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1.

Boas prticas de laboratrio de microbiologia: assepsia e tcnicas de inoculao


de microorganismos.

O trabalho realizado visa atender princpios, com vistas sade do laboratorista e
biossegurana, atravs do uso de equipamentos pessoais de proteo, a desinfeco e
limpeza das bancadas e dos seus instrumentos de trabalho.
Antes de qualquer procedimento ser realizado sobre as bancadas, as mesmas
devem passar por uma rotina de limpeza e desinfeco prvia. A bancada de trabalho deve
estar a mais desimpedida possvel. Retirar adornos pessoais, das mos e dos antebraos.
Usar corretamente luvas, mscaras, jaleco, cala e sapato fechado.
Passar detergente sobre a bancada. Passar papel toalha sobre a bancada para
retirar o detergente de modo que voc no o passe no mesmo lugar. Com a bancada ainda
mida passar lcool 70%. Ligar o bico de Bunsen aps quase completa evaporao do
lcool na superfcie da bancada. Dispor direita do bico de Bunsen o material que vai ser
inoculado e esquerda, o material que j foi inoculado. Flambar alas, agulhas e pinas
antes e aps o uso. Seguir as normas de uso dos aparelhos.
Materiais contaminados com microrganismos, inculos, placas de Petri que contm
culturas e gar, utenslios utilizados nos experimentos microbiolgicos, entre outros, devem
ser descontaminados antes de serem descartados e/ou limpos.

Os microorganismos necessitam de um meio de cultura adequado para seu
crescimento. O uso da chama essencial para evitar contaminaes externas, por isso o
material deve ser trabalhado sempre prximo chama do bico de Bunsen. A ala de platina
flambada antes e aps a inoculao, mas deve-se ter cuidado de resfria-la antes de entrar
em contato com o meio. H inmeras tcnicas de semeadura como:
Meio liquido: tcnica visa inocular as culturas bacterianas ou fngicas dispostas em
caldo ou em meio slido, em um meio lquido, com auxlio da ala de platina. Este
desenvolvimento caracterstico de agitao constante em equipamento denominado
Estufa Bacteriolgica Rotacional ou Shaker.
Meio Slido Inclinado: A tcnica visa inocular as culturas bacterianas ou fngicas
dispostas em caldo ou em meio slido, em um meio slido inclinado, com auxlio da ala de
platina, fazendo estrias na superfcie do gar, prximo da chama do bico de Bunsen.
Geralmente feita em tubos de ensaio, providos de tampas.
Meio Slido em Placa: A tcnica visa inocular as culturas bacterianas ou fngicas
dispostas em meio slido, em um meio slido em placa, com auxlio da ala de platina,
fazendo o estriamento sobre a placa em trs posies distintas. A ala de platina deve ser
flambada ao rubro, esfriada prxima da chama do bico de Bunsen, por alguns instantes, e
imergida em caldo que contenha as culturas ou raspada sobre cultura desenvolvida
superficialmente sobre o gar. O material da cultura fixado na ala deve ser espalhado
sobre a placa, em dois ou trs setores, de maneira a obter quantidades progressivamente
menores do material sobre a placa, sem recarreg-la na cultura inicial. O sucesso da
semeadura est em: fazer um grande nmero de estrias; no perfurar o meio (gar); no
voltar a ala sobre a estria; pegar pequena quantidade de material para semear.
Placa Pour-plate: Contagens de clulas viveis, que estima o nmero de clulas
viveis em uma amostra. Esta metodologia envolve a coleta de alquotas de uma cultura
microbiana em diferentes tempos de crescimento, as quais so ento inoculadas em meio
slido. Aps a incubao dos meios, geralmente por 24 horas, o nmero de colnias
contado.
Espalhamento em placa: o inculo adicionado superfcie do meio contendo gar
j solidificado. O inculo , ento, espalhado uniformemente na superfcie do meio atravs
da utilizao de um basto de vidro com uma dobradura especial. Este mtodo mais
empregado para bactrias que so muito sensveis ao calor, sendo destrudas durante a
solidificao do gar no formando colnias, se fosse feito por Pour-plate. As bactrias no
entram em contato com o gar fundido e crescem somente na superfcie do meio.
2. Estruturas externas parede celular bacteriana: morfologia e funo.

Glicoclice (cpsula): uma camada que fica ligada parede celular, como um
revestimento externo, encobrindo a clula. De natureza polissacardica, pode ser composta
por protenas ou glicoprotenas.
Funes:
Sustentao da clula em bactrias desprovidas de
peptidioglicano verdadeiro;
Reservatrio de gua e nutrientes;
Resistncia fagocitose (capacidade invasiva de
bactrias patognicas em hospedeiros);
Aumentam a aderncia das bactrias em superfcies
(biofilmes) e o poder infectante;
Aumento da resistncia das bactrias a biocidas;
Despejo de substncias de escria;
Aumento do poder virulento, produzindo
enfermidades.



Filamentos axiais: estrutura rgida, e com ela, mobilidade exclusiva.
Emergem de ambos os extremos das clulas e as rodeiam em espiral por
debaixo do envlucro.
Funo: o movimento melhorado pelos filamentos axiais. Podem mover-
se em ambas as direes.




Flagelos: formado de uma estrutura basal, um gancho e um
longo filamento externo membrana. Seu comprimento
geralmente maior que o da clula. So muito finos.
Funo: confere movimento clula em velocidades muito
elevadas.







Fimbrias (pelos, pilli): so apndices filamentosos proteicos. So menores, mais
curtos e mais numerosos que os flagelos e no formam ondas regulares. No
desempenham nenhum papel relativo mobilidade.
Funes:
A fmbria F, ou fmbria sexual, serve como condutor de
material gentico durante a conjuno bacteriana;
Stios de adsoro de vrus;
So estruturas de aderncia s clulas de mamferos
e outras superfcies e em tecidos nutrientes.



3. Estruturas internas parede celular bacteriana: morfologia e funo.

Plasmdios: pequenas molculas circulares de DNA, que se replicam de forma
autnoma e independente. So de importncia para as clulas, pois podem agregar genes
que determinam atividades como a resistncia a antibiticos, tolerncia a metais txicos,
produo de toxinas e sntese de enzimas.

Componentes citoplasmticos: todos os componentes do interior do citoplasma
da clula, envoltos pela membrana plasmtica (citoplasmtica). As principais estruturas que
se encontram no citoplasma so DNA (nucleide), ribossomos, depsitos de reservas
chamados incluses e vacolos gasosos.

Incluses: so estruturas de natureza qumica.
Funo: reter substncia de reserva e subunidades de macro molculas para compor
outras estruturas celulares.

Ribossomos: partculas citoplasmticas responsveis pela sntese proteica,
compostas de RNA (60%) e protena (40%).

Vacolos gasosos: so vesculas gasosas individuais. As vesculas so cilindros
ocos cobertos por protenas, organizadas de maneira a formar uma estrutura rgida
somente permevel a gases e impermevel a gua ou solutos.
Funo: manter a flotabilidade, de modo que as clulas possam permanecer na
gua na profundidade adequada para receber suficiente quantidade de oxignio, luz e
nutrientes.

Membrana plasmtica: uma estrutura que forma uma barreira responsvel pela
separao do meio interno (citoplasma) e externo da clula. formada por fosfolipdios e
protenas. As membranas plasmticas eucariticas contm esteroides (colesterol) e
acares, ao passo que, as procariticas no contm esteroides, sendo menos rgidas.
Funes:
Barreira seletiva de nutrientes clula (permeabilidade a molculas e ons);
Contm enzimas capazes de catalisar as reaes qumicas que rompem as
substncias nutritivas (degradao de nutrientes) e produzem ATP (produo de
energia), excreo de substncias inteis.

Material nuclear (nucleide): o nucleide ou DNA bacteriano, quando devidamente
corado, pode ser visualizado com auxlio do microscpio ptico. A regio nuclear
preenchida por fibrilas de DNA dupla hlice na forma de uma nica molcula de
aproximadamente 1 mm de comprimento (desdobrada). O nucleide no apresenta
cobertura nuclear (membrana) e podem assumir formas esfricas ou alargadas.













4. Parede celular bacteriana e a colorao de Gram:

Parede celular: estrutura constituda por aminocidos, acares, carboidratos e
lipdios. Funo: Estrutura e proporciona a manuteno da forma bacteriana.
Colorao de Gram usada para classificar microrganismos com base em suas
caractersticas tintoriais, tamanho, forma e arranjo celular.
A diferenciao encontrada em clulas Gram-negativas e Gram-positivas,
justamente na composio qumica.
O mecanismo da colorao de Gram se refere composio da parede celular,
sendo que as Gram-positivas possuem uma espessa camada de peptidioglicano e cido
teicico, e as Gram-negativas, uma fina camada de peptidioglicano, sobre a qual se
encontra uma camada composta por lipoprotenas, fosfolipdios, protenas e
lipopolissacardeos.









Consiste no tratamento sucessivo de um esfregao
bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal
violeta, lugol, etanol-acetona e fucsina bsica. Essa tcnica
permite a separao de amostras bacterianas em Gram-
positivas e Gram-negativas e a determinao da morfologia
e do tamanho das amostras analisadas. Toda bactria
absorve de maneira idntica o cristal violeta e o lugol,
adquirindo a cor roxa devido ao complexo formado pelas
duas substncias no citoplasma da clula. Entretanto, ao
serem tratadas com o lcool, apresentam comportamentos
diferentes: as Gram-positivas no se deixam descorar pelo
lcool, enquanto as Gram-negativas o fazem sem qualquer
dificuldade. As bactrias Gram-positivas mantm, ento, a
cor roxa do complexo cristal violeta-lugol, e as Gram-
negativas, que o perderam, tornam-se descoradas. Ao
receber a fucsina, somente as ltimas bactrias se deixam
corar, adquirindo a cor avermelhada do corante. Assim,
quando se examina ao microscpico um esfregao
bacteriano corado pelo mtodo de Gram, as bactrias
Gram-positivas se apresentam na cor roxa e as Gram-
negativas, de cor avermelhada.












5. Morfologia microscpica das clulas bacterianas:

As bactrias podem apresentar formas esfricas ou cocos; cilndricas ou bacilos; de
espiral.

Bacilos: Cilndrica ou bastonete. Se dividem para formar poucos arranjos ou
agrupamentos: os diplobacilos aparecem aos pares e os estreptobacilos ocorrem em
cadeias. Alguns bacilos assemelham-se tanto aos cocos que, por isso, so chamados de
cocobacilos.

Espiraladas: Espiralada ou helicoidal. Podem ter um ou mais espirais. Podem ser
classificadas como vibries, quando tm corpo rgido, feito vrgulas; os espirilos, quando
tm a forma de saca-rolhas e as espiroquetas, quando tm corpo flexvel e espiralado.

Cocos: Elipsoidal ou esfrica. Quando as bactrias em forma de cocos se dividem,
as clulas podem permanecer unidas umas s outras, surgindo em decorrncia, cocos aos
pares (diplococos), cadeias (estreptococos) e cachos (estafilococos).




























6. Morfologia macroscpica de colnias bacterianas:

Tamanho e homogeneidade: o tamanho das colnias varia desde dimenses muito
pequenas (puntiformes), com apenas uma frao de milmetros de dimetro, at colnias
muito grandes, com 5 a 10 mm de dimetro.

Borda: a periferia das colnias pode formar muitos desenhos diferentes,
dependendo da espcie. Pode ser inteira, ondulada, lobulada, denticulada, radiada ou
franjada.

Elevao: as colnias podem ser achatadas, espraiadas, convexas (baixa e alta),
umbilicada, centro saliente, mamilonada, papilfera.

Pigmentao da colnia (frente e verso): opaca, translcida ou com algum
pigmento.

Pigmentao do miclio (frente e verso): se esteja presente opaco, translcido
ou com algum pigmento (amarela, branca, preta, rsea, esverdeada, etc.).

Alterao de cor entre a borda e o centro: h alguma distino de colorao entre
estas zonas na colnia?

Fluorescncia: fluorescente, no fluorescente ( luz UV 365 nm).

Forma: as colnias podem ser circulares, irregulares, radiadas, rizoides.

Textura: pode ser semelhante a consistncia da manteiga, facilmente removvel com
a ala de platina: viscosa ou mucoide; fungos geralmente apresentam textura micelial ou
filamentosa; seca ou quebradia.

Brilho (se viscosa): opaca, creo (com aspecto de cera de vela), vtreo, fosco.

Formao de setores: identificada como alteraes significativas na forma da
colnia.

Presena de frisos ou nervuras: ausente, se presente: radiais, irregulares,
onduladas, lobuladas, denticuladas ou franjadas.

Crescimento no gar: somente na superfcie, somente no fundo, distribudo.

Odor: nenhum, pronunciado, semelhante a.