetal em laboratrio depende, em grande
parte, do procedimento de coleta do material e do tempo decorrido entre a coleta e a chegada
deste no laboratrio de anlise. Recomenda-se que esse tempo seja o mais breve para que os
processos de respirao e de decomposio do vegetal no venham comprometer os
resultados da anlise. O ideal seria que a amostra chegasse ao laboratrio no mesmo dia da
coleta, acondicionada em saco plstico para transporte a baixa temperatura ou em sacos de
papel. Ao chegar no laboratrio, as amostras devem ser registradas e identificadas.
O preparo de amostras de tecido vegetal para anlise qumica consiste em quatro
operaes unitrias: lavagem, secagem, moagem e peneiramento. Em resumo, a lavagem
consiste na eliminao de qualquer contaminante do tecido vegetal, seja solo, pesticida ou
6

adubos foliares; a secagem consiste na eliminao ou reduo significativa da gua livre
(umidade) e estabilizao enzimtica da amostra e a moagem a reduo da granulometria do
tecido vegetal seco para facilitar a extrao dos minerais presentes neste tecido e o
peneiramento uma homogeneizao da dimenso do material modo.
Inicialmente, deve-se fazer a descontaminao do tecido vegetal atravs da lavagem,
eliminando folhas ou outros componentes vegetais que estejam secos, murchos ou
deteriorados. Deve-se lavar com soluo de detergente antes de seguir para a lavagem
convencional tecidos contendo resduos de pesticias ou adubos. importante ressaltar que as
lavagens devem ser feitas rapidamente, pois existe a possibilidade de perdas por solubilizao
de nitrato, boro, potssio e cloreto. (SILVA, 1999).
Aps a lavagem, deve-se realizar a secagem em que a umidade da amostra dever ser
removida por volatilizao, causada por secagem ao calor ou a frio. Em casos de secagem em
estufas, deve-se haver um sistema de circulao forada de ar, com temperatura variando de
65-70 C, at peso constante (aproximadamente 72h). A percentagem da amostra que sobra
aps a remoo desta umidade conhecida como percentagem de matria seca ou matria
parcialmente seca. O objetivo deste procedimento obter matria seca do material coletado.
O prximo passo a moagem da amostra seca que feita, geralmente, em moinhos
de facas de ao inoxidvel, tipo Willey, passando em peneira de 1 mm de malha (20 mesh)
para que os grnulos tenham tamanhos mais homogneos possveis. importante ressaltar a
importncia da limpeza do moinho entre uma amostra e outra que evita a contaminao das
amostras. As amostras modas devem ser preferencialmente armazenas em frasco com tampa
rosquivel, a fim de evitar a umidificao. Alm disto a amostra pode ser armazenada por
longo perodo de tempo se mantida a baixa temperatura, protegida da luz e de umidade.
(FAQUIN, 2002)
2.4- Destruio da matria orgnica
Poucas amostras podem ser analisadas sem a necessidade de alteraes fsicas ou
qumicas. Na maioria dos instrumentos empregados em anlises qumicas, preciso que o
analito esteja dissolvido em gua ou em algum solvente. Para isso existem os mtodos onde
ocorre a destruio da matria orgnica por via mida: digesto mida em bloco digestor e
digesto mida em forno microondas; outro mtodo de obteno do analito dissolvido o
mtodo extrativo atravs da solubilizao em HCl 1mol.L
-1
, em que no ocorre destruio da
matria orgnica, apenas solubilizao dos elementos em cidos com o auxlio de calor e
agitao.
7

Alm destes mtodos, existe a destruio da matria orgnica atravs da digesto
seca em que o material vegetal submetido a uma mufla a temperatura de 500 a 550C por 4
a 8 horas. Nesse processo a matria orgnica destruda (oxidada) pela ao do calor. As
cinzas restantes so solubilizadas em cidos diludos. (KARLA, 1998)
Nos mtodos estudados neste trabalho: Mtodo Kjelhdal e mtodo
espectrofotomtrico baseado na reao de Berthelot, ambos para determinao de nitrognio
em amostras de tecido vegetal, a digesto das amostras so realizadas via mida.
2.4.1- Digesto mida
A caracterstica bsica da digesto mida a decomposio das plantas (matria
orgnica) em cidos ou misturas de cidos, com ou sem gua oxigenada. Para isso utiliza-se
blocos digestores para que possa ocorrer a digesto a quente.
Os cidos clordrico, ntrico, perclrico e sulfrico so utilizados individualmente ou
em conjunto. A escolha de qual ou quais cidos utilizar ir depender de caractersticas da
amostra e do que se quer analisar. De uma maneira genrica, no se pode utilizar cido
clordrico na determinao de Cloreto (Cl
-
), porque esse nion constitui o cido; no se utiliza
cido ntrico em determinao de nitrognio. O cido sulfrico recomendado quando se tem
amostras com alto teor de cinzas, pois ele diminui o efeito de respingos.
A mistura nitro-perclrica, cido ntrico e cido perclrico, a mais utilizada.
recomendada para um grande nmero de amostras, tais como: folhas, sementes, razes, caules
e cascas.
Na quantificao de nitrognio em amostras de tecido vegetal, utiliza-se a digesto
mida com cido sulfrico e perxido de hidrognio com o auxlio de um catalisador. Os
catalisadores mais utilizados para acelerar o processo de decomposio da matria orgnica
so o sulfato de cobre, xido de mercrio, xido de cobre, selnio, dentre outros.
A maior limitao da digesto mida o desprendimento de vapores e gases txicos
dentro do laboratrio e salas vizinhas. Geralmente, o sistema de exausto das capelas no so
suficientemente eficientes para evitar que os vapores e gases difundam no interior das salas.
comum, mesmo quando os vapores e gases so eliminados para o exterior atravs de um
eficiente sistema de exausto, os gases e vapores retornarem ao laboratrio e salas prximas
principalmente nos dias de umidade relativa baixa. (MORAES; RABELO, 1986)

8

2.5- Mtodo Kjeldahl para determinao de Nitrognio
2.5.1- Fundamentos da titulao
A determinao da concentrao de um cido ou de uma base atravs da destilao
uma das aplicaes mais importantes de uma reao cido-base. Este procedimento
conhecido como titulao cido base.
Segundo a INFOPDIA (2012), no procedimento citado, adiciona-se uma soluo de
concentrao rigorosa o titulante, que se encontra numa bureta a uma soluo contida num
balo Erlenmeyer de concentrao desconhecida o titulado. A reao processa-se enquanto
houver excesso de cido ou base, ou seja, at que sejam adicionadas quantidades equivalentes
das duas solues. Atinge-se nessa altura o ponto de equivalncia. Do ponto de vista prtico, a
deteo do ponto de equivalncia pode ser feita usando um indicador cido-base apropriado,
que, mudando de cor para um valor de pH, o mais prximo possvel do ponto de equivalncia,
assinala o fim da titulao. No entanto, existem outros processos de deteco como o uso de
um medidor de pH (mtodo potenciomtrico) ou a medio da condutividade eltrica do
titulado (mtodo condutimtrico).
As titulaes de cido-base baseiam-se no pH do titulado que varia ao longo da
titulao, medida que se adiciona o titulante. Essa propriedade, torna de grande importncia,
conhecer o tipo de variao do valor do pH no decurso da reao.
Podem considerar-se quatro tipos de titulaes: cido forte/base forte; cido
fraco/base forte; cido forte/base fraca e cidofraco/base fraca. Numa titulao de um cido
forte com uma base forte, pode concluir-se que no ponto de equivalncia, a 25 C, a soluo
neutra, pelo que o pH da soluo 7. Numa titulao de um cido fraco com uma base forte,
pode concluir-se que no ponto de equivalncia, a 25 C, dada a formao do on OH
-
, o pH do
titulado superior.
Numa titulao de um cido forte com uma base fraca pode concluir-se que no ponto
de equivalncia, a 25 C, dada a formao do on H
3
O
+
, o pH do titulado inferior a 7.
Finalmente, numa titulao de um cido fraco com uma base fraca o valor do pH poder estar
situado na zona cida, bsica ou neutra, dependendo da fora relativa de cada espcie
envolvida.

9

2.5.2- O mtodo Kjeldahl
O mtodo Kjeldahl, proposto por Johan Gustav Kjeldahl um processo oxidativo via
digesto mida em que a amostra aquecida com cido sulfrico at temperaturas elevadas
por algumas horas. Para aumentar a temperatura de ebulio do cido so utilizados sais como
sulfato de potssio-K
2
SO
4
ou sulfato de sdio-Na
2
SO
4
. Alm disso, selnio, cobre ou chumbo
so utilizados como catalisadores promovendo maior velocidade de oxidao da matria
orgnica (BREMMER, 1982).
A utilizao de sais, como o sulfato de sdio ou de potssio, tem como finalidade, a
eliminao de umidade da amostra, para permitir o ataque dos reagentes, esses sais tambm
diminuem a presso de vapor da amostra que est sendo digerida, diminuindo assim sua
temperatura de ebulio, j que para um processo eficiente a digesto acorre a altas
temperaturas chegando a at 500C e o cido sulfrico utilizado que tem ponto de ebulio
300C no pode ser totalmente vaporizado.
Neste processo, carbono e hidrognio so oxidados e o nitrognio reduz-se sulfato
de amnio. Este, por sua vez, convertido amnia na presena de uma base concentrada
(NaOH) segundo as reaes seguintes.

NH
SO
+ 2NaOH

2NH
OH + Na
SO

(1)

NH
OH
NH
+H
O (2)

Em seguida, a amnia desprendida na reao junto a um indicador coletada em um
recipiente contendo cido brico em um processo de destilao. A medida que vai se
formando borato de amnio, segundo a reao a seguir, a soluo passa de uma colorao
rsea para azulada.
H
BO
+NH

NH
BO
(3)
Por fim, o borato de amnio titulado com cido clordrico (HCl) de ttulo
conhecido at o ponto de viragem do indicador, segundo a reao que se segue (GALVANI,
2008).

10

NH
BO
+ HCl

H
BO
+ NH
Cl

(4)
Deste modo, atravs de uma titulao volumtrica cido-base possvel conhecer o
teor de nitrognio inicial presente na amostra.
2.6- Mtodo espectrofotomtrico para determinao de Nitrognio
2.6.1- Fundamentos da espectrofotometria
A espectrofotometria definida como toda tcnica analtica que usa a luz para medir
as concentraes das solues, atravs da interao da luz com a matria. Os mtodos
espectroscpicos baseiam-se na absoro e/ou emisso de radiao eletromagntica por
muitas molculas, quando os seus eltrons se movimentam entre nveis energticos,
permitindo comparar a radiao absorvida ou transmitida por uma soluo que contm uma
quantidade desconhecida de soluto, com uma quantidade conhecida da mesma substncia.
(JONES; ATKINS, 2006)
Esta tcnica baseia-se, portanto, na absoro da radiao nos comprimentos de onda
que corresponde a uma gama de comprimentos de onda que vai desde o ultravioleta ao
infravermelho no espectro da radiao eletromagntica. O espectro visvel est contido
essencialmente na zona entre 400 e 800 nm. A espectrofotometria visvel e ultravioleta so
um dos mtodos analticos mais usados nas determinaes analticas em diversas reas e so
aplicadas para determinaes de compostos orgnicos e inorgnicos, como, por exemplo, na
identificao do princpio ativo de frmacos.
A espectroscopia de absoro molecular valiosa para a identificao dos grupos
funcionais na molcula. Mais importante, entretanto, so as aplicaes da espectroscopia de
absoro visvel/ ultravioleta para a determinao quantitativa de compostos contendo grupos
absorventes.
O espectrofotmetro um aparelho que faz passar um feixe de luz monocromtica
atravs de uma soluo, e mede a quantidade de luz que foi absorvida por essa soluo.
Usando um prisma o aparelho separa a luz em feixes com diferentes comprimentos de onda
(tal como acontece no arco ris com a separao das cores da luz branca). Pode-se assim fazer
passar atravs da amostra um feixe de luz monocromtica (de um nico comprimento de
onda, ou quase) permitindo-nos saber que quantidade de luz absorvida a cada comprimento
de onda. (HARRIS, 1999)
11

Diferentes substncias tm diferentes padres de absoro, a espectrofotometria
permite-nos, por exemplo, identificar substncias com base no seu espectro. Permite tambm
quantific-las, uma vez que a quantidade de luz absorvida est relacionada com a
concentrao da substncia.
2.6.2- Lei de Lambert-Beer na espectrofotometria
A absoro da luz depende de dois princpios,o primeiro que a absoro ser tanto
maior quanto mais concentrada for a soluo por ela atravessada, e o segundo princpio
baseia-se no fato de que a absoro da luz tanto maior quanto maior for a distncia
percorrida pelo feixe luminoso atravs das amostras. Para que seja possvel relacionar a
quantidade de luz absorvida por uma amostra com a concentrao do analito investigado,
preciso correlacionar estas grandezas. Isto possvel pela lei de Beer- Lambert, que d a
relao entre a intensidade da luz incidindo na soluo (io), e a intensidade da luz saindo da
soluo (i).

Log (io/ i) =A=.c.l

(5)
A razo entre a intensidade de luz que incide na soluo com a intensidade de luz
que sai da soluo determinada de transmitncia.

T= i/io

(6)
Assim, a transmitncia se encontra entre 0 (0%) e 1 (100%). A absorbncia A ,
portanto, definida como o logaritmo do inverso da transmitncia. Quando nenhuma luz
absorvida i = io, ento, T = 1 e A = 0. A absorbncia muito importante, pois tem, segundo
Lambert-Beer, relao linear com a concentrao da espcie absorvedora da radiao.
(HARRIS, 1999)
Embora largamente aplicvel, a Lei de Lambert-Beer tem suas limitaes que devem
ser observadas pelo analista. Essa lei s vlida para radiao monocromtica passando
atravs de uma soluo diluda (<0,01 mol.L
-1
), j que em solues muito concentradas, as
molculas de soluto influenciam uma s outras devido suas proximidades, gerando desvios na
absortividade. Alm disso, a Lei de Lambert-Beer s pode ser utilizada onde a espcie
12

absorvente no est participando de um equilbrio que seja dependente da concentrao.
(HARRIS, 1999)
2.6.3- Instrumentao analtica na espectrofotometria
Quando a regio espectral usada a ultravioleta/visvel, so necessrios componentes
ticos de quartzo e detectores altamente sensveis capazes de detectar radiaes nessa extensa
faixa espectral em que atua o instrumento. Os espectrofotmetros, em geral, contm cinco
componentes principais: fontes de radiao, monocromador, recipientes para conter as
solues, detectores e indicadores de sinal. A Figura 1 mostra o esquema dos componentes
principais de um espectrofotmetro.

2.6.3.1- Fontes de Radiao
As fontes de radiao mais comuns baseiam-se na incandescncia e so muito prticas
no infravermelho e no visvel, mas devem atuar em temperaturas elevadas na faixa do
ultravioleta. As fontes de radiao so constitudas por filamentos de materiais que so
excitados por descargas eltricas com elevada voltagem ou aquecimento eltrico e estas
devem gerar radiao continua, ou seja, emitir todos os comprimentos de onda, dentro da
regio espectral utilizada. Alm disso, as fontes de radiao devem ter intensidade de potncia
radiante suficiente para permitir a sua deteco pelo sistema detector da mquina, bem como
devem ser estveis, isto , a potncia radiante deve ser constante com vida longa e baixo
custo. Existem diferentes tipos de fontes de radiao (SILVERSTEIN et al.,1979) e
(VINAD, 2005):
Fontes de radiao Monocromador Compartimento
Amostra/padro
Sistema detector Dispositivo de
processamentos de dados
Figura 1 - Principais componentes de um espetrofotmetro
13

Lmpada de filamento de tungstnio: incandescente, produz emisso continua na
faixa e 320 a 2500nm. O invlucro de vidro absorve toda radiao abaixo de 320nm,
limitando o uso da lmpada para o visvel e infravermelho.
Lmpada de quartzo-iodo: incandescente, o invlucro de quartzo emite radiao de
200 a 3000nm. Sua vantagem que pode atuar na regio do ultravioleta.
Lmpada de descarga de hidrognio ou de deutrio: a mais usada para emisso de
radiao ultravioleta. Consiste em um par de eletrodos fechados em um tubo de quartzo ou
vidro, com janela de quartzo, preenchido com gs hidrognio ou deutrio. Aplicando alta
voltagem, produz-se uma descarga de eltrons que excitam outros eltrons gasosos a altos
nveis energticos. Quando os eltrons voltam a seus estados fundamentais, emitem radiao
contnua de 180 a 370nm.
Lmpada de catodo oco: tipo especial de fonte de linha. preenchida com um gs
nobre, a fim de manter uma descarga de arco. O ctodo tem a forma de um cilindro oco,
fechado em uma extremidade, revestido com o metal cujas linhas espectrais se desejam obter.
O nodo um fio reto ao lado do ctodo. A energia do arco causa ejeo dos tomos
metlicos do revestimento do ctodo os quais, excitados, emitem os seus espectros
caractersticos.
Laser: pelo processo de emisso estimulada, os lasers produzem uma enxurrada de
feixes muito estreitos e intensos de radiao. Todas as ondas procedentes ao material emissor
esto em fase entre si, e, por isso, praticamente no apresenta disperso quando se propaga.
2.6.3.2- Monocromadores
Os monocromadores so dispositivos essenciais dos espectrofotmetros e tem como
funo a seleo do comprimento de onda de interesse para a anlise. Este constitudo de
uma fenda de entrada de um elemento de disperso de radiao e de uma fenda de sada. O
elemento de disperso pode ser um prisma ou uma rede de difrao (SILVERSTEIN et
al.,1979) e (VINAD, 2005).
Monocromador prismtico: a radiao policromtica procedente da fonte de radiao
passa pela fenda de entrada e incide sobre a face de um prisma, sofrendo desvio. Os prismas
de quartzo so indicados para trabalhar na regio ultravioleta, embora tenham mais disperso
que o vidro. Na regio do visvel so empregados primas de vidro. Os prismas de quartzo
apresentam desvantagem de serem altamente refringentes e oticamente ativos. A Figura 2
mostra a ao de um monocromador prismtico.
14

Figura 2- Monocromador prismtico

Monocromador reticular: o principal elemento de disperso dos monocromadores
reticulares a rede de difrao, que consiste em uma placa transparente com inmeras
ranhuras paralelas e de mesma distncia. As redes de difrao dispersam a radiao
policromtica baseadas no fenmeno da interferncia, e a disperso resultante desta rede
linear. As redes de difrao possuem resoluo melhor que os prismas e podem ser utilizadas
em todas as regies espectrais.
2.6.3.3- Cubetas
So usados como recipientes das amostras a serem analisadas, cubas ou cubetas
retangulares de vidro ou quartzo. As cubetas de vidro so usadas quando se trabalha na regio
do visvel. Para a regio do ultravioleta, devem-se usar as cubetas de quartzo, que so
transparentes radiao ultravioleta, pois o vidro absorve a mesma (SILVERSTEIN et
al.,1979) e (VINAD, 2005).
Para simplificar os clculos da expresso da Lei de Beer, costuma-se utilizar cubetas
de 1 cm. As cubetas, no entanto, podem ter dimenses diferentes, e esse dado deve ser
considerado no clculo.
Para aplicaes industriais, como, por exemplo, no controle de qualidade de lotes de
produo, utiliza-se um sistema automatizado em que as amostras circulam em srie em
cubetas adequadas. Esse sistema chamado de anlise por injeo de fluxo ou FIA (do ingls
Flow Injection Analysis).
2.6.4- O mtodo espectrofotomtrico baseado na reao de Berthelot
O mtodo espectrofotomtrico para determinao de nitrognio total baseia-se na
reao de Berthelot (BERTHELOT, 1859). Os reagentes utilizados na reao de Berthelot ou
15

em alguma verso modificada so um composto fenlico, um catalisador e um agente
oxidante, sendo que a reao deve ocorrer em pH alto, aproximadamente 12. (FEREIRA,
2007)
Nessa reao, ocorre a produo do azul de indofenol a partir da reao de fenol com
amnia e hipoclorito em meio alcalino (PATTON, 1977) e (BOLLTER, 1961). O mecanismo
da reao de Berthelot mostrado a seguir (HARFMANN; CROUCH, 1989).

(7)

(8)

(9)

Na reao 7 a amnia reage com o hipoclorito, formando a monoclorimina. Na
reao 8, a monoclorimina reage com um fenol formando a benzoquinaclorimina e na reao
9, a benzoquinaclorimina reage com outra molcula de fenol formando assim o azul de
indofenol. (SEARLE, 1984).
O azul de indofenol confere uma colorao azulada amostra a ser analisada e assim,
possvel atravs de um espectrofotmetro, determinar de forma indireta a quantidade de
nitrognio total presente na amostra. No entanto, o fenol uma substncia txica e altamente
voltil, o que fez com que a utilizao do mesmo neste mtodo fosse suspendida. Alm disso,
nesta reao h a formao de um intermedirio de odor muito forte. Tal intermedirio foi
estudado por VERDOUW et al (1978) atravs de espectroscopia por infravermelho e
determinou-se a presena de orto-clorofenol no mesmo. Este composto tem a capacidade de
penetrar na pele humana, sendo cerca de trs vezes mais txico que o fenol. (BOWER;
HOLM-HANSEN, 1980)
Um substituto ao fenol nesta reao o salicilato que tambm faz a determinao
colorimtrica do nitrognio amoniacal sem, contudo, promover a formao de orto-clorofenol.
Apesar da no utilizao do fenol nesta metodologia, o termo azul de indofenol prevalece
na literatura. O mecanismo da reao de Berthelot modificada, utilizando salicilato,
mostrado a seguir (DEEPA et al., 2003)

16

(10)

(11)

(12)

A substncia mais utilizada como catalisadora dessa reao o nitroprussiato de
sdio Na
2
[Fe(CN)
5
NO].2H
2
O (DEEPA et al., 2003) que promove um aumento da velocidade
de formao do composto colorido, aumentando o sinal espectrofotomtrico. Entre as fontes
de oxidantes mais empregadas pode-se citar o hipoclorito (DEEPA et al., 2003) e o
hipobromito (GLEBKO et al., 1967). Uma soluo realizada com hipobromito apresenta
estabilidade de at 4 semanas se mantida entre 4C e 5C e em geral utilizada quando o
composto fenlico utilizado o timol. (SEARLE, 1984).
Aps a reao se completar, possvel determinar a quantidade de nitrognio
presente na amostra utilizando um espectrofotmetro.
2.7- Validao de um mtodo analtico
Para o desenvolvimento de um novo mtodo analtico, adaptao ou implementao
de mtodo conhecido, deve-se fazer uma avaliao que estime a eficincia do mtodo na
rotina do laboratrio. A este processo, costuma-se dar o nome de validao. O objetivo da
validao consiste em demonstrar que o mtodo analtico adequado para o seu propsito.
(WALSH, 1999). Alguns parmetros envolvidos na validao de uma metodologia analtica
so: Especificidade/Seletividade, Faixa de Trabalho, Linearidade, Sensibilidade, Exatido,
Preciso, Limite de Deteco (LD), Limite de Quantificao (LQ) e Robustez.

17

2.7.1- Especificidade/Seletividade
a capacidade que o mtodo possui de medir exatamente um composto especfico
independente da matriz da amostra e de suas impurezas. Para anlise qualitativa (teste de
identificao) necessrio demonstrar a capacidade de seleo do mtodo entre compostos
com estruturas relacionadas que podem estar presentes. Isto deve ser confirmado pela
obteno de resultados positivos em amostras contendo o analito, comparativamente com
resultados negativos obtidos com amostras que no contm o analito, contendo estruturas
semelhantes. A especificidade e a seletividade esto relacionadas ao evento da deteco. A
especificidade refere-se a um mtodo especfico para um nico analito e a seletividade refere-
se a um mtodo utilizado para vrios analitos com capacidade de distino entre eles (SILVA;
ALVES, 2006).
Os testes de especificidade objetivam determinar os componentes que precisam ser
analisados na amostra, para isso, necessrio definir a matriz, assim como os possveis
interferentes. A especificidade pode ser determinada pela comparao dos resultados obtidos
de amostras contaminadas com quantidades conhecidas de impurezas com amostras no
contaminadas. Dessa forma possvel demonstrar que o resultado do teste no afetado por
esses materiais contaminantes.
2.7.2- Faixa de trabalho
Em qualquer mtodo quantitativo, existe uma faixa de concentraes do analito no
qual o mtodo pode ser aplicado. Os primeiros valores da faixa podem ser dos valores dos
limites de deteco e de quantificao, que sero discutidos nos prximos tpicos, e os
ltimos dependem do sistema de resposta do equipamento de medio (SILVA; ALVES,
2006).
A faixa linear definida como a faixa de concentraes na qual a sensibilidade pode
ser considerada constante e so normalmente expressas nas mesmas unidades do resultado
obtido pelo mtodo analtico. Para escolher a faixa de trabalho deve-se proceder da seguinte
maneira: quando se tem uma amostra especfica, a concentrao esperada deve se situar no
meio da faixa de trabalho e quando a concentrao do analito desconhecida utiliza-se a faixa
de trabalho estudada para amostras diversificadas. Os valores medidos tm que estar dentro da
faixa de trabalho. No caso de concentrao do analito muito pequena, os valores medidos
devem estar prximos ao limite inferior da faixa de trabalho, sendo, porm, diferente dos
brancos dos mtodos.
18

Geralmente, os analistas selecionam o intervalo de trabalho (baseado no nvel de
concentrao do analito que desejam estudar) e depois determinam se a relao sinal versus
concentrao linear.
2.7.3- Linearidade
Segundo a International Conference on Harmonisation (ICH) a linearidade refere-se
capacidade do mtodo de gerar resultados linearmente proporcionais concentrao do
analito, enquadrados em faixa analtica especificada.
A linearidade obtida por padronizao interna ou externa e formulada como
expresso matemtica (equao da regresso linear) usada para o clculo da concentrao do
analito a ser determinado na amostra real. O coeficiente de correlao linear (r)
freqentemente usado para indicar a adequabilidade da curva como modelo matemtico. Um
valor maior que 0,90 , usualmente, requerido. O mtodo pode ser considerado como livre de
tendncias (unbiased) se o corredor de confiana da reta de regresso linear contiver a origem.
(SILVA; ALVES, 2006)
2.7.4- Sensibilidade
A sensibilidade a capacidade do mtodo em distinguir, com determinado nvel de
confiana, duas concentraes prximas (AMARANTE et al., 2001). Este parmetro pode ser
expresso pela inclinao da curva de regresso linear de calibrao.
Em mtodos sensveis, uma pequena diferena na concentrao do analito causa
grande variao no valor do sinal analtico medido. Esse critrio expressa a capacidade do
procedimento analtico gerar variao no valor da propriedade monitorada ou medida,
causada por pequeno incremento na concentrao ou quantidade do analito.
2.7.5- Exatido
Exatido o grau de concordncia entre os resultados individuais encontrados e um
valor de referncia aceito como verdadeiro (MENDHAM, 2002).
A RESOLUO N899 de 29 de maio de 2003 define que a exatido calculada
como porcentagem de recuperao da quantidade conhecida do analito adicionado amostra,
ou como a diferena porcentual entre as mdias e o valor verdadeiro aceito, acrescida dos
intervalos de confiana. Ainda de acordo com esta resoluo, a exatido expressa pela
19

relao entre a concentrao mdia determinada experimentalmente e a concentrao terica
correspondente.

Exatido =

*100

(13)
2.7.6- Preciso
A RESOLUO N899 (2003) define a preciso como a avaliao da proximidade
dos resultados obtidos em uma srie de medidas de uma amostragem mltipla de uma mesma
amostra. Esta considerada em trs nveis: repetibilidade (preciso intra-corrida) que a
concordncia entre os resultados dentro de um curto perodo de tempo com o mesmo analista
e mesma instrumentao; preciso intermediria (preciso inter-corridas) que a
concordncia entre os resultados do mesmo laboratrio, mas obtidos em dias diferentes, com
analistas diferentes e/ou equipamentos diferentes e a reprodutibilidade (preciso inter-
laboratorial) que a concordncia entre os resultados obtidos em laboratrios diferentes como
em estudos colaborativos, geralmente aplicados padronizao de metodologia analtica
A preciso pode ser expressa como desvio padro relativo (DPR) ou coeficiente de
variao (CV%), segundo a Equao 14.

DPR CV% =

*100

(14)
20

2.7.7- Teste de decomposio dos reagentes
O teste de decomposio dos reagentes importante para a operacionalidade do
mtodo em questo. Neste caso, este teste est relacionado com a verificao da necessidade
de se preparar os reagentes utilizados nas anlises no mesmo dia da realizao das mesmas.
Para uma melhor operacionalidade, o ideal que os reagentes possam ser preparados
em um dia e serem utilizados em todas as anlises da semana. Para tanto, isto s poder ser
feito caso os reagentes no se decomponham ao longo de um curto intervalo de tempo.

2.7.8- Teste de estabilidade da colorao
Apesar deste teste no estar comumente apresentado em livros de validao
metodolgica, nesta validao espectrofotomtrica este de suma importncia para que se
possa determinar por quanto tempo a soluo de colorao verde estvel sem se decompor.

2.7.9- Limite de Deteco (LD)
A RESOLUO N899 (2003) define limite de deteco como sendo a menor
quantidade do analito presente em uma amostra que pode ser detectado, porm no
necessariamente quantificado, sob as condies experimentais estabelecidas.
Este parmetro estabelecido por meio da anlise de solues de concentraes
conhecidas e decrescentes do analito, at o menor nvel detectvel.
Segundo a resoluo, no caso de mtodos no instrumentais (CCD, titulao,
comparao de cor), esta determinao pode ser feita visualmente, onde o limite de deteco
o menor valor de concentrao capaz de produzir o efeito esperado (mudana de cor,
turvao, etc). No caso de mtodos instrumentais (CLAE, CG, absoro atmica), a
estimativa do limite de deteco pode ser feita com base na relao de 3 vezes o rudo da
linha de base. Podendo ser determinado pela equao 15.

LD =

*3

(15)

Em que DPa o desvio padro do intercepto com o eixo do Y de, no mnimo, 3
curvas de calibrao construdas contendo concentraes do frmaco prximas ao suposto
21

limite de quantificao. Este desvio padro pode ainda ser obtido a partir da curva de
calibrao proveniente da anlise de um nmero apropriado de amostras do branco; S a
sensibilidade do mtodo.
No caso dos processos estatsticos, utiliza-se o "teste de hiptese" para estimar o LD
com valores obtidos de vrias medidas do branco, conforme a Equao 16.

LD =
2 DP
t
%
S

(16)

Em que t
95%
o valor tabelado em funo do nmero de anlises; DPb o desvio-
padro do branco. Quando se obtm poucos valores de medidas do branco ou quando tais
valores se apresentam como linha de base, esse tipo de estimativa pode no ser adequado.
2.7.10- Limite de quantificao (LQ)
A RESOLUO N899 (2003) define limite de quantificao como sendo a menor
quantidade do analito em uma amostra que pode ser determinada com preciso e exatido
aceitveis sob as condies experimentais estabelecidas.
O limite de quantificao estabelecido por meio da anlise de solues contendo
concentraes decrescentes do analito at o menor nvel determinvel com preciso e exatido
aceitveis. Pode ser expresso pela equao 17.

LQ =

*10

(17)
2.8- Estatstica
2.8.1- Importncia da estatstica
Ao propormos ou validarmos uma metodologia em nvel de laboratrio, infelizmente,
no existe nenhum mtodo amplamente aplicvel para a determinao da confiabilidade de
um dado com absoluta certeza. O uso da estatstica na anlise dos dados experimentais de
suma importncia para que um resultado analtico possua uma confiabilidade aceitvel.
A confiabilidade necessria de um resultado justifica o esforo extra requerido para
que anlises em replicatas sejam realizadas, uma vez que os resultados individuais de um
conjunto de medidas raramente so iguais.
22

KEITH et al. (1983) fazem relevante observao sobre a estatstica na tomada de
decises:
Qumicos analticos sempre devem enfatizar ao pblico que a caracterstica mais
importante de qualquer resultado obtido de uma ou mais medidas analticas uma afirmao
adequada de seus intervalos de incerteza. Advogados geralmente tentam prescindir de
incertezas e tentam obter sentenas inequvocas; portanto, um intervalo de certeza deve ficar
claramente definido no caso que envolvem questes judiciais e/ou processos de execuo. Por
outro lado, um valor de 1,001 sem uma incerteza especificada, por exemplo, pode ser visto
como excedendo um nvel tolervel de 1.

2.8.2- Testes estatsticos
Para que se possa estabelecer uma comparao entre dois conjuntos de dados
necessrio fazer uma comparao de mdias e varincia j que o pesquisador precisa de um
mtodo que fornea a diferena mnima significante entre duas mdias.
Toda vez que o valor absoluto da diferena entre duas mdias igual ou maior do
que a diferena mnima significante, as mdias so consideradas estatisticamente diferentes,
ao nvel de significncia estabelecida (VIEIRA et al., 1989).
Segundo VIEIRA et al. (1989), a comparao de mdias s pode ser feita aps a
anlise de varincia. Isto porque todos os procedimentos para obter o desvio de mdias
exigem o clculo do quadrado mdio do resduo.
Segundo FONSECA et al. (1982) o mtodo de anlise de varincia indica a aceitao
ou rejeio da hiptese de igualdade das mdias. Se a hiptese de nulidade (Ho) for rejeitada,
estaremos admitindo que, pelo menos, uma das mdias diferente das demais.
2.8.2.1- Teste de Hipteses
Os testes de hipteses constituem procedimentos estatsticos cujo maior objetivo
tomar decises baseadas nas evidncias fornecidas pelos dados amostrais ou populacionais.
Supondo que seja levantada uma hiptese sobre o valor do parmetro, essa hiptese ser
considerada at que prove o contrrio Deste modo, o teste de hiptese o procedimento que
nos far tomar a deciso de rejeitar ou no determinada hiptese. Para formulao levantamos
duas hipteses:
Hiptese nula (Ho): Sugere que a afirmao que estamos fazendo sobre o parmetro
23

populacional ou amostral verdadeira. Ho, portanto sempre inclui o sinal de igualdade.
Hiptese alternativa (Ha): Sugere que a afirmao que estamos fazendo sobre o
parmetro populacional ou amostral falsa, isto , que o valor do parmetro diferente,
menor ou maior que o estipulado. H, portanto, inclui sempre o sentido de variao.
Para tomarmos a deciso em um teste estatstico, isto , decidirmos se rejeitamos ou
no a hiptese de nulidade precisamos comparar o valor especificado para o parmetro com
aquele estimado a partir de uma amostra da populao.
Do ponto de vista matemtico, o valor estimado pode diferir do valor esperado para o
parmetro. Esta diferena matemtica nem sempre representa que a hiptese de nulidade deva
ser rejeitada, pois como o valor estimado uma varivel aleatria, esperado que ele assuma
valor esperado dentro de um intervalo.
O que um teste de hipteses faz comparar o valor especificado para um parmetro
com a estimativa fornecida pelo estimador. Se a variao entre os dois valores for pequena
diz-se que o valor do parmetro realmente o especificado. Logo, a diferena entre o valor
paramtrico e sua estimativa no significativa e no se rejeita a hiptese de nulidade.
2.8.2.2- Teste F para comparao de varincias
Suponha que queremos comparar as varincias
1
2
e
2
2
de duas populaes normais
independentes. Para isso, retiramos uma amostra aleatria X
1
, X
2
, ..., X
n1
da populao 1, com
distribuio N (
1
,
1
2
), e uma amostra Y
1
, Y
2
, ..., Y
n2
da populao 2, com distribuio N(
2
,
2
2
).
Primeiramente, como em qualquer outro teste, precisamos fazer a formulao das
hipteses, que nesse caso so dadas pelas Equaes 18 e 19.

(18)

(19)

Nesta formulao de hiptese, a hiptese nula que o desvio padro dos conjuntos
populacionais estatisticamente igual. A hiptese alternativa, por sua vez, afirma que o
desvio padro dos conjuntos populacionais estatisticamente diferente. (GUIMARES,
2008).
Quando desejamos comparar varincias, devemos utilizar a estatstica F (ou teste de
Fisher-Snedecor). O F
calculado
ou simplesmente Fc dada pelo quociente entre as duas
24

estimativas de varincias ao quadrado. Assim, preciso utilizar n-1 graus de liberdade para
cada um dos conjuntos de amotras (neste caso utiliza-se o desvio padro amostral) ou
populaes (neste caso utiliza-se o desvio padro populacional).

(20)

O F
crtico
ou F
tabelado
obtido na tabela da distribuio F apresentada no ANEXO 1,
com n
1
-1 e n
2
-1 e com um nvel de confiabilidade fixado. Em que n
1
o nmero de
elementos da populao 1 e n
2
o nmero de elementos da populao 2.
A concluso do teste pode ser feita comparando o valor de F calculado com os dados
da amostra (Fc) e o valor de F tabelado (F
crtico
), obtido na tabela da ditribuio F. Assim, se
Fc F
crtico
, rejeita-se Ho. Neste caso no podemos dizer, a nvel de confiana que as
varincias dos dois conjuntos populacionais so estatisticamente iguais. Se, por outro lado,
Fc< F
crtico
podemos inferir a nvel de confiana que as varincias dos dois conjuntos
populacionais so estatisticamente iguais.
2.8.2.2- Teste T para comparao de mdias
Fazer a comparao de mdias de dois conjuntos amostrais ou populacionais de
suma importncia em validao de um mtodo analtico, isto porque atravs deste que
podemos considerar que dois mtodos fornecem valores mdios estatisticamente iguais.
Para realizarmos este teste, precisamos primeiramente ter realizado o teste F. Isto
porque o teste de comparao de mdias se difere para casos em que foi comprovada
igualdade estatstica entre as varincias dos casos em que no foi comprovada igualdade
estatstica entre as varincias. Consideremos uma das seguintes hipteses:

Ho: 1 = 2
Ha: 1 < 2

(21)
Ho: 1 = 2
Ha: 1 > 2

(22)
Ho: 1 = 2

(23)
25

Ha: 1 2

As duas primeiras hipteses estabelecem os chamados testes unilaterais, j que a
regio de rejeio est somente em uma das caudas da distribuio. A ltima situao
estabelece o teste bilateral, no qual a regio de rejeio se distribui igualmente em ambas as
caudas da distribuio.
Assim, se estivermos interessados em mostrar que um parmetro significativamente
superior ou inferior a um determinado valor, teremos que realizar um teste unilateral e
teremos uma nica regio de rejeio, do tamanho do nvel de significncia fixado. Mas se, no
entanto, estivermos interessados em mostrar que um determinado parmetro diferente de um
determinado valor (sem especificar se inferior ou superior) teremos que realizar um teste
bilateral e a regio de rejeio ser dividida em duas partes iguais, nas extremidades da curva
do teste, em que cada regio de rejeio ter metade do nvel de significncia. Dessa forma,
para realizao do teste, deveremos primeiramente estimar a mdia e o desvio padro de cada
uma das amostras envolvidas e calcular a estatstica do teste. (GUIMARES, 2008)
A Equao 24 a estimativa do parmetro t de t de Students e deve ser utilizada
quando o teste F mostrar equivalncia estatstica entre as varincias da amostra.

t =

Sp .
1
n
+
1
n

(24)

O parmetro Sp calculado pela Equao 25:

Sp =
n
1. s
+n
1. s
+ n
2

(25)

No caso em que o Teste F no ter mostrado equivalncia estatstica entre as
varincias, deve-se utilizar a Equao 25.

t =
+
s

(26)
26

Em que:
1 e 2 so as mdias do grupo 1 e 2, respectivamente;
S1 e S2 so os desvios padres do grupo 1 e 2 respectivamente;
n1 e n2 so os tamanhos de amostra do grupo 1 e 2 respectivamente.

Para o caso de testes bilaterais, rejeita-se Ho se Tcalculado > t (/2) n1+n2-2,
com nvel de significncia. O valor de t (/2) n1+n2-2 tabelado conforme a distribuio T
de Student apresentada no ANEXO 1.
2.9- Gerenciamento de Resduos gerados em Laboratrios
Em laboratrios de anlises qumicas, os resduos gerados merecem uma
considervel ateno, j que estes apresentam elevada complexidade, principalmente pela
inconstncia e variao do nvel de toxidade, bem como das caractersticas fsico-qumicas
dos compostos. Outro aspecto a complexidade, em nvel de estrutura dos compostos, que
torna tal gerenciamento uma atividade difcil. Alm disso, os resduos gerados em unidades
laboratoriais so, muitas vezes, manuseados inadequadamente e tem-se observado que os
resduos que apresentam maior periculosidade so acondicionados e armazenados no prprio
laboratrio, em reas inseguras, e outros com menor periculosidade so descartados
diretamente na pia (SCHNEIDER, 2007).
Surge ento, a necessidade de um gerenciamento capaz de minimizar a gerao de
resduos, alm de tratar aqueles que no so passveis de serem evitados. Alm disso,
necessria tambm uma racionalizao dos reagentes, visando maior economia dos mesmos, o
que garante um melhor aproveitamento do ponto de vista econmico, bem como ambiental,
devido a menor gerao de resduos.
A preveno da poluio a forma mais eficaz para preservao ambiental. Se no
for possvel reduzir a fonte de gerao de resduo, deve-se promover a reciclagem do mesmo
de forma ambientalmente segura. Se ainda assim, a reciclagem no for possvel, ento a
poluio deve ser evitada, com modificao na metodologia analtica ou tratamento do
resduo gerado. O descarte no ambiente dever ser entendido e praticado como ltimo recurso,
sendo realizado de maneira ambientalmente segura.
A implementao de um programa de gesto de resduos algo que exige, antes de
tudo, mudana de atitudes, e por isto, uma atividade que traz resultados a mdio e longo
prazo, alm de requerer realimentao contnua. (JARDIM, 1997)
27

3- METODOLOGIA
3.1- Amostragem
Coletou-se amostras da cultura de feijo-vagem (Phaseolus vulgaris) do tipo Rud,
BRS Esplendor Yoki, alm de amostras de Folha de Arroz e Braquiria (Brachiaria
ruziziensi), selecionando-se brotos e folhas verdes. O material foi coletado em quantidade
suficiente para as anlises subsequentes.

3.2- Preparao das amostras para anlise qumica
Antes das anlises qumicas, preparou-se as amostras de mandeira que o primeiro
passo foi a descontaminao do material foliar. Realizou-se uma lavagem com gua destilada,
a seguir com detergente neutro, na concentrao de 0,1%. Em seguida, o material foi
novamente lavado com gua destilada.
Aps o processo de lavagem, as amostras foram submetidas secagem em estufa
com temperatura controlada em 80C (+/-5C) por 24 horas.
Depois de seco, o material foi modo em moinho de facas de ao inoxidvel (tipo
Willey). No intervalo de moagens entre as amostras de Feijo-Vagem e Braquiria realizou-
se a limpeza do moinho com auxlio de escova plstica e aspirador.
3.3- Lavagem e descontaminao de vidrarias
Durante as anlises, todas as vidrarias utilizadas foram lavas e descontaminadas. Na
descontaminao das vidrarias, fez-se a lavagem das mesmas com detergente neutro e em
seguida estes foram enxaguados com gua corrente. Aps esta etapa, cada vidraria foi
enxaguada trs vezes com gua deionizada (Mili Q- System Millipore, Bedford, MA) e
descontaminadas em seguida com a imerso das mesmas em soluo de cido ntrico (5%)
por 24 horas. Por fim, as vidrarias foram enxaguadas novamente com gua deionizada.
3.4- O mtodo Kjeldahl
3.4.1- Insumos, equipamentos e utenslios
Insumos:

Mistura catalisadora: sulfato de potssio (K
2
SO
4
) e sulfato de cobre penta-
28

hidratado (CuSO
4
.5H
2
O);
cido sulfrico (H
2
SO
4
) P.A 98%;
Soluo de NaOH 40%;
Soluo Indicadora de H
3
BO
3
2%;
Soluo Fatorada de H
2
SO
4
0,01 mol/L

Equipamentos e Utenslios:

Tubos de digesto;
Frascos conta-gotas;
Erlenmeyer de 125 mL;
Proveta graduada de 50 mL;
Bquer 100 mL.
Instrumentos de medio e equipamentos:

Balana analtica;
Balana analtica;
Bloco digestor para 40 tubos;
Tubo digestor de 100 mL ou balo Kjeldahl de 100 mL;
Destilador de Nitrognio;
Bureta eletrnica;
Dispensador para cido sulfrico;
Dispensador para soluo indicadora de H
3
BO
3
2%.
29

3.4.2- Digesto mida para o mtodo Kjeldahl
Pesou-se 40 tubos de ensaio (1 bateria) e com uma caneta de retroprojetor
identificou-se com nmeros sequenciais os tubos de digesto limpos e secos. O nmero de
cada tubo, bem como o peso dos tubos vazios foram anotados em uma planilha de registro de
dados brutos.
A seguir foram pesados em torno de 0,1000 a 0,1500 g de amostra de cada amostra
em balana analtica e o peso exato foi anotado. Essas amostras foram pesadas em papel
vegetal livre de nitrognio para que no ficasse nenhuma massa retida na parede do tubo de
ensaio, garantindo a posterior digesto completa de toda a amostra pesada. Cada papel livre
de nitrognio, contendo uma amostra foi empacotado e adicionado a um tubo, exceto no caso
do branco, em que o papel no continha nenhuma amostra.
Com o auxlio de uma colher dosadora, adicionou-se 1,2 g da mistura de sais
catalisadora. Em seguida, os tubos foram levados para capela e o exaustor foi ligado.
Utilizando-se um dispensador de cido sulfrico, adicionou-se 3,5 mL de cido concentrado
98% PA em cada tubo de digesto.
A seguir, os tubos foram colocados no bloco digestor e a temperatura do mesmo foi
aumentada at 360C de forma lenta e gradativa.
3.4.3-Destilao
Para destilao das amostras, utilizou-se o Destilador de Nitrognio Marconi MA-
036 (Figura 3).

Figura 3- Destilador de Nitrognio Marconi MA-036

30

Neste processo, deslocou-se a mesa suporte do erlenmeyer e introduziu-se pelo bico
do condensador um erlenmeyer contendo 20 mL de soluo indicadora de cido brico 2%.
Essa soluo foi transferida utilizando-se um dispensador de lquidos dedicado soluo de
cido brico.
Para que o bico do condensador ficasse submerso na soluo de cido brico,
evitando a perda de nitrognio no condensado, regulou-se a altura da mesa atravs do
parafuso com canopla presente na mesa.
O tubo de digesto com o produto digerido foi acoplado ao bocal apropriado para
que no houvesse vazamento de nitrognio. No copo de soda do destilador, foi adicionado
12,5 mL de soluo de hidrxido de sdio, com o auxlio de uma proveta de 25 mL. Em
seguida, a torneira frontal foi aberta lentamente para a passagem da soluo de hidrxido,
iniciando-se assim a destilao.
Foi coletado 50 mL de destilado de cada amostra, que por sua vez foi titulado com
cido sulfrico 0,01 mol/L, conforme o item 3.4.4.
3.4.4- Titulao
Utilizando-se uma bureta eletrnica, titulou-se o destilado utilizando a soluo
padronizada de cido sulfrico 0,01 mol/L. O volume de cido gasto para viragem foi anotado
para que fosse possvel calcular a concentrao de nitrognio total presente na amostra.
3.5- O mtodo espectrofotomtrico baseado na reao de Berthelot
3.5.1- Insumos, equipamentos e utenslios
Para as anlises de nitrognio via mtodo espectrofotomtrico, utilizou-se em cada
amostra:
1g de sulfato de potssio (K
2
SO
4
) com pureza do reagente apresentada nas
especificaes do rtulo de 99% e quantidade mxima de nitrognio de 0,0005%;
35 mg de selnio metlico ;
3 mL de cido sulfrico (H
2
SO
4
) P.A 98%
2 mL de perxido de hidrognio (H
2
O
2
) 30%
8 mL de R1 + 1,5 mL de R2 (Estes reagentes sero detalhados no item 3.5.2)

31

Para as anlises os seguintes instrumentos foram utilizados:

Tubos de digesto: tubo micro em vidro borossilicato de 100mL (25x250mm);
Dispensador graduado de 0 a 20 mL;
Suporte para tubos;
Esptula (de material polimrico ou ao inox).
Balana analtica;
Bloco digestor com capacidade para 40 provas micro. Controle de temperatura
digital; Temperatura: de ambiente +7 at 450C; Sensor: tipo J; Preciso: 2C;
Uniformidade: 5C; Potncia da resistncia: 2200 Watts; Gabinete: em ao
inoxidvel 304; Bloco em alumnio fundido com profundidade dos orifcios de
45mm; Segurana: resistncia blindada evitando contato com o cido; Tenso:
220 Volts.
3.5.2- Preparo de solues
Reagente 1 (R1)
Em uma balana analtica pesou-se 32,68 g de Salicilato; 56,96 g de Fosfato de
Sdio Dibsico e 1 g de Nitroprussiato. Em um bquer de plstico de 2L foram adicionados
aproximadamente 800 mL de gua Deionizada. Em seguida, adicionou-se o Salicilato e o
Fosfato de Sdio Dibsico pesados anteriormente e agitou-se a mistura at que os mesmos
fossem dissolvidos. Com o auxilio de um pHmetro, ajustou-se o pH para 13,1 com uma
soluo de NaOH 40%. Adicionou-se o nitroprussiato e manteve a agitao at que o mesmo
fosse dissolvido. Em seguida a soluo foi transferida para um balo volumtrico de 2L e
aferiu-se o volume. A Figura 4 mostra a etapa de agitao no preparo do reagente R1.

32

Figura 4- Preparao do reagente R1

Reagente 2 (R2)

Diluiu-se 20mL da soluo de hipocolrito de sdio 6% em 1000mL de gua
deionizada.
33

3.5.3- Digesto mida para o mtodo espectrofotomtrico baseado na reao de
Berthelot
Pesou-se 40 tubos de ensaio (1 bateria) e com uma caneta de retroprojetor
identificou-se com nmeros sequenciais os tubos de digesto limpos e secos. O nmero de
cada tubo, bem como o peso dos tubos vazios foram anotados em uma planilha de registro de
dados brutos.
A seguir foram pesados em torno de 0,1000 a 0,1500 g de amostra de cada amostra
em balana analtica e o peso exato foi anotado. Essas amostras foram pesadas em papel
vegetal livre de nitrognio para que no ficasse nenhuma massa retida na parede do tubo de
ensaio, garantindo a posterior digesto completa de toda a amostra pesada. Cada papel livre
de nitrognio, contendo uma amostra foi empacotado e adicionado a um tubo, exceto no caso
do branco, em que o papel no continha nenhuma amostra. A Figura 5 retrata a pesagem das
amostras.

Figura 5- Pesagem das amostras em papel livre de Nitrognio

A seguir, adicionou-se, com o auxilio de uma colher dosadora, aproximadamente 1,0
g de sulfato de potssio e 35 mg de Selnio (Figura 6). Os tubos de digesto contendo as
amostras foram levados para a capela e o exaustor foi ligado.

Figura 6- Sais catalisadores da digesto
34

Com auxlio do dispensador adicionou-se a cada tubo de digesto 3,5 mL de cido
sulfrico PA, e deixou-os em over night. A seguir, adicionou-se 2,0mL de Perxido de
Hidrognio a 30% e com o auxlio do suporte para tubos colocou-se os mesmos no bloco
digestor.
Em seguida, regulou-se a temperatura do bloco digestor para 360 C e os tubos foram
mantidos no bloco por 3h aps atingir esta temperatura. (Figura 7)

Figura 7- Digesto das amostras em bloco digestor

Em casos que foram formados materiais carbonizados nas paredes do tubo, a
seguinte metodologia foi realizada: O tubo foi retirado cuidadosamente do bloco digestor,
inclinou-se o tubo e este foi girado para que o cido entrasse em contato com o material
carbonizado na parede do tubo, direcionando assim todo o material ao fundo do mesmo. Este
procedimento di feito com muito cuidado para que no fosse derramado nenhum material
durante o procedimento.
Ao trmino da digesto, retirou-se os tubos do bloco e esperou-se at que os mesmos
estivessem resfriados temperatura ambiente. A Figura 8 mostra o tubo da esquerda com a
amostra aps 1 hora de digesto e o tubo da direita com a amostra no final da digesto.

35

Figura 8- Diferena da amostra na primeira hora da digesto e ao trmino da digesto.

Aps resfriados, foram adicionados a cada tubo 40mL de gua Deionizada e em
seguida, pesou-se os tubos contendo o extrato.
Aps a pesagem, os tubos foram agitados por aproximadamente 40 segundos at que o
slido contido no fundo deste fosse dissolvido.
3.5.4- Diluio intermediria
Pipetou-se do tubo digestor 0,5mL e este foi transferido para um tubo de ensaio. Em
seguida adicionou-se 9,5mL de gua Deionizada e agitou-se. Da diluio intermediaria
retirou-se uma alquota de 0,5mL e transferiu-a para um tubo micro borosilicato, marca Pirex.
Adicionou-se em seguida 8,0mL do R1 e 1,5 mL do R2, nesta ordem. Os tubos foram
fechados imediatamente. A Figura 9 mostra a etapa de adio dos reagentes utilizando pipetas
automticas. Na esquerda est representada a adio do Reagente R1 e na direita a adio do
Reagente R2.

Figura 9- Adio dos reagentes R1 e R2.
36

3.5.5- Leitura das amostras
Para a leitura das amostras foi utilizado o espectrofotmetro HACH DR2800 (Figura
10). Ajustou-se o comprimento de onda () para 685nm e o equipamento foi zerado com o
padrao de zero. Em seguida foi anotado a Absorbncia de cada leitura.

Figura 10- Espectrofotmetro HACH DR2800

3.6- Validao
3.6.1- Teste de Especificidade
Para o teste de especificidade preparou-se em triplicata duas solues padro de 100
ppm contendo possveis interferentes. A primeira soluo foi preparada com 1,19 ppm de
fsforo e a segunda soluo contendo 0,06 ppm de mangans. O procedimento para diluio
intermediria, adio dos reagentes e leitura so idnticos aos aplicados para as amostras.
Alm das duas solues contendo quantidades conhecidas dos possveis interferentes, foi
preparada, tambm em triplicata, uma soluo padro de 100 ppm sem interferentes. Aps a
leitura, verificou-se a possvel interferncia destes elementos na determinao de nitrognio
pelo mtodo espectrofotomtrico.
3.6.2- Faixa de trabalho/Teste de Linearidade/Teste de Sensibilidade
A faixa de trabalho foi determinada preparando-se padres em triplicata de 0, 5, 10,
15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 180, 210, 240, 270 e 300 ppm de amnio. Aps este preparo
realizou-se o procedimento para diluio intermediria, adio dos reagentes e leitura
idnticos aos aplicados para as amostras. Em seguida, construiu-se a curva da absorbncia
37

pela concentrao dos padres, obtendo em seguida o coeficiente de correlao da curva.
Para o teste de linearidade, preparou-se em triplicatas solues padro de 25, 50, 75,
100, 125 e 150 ppm de amnio, alm de triplicatas de brancos (solues preparadas sem
adio do analito). Aps a leitura, construiu-se uma curva da absorbncia pela concentrao e
calculou-se os coeficientes angulares e lineares da curva de calibrao, bem como o
coeficiente de correlao. O coeficiente angular da curva de calibrao determinado como o
fator de sensibilidade do mtodo (S).
3.6.3- Teste de Exatido/Teste de Preciso
Para o teste de exatido, utilizou-se como referncia uma amostra certificada pela
IPE- International Plant-Analytical Exchange (IPE sample 903). Esta amostra foi analisada
pelos mtodo de Kjeldahl e pelo mtodo espectrofotomtrico. Os valores obtidos foram
comparados e em seguida determinou-se a exatido de cada mtodo.
Para o teste de preciso fez-se as anlises de nitrognio em quintuplicata pelo mtodo
espectrofotomtrico para as amostras de Folha de Arroz, Braquiria, Feijo Rud, Feijo
Esplendor e Feijo Yoki. Dos resultados obtidos fez-se a mdia, o desvio padro e calculou-se
o coeficiente de variao de cada conjunto de quintuplicatas. Aps este processo, determinou-
se o coeficiente de variao (CV%) mdio do mtodo.
3.6.4- Teste de decomposio dos reagentes
Para realizao do teste de decomposio dos reagentes, preparou-se em um dia o
reagente R1 e R2 e em seguida, realizou-se o processo de anlise do teor de nitrognio das
amostras padro de 0 a 150 ppm. Em uma segunda bateria de anlises, preparou -se em um
dia o reagente R2 e na semana seguinte, preparouse o reagente R1, fazendo em seguida a
leitura das amostras. Por ltimo, realizou-se as mesmas anlise com os reagentes R1 e R2
velhos, isto , preparados ambos na semana anterior.
O resultado destas anlises foram plotados em uma curva de absorbncia por
concentrao do padro e em seguida analisados.
3.6.5- Teste da estabilidade da colorao
Para realizao do teste da estabilidade da colorao verde obtida aps a adio dos
reagentes nos extratos diludos, realizou-se a leitura no espectrofotmetro da absorbncia de
uma amostra em intervalos de tempo de 10 em 10 minutos por 4 horas e anotou-se cada
38

leitura em uma planilha de registro de dados brutos. Feito isto, plotou-se uma curva das
absorbncias medidas por tempo.
3.6.6- Limite de deteco e Limite de quantificao
O limite de deteco e de quantificao foram obtidos calculando o desvio padro da
absorbncia observada a partir da leitura de 10 amostras de branco realizadas em dias
diferentes. Alm disso, utilizou-se a sensibilidade do mtodo, calculada no item 3.6.2.
3.6.7- Comparao de Mdia e Varincia
A comparao de mdias e varincias foi feita a partir das anlises de nitrognio em
quintuplicata pelo mtodo de Kjeldahl e pelo mtodo espectrofotomtrico para as amostras de
Folha de Arroz, Braquiria, Feijo Rud, Feijo Esplendor e Feijo Yoki. A partir das anlises
foi calculado as mdias, varincias e desvio padro de cada conjunto de quintuplicas. Em
seguida, aplicou-se o Teste F para comprovar se havia ou no igualdade estatstica entre as
varincias dos dois mtodos e aplicou-se o Teste T para comprovar se havia ou no igualdade
estatstica entre as mdias dos dois mtodos.
3.7- Tratamento dos resduos gerados pelas anlises qumicas
3.7.1- Tratamento de resduos contendo cobre
Para reduzir o volume de resduos de cobre gerados pelas anlises, fez-se a
decantao dos ons Cu
2+
na forma de hidrxidos insolveis. Para tanto, esperou-se a
decantao do resduo bsico formado nas anlises e em seguida, fez-se a sifonao, retirando
o sobrenadante e descartando-o na pia. O slido formado foi seco em estufa e encaminhado ao
GERELAB (Gerenciamento de Resduos Qumicos de Laboratrio) da EMBRAPA Arroz e
Feijo.
A reao que se segue a de formao do composto slido insolvel hidrxido de
Cobre-Cu(OH)
2.

CuSO
+2 NaOH

CuOH
+Na
SO

3.7.2 Tratamento de resduos contendo selnio
A soluo cida de selnio foi tratada com metabissulfito de sdio (Na
2
S
2
O
5
),
39

ocorrendo a precipitao de um slido vermelho que uma das formas alotrpicas desse
elemento, tendo uma estrutura semelhante quela do enxofre amarelo (S
8
). Abaixo est a
reao de reduo com metabissulfito de sdio.

8 SeO
+8 Na

Se
+8 Na
SO
+8 SO

Em seguida fez-se a neutralizao com hidrxido de sdio (NaOH), e esperou-se at
ocorrer a decantao. Logo em seguida, retirou-se o sobrenadante por sifonao, descartando-
o na pia. O precipitado de colorao vermelha (S
8
) foi seco e encaminhado ao Gerelab. A
reao de neutralizao segue abaixo.

H
SO
+2 NaOH

Na
SO
+2 H
O

4- RESULTADOS E DISCUSSO
4.1- Reagentes utilizados nos mtodos
O catalisador da reao de Berthelot Modificada, utilizado na determinao de
nitrognio pelo mtodo espectrofotomtrico o selnio metlico. Este no interfere na
colorao final aps a adio dos reagentes colorimtricos. O sulfato de cobre, por sua vez,
tem uma colorao levemente azulada e interfere na colorao obtida aps a adio dos
reagentes colorimtricos. Esta interferncia significante na absorbncia detectada pelo
espectrofotmetro e poderia levar a erros considerveis nas anlises de nitrognio.
Ambos catalisadores so considerados txicos, sendo assim, o resduo gerado pelas
anlises dos dois mtodos foram devidamente tratados.
4.2- Digesto mida
A digesto mida bastante operacional, pois trabalha com tubos de digesto em
estantes, porm existe a desvantagem da necessidade desta exigir um sistema de exausto.
Durante a digesto mida ocorre a liberao de vapores cidos oxidantes j que neste
processo, a matria orgnica oxidada e expelida na forma de gases (CO2, NOx e H2O).
Ao final da digesto mida, a amostra de brachiaria no foi digerida totalmente,
restando material particulado no fundo do tubo. Do ponto de vista analtico, isso acarretaria
menor recuperao de nitrognio, podendo acarretar em erro negativo nas anlises. Contudo,
40

foi observado nas anlises realizadas pelo Laboratrio de Anlises Agroambientais da
Embrapa Arroz e Feijo, que alguns tipos de tecido vegetal no digerem totalmente nem
perdurando o tempo no bloco digestor. Isso ocorre devido a existncia de compostos
orgnicos (principalmente a lignina) que so mais resistentes ao ataque cido e trmico. A
lignina, um polmero no-carboidrato um dos principais componentes responsveis pela
queda da digestibilidade dos nutrientes das plantas forrageiras. (FUKUSHIMA et al, 1999)

4.3- Validao do mtodo
4.3.1-Teste de especificidade
A HACH, fabricante do espectrofotmetro presente no laboratrio L.A.A, testou
possveis interferentes na determinao de nitrognio pelo mtodo espectrofotomtrico e
apresentou em seu manual a quantidade mxima testada sem que fosse observado
interferncia na leitura. Alm disso, est apresentada no Handbook de tecido vegetal (MILLS;
JONES, 1996), a quantidade mxima de diversos nutrientes que pode ser encontrada em
amostras de tecido vegetal, sendo possvel conhecer a quantidade mxima destes nutrientes
nos extratos analisados pelo mtodo em questo. O fsforo e mangans foram os nicos
elementos em que a quantidade mxima possvel de ser encontrada nos extratos foi superior a
mxima testada pela HACH. Desta forma, foi feito neste trabalho, o teste de especificidade
apenas para os elementos fsforo e mangans e a quantidade mxima destes minerais no
extrato e testados pela HACH so apresentados na Tabela 1.

Tabela 1- Quantidade mxima de minerais presentes no extrato e quantidade mxima testada
pela HACH.

Quantidade mxima em tecido
vegetal presente no extrato
(ppm)
Mximo testado pela HACH
(ppm)
Fsforo 1,19 0,65
Mangans 0,06 0,05

A escolha pelo padro de 100 ppm de amnio na elaborao do teste foi feita pelo
fato deste ser um valor mdio de nitrognio observado nos extratos das anlises de amostras
de tecido vegetal. A Tabela 2 mostra a absorbncia lida das triplicatas sem interferentes; com

1,19 ppm de fsforo e com 0,06 ppm de mangans.
Tabela 2- Absorbncia do padro de 100 ppm de amnio sem e com possveis interferentes.

Sem interferentes
P
Mn

Estes valores foram plotados
proximidade das leituras obtidas para o padro de 100 ppm.
Figura 11- Curva padro e absorbncia do padro de 100 ppm de amnio sem e com
Assim, a partir da mdia dos valores de cada triplicata, a Tabela 3 apresenta
interferncia mxima na leitura ca
Tabela
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0
A
b
s
o
r
b
n
c
i
a
1,19 ppm de fsforo e com 0,06 ppm de mangans.

Absorbncia do padro de 100 ppm de amnio sem e com possveis interferentes.
Padres (ppm de amnio) Absorbncia
100 0,245
100 0,252
100 0,240
Estes valores foram plotados (Figura 11) de forma a ser possvel observar a
proximidade das leituras obtidas para o padro de 100 ppm.

Curva padro e absorbncia do padro de 100 ppm de amnio sem e com
possveis interferentes.

, a partir da mdia dos valores de cada triplicata, a Tabela 3 apresenta
mxima na leitura causada por interferentes.

Tabela 3- interferncia mxima na leitura.
y = 0,002x + 0,001
R = 0,999
50 100 150
Concentrao de amnio (ppm)
Curva Padro
Padro de 100 ppm com fsforo
Padro de 100 ppm com mangans

41
Absorbncia do padro de 100 ppm de amnio sem e com possveis interferentes.
Absorbncia
0,242 0,240
0,240 0,244
0,245 0,244
de forma a ser possvel observar a

Curva padro e absorbncia do padro de 100 ppm de amnio sem e com
, a partir da mdia dos valores de cada triplicata, a Tabela 3 apresenta a
200
42

Interferncia (%)
Fsforo 1,23
Mangans 0,27

Estes valores de interferncia so muito baixos (<5%) e no so considerados
significativos pelos solicitantes das anlises feitas pelo Laboratrio de Anlises
Agroambientais.
4.3.2- Faixa de trabalho, linearidade e sensibilidade
A Figura 12 mostra a faixa de trabalho testada para o mtodo espectrofotomtrico de
determinao de Nitrognio.

Figura 12- Faixa de trabalho testada

Com o coeficiente de correlao de 0,996 possvel inferir que o mtodo em questo
capaz de fornecer resultados satisfatrios para amostras com concentraes entre 0 e 300
ppm.
A figura 13 mostra o resultado do teste de linearidade e sensibilidade do mtodo.
y = 0,004x + 0,013
R = 0,996
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 50 100 150 200 250 300 350
A
b
s
o
r
b
n
c
i
a

-
6
8
5

n
m
Concentrao (ppm)
43

Figura 13- Linearidade e sensibilidade do mtodo

A boa aproximao dos pontos a uma curva linear nos testes de faixa de trabalho,
linearidade e sensibilidade mostra que a menor diferena de concentrao do analito gera a
maior diferena na absorbncia. Assim, se duas amostras apresentarem uma pequena
diferena na concentrao de amnio, a anlise ir gerar sinais diferentes suficientemente para
distinguir a concentrao das duas amostras. Dessa forma, o mtodo em questo dito
sensvel a concentrao de amnio. A sensibilidade em questo o coeficiente angular da
curva de regresso (S=0,002).
4.3.3- Teste de Exatido
A tabela 4 mostra as concentraes de nitrognio obtidas pelos mtodos
espectrofotomtrico e pelo mtodo Kjeldahl a partir de uma amostra certificada pela
Internacional Plant-Analytical Exchange (IPE sample 903).

Tabela 4- Teor de nitrognio na amostra certificada obtido pelos mtodos avaliados

Mtodo
Espectrofotomtrico
Mtodo Kjedahl

Valor Certificado
N (g/kg)
44,93 Mdia 44,63 Mdia
45,4 - 46,5

47,07
45,60
45,13
44,78
Mdia Esperada
44,80 44,59 45,95

A partir da mdia dos valores obtidos em ambos os mtodos, determinou-se o erro
y = 0,002x + 0,003
R = 0,998
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0 50 100 150 200
A
b
s
o
r
b
n
c
i
a

-
6
8
5
n
m
Concentrao (ppm)
44

relativo dos mtodos em relao ao valor certificado.

Tabela 5- Erro relativo dos mtodos em relao ao valor certificado

Mtodo Espectrofotomtrico Mtodo Kjedahl
Erro Relativo (%) 0,76 2,54

Assim, possvel verificar que o mtodo espectrofotomtrico se mostrou mais exato
que o mtodo Kjeldahl, j que o mtodo espectrofotomtrico apresentou um erro relativo em
relao ao valor certificado menor.
4.3.4- Teste de Preciso
A Tabela 6 mostra a mdia, o desvio padro e o coeficiente de variao das anlises
de nitrognio obtidas por ambos os mtodos.

Tabela 6- Mdia, desvio padro e coeficiente de variao das anlises obtidas
Amostras
Mtodo Espectrofotomtrico Mtodo Kjeldahl
Mdia
(g/kg)
Desvio
Padro
CV (%)
Mdia
(g/kg)
Desvio
Padro
CV (%)
Folha de
arroz
26,46 1,34 5,08 25,66 0,37 1,42
Braquiria 15,36 0,46 3,00 15,09 0,25 1,65
Feijo
Rud
28,45 0,47 1,64 28,89 0,23 0,79
Feijo
Esplendor
35,96 1,02 2,84 34,44 0,29 0,84
Feijo
Yoki
37,93 1,45 3,83 38,31 0,98 2,56

A tabela 7 mostra o valor mdio do coeficiente de variao para cada mtodo.

45

Tabela 7- Coeficiente de variao mdio das anlises
Teste de Preciso Mtodo Espectrofotomtrico Mtodo Kjeldahl
CV mdio(%) 3,01 1,42

A partir da anlise da Tabela 7 possvel verificar que o mtodo espectrofotomtrico
menos preciso que o mtodo Kjeldahl, isto , a repetibilidade representada pelo coeficiente
de variao se mostrou mais precisa no mtodo Kjeldahl.
Segundo a Resoluo-RE N 899, de 29 de maio de 2003, O valor mximo aceitvel
para o coeficiente de variao deve ser definido de acordo com a metodologia empregada, a
concentrao do analito na amostra, o tipo de matriz e a finalidade do mtodo, no se
admitindo valores superiores a 5%.
Nas anlises realizadas no Laboratrio de Anlises Agroambientais, o teor de
nitrognio presente nas amostras baixo, sendo que o valor de CV=3,01% admitido
aceitvel pelos solicitantes das anlises.
4.3.5- Teste de Decomposio dos reagentes
O primeiro passo para verificar a possvel decomposio dos reagentes R1 e R2, foi
preparar uma curva padro com os reagentes novos, isto , preparados no mesmo dia da
realizao das anlises. A Figura 14 mostra a curva obtida da absorbncia pela concentrao.

Figura 14- Curva padro com R1 e R2 novos

O coeficiente de correlao R
2
=0,996, mostra o bom ajuste linear dos dados obtidos.
y = 0,002x - 9E-05
R = 0,996
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0 20 40 60 80 100 120 140 160
A
b
s
o
r
b
n
c
i
a

-
6
8
5
n
m
Concentrao (ppm)
46

Para verificar a possibilidade da preparao do reagente R1 alguns dias antes da anlise,
preparou-se o reagente R1 em uma semana e apenas na semana posterior realizou anlises de
nitrognio utilizando este reagente. A Figura 15 mostra a curva obtida.

Figura 15- Curva padro com R1 velho e R2 novo

O coeficiente de correlao R
2
=0,997 mostra que no h, ao longo de uma semana,
decomposio do reagente R1, sendo que este pode ser preparado dias antes da anlise. Este
teste se mostra importante na validao do mtodo j que a preparao do reagente R1 uma
etapa lenta no processo, sendo assim, o preparo deste reagente em volumes maiores torna o
processo mais operacional ao analista, que no precisa realizar o procedimento a cada dia.
Por fim, foi realizada as anlises de nitrognio utilizando os dois reagentes (R1 e R2)
velhos, isto , preparados na semana anterior ao processo de anlise. A Figura 16 mostra a
curva obtida.

y = 0,002x - 0,000
R = 0,997
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
0 50 100 150 200
A
b
s
o
r
b
n
c
i
a

-
6
8
5
n
m
Concentrao (ppm)
47

Figura 16- Curva padro com R1 e R2 velhos

Pelo coeficiente de correlao R
2
=0,999, percebe-se que no h decomposio de
ambos os reagentes com o tempo. Assim, possvel preparar os reagentes e armazen-los para
que se possa ser utilizados nas anlises subsequentes.
4.3.6- Teste da estabilidade da colorao
A colorao obtida aps a adio dos reagentes colorimtricos ao extrato diludo,
provoca uma colorao verde mais intensa quando h alto teor de nitrognio na amostra e
menos intensa, quando h baixo teor de nitrognio na amostra, segundo as reaes qumicas
apresentadas pelas equaes 10, 11 e 12. A Figura 17 mostra, da esquerda para a direita, a
intensificao da colorao verde para o padro de zero ppm (branco) ao padro de 150 ppm.

Figura 17- Colorao dos padres

y = 0,003x + 0,000
R = 0,999
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
0 20 40 60 80 100 120 140 160
A
b
s
o
r
b
n
c
i
a

-
6
8
5
n
m
Concentrao (ppm)

Para verificar a estabilidade da colorao
absorbncia de cada padro pelo tempo. A Figura 18 mostra tal evoluo.

Figura 18
A Srie azul mostra os valores mdios da absorbncia dos padres com o passar do
tempo. As sries vermelha e verde mostram respectivamente, os valores mnimos e mximos
de absorbncia obtidos nas leituras dos padres em cada tempo medido.
A partir da anlise desta curva, fica perceptvel que a absorbncia provocada pela
colorao decai lentamente com o passar do tempo, sendo estvel por pelo menos 4 horas.
Alm disso, os valores mnimos e mximos obtidos para a absorbncia dos padres mostr
proximidade destes em relao mdia, isto , em cada instante de leitura, no houve
variaes significativas de absorbncia.
O instante cuja absorbncia mxima acontece por volta de 40 minutos aps a adio
dos reagentes colorimtricos, sendo assim
instante timo de leitura das amostras.
4.3.7- Limite de Deteco e Limite de Quantificao
A Tabela 8 mostra os valores das absorbncia
0,400
0,450
0,500
0,550
0,600
0,650
0,700
0,750
0,800
0
:
2
5
0
:
3
5
0
:
4
5
0
:
5
5
1
:
0
5
A
b
s
s
o
r
b
n
c
i
a
Para verificar a estabilidade da colorao verde, foi feita uma anlise da evoluo da

18- Evoluo da absorbncia ao longo do tempo

de absorbncia obtidos nas leituras dos padres em cada tempo medido.
Alm disso, os valores mnimos e mximos obtidos para a absorbncia dos padres mostr
variaes significativas de absorbncia.
dos reagentes colorimtricos, sendo assim, a partir deste teste, determinou
instante timo de leitura das amostras.
Limite de Deteco e Limite de Quantificao
A Tabela 8 mostra os valores das absorbncias de 10 amostras de zero ppm, isto ,
1
:
0
5
1
:
1
5
1
:
2
5
1
:
3
5
1
:
4
5
1
:
5
5
2
:
0
5
2
:
1
5
2
:
2
5
2
:
3
5
2
:
4
5
2
:
5
5
3
:
0
5
3
:
1
5
3
:
2
5
3
:
3
5
Tempo (horas)
Mdia das absorbncias
Absorbncia mnima
Absorbncia mxima
48
verde, foi feita uma anlise da evoluo da

tempo

Alm disso, os valores mnimos e mximos obtidos para a absorbncia dos padres mostra a
, a partir deste teste, determinou-se 40 minutos o
s de 10 amostras de zero ppm, isto ,
3
:
3
5
3
:
4
5
3
:
5
5
49

amostras branco em relao ao nitrognio.

Tabela 8- Absorbncia dos brancos
Brancos Absorbncia
1 0,000
2 0,000
3 0,000
4 0,000
5 0,001
6 0,000
7 0,000
8 0,000
9 0,000
10 0,002

Para a determinao do Limite de Deteco (LD) e Limite de Quantificao (LQ),
determinou-se o desvio padro dos brancos (DPa). Alm disso, foi resgatado o coeficiente
angular da curva de calibrao, isto , a sensibilidade do mtodo, de acordo com item 4.3.2.
A Tabela 9 mostra o desvio padro dos brancos, a sensibilidade do mtodo, bem
como os limites de deteco e de quantificao.

Tabela 9- Limite de Deteco e Limite de Quantificao
Desvio padro Sensibilidade
Limite de Deteco
(LD)
Limite de quantificao
(LQ)
0,0007 0,002 0,0079 0,0247

Assim, a partir do Limite de deteco (LD) podemos estabelecer que a menor
quantidade de analito que "significativamente diferente" de um branco 0,0079 ppm. Alm
disso, pelo Limite de quantificao (LQ) podemos estabelecer que o sinal suficientemente
forte para ser medido com mais exatido aquele gerado por uma concentrao de analito
igual a 0,0247 ppm.

4.3.8- Comparao de mdia e varincia
A partir dos dados obtidos pela Tabela 6, foi possvel construir a Tabela 10, em que
mostrado os valores dos testes de hipteses F e T. Os valores calculados foram obtidos a partir
50

da mdia e do desvio padro das concentraes de nitrognio obtida para a quintuplicata de
cada amostra e os valores crticos foram determinados com o auxlio da tabela F e T tendo
como base 95% de confiana.

Tabela 10- Teste de comparao de varincia e mdia
Amostras
Comparao de varincias Comparao de mdias
F calculado F crtico T calculado T crtico
Folha de arroz 13,54 6,39 0,26 2,31
Braquiria 3,41 6,39 0,34 2,31
Feijo Rud 4,13 6,39 0,24 2,31
Feijo Esplendor 12,61 6,39 0,24 2,31
Feijo Yoki 2,19 6,39 0,64 2,31

A varincia dos mtodos espectrofotomtrico e de Kjeldahl no estatisticamente
igual apenas para a folha de arroz e para o feijo esplendor, j que o F calculado foi maior que
o crtico. Para todas as amostras, porm, a mdia dos resultados se mostrou estatisticamente
igual. Assim, possvel inferir, com 95% de confiana que as anlises de nitrognio
realizadas por ambos os mtodos fornecem valores mdios estatisticamente iguais.

4.4-Tratamento dos resduos gerados pelas anlises qumicas
4.4.1- Tratamento de resduos contendo cobre
Na determinao de Nitrognio pelo mtodo convencional de destilao (Mtodo
Kjeldahl) utiliza-se uma mistura de reagentes contendo 86,44% em massa de sulfato de sdio
e 13,56% de sulfato de cobre penta-hidratado como catalisador da reao de oxidao da
matria orgnica presente no tecido vegetal.
Cada anlise de Nitrognio por este mtodo gera aproximadamente 15 ml de NaOH
(40%V:V) e 3,5 ml de H
2
SO
4
P.A. Neste volume est contido tambm 1 g de mistura
catalisadora contendo 0,864 g de K
2
SO
4
e 0,136 g de sulfato de potssio penta hidratado
(CuSO4.5H20).
O resduo gerado apresenta, portanto, uma concentrao de 1868,42 mg/L de ons
51

Cu
2+
.
Para reduzir o volume de resduos de cobre gerados pelas anlises, faz-se a
decantao dos ons Cu
2+
na forma de hidrxidos insolveis. Para tanto, espera-se a
decantao do resduo bsico formado nas anlises. Em seguida, faz-se a sifonao, retirando
o sobrenadante e descartando-o na pia. O slido formado seco e encaminhado ao
GERELAB.
Na neutralizao da soluo alcalina formada (pH=14,073) foram necessrios 0,643
ml de H
2
SO
4
para cada amostra analisada.

4.4.2- Tratamento de resduos contendo selnio
Nas anlises de nitrognio total pelo mtodo espectrofotomtrico so gerados
extratos cidos cuja concentrao de selnio de 875 mg.L
-1
e extratos diludo de
concentrao de selnio 43,75 mg.L
-1
. Cada amostra gera 43,5 mL de extrato cido e 10,0 mL
de extrato cido diludo, totalizando 53,5 mL a 719 mg.L
-1
.
A soluo cida de selnio foi tratada com metabissulfito de sdio (Na
2
S
2
O
5
),
ocorrendo a precipitao de um slido vermelho. Assim, so necessrios para cada 1 litro de
resduo 1,73 g de metabissulfito. Partindo-se de 10% de excesso usa-se 1,91g de Na
2
S
2
O
5
ou
103 mg por amostra.
Em seguida faz-se a neutralizao com hidrxido de sdio (NaOH), e espera-se at
ocorrer a decantao. Logo em seguida, retira-se o sobrenadante por sifonao, descartando-o
na pia. O precipitado de colorao vermelha (S
8
) seco e em seguida encaminhado ao
Gerelab.
O extrato resultante da mistura do extrato cido com o diludo contm 4,9% de
H
2
SO
4
sendo necessrio, portanto, 69,04 g de NaOH para neutralizao de cada litro do
extrato, ou 3,69 g de NaOH com 10% em excesso para cada amostra analisada.

5- CONCLUSES
O mtodo de determinao de nitrognio a partir do mtodo espectrofotomtrico,
baseado na reao de Berthelot modificada compatvel com a metodologia Kjeldah e pode
ser utilizada em rotinas laboratoriais, tendo em vista sua maior operacionalidade, quando
comparada com a metodologia Kjeldah. Para comprovar tal compatibilidade, os testes de
validao realizados neste trabalho mostraram que o mtodo espectrofotomtrico seletivo,
52

linear, apresenta grande faixa de trabalho, sensvel e exato, porm menos preciso que o
mtodo convencional de Kjeldahl.
Alm disso, com os testes estatsticos de comparao de mdia e varincia, foi
possvel concluir que os mtodos geram resultados mdios estatisticamente iguais.

53

ANEXO 1

Distribuio F

54

55

Distribuio t-Studentes

56

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Análise espectrofotométrica como alternativa à metodologia Kjeldahl

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